专利名称：家蚕微孢子虫孢壁蛋白swp32基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕微孢子虫孢壁上的与家蚕相互 作用的孢壁蛋白基因SWP32。
技术背景微孢子虫(必'cro邵oric/i's)隶属于原生生物界(尸rot/"a)、微孢子虫门(#icrospora) (Levine and Corliss 1980)，近期研究表明微孢子虫在进化上与真菌有着紧密的亲缘关 系。微孢子虫近150个属1300余种，是专营细胞内寄生，具有抗性极强的孢子，通过极 管刺入宿主组织细胞后将其孢原质注入细胞，完成感染并大量增殖，最终破坏宿主组织。 它能广泛寄生感染无脊椎动物和脊椎动物，尤其是极具经济价值的昆虫、鱼类、啮齿类、 兔类、皮毛动物、灵长类以及家庭宠物如狗和鸟，引发疾病甚至死亡。其中家蚕微孢子虫 (/fese/ag 60/^.KCi's)，能经食下和胚种途径寄生于家蚕，引发严重的传染性微粒子病，最 终导致家蚕大规模死亡，给世界蚕业造成巨大的经济损失，成为近100年来影响蚕业生产 的难题。另外新发现，许多属的微孢子虫与人类疾病有关，如角膜病、角膜结膜炎、呼吸 疾病、前列腺肥大和扩散感染、肝炎、脑炎、痢疾、肌炎、胆管炎等等，甚至还能机会性 地感染艾滋病(AIDS)患者、器官移植病人、服用免疫抑制剂药物病人和先天性免疫机能 不健全者，引起呼吸系统、泌尿系统和皮肤溃烂等恶性疾病，加剧病情，加速病人的死亡。 对于微孢子的治疗已有报道，如烟曲霉素及它的衍生物抑制甲硫氨酸氨基肽酶2的活 性，阿苯达唑和苯丙咪唑能够抑制微管蛋白形成，它们被鉴定为治疗微孢子的有用药剂， 然而，对于治疗感染人类的多种微孢子仍没有找到有效、安全的药物。微孢子虫能够产生一种感染性的，能够抵制环境的孢子，孢子弹出内部极丝并将其内 含物接种到临近宿主细胞。孢子发芽机制一直吸引着微孢子虫研究者们。近年来的研究表 明，在微孢子虫受到外界刺激发芽之前，存在一个微孢子虫孢子与宿主细胞相互接触，以 提高宿主细胞感染率的过程，而微孢子虫的孢壁蛋白在此过程中起着与宿主细胞相互识别 和粘附的作用，如果抑制了微孢子虫孢子与宿主细胞的粘附作用，就可能降低了宿主细胞 的感染率甚至控制宿主细胞的感染，因此近年来微孢子虫孢壁蛋白已成为该领域的研究焦 点。发明内容本发明基于蛋白质组学研究和基因组数据分析，克隆分析和免疫学鉴定家蚕微孢子虫 孢壁蛋白蛋白基因SWP32，通过对家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因的克隆，得到了孢壁蛋白 SWP32的编码序列，具体方法如下(1) 引物设计根据蛋白质组学的方法以及家蚕微孢子虫的6倍基因组数据，获得 孢壁蛋白SWP32编码序列，利用引物设计软件Primer 5.0进行引物设计，在正向引物加入 BamHI酶切位点，在反向引物加入XhoI酶切位点。引物序列分别为SWP32-primer-F: 5， GCGGATCCATGAAAACTTCAGTGGTTATCC 3' SWP32-primer-R: 5， CCGCTCGAGGCATTGATAAGAACAGACC 3'(2) NbSWP32基因PCR扩增由于微孢子虫基因组的高度简化特点，内含子很少， 基因组序列数据显示SWP32基因不含内含子，故利用提取的微孢子基因组直接作为模板， 采用基因组PCR扩增目的片段。SWP32基因长度为948 bp;(3) NbSWP32基因克隆NbSWP32扩增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)载体上， 然后进行序列测定，从而获得NbSWP32的全长编码序列；(4) 序列分析将家蚕微孢子虫NbSWP32与NCBI数据库所登录的蛋白质库同源比 对分析，表明NbSWP32无同源序列存在。序列分析结果见下表。ProteinSP/Lth (Aa)ESTNCBI homologueTMD Predicted N-glycosylat ion sitesPredicted phosphoryla tion sitespl/MM (阔HBM numberSWP32腦16Yesnono YesYes7.25/37.4(5)蛋白的鉴定将克隆的SWP32基因进行原核表达，制备抗血清，利用免疫学的 手段免疫印迹、间接荧光免疫实验和免疫电镜对SWP32蛋白进行鉴定。结果表明SWP32 蛋白质在家蚕微孢子虫孢壁上特异性表达，而且为孢壁蛋白。