附睾蛋白酶抑制蛋白b细胞表位及包含此表位的抗原肽的制作方法

文档序号:3572344阅读:136来源:国知局
专利名称:附睾蛋白酶抑制蛋白b细胞表位及包含此表位的抗原肽的制作方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位及包 含此表位的抗原肽。
背景技术
计划生育是我国的基本国策,为有效地控制人口过度增长,开发高效、安 全、可逆的避孕方法一直是计划生育研究的重要课题。目前,男性避孕还局限 于传统的使用避孕套或输精管结扎手术,前者失败率较高,后者具有不可逆性, 且可能产生意料不到的严重免疫学后果,如持续高水平的抗精子抗体滴度和/或 睾丸形态学的改变等,二者均不能令人满意。多年来,国内外科学家一直致力 于男性避孕疫苗的研制,主要是以生殖相关激素和精子特异性蛋白为靶抗原, 如精子膜抗原PH-20、受精抗原FA-1、顶体抗原SP-IO、受精素P等,已研制出 的多价疫苗可明显抑制动物的精卵结合与融合,但避孕率仍停留在50%左右。
附睾是精子获能和成熟的场所,附睾蛋白酶抑制蛋白(epididymal protease inhibitor, E卯in )作为一种附睾特异表达的分泌蛋白,在保持精子活性以及 精卵结合过程中均发挥重要作用。最新研究表明,用重组Eppin免疫的雄性猕猴 出现可逆性的不育(避孕率7/9,可逆率5/7),精液分析发现精子的前向运动能 力减弱,而精子的数量及体内雄激素水平不受影响,亦未见自身免疫性疾病的 发生,表明Eppin可作为潜在的有效的男性避孕疫苗。生育研究结果提示,抗 E卯in抗体可能结合于精子表面,潜在地破坏了精子在男性生殖道内和射精后精 子最初储存在女性阴道内的生存微环境,影响了精子的获能,干扰了精子受孕 前的一些基本步骤,造成免疫性不育。
蛋白质抗原通过表位体现其免疫特异性。就某一蛋白质抗原而言,它不仅
含有B细胞表位、T辅助细胞(Th)表位、细胞毒性T细胞(CTL)表位、自然 杀伤细胞(NK)表位、主要组织相容性复合物(MHC)限制位等与免疫识别密切 相关的结构,同时还含有毒性表位、抑制性表位、交叉反应性表位等不良表位, 这些不良表位可引起免疫偏移、免疫颠覆等不利的免疫反应而导致免疫耐受。 因此,为了提高蛋白质抗原的保护性,须在表位水平上做出选择,摒除后者, 保留或改善前者以得到更理想的疫苗分子。

发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供Eppin的B细胞表位,具有SEQ ID No. 1所示氨基酸序列。
本发明的目的之二在于提供包含所述E卯in的B细胞表位的抗原肽,由T 辅助细胞表位与E卯in的B细胞表位串联而成;所述T细胞表位具有SEQ ID No. 2 所示氨基酸序列。
进一步,T辅助细胞表位通过柔性接头与E卯in的B细胞表位串联; 进一步,所述柔性接头选自由GGG、 GGS或KK组成的短肽。 本发明的目的之三在于提供包含免疫学有效量的所述包含Eppin的B细胞表 位的抗原肽的组合物。
进一步,还包含药学上可接受的载体;
进一步,所述免疫学有效量为每剂每千克体重2-5毫克。
本发明的目的之四在于提供能够与所述Eppin的B细胞表位特异性结合的抗

本发明的目的之五在于提供能够与所述包含Eppin的B细胞表位的抗原肽特 异性结合的抗体。
本发明的目的之六在于提供所述包含Eppin的B细胞表位的抗原肽在制备男 性避孕疫苗中的应用。
本发明的有益效果在于本发明公开了Eppin的优势B细胞表位,具有SEQ ID No.l所示氨基酸序列,其成分单一、结构简单、摆脱了天然蛋白抗原中不良表
位的影响,引发的免疫反应针对性强;本发明还公开了包含此优势B细胞表位的 抗原肽,由麻渗病毒融合蛋白的T辅助细胞表位与此优势B细胞表位串联而成; 此抗原肽中的T辅助细胞表位能刺激机体产生CD4十T细胞,从而辅助B细胞活化, 使其分泌高滴度的特异地靶向所述优势B细胞表位的抗体,诱导高效、安全、可 逆的抗生育作用,可用于制备男性避孕疫苗,为男性避孕的临床主动免疫治疗 提供新的手段,具有重要的理论价值和广阔的应用前景,能够产生重大的社会 效益和经济效益。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发 明作进一步的详细描述,其中
