专利名称：连续式高处理量筛选的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用了至少一种多孔基质的连续式高处理量筛选方法 (Continuous format high throughput screening, CF-HTS ), 该方法使 得制药工业能够同时对大量生物学或生化活性分布广泛的化学实体进
行筛选。此外，CF-HTS也可用于进行多步骤的检测实验。
背景技术：
生物学和生物化学检测实验的设计是为了对各种各样系统的活性进
行测试，其中包括从蛋白-蛋白相互作用、Sl^化、小分子-蛋白结合
到细胞功能。在"高处理量篩选方法"(HTS)中应用了这些检测实验测 试大量化学实体以探索这些化学实体先前未知的生物学或生物化学功能
一步(homogenous)和多步(heterogeneous)检测实验 所有不同种类的生物学检测实验都可归成两个大类 一步检测实验
和多步检测实验。在一步检测实验中，同时加入所有的试剂，并测量或 解释结果而无需另外的操作。例如，在皮氏培养亚中培养的细胞可用化 学物质处理。如果化学物质对细胞是毒性的可通过简单地观察变清澈的 区域而判断毒性。另一个例子是可以使用表达蛋白的细胞，所有表达蛋 白能改变该细胞的颜色。生长于含X-gal琼脂上的表达p-半乳糖苷酶 (P-gal)的细胞这个例子中，根据P-gal蛋白表达量的不同细胞会不 同程度地变蓝。因此对于任何影响报告基因，如p-半乳糖苷酶基因表达 的生物学过程，可设计一个一步检测实验。 一步检测实验的另一例子是 利用一种在酶的作用下改变颜色或焚光的底物。最后，如Amersham的 邻近闪烁检测(Scintillation Proximity Assays, SPA )，这样的技术能直接 测量放射性标记的配基与固定到含闪烁剂小珠上的蛋白或任何配基结合物质的结合。以上所有的例子都是一步检测实验的例子，因为它们除了 在最后的探测、测量或读取信号之前加入试剂外不需要任何另外的步骤
另一方面，多步检测实验需要至少两个不能合并成一步的步骤，因 为这些步骤不同程度上固有地不相容。例如，许多多步检测实验要求按 一定的顺序加入试剂(例如一些试剂将影响前面的步骤，但对于完成后 面的步骤又是必须的)。这种情况的常见例子包括需要加入信号显示试剂 以间接地报告反应产物的存在或浓度的检测实验。在多步检测实验中另 一常见的步骤是洗涤步骤。在检测实验前期步骤中通常需要加入过量检 测试剂，但在随后的步骤中需要洗去以便随后进行的实验不会出现过高 的背景信号。例如，在放射性配基结合实验中，首先将标记的配基与结 合到固相表面上的蛋白温育，但这些配基中只有一小部分真正结合有限 的蛋白位点。温育后，在能准确测量结合的放射性配基之前，必须将过 量的未结合配基洗去。洗涤可通过多种供选的方法完成，包括过滤、重 复洗涤/倒干、沉淀/分相和/或离心。
许多生物学和生物化学过程只能通过多步检测方法测量。进而，尽
管存在通过调整其他生物学或生物^:学过程使之适合一步法的途径，但 使用多步法可使这些其他过程更有效地发挥作用，或可以使用更容易得 到的试剂进行操作。给出的多种一步检测技术的方法和试剂盒如SPA
(Amersham)，荧光极化(Jolley公司和其它公司)和时间分辨荧光技 术(Packard公司和其它公司)中只有少数是可由商业途径获得。而且， 使用这些方法总是需要更多的费用和时间。对于多数检测而言，多步法 可以更好地建立，并且更易于快速显示结果。因此，多步法，如ELISA、 过滤结合、RIA、荧光素酶细胞检测实验等等的应用仍然很广泛。下文将 就这些方法中的一些做法更为详细地描述。 高处理量筛选(HTS)
多年以来，制药工业越来越依赖于筛选化合物库的HTS以发现候选 药物。HTS是指一种平行测试许多离散化合物以便同时或几乎同时筛选 大量测试化合物的生物学活性。目前，使用最广泛的方法采用了 96孔微 量滴定板。在这种方式中，在一块含96个反应孔的8cmxl2cm的塑料板 上同时进行96个独立的测试。这些孔要求的检测容量通常为50-500nl 。对于许多一步和多步检测实验而言，除了板外，还可从商业途径获得多种与这种96孔板方法配套的仪器、材料、移液器、机器人、洗板机、 和读板仪等等。
