专利名称：：丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有抗体的医药配制品，或单克隆抗体的制备，具体是一种丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体及其用途。技术背景随着社会无偿献血事业的广泛开展，实践证明丙氨酸氨基转移酶(AlanineTransaminase，ALT)4企测不合格是造成当前血站血液4艮废的主要原因。ALT是人体内反映肝细胞损伤的重要酶类之一，检测血清ALT有助于鉴别输血相关肝炎病毒携带者，同时也可以在一定程度上弥补某些肝炎病毒标志物未被检测及感染"窗口期"的缺陷，从而减少由于ALT不合格造成的血站血液报废。街头采血车工作人员对献血前ALT的筛选可以有效减少和降低血液报废率。传统的ALT检测采用酶化学法，由于反应时间长，需要特殊检测设备，携带不方便，酶试剂不稳定，难以实现快速'检测。中国专利1231341公开了"一种丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒，，，其包括酶试剂、基质液、丙氨酸氨基转移酶、参考血清、参考血清复溶液以及试条，其特征在于酶试剂的组成为丙酮酸氧化酶3IU/L，过氧化物酶3IU/L,维生素C氧化酶5IU/L，黄素腺噪呤二核苷酸36umol/L;基质液的组成为L-丙氨酸O.50mol/L,a-酮戊二酸0.003mol/L，显色剂，亚纟失氰化钾0.0168g/L;试条主要有转运膜和反应膜组成，转运膜覆盖在反应膜的一半处。中国专利101105491公开的"定量测定人体丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸"，试纸由长条形的上、下支持层组成，在测试区从上到下依次为加样孔、底物层、显色层和测试孔。底物层可选用玻璃纤维、滤纸和,无纺布等材料，浸渍有底物等试剂；显色层为各种滤纸、无纺布或合成膜，浸渍有色原等试剂。样品从加样孔进入底物层，转运至显色层的样品面，含有被检测成分的液体渗透至显色层的检测面，通过化学反应引起色原颜色的改变，通过下支持层上的测试孔在显色层的检测面即可测定光密度的变化。该试纸用于快速测定人体全血、血清或血浆中的丙氨酸氨基转移酶的活性，是肝功能检测的重要指标之一。但是，建立具有简便、快速、特异的优点的ALT免疫学分析方法，首先需要制备高特异性的抗ALT抗体。
发明内容本发明就是为了解决传统的酶化学法检测ALT,反应时间长，需要特殊检测设备，携带不方便，酶试剂不稳定，以及难以实现快速检测等问题，为建立具有简便、快速、特异的优点的ALT免疫学分析方法，而提供一种丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)及其用途。本发明是按以下技术方案实现的。一种丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体，该抗体具有抗人丙氨酸氨基转移酶的特异性，其是由保藏号CGMCCNo.2322的杂交瘤细胞产生。所述的丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体，其杂交瘤细胞产生的抗体重链为IgGl亚类，轻链为K型。所述的丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体，该抗体的间接ELISA法测定抗体效价，细胞培养上清为l:io4，腹水为l:io6。一种产生丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的杂交瘤细胞，其杂交瘤细胞anti-ALT7D1，保藏号CGMCCNo.2322。所述的丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体，其杂交瘤细胞染色体数目为95-106。所述抗人丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的制备方法，每次/只用20ug纯化的丙氨酸氨基转移酶抗原免疫BALB/C小鼠；取血清效价高于10—4的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下融合；经次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧咬核苷(HAT)选择性培养；用间接ELISA对杂交瘤细胞培养上清进行筛选后，阳性对照为免疫小鼠的多抗血清，阴性对照为骨髓瘤细胞SP2/0培养上清，As。值为阴性对照2.1倍或以上者为阳性孔，对检测阳性孔用有限稀释法进行亚克隆，3轮后获得全部阳性单克隆。对杂交瘤细胞抹及时进行冻存；同时取部分杂交瘤细胞于传代培养48h后加入秋水仙素至终浓度为0.04mg/L，继续培养6-10h，收集培养液，进行染色体分析、类别鉴定后，确定该杂交瘤细胞株为7D1;将该杂交瘤细胞冻存品复苏，扩大培养并接种于BALB/C小鼠腹腔，采集并纯化McAb腹水，作分子量及效价测定，即得抗人ALT的特异性ALT单克隆抗体(McAb)。一种丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的用途，该抗体用于检测人血清中的丙氨酸氨基转移酶。本发明涉及的生物材料样品于2008年1月7日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号CGMCCNo.2322，建议的分类命名杂交瘤细胞。这样制备的本发明能特异性识别人血清中的ALT,而与血清中的其他蛋白无交叉反应，且具有很好的亲和力，为临床应用奠定了良好的基础，也为免疫诊断方法建立提供了必要条件。图1是本发明杂交瘤细胞染色体图镨；图2是本发明McAb12%SDS-PAGE电泳图；图3是本发明McAb的Western-blotting结果。