专利名称：一种从琼脂糖凝胶中回收dna的方法
技术领域：
本发明专利涉及一种回收纯化DNA的方法，具体涉及一种从电泳后琼脂糖 凝胶中回收纯化DNA的方法。
背景技术：
在分子生物学技术领域中，很多实验都需要通过琼脂糖电泳分离开DNA片 段，再将需要的DNA条带回收用于后续实验，如DNA片段克隆、酶切分析、标 记、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,縮写为PCR)以及体外转录 等。琼脂糖凝胶DNA的回收一直是分子生物学实验的主要内容，由于琼脂糖凝 胶是固体，包含在里面的DNA条带不容易被释放出来，故对其回收一直都需要 多步操作。在涉及DNA领域的中国发明专利申请有许多，申请号为200610037351.5， 发明名称为《从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA的方法》的方法，介绍了从电 泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA的方法，它依次包括以下步骤用dH20清洗胶 条样品、以凝胶研磨棒研磨凝胶至成粉状、凝胶浸泡、凝胶去除、DNA连接、DNA 吸附、DNA洗涤、DNA洗脱等。据介绍该发明的优点是①DNA回收量大，纯度高。 ②操作时间短，操作简单。(D不需要特殊设备，成本低廉。④可以制成试剂盒。 ⑤也可用于琼脂糖凝胶的DNA回收。这也反映了现有回收琼脂糖凝胶DNA的方法 和试剂盒，最常用的是从琼脂糖凝胶上将目的DNA条带切割下来，加入溶解溶液后加温溶解，再过回收柱，达到纯化的目的。其他常用方法还有用低熔点琼脂糖法，DEAE-纤维素膜电泳法等，都需要不至一次的操作凝胶，如切胶或插入膜 片，再电泳等。操作烦琐，而且费时。发明内容本发明目的是为了克服现有方法，切胶回收的烦琐操作和在操作多个样品 时易交叉污染的缺点，提供一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收线性或环状DNA 的方法，该方法能在15min内从琼脂糖凝胶中回收纯化目的DNA片段，且纯度 很高，能满足后续的分子克隆、酶切分析、标记和PCR等操作。本发明的主要原理为0.6% 2%的琼脂糖凝胶机械强度很低，可很容易地 将硬质吸水海绵直接插入其中。同时琼脂糖凝胶主要为水溶液，有高吸水性能 的硬质吸水海绵可迅速吸收充胀，在此过程中DNA也即与凝胶中溶液一并被吸 收出来。通过高速离心可又将吸收的DNA溶液甩出该吸水海绵，达到将DNA从 琼脂糖凝胶中释放出来的目的。本发明是一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA的方法，依次包括如下步骤(1) 吸水材料制备将具有一定硬度的硬质吸水海绵裁成3mmX3mmX10鹏， 下端为楔型的条状物，并事先经过消毒灭菌。(2) 样品吸出电泳后，在紫外灯照射下将制成楔型的强吸水材料条对准 目的DNA条带插入凝胶中，待其吸收15 30秒后，可见发出荧光的DNA条带被 吸入其中，然后拔除。(3)离心收集将此吸水材料放入带有漏斗的离心管中，以15000rpm速度 离心3 4分钟，即可将DNA溶液从中离心脱出来。完成这3步所制得的DNA样品就可用作PCR模板、酶切、分子克隆等实验 操作，若需进一步去除杂质，可将回收DNA溶液采用如下纯化操作步骤(4) DNA吸附将DNA回收柱放置在离心管中，将离心收集溶液移入回收柱 纯化膜上，室温下放置2分钟，以10000 12000rpm速度离心1分钟，弃离心 管底部液体。(5) DNA洗涤在DNA回收柱中加入成份为10 20mmol/L pH8. 0的Tris (三 羟甲基氨基甲烷)与无水乙醇为l: 2至1: 4混合的DNA洗涤液500 800ul， 以10000 12000rpm速度离心1分钟，弃离心管底部液体，重复操作1次。将 DNA硅胶吸附柱重新放入离心管中，室温10000 12000rpm离心2分钟。(6) DNA洗脱将DNA回收柱移入一只新1. 5ml离心管中，向DNA回收柱纯 化膜中央加入30 40p 1预热至37。C的TE溶液或用去离子水洗脱，在室温下放 置2分钟，然后以12000rpm速度离心2分钟，离心管底的液体即为琼脂糖凝胶 中回收的DNA溶液，可直接用于后续实验，也可-2(TC保存备用。一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA的方法，操作中采用硬质吸水海绵 用于从琼脂糖凝胶中快速吸收出DNA样品，带漏斗的离心管利于高吸水材料吸 收样品被离心至底部，硬质吸水海绵和带漏斗的离心管为商业购得。DNA洗涤液 用于冲洗掉DNA以外的杂质成分，在含有约70%的乙醇时，洗涤过程中DNA不会 溶解丢失，TE (是三羟甲基氨基甲烷加EDTA)溶液，或是用去离子水用于溶解 DNA。本发明的有益效果是，克服了现有方法中切胶回收的烦琐操作和在操作多个 样品时易交叉污染的缺点，提供一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收线性或环状DNA的方法，能在15min内从琼脂糖凝胶中回收纯化目的DNA片段，且纯度很高， 能满足后续的分子克隆、酶切分析、标记和PCR等操作，发明的器材简单、操 作简便，回收率高、成本低，省去了传统的割胶步骤，可以试剂盒化。
具体实施方式
