超滤法提取Ⅱ型真菌疏水蛋白的方法

专利名称：超滤法提取Ⅱ型真菌疏水蛋白的方法
超搶i取II型真菌疏l7K蛋白的方法技术领域：
本发明属于生t/M料技术领域，特别涉及一种II型疏水蛋白的纯化方法，即 用超搶法纯化II型疏水蛋白。该疏水蛋白可以应用到生物传感器、细胞固定化、化妆品、医药卫 生和乳化等的众多领域。背景S^疏冰蛋白(hydrophobin)是高等丝状真菌在特定发育P介段大量分泌的一类具 有特殊14M的小型结构蛋白，它们會辦在不同界面处自组装成为一种两亲性薄膜。这种特性在很 多方面漸导到了細，涉及到生物传繊、细胞固定化、化妆品、医药卫生和 L化等的众多领域。 由于疏水蛋白的 性质，疏水蛋白的纯化与一般蛋白相比，3艘比 :。根据疏水性图谱及装配成的两性蛋白膜的溶解性辦征，IfeK蛋白可以分为两类I型和II型，并且因为两者的 'M穀舰大，因而提取方、瞎别也很大。据已公开的文棘看，疏冰蛋白的主要纯化方法如下(1) 三氟乙酸法如SC3、 SC4、 EAS、 HYPA等I型疏水蛋白就是利用此Sii，化。这种方 法禾,了 I型ifeK蛋白在界面形成的聚合物(包括菌丝和孢子的表面)不能在热SDS溶液中解聚 和溶解，而只能在强鹏口过氧甲酸(PFA)和三氟乙酸(TFA)中解聚成单体(早期用PFA，后期都 用TFA)的特性。(2) 唯一的一种温和劍牛下提取I型€*蛋白的方法1998年Lora JM等发鹏褶菌分泌 SC3的同时分泌高^T量的多糖裂褶菌素，裂mffi素feK溶液能稳定SC3，以此发明了用疏iTK层析 法/Aa,液中分离I型疏iZK蛋白的方法。除fc外，对I型i^7K蛋白还没有提出TFA (或PFA) 解聚以外的分离纯化方法。(3) II型疏冰蛋白纯《七法因为II型疏l7JC蛋白能被1% 2%SDS溶液和60%乙, 聚 和溶解，所以如CU、 CFTH1以及融合蛋白EGIcore-HFBI等一般flPF用PFA或TFA解聚，而用近几 年3f5SDS抽提法、)Z7jC相系统ATPS分离法和各种层析离纯化。但SDS抽提法和)5i7jC相 系统ATPS分离 孺要f顿大量的无m^有机试剂，分离后产生的废 需额外处理,并且最后所得 II型蛋白溶液含有大量盐类和色素，还需要下一步工艺来去除它们;各种层析方法虽然能有效的解 决最终II型疏冰蛋白溶液中含有麟和色素的问题但实际应用中能处理蛋白粗样品的规丰駄小， 并且各种层析所用填料价格昂贵,不适舒大规模4顿。超滤(UF)以压力为推动九禾,中空纤维超滤膜不同孑L湖液体进行分离的物理筛分过程， 其切割W量(CWCO) 103至106，孔径1100nm。 1965年，首先由美国康公司开功中空纤维 式超滤器，S放巿场。超滤应用范围很广，除在水处理工程中，用于除菌、胶体和大肝有机 物等外，还可以用于许多特殊溶液的分离、精制，如血液净化、蛋白质ftj、大M有机物与盐 的分离和I7K等。超滤作为一种较为快速简便的方法，具有对产物破坏少的优点。中空纤维超滤膜由于孔径小，过滤时不易产生浓差极化，并具有可同时脱盐和浓縮靴点,故被国内外一些研究 者相^^用，用于蛋白质的 和沉淀剂去除。但是到目前为止，市场上还没有一种成型的疏水蛋白产品，主要是因为现有的疏水蛋白的纯 化方法过程錢，成本过高，不适合在大规模，^擅用。