迄今为止，改进HTS的努力集中于使孔更小(小型化)。因为如果 减小孔的大小就可以增加每块板上孔的数量，从而提供更多的平行测试 。进而，通过减小检测实验的体积可以减小每次测试的试剂费用。进而， 因为可以更小的体积进行更多的平4亍测试，从而可以同时测试更多化合 物以发现候选药物。目前为止，通过提供384孔(96x4)的方式稍稍改 进了 96孔才支术，参见Comley et al" J. Biomol. Screening, vol.2(3)，
pp.ni-78(1997)。事实上，密度更大的方式已有报道，包括moo孔的方 式。但是，小型化必然会带来费用和复杂性的问题，
这些费用和复杂性问题与使筛选方式小型化的三个主要部分直接相
关。首先，必须能使测试容器(管、孑L、凹窝等等)小型化。其次，必
须能将所有必需的测试试剂精确地分加到更多且更小的孔中(通常通过 液体处理机器人加入到多个孔中而完成)。第三，必须能从高密度的排列 "读取"测试结果。
就平行独立检测实验的要求而言，各种部分都挑战或限制着多大程 度上小型化是可行的，或在费用上是有效的.例如， 一种新的更小型的 方式可能需要完全不同的分加试剂的方法，或需要分辨率、灵敏度、和 工程技术上与新的小型化方式相容的读数仪器。如果减小了每个孔的大 小，那么制造容器阵列、分加更小量试剂和每个测试样品的读数变得更 困难，更消耗时间并更昂贵。并且，由于分加更小体积的试剂和测量更 弱的样品信号时固有的不准确性，更小的样品量也将增加样品与样品之 间的统计可变性。进而，当样品量减小到一定水平以下时，诸如蒸发和 表面张力这样的因素甚至给实施新的小型化方式增加了更高的费用和更 大的复杂性，
对于HTS技术在量上的进步，制药工业急切需要"自由式检测实验 "或在样品之间无物理隔离的可能。这种技术通常被想象为在没有任何 孔的情况下测试小液滴，但真正用常规的离散化合物汇集进行自由式的 HTS检测还未见报道。
组合文库的筛选—胶渗入方法
随着组合化学的到来，可以在固相支持物(通常为小珠)上迅速生 产以百万计的化学实体。尽管96孔方式正被用于筛选基于小珠的文库，但是这种方式通常被认为效率不高，因为(1)每个小珠只带有小量的化
学实体；(2)待测试的化合物数量极其大；(3)将小珠加入96孔微孔板 的操作很困难。
为了避免用96孔方式筛选组合文库时固有的问题，有些人报道了可 被称为"自由式"的简单一步检测法的应用。举个例子，Jayawickreme et al在Proc. Nat，l Acad. Sci. (USA), vol.191, pp.1614-18 (March,1994)中报 道了在组合肽库的一个简单一步检测中使用了色素细胞(黑色素细胞)。 根据作者，他们将细胞放在有盖培养亚中的琼脂下，然后将带有组合化 合物的小珠放在琼脂的表面上，让化合物从小珠上部分释放到琼脂中。 活性物质表现为黑色区域，因为当化合物局部扩散到凝胶介质中时，该 活性物质^t细胞改变颜色。
另 一个最近的例子是Daniel Chelsky在Philad印hia， PA的生物分子 筛选协会第一届年会(First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening ) (1995年11月7 - 10日)上报道的"组合文库 筛选策略传统方法和新方法"。Chelsky在琼脂凝胶中放置了一种检测 羰基脱水酶的简单一步检测法，使得凝胶中的这种酶能使整个凝胶变色 。随后，加入通过光敏连接而带有组合化合物的小珠加入到凝胶中，并 通过紫外线部分释放化合物.抑制酶活性的化合物表现为颜色改变较少 的局部抑制区。最后在Molecular Diversity v 2， pp 57-64 (1996)中Salmon 等人报道了 一种类似Jayawickreme等人的方法，其中组合化合物文库是 用于筛选对生长在琼脂上的癌细胞具有细胞毒效应的化合物。
所有的三个例子都是抗细菌或抗癌物质的久经试验的凝胶检测的变 体，它们还与熟悉的在凝胶中测量抗原/抗体反应的免疫学检测实验类似 。尽管这些凝胶渗入检测实验非常适合篩选基于小珠的组合文库，还没 有人报道将这种方式扩展到多步检测实验或不基于小珠的文库。常识阻 碍研究者以连续的方式测试样品，因为这种方式会使样品混合。在报道 的有限种检测实验和对以连续方式检测时多种样品会混合在一起的关注 中，只有基于小珠的文库检测测试。由于这些限制，研究者相信96孔方 式更适于多步的和不基于小珠的文库篩选。在自由方式装置中进行多步 检测将是合乎需要的。进而，在自由方式设置中测试离散化合物将是合 乎需要的。发明概述