具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。一.材^牛和方法1细力包、动物和试剂SPF级BALB/C小鼠购自中国医科院血液学研究所实验动物中心，小鼠骨髓瘤细胞抹(Sp2/0)由中国医科院协和医科大学基础医学细胞中心引进，ALT免疫原，次黄噪呤(Hypoxanthine，H)、氨基喋呤(Aminopterin，A)、胸腺嘧咬核香(Thymidine,T)、降植烷(pristane)、福氏佐剂、聚乙二醇4000(PEG400)购自Sigma公司，胎牛血清、DMEM培养基购自Invitrogen7〉司，单克隆抗体亚类鉴定试剂为SouthernBiotech公司产品，辣4艮过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG为北京中杉金桥公司产品。2方法①动物免疫选择体重18-20g，6-8周龄的雌性BALB/C小鼠5只，基础免疫3-4次，间隔2周，每只每次20ugALT抗原腹部皮下多点注射，初次免疫与等体积的福氏完全佐剂乳化，其余2-3次加福氏不完全佐剂乳化，末次免疫后7-10d，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清效价，取效价高于10—4的小鼠进行融合，融合前3d用不含佐剂的ALT抗原(20ug)进行小鼠尾静脉注射作加强免疫。②细胞融合和杂交瘤细胞的筛选经免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下融合，经次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧咬核苷(HAT)选择性培养。1w后待细胞长至孔底面积的1/3时，用间接ELISA对杂交瘤细胞培养上清进行筛选。阳性对照为免疫小鼠的多抗血清，阴性对照为骨髓瘤细胞SP2/0培养上清，1。值为阴性对照2.l倍或以上者为阳性孔，对检测阳性孔用有限稀释法进行亚克隆，3轮后获得全部阳性单克隆。对杂交瘤细胞抹及时进行冻存和定期复苏。③杂交瘤细胞染色体分析于传代培养48h的杂交瘤细胞中加入秋水仙素至终浓度为0.04mg/L，继续培养6-10h，收集培养液，1000r/min离心10min，弃上清，细胞沉淀加入37。C预温的0.075mol/LKC1溶液，用曱醇、冰醋酸(3:1)混合液固定2次，制片、干燥后Giemsa染色，油镜下计数100个完整的中期分裂相细胞，分析其染色体数目分布。④McAb的类别及亚类鉴定采用SouthernBiotech7>司的免疫5求蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定。应用ELISA双抗夹心法，用捕获抗体(5ug/ml)包被ELISA板，4°C过夜；PBST洗涤后，用ly。牛血清白蛋白室温封闭lh;再用PBST洗涤后，加入杂交瘤培养上清，室温温育lh;PBST洗纟反，然后分别加入HRP标记的山羊抗鼠Ig亚类抗体，室温温育lh;PBST洗板后，用ABTS底物液显色10min;用2mol/L&304终止反应；酶标仪读取A。s值；结果判定以与阴性对照A。5比值大于2.1为阳性。⑤McAb腹水的制备及纯化将杂交瘤细胞1x106个，接种经降植烷预处理的BALB/C小鼠腹腔，7-10d后，待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，1200g离心5min收集上清，即为McAb腹水，用ProteinA-S印harose4B亲合层析纯化抗体。McAb的分子量测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法将纯化后的单克隆抗体稀释后煮沸，上样，电泳，纟艮据Marker指示的特异性条带、电泳位置判断单克隆抗体的分子量大小。⑦McAb的Western-blotting分析纯化抗原和正常Ajk清100倍稀释后经SDS-PAGE电泳分离，常规方法电转移至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭后加入纯化的单克隆抗体反应，洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，用化学发光方法显影，用凝胶图像处理系统分析结果。⑧腹水效价测定用包被液(pH9.6碳酸盐緩沖液)稀释抗原，100ul/孔包被ELISA板，4。C过液；PBST洗涤3次后用5°/。的脱脂奶粉200ul/孔37。C封闭2h，PBST洗涤后，加入培养上清100ul/孔，37。C温浴lh，PBST洗涤3次后加入HRP标记的羊抗鼠IgG100ul/孔，37。C温浴lh，PBST洗涤3次后，用TAB底物显色，15min后用2mol/L1^04终止反应，用酶标仪读取A。值，以与阴性对照As。值比值大于2.1为阳性。⑨单克隆抗体特异性、腹水效价及抗体相对亲和力测定参照Beatty等建立的间接ELISA法测定相对亲和力，用纯化的ALT包被(2ug/ml),—抗为不同稀释度的抗ALT单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，用TMB显色，于波长450nm测定^值。再以McAb浓度为横坐标，As。值为纵坐标绘制反应曲线。从曲线上找到趋于平坦段；值的50。/。所对应的McAb浓度，再求出其倒数，以此表示McAb的为相对亲和力。二.结果1.抗ALT杂交瘤细胞的建抹接种融合细胞672孔，细胞融合5-7d后观察，克隆生长452孔，克隆生长率为67.2%，经ELISA检测特异分泌抗-ALT阳性杂交瘤，获得1林稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞林7D1。对其进一步研究，体外连续传代培养16周能稳定分泌抗体，冻存14周后复苏，仍能稳定分泌抗ALT-McAb。