下列实例是进一步对本发明的说明，不应该当作本发明的限制。 实施例1:按以下程序从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA:1) 将事先已经消毒灭菌过的硬质吸水海绵裁成3咖X3mmX10mm，下端为楔 型的条状物。2) 待电泳完后，在紫外灯照射下将制成楔型的硬质吸水海绵条对准目的DNA 条带插入凝胶中，待其吸收20秒后，可见发出荧光的DNA条带被充分吸入 其中，然后拔除。3) 放入带有漏斗的离心管中，15000rpm离心3分钟，即可将DNA溶液从中 离心出来。4) 将DNA回收柱放置在离心管中，DNA溶液移入DNA回收柱上，室温放置 2分钟，12000rpm离心l分钟，弃管底废液。5) 在回收柱中加入100 u 1 DNA洗涤液，成份20画1/L的Tris HCL(pH8. 0 盐酸Tris)与无水乙醇l: 3混合，以10000rpm，离心1分钟，弃离心管中 液体，重复操作1次，将DNA回收柱重新放入离心管中，空管10000rpm离心2min。6)将DNA回收柱移入一只新1. 5ml离心管中，DNA回收柱底部中央加入30 P 1预热至37。C的TE溶液洗脱，成份10鹏ol/L TrisHC1 (pH8.0)和 l咖ol/L EDTA(pH8. 0)，在室温下放置3min，然后以12000rpm速度离心2min， 离心管底的液体即为琼脂糖凝胶中回收的DNA溶液，可直接用于后续实验， 也可-2(TC保存备用。此例在15min内从琼脂糖凝胶中回收的DNA样品，A26()/A28()为1. 7，满足后 续的PCR、分子克隆和酶切分析等。(A26。/A28o为该样品在260nm和280丽波长 处的吸光度，这个比值是用来表示DNA的纯度)实施例2:按以下程序从电泳后的琼脂糖凝胶中回收质粒DNA (为闭合环状DNA):1) 将事先己经消毒灭菌过的硬质吸水海绵裁成3ramX3mmX10rran，下端为楔型 的条状物。2) 待电泳完后，在紫外灯照射下将制成楔型的硬质吸水海绵条对准目的质粒 DNA条带插入凝胶中，待其吸收20秒后，可见发出荧光的DNA条带被充分吸 入其中，然后拔除。3) 放入带有漏斗的离心管中，15000rprn离心5分钟，即可将质粒DNA溶液从 中离心出来。可直接用于后续实验，也可-2CTC保存备用。此例在6min内从琼脂糖凝胶中回收的DNA样品，A26Q/A28()为1. 45，可满足 后续的PCR和酶切分析等试验。(A26o/A，为该样品在260服和280nm波长处的 吸光度，这个比值是用来表示DNA的纯度)
权利要求
1、一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA的方法，其特征是依次包括如下步骤1)吸水材料制备将硬质吸水海绵裁成3mm×3mm×10mm，下端为楔型的条状物，并事先经过消毒灭菌；2)样品吸出电泳后，在紫外灯照射下将制成楔型的强吸水材料条对准目的DNA条带插入凝胶中，待其吸收15～30秒后，可见发出荧光的DNA条带被吸入其中，然后拔除；3)离心收集将此吸水材料放入带有漏斗的离心管中，以15000rpm速度离心3～4分钟，即可将DNA溶液从中离心脱出来；完成这3步所制得的DNA样品就可用作PCR模板、酶切、分子克隆等实验操作，若需进一步去除杂质，可将回收DNA溶液采用如下纯化操作步骤4)DNA吸附将DNA回收柱放置在离心管中，将离心收集溶液移入回收柱纯化膜上，室温下放置2分钟，以10000～12000rpm速度离心1分钟，弃离心管底部液体；5)DNA洗涤在DNA回收柱中加入成份为10～20mmol/L pH8.0的三羟甲基氨基甲烷与无水乙醇为1∶2至1∶4混合的DNA洗涤液500～800μl，以10000～12000rpm，离心1分钟，弃离心管底部液体，重复操作1次，将DNA硅胶吸附柱重新放入离心管中，以10000～12000rpm速度离心2分钟；6)DNA洗脱将DNA回收柱移入一只新1.5ml离心管中，向DNA回收柱纯化膜中央加入30～40μl预热至37℃的TE溶液或用去离子水洗脱，在室温下放置2分钟，然后12000rpm离心2分钟，离心管底的液体即为琼脂糖凝胶中回收的DNA溶液，可直接用于后续实验，也可-20℃保存备用。
2、根据权利要求1所述的一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA的方法， 其特征是采用硬质吸水海绵用于从琼脂糖凝胶中快速吸收出DNA样品，带漏斗 的离心管利于高吸水材料吸收样品被离心至底部，硬质吸水海绵和带漏斗的离 心管均可为商业购得，DNA洗涤液用于冲洗掉DNA以外的杂质成分，在含有约 70%的乙醇时，洗涤过程中DNA不会溶解丢失，TE溶液是三羟甲基氨基甲烷与 EDTA的溶液，或是用去离子水洗脱DNA。
全文摘要
本发明涉及一种从琼脂糖凝胶中回收DNA的方法，这种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA样品的方法，它依次包括如下步骤首先制备楔型的条状吸水材料，然后插入凝胶中吸出DNA样品，再经离心收集、DNA吸附、DNA洗涤、DNA洗脱等；本发明克服了现有方法中切胶回收的繁琐操作和在操作多个样品时易交叉污染的缺点，提供一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收线性或环状DNA的方法，能在15min内从琼脂糖凝胶中回收纯化目的DNA片段，且纯度很高，能满足后续的分子克隆、酶切分析、标记和PCR等操作；本发明使用的器材简单、操作简便，回收率高、成本低，可以试剂盒化。
文档编号C07H21/04GK101274952SQ20081006862
公开日2008年10月1日 申请日期2008年1月22日 优先权日2008年1月22日
发明者冯发莉, 杨 刘, 健 黄, 海 黄 申请人:贵阳医学院