上述方法获得的NbSWP32基因编码序列及其推断的氨基酸序列如下 SWP32的序列1 atgaaaacttcagtggttatccttgcaatgeigctatattacatceiatctttgccaat組 MKTSVVILAMSYITSIFANNSYDFCDGEFAISEKDDKCGF 121 tcatttaatcc8tgtaccct3tataaacagatacaga肌gaatattcaa8ictgcgteata181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901SFNPCTLYKQIQKEYSNCVI ctcagattttaccttaaagcgattagtaacatgttagaaagtatctgtgacaacaacaaa LRFYLKAISNMLESICDNNKRCLPFSIDSLYRPLYNREOF aagcacaaacaccaccatactttgtacgctctcttcagaaattgcttatatcttgtcaacKHKHHHTLYALFRNCLYLVN ccaatttatttcaaagaataccaagatgctcttgcatgtaatcaattagatgtctgctacPIYFKEYQDALACNQLDVCY tttttaattagaagaacagtatgccctaagtatggagttacgaaatacatcgaatgtcttFLIRRTVCPKYGVTKYIECL aaaaagagatgtgaagataggtttgatgaaaaagaacttgctatctttatctgtgattcaKKRCEDRFDEKELAIFICDS gagacatttgtcaatatcaaacttgaaattgatgcttgcagaaaaatatgccccgctgatETFVNIKLEIDACRKICPAD tgtacacttgatatttgtaaaatatacagtcttgatttctgggagagaagagatttattgCTLDICKIYSLDFWERRDLL aaagcaatttttgattatcattactgccatgttttatcttctgacaatacaageigatgaaKAIFDYHYCHVLSSDNTRDE ataattaaaaagattgaagagatctatctaaatggaactgaaagagatataaaattcactIIKKIEEIYLNGTERDIKFT tcattcattatataccaacttttcactgatttagttgcatgcaaatcaagtgataaaaatSFIIYQLFTDLVACKSSDKNIKRILDLICLYEKKDKCPSG gtgatggttatgattgaattcttcgtaaaggtctgttcttatcaatgctaa VMVMIEFFVKVCSYQC本本发明的优点是(1) 微孢子虫孢壁蛋白在孢子与宿主细胞相互粘附的过程中起着起要的作用，抑制 了孢子与宿主细胞之间的粘附能有效控制微孢子虫的感染。孢壁蛋白SWP32基因具有与宿 主细胞结合的潜在基序。(2) 序列分析结果显示孢壁蛋白SWP32基因均是家蚕微孢子虫物种所特有的基因， 实验证明针对SWP32蛋白的抗体与其他蛋白无交叉反应，可以用于家蚕微孢子虫的免疫 学检测，为蚕业生产上微粒子病检测手段带来革命性的改变。
具体实施方式
-实施例根据蛋白质组学的方法以及家蚕微孢子虫的6倍基因组数据，通过基因组数据库以及一系列的克隆与亚克隆，获得了家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP32基因编码序列，利用引物设计软件Primer 5.0进行引物设计，在正向引物加入BamH I酶切位点，在反向引物加入 Xhol酶切位点，分别设计如下引物SWP32-primer-F: 5' GCGGATCCATGAAAACTTCAGTGGTTATCC 3, SWP32-primer-R: 5， CCGCTCGAGGCATTGATAAGAACAGACC 3' 从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增SWP32基因编码序列，扩增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)载体上，然后进行序列测定，从而获得SWP32基因的全长编码序列。将SWP32 基因不含信号肽的序列克隆到原核表达载体pGEX-4Tl上进行诱导表达，纯化表达产物； 将纯化的表达产物作为抗原免疫小鼠制备抗血清；利用免疫学的手段免疫印迹、间接荧光 免疫实验和免疫电镜对SWP32蛋白或家蚕微孢子虫进行鉴定、诊断。
权利要求