2.杂交瘤细胞染色体分析计数100个分裂相杂交瘤细胞，其染色体数目为95-106。基本上是小鼠脾细胞和SP2/0细胞染色体数之和，另外在杂交瘤细胞染色体中均可见中间着丝点和亚中部着丝点的染色体。(见图1)3.杂交瘤细胞分泌抗体类型的鉴定经SouthernBiotech公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定，该4朱McAb重链为IgGl亚类，轻链为K型。4.单克隆抗体腹水及上清效^f介测定用杂交瘤细胞株7D1，体内接种，收集腹水，间接ELISA法测定抗体效价，细胞培养上清为1:104，腹水为1:106。表l:单克隆抗体腹水及细胞培养上清效价测定结果吸光度"450)稀释度上清腹水SP2/01:100〉3〉30.1941:1012.62〉3O.l卯1:1021.55〉30.1841:1031.032.440.1811:1040.741.320.1761:1050.380.700.1721:1060.230.310.1685.单克隆抗体特异性检测(western检测)SDS-PAGE显示纯化的抗体在55KD和25KD附近各有一条带，与预计的分子量大小一致(见图2)。Western-blotting显示7D1纯化的单克隆抗体与人血清中的相对分子量为110KD的ALT有特异性反应条带，而与牛血清白蛋白(BSA)无任何反应条带(见图3)。6.亲和力4企测间接ELISA测定McAb的亲和力，以被检测McAb的不同浓度为横坐标，以相应的1。值为纵坐标，绘出McAb亲和力的测定曲线,从曲线上查出达到最大结合50%所需抗体浓度为10—"，故该McAb的相对亲和力为1011。采用纯化的ALT抗原免疫，用传统的细胞融合技术成功的建立了分泌抗ALT的McAb杂交瘤细胞抹，其染色体数为95-106，为小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞之和，对其分泌的McAb进行研究，发现它能识别人血清中的ALT,而与血清中的其他蛋白无交叉反应，且具有很好的亲和力，为进一步的临床应用奠定了良好的基础。7.人血清中丙氨酸氨基转移酶的快速检测采用纯化的ALT单抗包被，用酶免疫法才企测ALT质控品及人血清中丙氨酸氨基转移酶。操作流程方法如下应用ELISA双抗夹心法，ALT单抗(5ug/ml)包被ELISA板，4。C过夜；PBST洗涤后，用1%牛血清白蛋白室温封闭lh，加入样品100ul每孔，37。C孵育60分钟，洗板5次；再加入HRP酶标记的ALT单抗100ul每孔，37。C孵育60分钟，洗板5次；用TAB底物显色，混合后100ul每孔，37。C孵育15分钟，最后加终止液50ul每孔。在450nm/630nm测定每空的吸光度值。以与阴性对照A5。值比值大于2.1为阳性。生化指标由OLYPUSAU400全自动生化仪对ALT质控品及人血清中丙氨酸氨基转移酶进行检测(天津市血液中心常规检测项目)。对ALT质控品及人血清中丙氨酸氨基转移酶进行检测。方法取一滴血清或质控品加于含本发明的试纸条加样段，另取两条同时加样阴性、阳性对照品。10min内结果判断阳性为两条显色带；阴性为一条显色带。7例ALT质控品及8份人血清中丙氨酸氨基转移酶检测结果见表2。表2:ALT单克隆抗体对质控品及血清检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注生化值》40(U/L);酶免法OD值》0.105;试纸条法两条显带均为阳性。权利要求1.一种丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体，其特征在于该抗体具有抗人丙氨酸氨基转移酶的特异性，其是由保藏号CGMCCNo.2322的杂交瘤细胞产生。2.根据权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体，其特征在于杂交瘤细胞产生的抗体重链为IgGl亚类，轻链为K型。3.根据权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体，其特征在于该抗体的间接ELISA法测定抗体效价，细胞培养上清为1:104，腹水为1:106。4.一种产生丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于杂交瘤细胞anti-ALT7D1，保藏号CGMCCNo.2322。5.根据权利要求3所述的丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体，其特征在于杂交瘤细胞染色体数目为95-106。6.—种权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的用途，其特征在于该抗体用于检测人血清中的丙氨酸氨基转移酶。全文摘要本发明公开了一种丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体及其用途，属于含有抗体的医药配制品，或单克隆抗体的制备。本发明具有抗人丙氨酸氨基转移酶的特异性，其是由保藏号CGMCCNo2232的杂交瘤细胞产生。本发明用纯化的ALT抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选杂交瘤细胞；接种于小鼠腹腔，采集并纯化McAb腹水，获得抗人ALT的特异性ALT单克隆抗体；并可用于检测人血清中的丙氨酸氨基转移酶。这样制备的本发明能特异性识别人血清中的ALT，而与血清中的其他蛋白无交叉反应，且具有很好的亲和力，为简便、快速、特异的ALT免疫学分析方法建立提供了必要条件。文档编号C07K16/40GK101250229SQ20081005237公开日2008年8月27日申请日期2008年3月5日优先权日2008年3月5日发明者李玉艳,晶樊,袁玉华申请人:天津市血液中心