发明内容本发明目的，决现有技术存在的不足，提供一种适合在大规模X^fe^， 用的超搶,取II型疏L7jC蛋白的方法。以便去除II型1^7jC蛋白ffiJl液中的大部^fe素，无机盐 以及其它小^^质，得到高纯度的疏水蛋白。本发明,的超激iM取II型真菌疏水蛋白的方法，包括以下步骤第一、用SDS法从真難丝表面抽提II型真K7]C蛋白，经离心或板敏激导至暖白粗提瓶第二用Kci对蛋白粗提^a行处理，经离心，板框或微滤以除去n型真菌疏水蛋白粗提液中70%- 80X左右的SDS;第三、超滤，将KC1处理后的II型真菌疏冰蛋白粗提Wil^孔径为3000—10000的中空纤维超滤膜，乡SiS麟到II型真菌疏冰蛋白W液；超滤结束后对超滤鹏行反洗，待用。对，第三步得到II型真菌疏水蛋白浓缩液，可以进《fm规喷雾千燥，得到含量在20%—30 %的11型真菌^7乂蛋白干粉。其中，超滤过程中所用的中空纤乡鍋滤膜材质为聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚1W、聚丙烯腈或聚偏氟乙烯；中空纤纟,滤膜为巻^^或管 。超滤运行工艺^^牛为运行压力0. 02—0. 09MPa;运^f温度为20—45。C;运行PH为3—11; 每超滤2小时需要反洗。所述的反洗是在超滤过程中用去离子7jC反冲膜，以部分咴 通量；或在超滤结束时用水反TO以提高n型真菌疏冰蛋白收率，然后用碱性溶液 以完全咴 1量。本发明针对不同规模的II型疏l7K蛋白粗提液，选择材质、大小^S的超Mt， fflil超滤压力、 时间、、鹏、PH等超滤剝牛的优化，得到最佳的超滤割牛。顿滤过程中，用SDS-PAGE、高效液 相色谱、葡聚撒赚G-25层析、Western Blotting及吖啶橙》縛技术对蛋白粗提液中的疏冰蛋白、 无机盐和SDS进行定性和定量。本发明的优点和积极鄉本发明与传统的II型疏水蛋白纯化方法，如双水相系统分离法和各种层析法相比，超'搶法纯化n型疏冰蛋白更加方便，效率更高，所用财更少，M3S^^工^Ji大规模的纯化。本方法 的实施为加快疏水蛋白，的产业化打下了坚实的基础。
图1是瑞氏^llll7K蛋白HFBI标准品电泳图。 图2是不同超滤时间下膜通量曲线图。 图3是不同超滤压力下膜通量曲线图。 图4是不同超^lffi下膜通量曲线图。图5是不同超滤ph下ma量曲线图。图6 ，滤后瑞氏木ll^水蛋白HFBI电泳图和Western Blotting图。 图7 ，滤后瑞氏木Slif冰蛋白HFBI与标准品的HPLC对比图。 图8 ，滤后瑞氏木HSr冰蛋白HFBI的S印hadex G25层析图。 图9 ^0滤后检测SDS所用标准曲线。 图10是超滤后瑞氏^ll^水蛋白HFBI的定量标准曲线。具体实《^以目前国际上研究最多的II型疏水蛋白HFBI为例，选择以聚砜为材质的中空纤维膜(不易 结合蛋白质)，完整的实现了超滤纯化HFBI的S^程。 本发明方、M括以下步骤第一、用SDS法从真M丝表面抽提II型真菌疏冰蛋白，经离心舰敏滤得到蛋白粗提液； 第二、用KC1对蛋白粗提皿行处理，经离心，板框或微滤以除去II型真菌疏冰蛋白粗提液 中80%左右的SDS;第三、超滤，将KC1处理后的II型真菌疏水蛋白粗提M^孔径为3000—10000的中空纤 l腿滤膜，纟S1S 銜寻到II型真菌疏冰蛋白、 液；超滤结束后对超滤膜进行反洗，待用。 对上歩得到的II型真菌疏水蛋白浓^"液，进4亍常规喷雾干燥，得到含量在20%—30%的II 型真菌i^7]C蛋白干粉。本实施例所用的中空纤乡，滤膜材质为聚砜(效果好于其它材质)，超滤膜孔径为6000。 超滤运行工艺条^牛为运行压力0.02—0. 09MPa;运斤温度为20—45'C;运行PH为3—11;每超滤2小时需要反洗。最,作压力为0.06Mpa;最佳运fr温度为40。C;最佳运行PH为8;最佳反洗时间为2小时。下面结合附图对本实施例的方齒,一步的阐明。图1说明:il3l瑞氏^SIi^7iC蛋白HFBI标准品电泳图可以看出，疏冰蛋白的好量在7. 5KDa。 如果膜的切割肝駄小，贝依单位时间内单位面积3t^的通駄小，不能得到实际应用，如果膜的切割好《1大，贝IJTO^留物质的截流率太低。考虑至喊冰蛋白的肝量在7. 