在此描述的发明，连续式高处理量筛选(CF-H)，成功地补充了任 何能在96孔方式中完成的一步或多步检测实验的自由方式的概念。此夕卜， CF-HTS还可用于通过多步检测，而不仅仅是一步检测，筛选组合文库 。进而，CF-HTS能检测离散复合物并能同时避免小型化带来的费用和 复杂性问题。化学试剂和测试结果在后续的步骤中可能混在一起的担心 被证明是没有根据的。
本发明的一个实施例涉及通过以下方法测试样品的生物学或生物化 学活性
a) .将多种待测样品引入到多孔检测基质中，多孔检测基质可供选地 含有一种或多种检测组分；
b) 用至少一种基质引入一种或多种检测组分进行检测，其中该基质可 以是也可以不是多孔检测基质；以及
c) 进行以下步骤
i ).洗涤检测中使用的任一基质以除去过量的待测样品、检测组分或 其组合。
ii).将检测中使用的任一基质与溶于溶液中或液体形式的另 一种试剂 接触。
另 一实施例涉及通过将多种待测样品引入到多孔检测基质中，多孔 检测基质可供选地含有一种或多种检测组分，测试样品的生物学或生物 化学活性，并使用至少两种另外的基质进行检测实验。
而另 一实施例涉及将96种以上的待测样品引入到多孔检测基质中， 多孔检测基质可供选地含有一种或多种检测组分；同时测试96种以上待 测样品的生物学或生物化学活性。
附图简述
图1示明在非多孔基质上的gELISA待测样品与含检测试剂的多孔胶 基质的一侧接触，该检测试剂再顺次与含另一种检测试剂的非多孔基质 接触。
图2示明除去gELISA测试样品基质和多孔Ji^质，然后通过洗涤和 加入液体或溶液形态的试剂以在非多孔基质上形成受体复合物。
图3示明通过将受体复合物基质与含受体底物的多孔胶基质接触而显现gELISA的结果。图4示明配基基质是怎样被施加到滤器上的与带有细胞一面相对的 那一面上。图5示明当显现检测结果时，带细胞的滤器表面可能产生的现象。 图6显示使用不同浓度的已知剂量依赖性抑制剂检测VanA时的结果图7示明用不同浓度已知抑制剂检测EF - 3的结果。图8示明蛋白-蛋白相互作用的gELISA检测对照实验的结果。图9示明"抑制"蛋白-蛋白相亙作用的gELISA结果。图10显示放射性标记的ITAM对固定的LCK的结合具有剂量依赖性。图11将象素值对ITAM浓度作图显示出典型的受体—配基结合曲线图12示明放射性标记的IL-8的配基-细胞结合的对照实验。图13示明对IL-8配基-细胞相互作用的"抑制"。图14示明一个神经氨酸酶抑制剂的检测实验。图15示明同时检测10, 080个离散化合物对神经氨酸酶的抑制。发明详述在CF-HTS之后的中心思想是将待测样品置于一个多孔介质的环 境中。该方法包括将一种或多种检测组分放在基质如凝胶、塑料片、滤 器或易于操作的其它固体支持物之上或之中或底部。当样品被引入到多 孔基质后，它们的扩散足够緩慢从而使得可进行检测实验而不会导致待 测样品混合在一起。因此，CF-HTS是通过扩散，而不是通过不可渗透 的障碍分开样品。如果检测实验进行得太久那么测试样品和结果最终会 混合在一起。然而，如果仔细控制时间的话，CF-HTS允许同时但各自 独立地筛选高密度的化合物而不需往每个单独的孔或容器里加溶液或检 测组分。进而，通过对带有反应组分的基质的操作，甚至可以用这种方 式进行复杂的多步检测实验。通过对基质的操作进行多步检测实验是完 全没有先例的，它使得CF-HTS在广泛的生物学和生物化学过程的筛选 中与96孔方式具有同样的灵活性。进而，CF-HTS达到了小型化所预 期的长处而没有其缺点，并具有独特的优点。CF-HTS可应用多种基质和检测组分。基质包括，但不限于，由琼 脂糖、丙烯酰胺或其它凝胶状物质桑且成的凝胶、膜、滤器、塑料等等。 基质的材料组成包括，但不限于，聚苯乙烯、聚丙烯、其它塑料、纸纤 维、玻璃、玻璃纤维、硅胶、聚碳酸酯、聚酯、聚偏氯乙烯和聚乙烯。 基质可以是不渗透的固体、多孔固体如滤器、或凝胶。检测组分包括， 但不限于，大分子如核酸、蛋白、和其它合成或天然大分子；细胞，细 胞裂解液、生物抽提物、有机体和其它复杂生物实体和混合物；以及小 分子如緩冲剂、盐、抑制剂、底物、多肽、染料、核苷酸、辅助因子、 离子和溶剂。CF - HTS检测实验是指通过扩散而非通过不可渗透的障碍将多个待 测样品或化合物隔离开的检测实验。