1、家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP32基因，其特征在于其序列如下ATGAAAACTT CAGTGGTTAT CCTTGCAATG AGCTATATTA CATCAATCTT TGCCAATAAT60TCTTATGATT TCTGTGACGG AGAATTTGCT ATAAGTGAGA AAGATGATAA ATGTGGTTTC120TCATTTAATC CATGTACCCT ATATAAACAG ATACAGAAAG AATATTCAAA CTGCGTAATA180CTCAGATTTT ACCTTAAAGC GATTAGTAAC ATGTTAGAAA GTATCTGTGA CAACAACAAA240AGATGTTTAC CATTTTCTAT TGACTCCTTA TATCGTCCAC TTTACAACCG TGAACAATTT300AAGCACAAAC ACCACCATAC TTTGTACGCT CTCTTCAGAA ATTGCTTATA TCTTGTCAAC360CCAATTTATT TCAAAGAATA CCAAGATGCT CTTGCATGTA ATCAATTAGA TGTCTGCTAC420TTTTTAATTA GAAGAACAGT ATGCCCTAAG TATGGAGTTA CGAAATACAT CGAATGTCTT480AAAAAGAGAT GTGAAGATAG GTTTGATGAA AAAGAACTTG CTATCTTTAT CTGTGATTCA540GAGACATTTG TCAATATCAA ACTTGAAATT GATGCTTGCA GAAAAATATG CCCCGCTGAT600TGTACACTTG ATATTTGTAA AATATACAGT CTTGATTTCT GGGAGAGAAG AGATTTATTG660AAAGCAATTT TTGATTATCA TTACTGCCAT GTTTTATCTT CTGACAATAC AAGAGATGAA720ATAATTAAAA AGATTGAAGA GATCTATCTA AATGGAACTG AAAGAGATAT AAAATTCACT780TCATTCATTA TATACCAACT TTTCACTGAT TTAGTTGCAT GCAAATCAAG TGATAAAAAT840ATTAAAAGAA TCTTGGACTT GATTTGTCTT TACGAGAAAA AGGATAAATG TCCTTCTGGT900GTGATGGTTA TGATTGAATT CTTCGTAAAG GTCTGTTCTT ATCAATGCTA A 951。
2、家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP32基因编码的蛋白质，其特征在于其序列如下:MKTSVVILAMSYITSIFANNSYDFCDGEFAISEKDDKCGFSFNPCT国IQKEYSNCVI60LRFYLKAISNMLESIC酬KRCLPFSIDSLYRPLYN卿FK服HHHTLYALFRNCLYLVN120PIYFKEYQDALA国LDVCYFLIRRTVCPKYGVTKYIECLKKRCEDRFDEKELAIFICDS180ETFVNIKLEID織KICPADCTLDICKIYSL訓E,LLKAIFDYHYCHVLSSDNTRDE240I腦EEIYLNGTERDIKFTSFIIYQLFTDLVACKSSDKNIKRILDLICLYEKKDKCPSG300VMVMIEFFVKVCSYQC3160
全文摘要
一种家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP32，依据蛋白质组学的方法和家蚕微孢子虫的6倍基因组数据，经过克隆与亚克隆得到编码家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP32编码序列，并经一系列生物技术克隆以及免疫学手段证实。本发明所获得的家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP32基因为家蚕微孢子虫物种所特有，免疫学实验表明针对NbSWP32蛋白的抗体与其他蛋白无交叉反应。该基因可用于家蚕微孢子虫病的分子生物学、免疫学检测，为蚕业生产上微粒子病的检测带来革命性的改变。
文档编号C07K14/435GK101250538SQ20081006941
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月3日 优先权日2008年3月3日
发明者向仲怀, 周泽扬, 夏庆友, 潘国庆 申请人:重庆拓桑生物科技有限公司