5KDa,并 且要OT去除的色素、盐类以及SDS都是小^^J质，综合以上考虑，选择6000作为膜的切割分 子量(实验中发现使用切割^ 量为3000—10000的超滤膜都有 媒，6000为最佳)。图2说明从图中可以看出，随着时间的推移，膜通量开始衰减，但衰^Ut逐渐减慢。这 主要是由于蛋白质浓差极化形成MK层SEffi密戶^t系^it行2小时之后膜通量为起^1量的 64%左右，这种状态一直可機到第六小时，波动非常小，驻要是由于膜表面形成了稳定的 鹏 层所致。fi^统不能长时间在较低通SS行，因为低通量不仅效率比较低，而且长时间的压密对 以后的麟洗带来困难。所以运行2小时后要離子进行反洗。图3说明从图中可以看出，機作JEMS小时，渗3gii量与ffiMM线性关系，HMM大， 渗iiiil翻大；但是当ffi^il0.05MPa后，渗翻量的增长幅度明显减小，雖逐鹏于稳定， 与自无关，此时的渗M量为"临界渗透通量"，压差为"临界压差"。这是因为料 压力较小时，膜渗M量小，MM3i液带到膜表面的溶质量也较少，膜表面 孔内只形成了少量的 层和污染,由于压力将物料中压向凝胶层内的溶质和由于物料切线流动和扩散带走的溶质基本保持平瓶增大压力产生的压餘使通量增大；而在压力达到一定離后，超滤的初始通量很大，大量的溶质Wii液带至鹏表面并聚集形j^度极化层，浓差极化严重，这日彌大压力产生的压差会很快被加厚和压实的凝胶层所抵消，所以通量不再随着压力变化，如果继续增加压力，反而可能 将一些与膜孔大小相近的分子压进膜内,增加膜污染的危险，更严重的还会将膜压实，造成膜不可逆的损坏。在本i微中，与"临界压差"微的0.06MPa为最髓滤压力。图4说明从图中可以看出，随着m的升高，膜通量也相应的变大，m与m量成正相 关。这可能有两方面的原因， 一方面是随着鹏的升高，斷氐了蛋白粗提液的粘度，膜面上的大 ^t/质向两侧溶液中扩ffcii^有所增加，从而離了浓差极化柳繊层的产生，通翻加；另一方面是随着温度的升高，加快了中空纤维超滤膜的聚，链节的微观布朗运动使得单位时间单 位体积形成小孔的可能性增加，同时也增加了渗離分的、S^与扩散，结果4鹏的渗透性增强， 通量增加。值得注意的是，过高的^g会使蛋白质变性，且易于形成^^层，还会导致中空纤维 超滤膜的过快老化，所以超滤时的鹏不育敏高。在本微中，4(TC为最佳的超滤鹏。图5说明i^7K蛋白作为一种两亲性蛋白质，很容易在疏冰的聚砜中空纤维掛滤mil自组装成蛋白膜。为了尽量M^、成膜的可能性，就要使疏水蛋白远离等电点，这样可以使蛋白单体带上相同的电荷，相互排斥，不易于鹏；另外由于远离等电点，疏冰蛋白的溶解度增加，不易于聚 ,中空纤维超滤膜的表面，形成紧密的吸附层；再者由于蛋白带电，就与水的亲和力增加，相 应的中空纤纟t^滤膜上的吸附量就减少，膜的通量就较高。HFBI疏^7K蛋白的等电点在6左右，在 图中可以看出，当PH为6时，蛋白粗提液的通量是最低的，因为处于等电点的蛋白质间的斥力是 最小的，很容易在膜表面沉积，在等电点附近的PH时，可以看出蛋白粗提液的通量提高的不是很明显。考虑到PH的调节对通量的影B向不是很大，且如果调节PH，还要增加一i!X^，所以本微 选取蛋白粗提液的初始PH=8为超滤PH值。图6说明tt蛋白超滤7K溶^^^^真空冷冻干燥四十个小时之后，得到蛋白干粉。鹏 量蛋白干fH4行ricine-SDS-PAGE电泳及Western Blotting。结果如图^，可以清楚的看至lj在 7.5KDa处有一条蛋白带，进行Western Blotting检测，确定其是HFBI。图7说明实验中4顿C18层析柱，tt^径4.6咖，柱长25cm，柱^R4.15ml。 tt液A液 为20%乙腈,0.1%三氟乙酸；B液为80X， 0.1%三氟乙酸。进样20ul， ？臓为lml/min。首先 将HFBI纯品进fr液相色it^析，所做液相色谱为梯度洗脱。