图1为本发明抗原肽的HPLC鉴定图; 图2为本发明抗原肽的MS鉴定图3为本发明抗原肽免疫雄鼠血清中特异性抗体生成情况; 图4为本发明抗原肽免疫雄鼠血清与人精子蛋白提取液的ELISA反应结果; 图5为本发明抗原肽首次免疫雄鼠后第5周雌雄小鼠合笼实验中雌鼠的产 仔情况;
图6为本发明抗原肽首次免疫雄鼠后第26周雌雄小鼠合笼实验中雌鼠的产 仔情况。
具体实施例方式
发明人采用生物信息学方法,以单参数(亲水性、可及性、柔韧性及抗原 性)预测为基础,结合二级结构预测,从385个候选表位中筛选出多个Eppin的 优势B细胞表位,并以其中一个优势B细胞表位(SEQ ID No. 1)为基础,引入一 个T辅助细胞表位,构建了抗原肽。
B细胞表位成份单一,结构简单,摆脱了抗原蛋白中不良表位的影响,引发
的免疫反应针对性强,但当B细胞表位是自身抗原时,其存在免疫原性低的缺陷。 以往多是用B细胞表位交联外来载体蛋白(以提供和B细胞表位连接的新T辅助细 胞表位)的方法来刺激T辅助细胞,以提高其免疫原性。但是, 一些问题伴随着 载体蛋白的使用而产生,即(1) B细胞表位与载体蛋白的化学偶联可能会造 成目的决定簇的改变并且随机的反应会导致制品在大小和组成方面不均一;(2) 载体蛋白也许会导致不想要的免疫反应;(3 ) B细胞表位-载体蛋白缀合物可能 会激发不相关的免疫反应,错误地针对载体蛋白而非B细胞表位。为了避免这些 问题,T辅助细胞表位被用于替换载体蛋白来引发T辅助细胞反应。T辅助细胞表 位可以与B细胞表位串联形成抗原肽。在本发明中,T辅助细胞表位选择麻渗病 毒融合蛋白第288-302位氨基酸序列(SEQ ID No. 2 ),此T辅助细胞表位能刺激 机体产生CD4 + T细胞,从而辅助B细胞活化,使其分泌特异于Eppin的B细胞表位 的抗体。
在本发明中,T辅助细胞表位与B细胞表位串联形成抗原肽,可以是T辅助 细胞表位的羧基(C-)端与B细胞表位的氨基(N-)端连接;也可以是T辅助 细胞表位的N-端与B细胞表位的C-端连接。本领域技术人员应该理解,连接顺 序通常不会改变该氨基酸序列的抗原特异性。T辅助细胞表位与B细胞表位之间 通过柔性接头连接,柔性接头通常选自由GGG、 GGS或KK组成的短肽。柔性接 头在物理上将T辅助细胞表位与B细胞表位分隔开来,使得B细胞表位与B细 胞受体、T辅助细胞表位与T细胞受体可以更好地实现结合,不受空间位阻的影 响;柔性接头还可以打断由T辅助细胞表位和B细胞表位串联形成的人为二级 结构,并由此消除对T辅助细胞或B细胞反应可能照成的干扰;此外,柔性接 头还利于使抗原肽经蛋白酶降解后形成两个完整表位,即T辅助细胞表位和B 细胞表位。
本发明还涉及包含免疫学有效量的所述抗原肽的组合物。本发明抗原肽的 免疫学有效量通常为每剂每千克体重2-5毫克,这一剂量可以分成多次施用;但 正如免疫和治疗领域所熟知的,给药剂量可以根据患者的年龄、健康状况和个
体反应等进一步调整;安全有效量的抗原肽可以和药学上可接受的载体如弗氏 完全佐剂、弗氏不完全佐剂等制成疫苗等药物形式;本领域普通技术人员可以 4艮容易地确定药物剂型,包括速释或/和緩释制剂;所得药物制剂可以通过任何 一种便利的途径施用,包括皮下的、口服的、肌内的、腹膜内的,或其他肠胃 外的或肠道的途径。
以下将参照附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例一
本实施例抗原肽由T辅助细胞表位的C-端与E卯in的B细胞表位的N-端通 过柔性接头-GGG-连接而成,其^&酸序列为LSEIKGVIV服LEGVGGGCQGNNNNFQSKA N。