重要的组成步骤是将多个(一个以 上)待测样品引入到供选地含有一种或多种检测组分的多孔检测基质之 中或之上。含有检测组分的多孔检测介质是通过将组分添加、混合、倒 入、分配、或浸泡加入基质制备而成的.还可将检测组分偶联、覆盖、 结合、固定、连接、交联、或附接到基质中或基质的表面上而制备多孔 基质。进而，可通过在一层细胞、酶或其它固定的检测组分上形成一层 液体或溶液薄膜而制备多孔基质。多孔检测基质被用于控制组分加入的 顺序和/或持续时间，以及控制多种组分联合使用时混合和扩散的程度。CF - HTS也可使用非多孔基质。非多孔基质是通过将检测组分或待 测样品偶联、覆盖、结合、固定、连接、交联、或附接到非多孔基质的 表面上而制备的。在CF-HTS中，非多孔基质的应用在空间上固定了一 种或多种检测组分。当将检测组分引入到基质表面时，检测组分与经过非衍生化、衍生 化或其它预处理以促进检测组分结合的基质通过共价或非共价的、特异 或非特异的相互作用结合在一起。结合后，检测组分在空间上被固定从 而满足检测实验对固定化的需要。在这种情况下或者待测样品应能扩散 通过基质到达检测组分，以及/或者检测组分的亚组分或产物应能扩散通 过基质到达测试样品。至少一种含待测样品的多孔基质被用于以下步骤中的任何一步或多步。(1)使多孔基质的表面与至少一种其它(多孔或非多孔)基质接触， 使得样品和/或一种或多种检测组分能扩散通过界面。(2) 分开两种或多种基质以停止组分和/或样品的反应。(3) 使两种或多种基质的表面接触，使得检测组分能反应。(4) 用緩冲液或其它溶剂洗条、漂洗或洗脱基质以除去未结合和/ 或非特异性结合的检测组分。(5) 将溶液中的检测组分分配、倒入、加入或浸泡入基质或将上述 组分过滤通过基质。(6) 通过显象、读数、扫描、探测或其它方法，显现一种或多种基 质中的放射性测定的、荧光的、分光光度法的或电磁的信号。CF-HTS提供了许多超过先前技术的优点。由于没有明显的孔，从 而无需同时并准确地将检测组分或试剂分加入孔中.替代地，检测组分 是通过一步大量处理进行分加和混合的。由于检测组分是制备成均一大 量的溶液或基质，所以样品之间的统计学差异被减小到最小。与之相比， 96孔方式中存在的孔产生了很大的样品间差异。进而，CF-HTS提供了大量化合物的极高密度的筛选。尽管观察到 的选中样品在有限程度上"混合"在一起，但只需要对选中样品的邻近样 品进行再次测试。这样如果能将IO，OOO个测试样品减少到显现区域周围 的50个候选样品，甚至就可通过96孔技术从50种候选样品中很容易地 筛选到活性化合物。通过在塑料片上将离散化合物分配并干燥成高度密集的排列，然后 对其进行CF-HTS，就可致力于所有小型化的关键点。这种方式不需要 对塑料和其他材料做任何改进就可实现小型化，因为小型化是简单地通 过限制扩散到基质中的样品量而实现的。这种方式也不需要通过微量流 量控制来分加反应试剂，因为整个检测实验实质上是在"一个大孔"里 进行的，在这里试剂和溶液都是以批量的方式进行操作的。只有待测样 品需要通过微量流量控制分加.而且，这种方式存在的统计误差也小得 多，因为实验者只需要在均一的基质中寻找出不均一的固定区域。实验 者并不需要读取和比较不同的孔。除了小型化预期的所有优点外(费用、 处理量、试剂用量、待测化合物用量)外，CF-HTS还提供了惊人的长 处，如以批量的方式操作检测实验的大多数步骤。CF - HTS的一个中心特点是尽管在基质的界面检测组分和待测样品 也不会快速地侧向扩散。例如，当琼脂糖凝胶被放在塑料板上时，在凝 胶的交界表面上有大量的液体。当需要凝胶上的检测组分和板上的检测组分相互作用时(例如在ELISA的例子中)，凝胶中的组分能从凝胶扩 散到板上是很关键的。但是，CF-HTS要求伴随的侧向扩散相当慢，以 使板上的反应发生在凝胶中组分的初始位置附近。同样的原则也适用于 凝胶之间、滤器之间或任何组合形式的表面之间(或任何其它基质)的 基质-基质界面。意识到这种扩散《亍为是可控制的并通常适用于任何基 质界面是没有先例的，并与常识相反。将待测样品或化合物引入到基质中(如凝胶或润湿的滤器)的一种 优选方法是将小体积的每种样品分配到一个表面上，如塑料片的表面上， 形成排列并干燥，从而使得没有两个样品混合或重叠，并且每个处于特 定的位置。