从图中可以看到HFBI的出峰^g在 30%进禾1￡右。随后将乡Sl中空m隹自滤的样品进行HPLC分析，梯度洗脱，A液和B液成分同 上。可以看到，HFBI的出峰艘也在30X进禾驻右，同纯品出峰位置一致。图8说明用S印hadex G25舰疏冰蛋白HFBI进行检测，目的是为了^i正样品中色素和盐类是否己经大部分被除去。结果如图麻。横坐标为时间(射中)，mM标为紫外和离子吸收。蛋白峰只有一个，离子吸收一直没有什么变化。可见，用中空纤维自滤除去样品中色素和盐类的 效果非，。《腿合在工Jd:大规模^，可以大幅度附喊本。图9说明将不同浓度的SDS标准溶液，通过吖啶橙法测定，499nm下的0D值。每种浓度 检测5次，并求得平均值，将各i^处船乡魏臉准曲线。对会敏中空纤维月驅滤的蛋白干, 行SDS賴检测，代入公式求得SDS浓度值为0.02X。，说明经过KC1沉淀和中空纤维^S滤，绝 大部分SDS已被除去，繊匕较理想。图10说明舰行Tricine -SDS-PAGE电泳，第1—第5》媳为中空乡书t^滤所得疏冰蛋 白HFBI， /A^向右各》媳的上样量分别为7.5ng， 10ug， 12.5ixg， 15ng， 20yg ，第7^dt 为HFBI标准品，上样量为2.5ug。然后用 M^像仪扫描，扫描结mffl软件BandScan进行定量 分析。根据所 徵值，以样品HFBI的质量和光吸收H^坐标轴得到样品的标准曲线。
权利要求
1、本发明涉及一种新的超滤方法提取II型真菌疏水蛋白，该方法包括以下步骤第一、用SDS法从真菌菌丝表面抽提II型真菌疏水蛋白，经离心或板框过滤得到蛋白粗提液；第二、用KCl对蛋白粗提液进行处理，经离心，板框或微滤以除去II型真菌疏水蛋白粗提液中70％-80％的SDS；第三、超滤，将KCl处理后的II型真菌疏水蛋白粗提液通过膜孔径为3000-10000的中空纤维超滤膜，经过超滤得到II型真菌疏水蛋白浓缩液；超滤结束后对超滤膜进行反洗，待用。
2、 根据权利要求i戶;M的方法，，征在于，将第三步f导到n型真M7jc蛋白^L缩^^f亍常规喷雾千燥，得到含量在20%_30%的II型真菌疏水蛋白干粉。
3、 根据权利要求1皿的方法，，征在于，超滤过程中所用的中空纤纟腿滤Mt质为聚乙 烯、聚丙烯、H^乙烯、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈或聚偏氟乙烯；中空纤会腿滤膜为巻 或管 规
4、 根据权利要求1至3中任一项戶腿的方法，，征在于，超滤Jt行工艺^f牛为运行压力 0. 02—0. 09MPa;运，亍温度为20—45。C;运行PH为3—11;每超滤2小时需要反洗。
5、 根据权利要求4中阮述的方法，其特征在于，所逸的反洗是^滤过程中用去离子水反冲 膜，以部分咴SMffi量；或顿滤结束时用水反 以提高11型真菌疏冰蛋白收率，然后用碱性 溶液W以完全咴繊通量。
全文摘要
一种适合在大规模工业生产上应用的超滤法提取II型疏水蛋白的方法。本发明方法是超滤法，在超滤过程中使用的是膜孔径为3000-10000的中空纤维超滤膜。超滤运行的工艺条件为运行压力0.02-0.09MPa；运行温度为20-45℃；运行pH为3-11；每超滤2小时需要反洗。本发明经过超滤可得到II型疏水蛋白含量在20％-30％的蛋白浓缩液，疏水蛋白回收率在70％-90％之间。本方法可除去蛋白粗提液中大部分色素、无机盐以及其它小分子物质，操作简单，分离效率高，运行成本低。
文档编号C07K1/00GK101215321SQ200810052099
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月18日 优先权日2008年1月18日
发明者乔明强, 辉 冯, 冯树人, 强 张, 徐海津, 王泽方, 黄渝健 申请人:乔明强