本实施例抗原肽的合成在固相多肽合成仪(ABI 431A型)上完成。采用标 准药曱氧羰基(Fmoc)方案,起始选用0. 0125mmo1的聚苯乙稀(polystyrene, PS)树脂(美国ABI公司),按照设计的氨基酸序列使肽链从C-端逐个向N-端 延伸;各种Fmoc氨基酸用量为0. l隱ol;每步缩合前用1-羟基苯并三唑(H0Bt) /N,N'-二环己基碳二亚胺(Dec)活化Fmoc氨基酸的羧基,缩合后用含有体积 百分浓度为20 %的六氬吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP )溶液去除Fmoc保护基; 肽链合成后,将含树脂的肽链加至处于水浴条件下的裂解液[由结晶苯盼0. 75g、 酒石酸乙二胺(EDT)O. 25mL、苯石危基曱烷(Thionaisole)0. 5mL、去离子水0. 5mL、 三氟乙酸10mL组成]中,于室温、搅拌条件下反应4. 5小时,将肽链从树脂上 裂解下来,同时去除多种保护基团;将反应后的混合液经玻璃滤器过滤以滤掉 树脂及保护基团,并用三氟乙酸洗涤滤渣、反应瓶和滤器,滤液于常温下低压 蒸发至1-2mL,加乙醚50mL使多肽沉淀后,再经玻璃滤器过滤,收集沉淀,冷 冻干燥,即得抗原肽。所得抗原肽通过高效液相色语(HPLC)法和质谱(MS) 法进行鉴定,HPLC鉴定图如图1所示,所得抗原肽的纯度为85%; MS鉴定图如 图2所示,证实所得抗原肽为目标多肽。实施例二
本实施例抗原肽由Eppin的B细胞表位的C-端与T辅助细胞表位的N-端通 过柔性接头-GGS-连接而成,其M酸序列为CQGNNNNFQSKANGGSLSEIKGVIVHRLEGV。
本实施例抗原肽的合成在固相多肽合成仪(ABI 431A型)上完成。采用标 准Fmoc方案,合成方法与实施例一所述方法相同。
实施例三
本实施例抗原肽由T辅助细胞表位的C-端与Eppin的B细胞表位的N-端通 过柔性接头-KK-连接而成,其M酸序列为LSEIKGVIVHRLEGVKKCQGNNNNFQSKAN。
本实施例抗原肽的合成在固相多肽合成仪(ABI 431A型)上完成。采用标 准Fmoc方案,合成方法与实施例一所述方法相同。
本发明抗原肽的鉴定
方法(1 )实验动物分组将40只体重为18-20 g的清洁级6-8周龄雄性Balb/c 小鼠(北京军事医学科学院实验动物中心提供)随机分成4组实验组(本发明 抗原肽)、PBS对照组(以磷酸盐緩冲液PBS替代抗原肽)、无关肽对照组(以 氨基酸序列为LSEIKGVIVHRLEGVGGG的多肽替代抗原肽)和空白对照组(以超纯 水替代抗原肽),每组10只;
(2) 免疫方案首次免疫,将纯化的原核表达的重组Eppin蛋白与弗氏完 全佐剂等体积混合,充分乳化,制得免疫原,于小鼠腹股沟皮下组织部位注射, 每只50-80吗;间隔1周,加强免疫,将本发明抗原肽与弗氏不完全佐剂等体积 混合,充分乳化,制得免疫原,于小鼠腹股沟皮下组织部位注射,每只50 fig; 再间隔2周,以同样方法重复加强免疫l次;
(3) 免疫原性检测一首次免疫前后,每间隔一定时间,行小鼠尾静脉采 血,分离血清,置温度-2(TC保存,待测;采用间接酶联免疫吸附(ELISA)法
测定免疫雄鼠血清中特异性抗体的滴度将抗原肽用包浮皮稀释液(即浓度为O. 05 mol/L、 pH值为9. 6的碳酸钠-碳酸氢钠緩沖液)稀释,制成浓度为IO )tig/mL的包 被液;将包被液加至96孔反应板中,每孔IOO ^L,置温度37。C包被4小时,弃去 包被液,以洗涤液(在IOOO mL PBS中力口入O. 5 mL Tween-20和0. 1 g硫柳汞, 调节pH值至7.4,即得)洗涤3次,再加入用PBS稀释至体积百分浓度为5y。的小牛 血清(Hyclone公司)封闭液,每孔IOO pL,置温度37。C封闭^分钟,弃去封闭 液,以洗涤液洗涤3次,再加入按10倍连续稀释的免疫后小鼠血清,每孔100^L, 置温度37。C孵育1小时,以洗涤液洗涤3次,再加入辣才艮过氧化物酶(服P)标记 的羊抗小鼠IgG (稀释度为l : 5000, Nordic公司),每孔IOO jiL,置温度37。C 孵育40分钟,以洗涤液洗涤3次,加入邻苯二胺-过氧4匕氢(OPD-H202 )底物液, 每孔IOO ^L,置温度37。C避光显色40分钟,终止反应,测量492 nm波长处的光 密度(OD),以正常小鼠血清作阴性对照,结果以双复孔OD值均值表示,待测 孔0D值大于或等于阴性对照2. l倍者判为阳性,以判为阳性的最高稀释倍数为抗 体滴度。