当塑料片被放到基质上时，样品溶解并扩散到基质中，其位 置与它们在初始排列中的预定位置相对应。将样品分加到排列中的一种替代方法是将样品分加到多孔基质如滤 器上形成排列，每种样品的分加体积足够小以使得样品不会在基质中重 叠。在与另一种含有更多液体的基质接触后化合物扩散并启动检测实验一种将基于小珠的组合化合物《1入基质的优选方法是将小珠随机地 分加到一个表面上，如一个塑料片的表面上，或在表面上形成有序排列 。如果待测化合物是以不稳定的连接共价吸附到小珠上的话，那么随后 小珠从中释放(切割)出待测化合物(光切割以及气-相酸切割)为本 领域所熟知。然后每种化合物非共价地结合到其来源小珠所在的区域， 然后干的化合物可被引入到基质之中或之上。一种将离散化合物引入基质的替代方法是通过浸泡或其它方法使每 种化合物非共价吸附到小珠之中或之上。利用这种方法可以使大量的化 合物在小珠中一次混合同时每个小珠具有单一的化合物。然后可;f艮容易 地将小珠分散到一个表面上以引入到基质中。这种方法完全不需对小体 积液体进行操作。在CF-HTS筛选中，引入到基质中的样品初始排列是高度密集的， 以使得特定的活性区域在空间上覆盖了 一种以上样品的初始区域，然后 这些样品中的每种都是观察到的活性的潜在来源。对于更高的初始密度 而言，每个区域将具有更多的候选样品，因为在一个特定区域内将具有 多种样品。化合物可能扩散到一起，但它们仍然具有它们自身空间上的 梯度，并且数量上不会在任何一个位置混合。因此，区域的中心将仍然与活性化合物在初始排列中的精确位置对应。实际上，被选中的样品是 很稀少的，这足以使得为确保从每个活性区域中鉴定出活性化合物而对 多个样品进行再测试的工作量是微不足道的。本发明的一个替代实施例是在检测的基质中引入物理障碍(从而严 格上说使得此方式不连续)以限制样品能扩散的距离。例如分别含有一 种酶和底物的两块凝胶可被分別切成网眼状("蛋糕切割器"，cookie-cutter),使得每块凝胶被分成离散的区域。然后仍让这两块凝胶 接触，使得酶和底物在分割后的凝胶块中扩散到一起.然后将待测样品 亏1入到分割后的凝胶块中从而使得检测实验是完全独立的，在检测与检 测之间没有扩散。由于测试样品之间引入了统计差异，并且由于固定了 体积从而限制了信号的高度密集排列，因而这个实施例明显地丧失了 CF -HTS的一些优点。但是，此实施例仍然具有基于凝胶的多步检测实验 的优点，它不需要往大量的平行反应容器里分加检测组分，并且它消除 了样品的部分混合现象。 gELISA酶联免疫吸附检测实验(ELISA)是探测溶液中的配基与固定的受体 之间相互作用的多步检测实验。ELISA需要多次的混合和洗涤步骤，这 些在96孔方式中难以进^f亍，可以想象将96孔方式变成384孔方式时困 难更大。发明者将CF - HTS方法应用于检测对配基和固定的靶受体之间 结合的抑制(gELISA)。受体是能结合另一分子的任一分子。非限制性的例子包括蛋白、肽、 核酸、碳水化合物以及以上例子的复合物。受体被固定到几种可能的基 质中的一种(受体基质)的表面上，包括但不限于具有高靶结合容量的 塑料表面(例如有盖平皿或塑料板(源自Nunc))、膜或滤器(例如硝酸 纤维素、尼龙或PVDF (Millipore， Corning Costar， Schleicher&Schue11， BioRad )或衍生的膜如SAM膜(Promega ))。多孔配基基质(如琼脂糖 凝胶或多孔膜)的制备，使得固定受体的配基可被加入到基质之中或之 上。待测化合物或样品被直接分加到配基基质上或替代地被加入到待测 样品基质(例如聚苯乙烯(Tekra )、聚偏乙烯(例如源自Dow Brands的 )或其它柔性塑料片或膜)上.在适当时间的温育之后，将配基基质与 受体基质接触，使得配基与样品通过扩散和受体接触并发生可能的反应 。(图1示明固定受体R结合生物素标记的配基LP)。在温育中，除非样品化合物抑制配基/受体的结合，配基将结合到固定的受体上。在适当时间的温育之后，将受体基质移开并用适当的緩冲液洗涤以 除去未结合的和非特异性结合的配基和样品。然后将受体基质浸泡在含 能与配基反应的检测试剂的溶液中(例如一种抗体、在生物素标记的配 基的情况下的亲和素或链霉亲和素)，从而能直接(例如通过荧光或放射性)或间接(例如辣过氧化物酶(HRP )、碱性磷酸酶(AP )或P -半乳 糖苷酶)地检测(图2显示结合到生物素标记配基上的一种亲和素-HRP 标记物，AHRP)。在适当的温育后，从溶液中移开受体配基并洗涤以除 去未结合的和非特异性结合的试剂。在直接信号探测中，基质用适当的 方法显象(例如分光光度扫描仪，CCD照相机、膜、磷光显象仪或闪烁 探测装置)。非直接信号(如HRP或AP)需要另外的反应来显现信号， 这是通过将底物或其它必需的反应《且分分加到多孔底物基质之中或之上， 并使此基质与受体基质接触而完成的。然后酶(例如HRP或AP)与底 物(图3)反应。替代地，可将可沉淀的底物引入到溶液中代替基质。通 过任何可视方法，受体/配基结合区域将产生可见的反应，而受体/配基结 合受抑制的区域将不产生可见的反应。 细胞/配基结合CF - HTS也能用于探测对配基/细胞受体结合的抑制。在传统检测实 验中，实验者在一个容器，如孔中混合待测化合物、放射性标记配基和 表达相应受体的细胞。然后提供充分的时间使受体结合配基，如果这样 的结合不被测试化合物抑制的话。任何未结合的或非特异性结合的组分 都被从细胞上除去，然后测量与细J!包结合的放射性的量.本发明者将采 用CF - HTS方法来探测对配基和受体结合的抑制。将表达所需受体的细 胞生长在或铺到基质上(细胞基质)，例如，但不限于，凝胶、滤器或膜(例如Transwell组织培养膜(Corning Costar)或化学向性膜(Neuro Probe))。制备一种多孔基质(如琼脂糖凝胶或多孔膜)使得受体的标记 配基被分配到基质之上或之中(配基基质)。待测化合物或样品被直接分 加到配基或细胞基质之上，或替代地分加到另一基质(例如聚苯乙烯(Tekra)、聚偏乙烯、或其它柔软塑料片；样品基质)之上或之中。使 样品基质与配基基质接触使得样品扩散到配基基质上。在适当时间的温 育之后，将该配基基质与细胞基质接触，优选地在无细胞的一侧接触， 并使得配基和样品通过扩散与受体接触并反应。除非样品抑制配基/细胞结合，否则在温育过程中，标记配基将结合到固定的细胞上。温育后，将细胞基质从配基基质分开，并用适当的緩冲液洗涤以除 去未结合的或非特异性结合的配基和样品。细胞用恰当的方法显象(例如分光光度扫描仪，CCD照相机、膜、磷光显象仪或闪烁探测装置)(图 5示明在一张膜上显现检测结果)。如上所述，CF - HTS能够实现"自由方式"检测实验预期的全部优点， 并能在所有不同类型的方式下，用不同的试剂和装备，应用于所有不同 类型的生物学或生物化学检测实验。由于其广泛的应用性，在以下的实 施例中得到了最好的阐明。然而，尽管这些实施例阐明了本发明的优选 实施方案，但它们并不限制权利要求或说明书。本领域的普通技术人员 很容易理解到，可以在不离开本发明的精神和范围的前提下对特定的实 施例进行变化和修改。最后，所有参考文献在此引入作为参考。实施例实施例1:用于探测由万古霉素抗性酶VanA产生的磷酸根的两步比 色法凝胶检测实验，VanA是万古霉素抗性中的关键酶，它催化D -丙氨酸和D -丙氨酸 或D-丙氨酸和D-乳酸的连接。通常这种酶是通过使活性酶释放的磷 酸根产生颜色而进行检测(VanA活性将ATP水解成ADP和磷酸根)。 科学家已知D-环丝氨酸以剂量依赖的方式抑制VanA， 并将这种抑制 剂作为其它潜在抑制剂的阳性对照.酶凝胶酶凝胶的制备是通过在45"C下往溶于50mM HEPES(N-[2-羟基乙基
哌溱-N， _ [2-乙磺酸)20 mM MgCl2， 20mM KC1， pH7.3中的熔融的1 % 琼脂糖凝胶中加入VanA至终浓度2nM。然后将这种琼脂混合物倒入到 BioRad凝胶成型装置中，使之在2 - 8°C凝固30分钟。底物凝胶底物凝胶的制备是通过往熔化的琼脂中加入ATP、 D-丙氨酸、D-乳酸使它们的浓度分别达到lmM，1.5mM和1.75mM,然后按照酶凝胶的 方法制备。样品基质一系列顺序稀释的5000， 2000， 1000， 500, 200, lOO^M的D-环丝氨酸， 一种作为对照的抑制剂，溶于l: l乙醇-水中，取linl小样分 加到一片聚偏氯乙烯(PVDC)膜上并干燥10分钟。 将酶与底物在抑制剂的存在下^^育让酶凝胶与样品基质接触5分钟。然后将底物凝胶放在酶凝胶的顶 部并温育15-20分钟。随后将两块凝胶分离开。在温育过程中，可预期 由于该酶催化底物的连接在整块凝胶中产生磷酸根，只有D-环丝氨酸 的浓度足以抑制反应的区域例外。