(4)免疫原性检测二首次免疫后第5周,小鼠尾静脉采血,分离血清, 置温度-2(TC保存,待测;取健康男性新鲜精液,用Pereoll单层法去除圓细胞 和精浆,再用PBS洗涤2次后,参照文献方法(黄宇峰,许瑞吉.男性诊断学.上 海第二军医大学出版社,1999.),用裂解液(含有浓度为O. 5mol/L的Tris-HCl、 浓度为O. 28 mol/L的2-巯基乙醇、浓度为5 mol/L的盐酸胍)裂解精子,提取的 蛋白质用三氯乙酸/丙酮法沉淀后冷冻干燥,再以裂解緩沖液(含有浓度为8 mol/L的尿素,质量百分浓度为4。/。的CHAPS,浓度为40 nmol/L的Tris)溶解,即 得人精子蛋白提取液,测定总蛋白质浓度,置温度-2(TC保存,待用;采用间接 ELISA法检测免疫后雄鼠血清与人精子蛋白提取液的反应情况,具体步骤参照 "(3)免疫原性检测一,,所述方法以人精子蛋白提取液为包^皮抗原,以免疫 后雄鼠血清为一抗,以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗;同时设阳性对照组I [以 抗Eppin多克隆抗体(Santa Cruz乂^司)为一抗]、阳性对照组II (以纯化的重
组Eppin蛋白免疫雄鼠血清为一抗)和阴性对照组(以PBS为一抗);测量492認 波长处的OD值,结果以双复孔OD值均值表示,待测孔OD值大于或等于阴性对照 2. l倍者判为阳性。
(5)抗生育能力检测首次免疫后第5周,按雌雄比例l : 2行雌雄小鼠合 笼实验,记录雌鼠产仔情况;首次免疫后第26周,再次按雌雄比例l : 2行雌雄 小鼠合笼实验,记录雌鼠产仔情况。
结果(1 )免疫雄性Balb/c小鼠血清中特异性抗体生成情况如图3所示, 首次免疫后第l周,实验组雄鼠血清中即有特异性抗体产生,之后抗体滴度逐渐 升高,于首次免疫后第5周达到最高值(40万),抗体滴度可一直维持在此水平 至首次免疫后第20周,之后抗体滴度逐渐下降,于首次免疫后第26周降至5000 以下;PBS对照组、无关肽对照组和空白对照组小鼠血清中无特异性抗体产生。
(2 )免疫雄鼠血清与人精子蛋白提取液的ELISA反应结果如图4所示,实 验组反应结果呈阳性,显示采用本发明抗原肽免疫的雄性小鼠血清中含有特异 性抗体,可以与人精液中的抗原蛋白E卯in结合。
(3)在首次免疫后第5周进行的雌雄小鼠合笼实验中,雌鼠产仔情况如图5 所示,实验组免疫雄鼠的生殖力受到抑制,雌鼠产仔率与PBS对照组、无关肽对 照组和空白对照组比较,均有显著性差异(P<0. 05);
首次免疫后第26周,测得实验组免疫雄鼠血清中的特异性抗体滴度低于 5000,此时雌雄小鼠合笼实验中雌鼠产仔情况如图6所示,实验组免疫雄鼠的生 殖力得到恢复,雌鼠产仔率与PBS对照组、无关肽对照组和空白对照组比较,均 无显著性差异(P〉Q. 05)。
结论本发明抗原肽可以诱导高滴度的特异地靶向Eppin优势B细胞表位的 抗体,并产生高效、安全、可逆的抗生育作用,可用于制备男性避孕疫苗。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管 通过参照本发明的某些优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通 技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏
离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围
<110〉中国人民解;^文军第三军医大学
<120〉 附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位及包含此表位的抗原肽
<160> 2
<210> 1
<211〉 13
<212> PRT
<213〉 智人(H画n )
<400> 1
Cys Gin Gly Asn Asn Asn Asn Phe Gin Ser Lys Ala Asn 1 5 10
<210> 2 <211> 15 <212〉 PRT
<213> 麻渗病毒(morbillivirus ) <400〉 2
Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Arg Leu Glu Gly Val 15 10 1权利要求
1、附睾蛋白酶抑制蛋白的B细胞表位,具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列。
2、 包含权利要求l所述的附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位的抗原肽,其特 征在于由T辅助细胞表位与附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位串联而成;所述T 细胞表位具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列。
3、 根据权利要求2所述的包含附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位的抗原肽, 其特征在于T辅助细胞表位通过柔性接头与附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位串 联。
4、 根据权利要求3所述的包含附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位的抗原肽,其 特征在于所述柔性接头选自由GGG、 GGS或KK组成的短肽。
5、 包含免疫学有效量的权利要求2所述的包含附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表 位的抗原肽的组合物。
6、 根据权利要求5所述的组合物,其特征在于还包含药学上可接受的载体。
7、 根据权利要求5所述的组合物,其特征在于所述免疫学有效量为每剂 每千克体重2-5毫克。
8、 能够与权利要求1所述的附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位特异性结合的抗体。
9、 能够与权利要求2所述的包含附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位的抗原肽特 异性结合的抗体。
10、 权利要求2所述的包含附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位的抗原肽在制备 男性避孕疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位及包含此表位的抗原肽;本发明的附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位,具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列,其成分单一、结构简单、摆脱了天然蛋白抗原中不良表位的影响,引发的免疫反应针对性强;本发明的包含附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位的抗原肽,由T辅助细胞表位与附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位串联而成,T细胞表位具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列;此抗原肽可以诱导高滴度的特异地靶向附睾蛋白酶抑制蛋白B细胞表位的抗体,并产生高效、安全、可逆的抗生育作用,可用于制备男性避孕疫苗,具有重要的理论价值和广阔的应用前景,能够产生重大的社会效益和经济效益。
文档编号C07K16/38GK101362795SQ20081007028
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月11日 优先权日2008年9月11日
发明者畏 何, 吴玉章, 李晋涛, 梁志清, 萍 阎, 陈正琼 申请人:中国人民解放军第三军医大学
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1