检测结果的观察将由溶于1.33N HC1的0.15%孑L雀绿和1.4%钼铵酸组成的新鲜制备 磷酸根检测试剂倒入，并使之均一地分配到酶和底物凝胶上。这些试剂 与磷酸根反应，随着磷酸根浓度的浓度升高绿色背景加深。显色5-10 分钟(图6示明在凝胶上的显色，其中抑制剂的量为从5纳摩尔到0.5纳 摩尔)。用Stratagene Eagle Eye CCD相机对绿色的凝胶照相.如所预期 的那样，看上去不那么绿的抑制区域与加入的抑制剂的浓度相对应。因 此，通过将组合小珠或化合物分加到任何其它表面然后使之与检测凝胶 接触，这种检测实验可用于筛选VanA的抑制剂。这个检测实验还表明凝胶筛选方式可用于多步反应.此特征对于这 种方式在广泛的检测实验中的应用是必需的，因为许多检测实验需要进 行许多步骤。在这个例子中，VanA检测实验是在两步酶活性测试后进行 显色反应。此实验的一步(单一步骤)法方式是难以实行的，因为显色 的试剂和条件干扰VanA的活性，并且与在琼脂凝胶中传送不相容。因此， 在空间和温度上将这两个步骤分开，首先进行酶凝胶实验然后进行溶液 相的显色反应是合乎需要的，实施例2.用于检测由核糖体激活的哞酒糖酵母延伸因子3的ATP 酶活性产生的磷酸根的一种两步法凝胶实验当真菌延伸因子3 (EF-3)与核糖体相互作用时，磷酸酶活性被激 活。本发明的发明者将CF-HTS应用于检测这种活性。制备了一种酶凝胶，其中含有EF-3 (—种对温度高度敏感的酶) 和溶于EF-3检测緩冲液中的酵母核糖体。还制备了含有溶于检测緩冲 液的lmMATP的底物凝胶。两种凝胶都在低熔点琼脂糖(GibcoBRL) 中含有2%二甲亚砜，两种凝胶的制备都是在37°C进行并在4。C静置30 分钟。将聚_ L -赖氨酸的系列稀释液点样PVDC到膜上并干燥(样品基质)， 一种EF-3抑制剂用作对照样品，然后如在实施例1中那样进行检 测实验，首先将酶凝胶与样品基质上的抑制剂预温育，然后将酶凝胶与 底物凝胶接触20分钟。如在实施例1中那样，用孔雀绿/钼酸铵显色混合 物对酶和底物凝胶进行染色。然后用CCD相机对酶凝胶进行拍照。在绿 色背景下抑制剂点表现为较清晰的区域，图7示明抑制剂量在5皮摩尔 和200皮摩尔之间时在凝胶上的显色。结果表明抑制剂的信号是剂量依 赖性的，这意味着可以用这种检测方法筛选化合物以发现新的EF-3抑 制剂。实施例2示范了 CF-HTS在存在细胞器和其他粗制生物混合物或 抽提物的复杂体系中的应用.实施例3:蛋白-蛋白相互作用抑制剂的gELISA间接颜色检测如上文所讨论，ELISA经常用于检测对配基-受体相互作用的抑制， 其中受体是固定在微量滴定孔上的。用于ELISA中的"配基-受体对" 可包括从蛋白或其它大分子到小分子的任何结合分子对。这些检测是复 杂的，多步骤的检测，需要固定受体，将受体与配基温育，洗涤以除去 可能造成高背景信号的非特异性保留的多余配基，使结合显示试剂(例 如，与报告酶标记的对配基特异的抗体)和受体结合的配基结合并通过 提供报告酶的底物产生可见信号。显然，ELISA的复杂性使得HTS工业 得出结论，认为ELISA不能被改造成自由方式的检测实验。尽管如此，本 发明的发明者仍能将这种复杂的多步骤检测实验改造成了 CF-HTS方 式以检测许多蛋白-蛋白、蛋白-配基以及其它配基结合相互作用。尿激酶型血浆纤溶酶激活剂(uPA)与其相应受体的结合(uPAR) 。uPA/ uPAR相互作用已被用于检测各种类型的癌症转移。本发明的发 明者已将传统的uPA/ uPAR ELISA改造成了利用纯化受体和配基的CF -HTS。uPAR基质用15毫升溶于磷酸盐緩沖液(PBS ) ( Life Technologies, Grand Island: NY)的U8nM uPAR，在pH7.4和4°C的条件下包被塑料板(7.5 cm x 11.5 cm;购自Nunc. Naperville, EL)过夜。在塑料板包被过夜后，倒去uPAR 溶液，加入15ml含1 % (w/v)酪蛋白的PBS (Life Technologies, Grand Island, NY)，室温(RT)温育2小时以封闭塑料板上剩下的结合位点。 封闭后倒空封闭液，并用20ml由溶于PBS的0.05% Tween-20(聚氧化乙烯 山梨聚糖单月桂酸)组成的洗涤液洗涤5次。洗涤后塑料板在RT干燥10分钟。这一步需要控制好时间，使得塑料板随后能立刻用于下述的实验 并避免基质的过分干燥而导致失活。B- uPA基质为了检测的目的，使用的uPA用生物素进行标记(uPA )。含有p- uPA 的凝胶是通过将P- uPA浸泡入琼脂以避免高温(与实施例l和2中将其 倒入熔化的琼脂的方法相反)。制备琼脂时首先将O.lg的琼脂(Sigma， St. Louis, MO)与10ml PBS混合，加热至熔化，然后倒入到8x7x0.075cm3 的灌胶装置中(Bio-Rad， Hercules, CA )。固化后(在室温或在4。C )，将 凝胶在溶于检测緩冲液的15ml p- uPA中4°C浸泡过夜；上述检测緩冲液 由PBS、 0.05% Tween-20和0.1%的酪蛋白(两者都购自Sigma, St. Louis, MO )组成。在使用前将凝胶RT干燥20分钟。样品基质在针对uPA/ uPAR结合的已知小分子抑制剂不存在的条件下，将未 用生物素标记的uPA (Pro- uPA)用作抑制uPA/ uPAR结合的对照样品。 将溶于检测緩冲液的O、 0.03、 0.1、 0.3、和3jxMpro-uPA的5微升小样 分加到PVDC膜(Dowbrands L. P. Indianapolis, IN)上并在RT干燥2 小时。将uPAR与Pro-uPA和B — uPA温育将样品基质置于P - uPA凝胶的 一侧，使干燥的pro-uPA点与p - uPA 凝胶表面接触。RT温育10分钟，使得pro-uPA扩散到凝胶中。然后将P - uPA凝胶的另 一侧放在塑料板上使得P-uPA(作为配基)和pro-uPA(作 为竟争抑制剂)与塑料板表面上的uPAR相互作用。在RT温育20分钟 进行结合/竟争反应。温育后，将塑料板从凝胶分离开，迅速用20ml洗涤 緩冲液洗4次。将亲和素-辣根过氧化物酶(Sigma, St. Louis， MO)用 检测緩冲液1比25,000稀释以制备亲和素-HRP标记物溶液，并将15ml 加入到塑料板上。反应在RT温育10分钟进行，然后倒空亲和素-HRP 溶液并如上文所述洗涤塑料板。塑料板干燥20分钟。亲和素-HRP中的亲和素特异性地与生物素结合，使得只有发生"配 基/受体"结合的基质区域最终才会显色。"配基/受体"结合被pro-uPA 竟争性抑制的的基质区域将不会显色。显色含有比色测定HRP底物的显色凝胶(OPD凝胶)是通过将盐酸2-邻苯二腐OPD )药片溶于7ml稀释'液(两者都来自Abbott kit no. 6172-30， Aboot Labs， Abbott Park EL)并将此溶液与琼脂糖溶液混合而制备，琼 脂糖溶液是通过用3ml水熔化O.lg琼脂糖而制备的。将最终的10ml混合 物倒入8x7x0.075cm的mini-proteinll凝胶装置中并在4°C凝固15分钟 。将凝胶从灌胶架的玻璃板上转移到PVDC膜或柔软的塑料片上，并在 空气中室温干燥10分钟。然后将凝胶转到另 一张PVDC膜或塑料片上使 凝胶的另一侧干燥10分钟。然后将OPD凝胶放到塑料板上开始显色。 在OPD温育的不同时间将塑料板放在440nm滤色镜上(Omega Optical, Inc., Brattleboro， VT )，而上述滤色镜放在纤维光学散射板上，散射板放 在Fiber-Lite光源上(两者都来自Dolan-Jenner Industries" Lawrence, MA )。得到的图象用CCD相机获取(Eagle Eye system, Statagene, La Jolla: CA)。对照实验图8示明实施例3的对照实验.在图8A中，琼脂方块(lcm"浸泡 在如方块下方所表示的各种浓度的P - uPA中(除了 50nM的溶液是在琼 脂方块的左边标明)。在琼脂方块与塑料板上固定的uPA温育后，这些方 块被移开。然后洗涤塑料板，按照上文所述观察基质上发生P - uPA/uPAR 结合的区域。图8B示明OPD显色的不同时间中每个方块的平均象素值 (减去背景)(利用NIH图象检测软件检测CCD相机数字图象而确定) 对每个方块中P-uPA的浓度作图从琼脂方块中释放的P-uPA表现出典型 的受体-配基结合曲线，半-最大结合(Kd)为2-5nM，这与常规ELISA 和其它测量此参数的检测实验中此反应的报道值相一致.图8表明由 gELISA产生的间接比色信号定量地依赖于配基-受体相互作用程度。 Pro-upA/B-uPA竟争实验结果图9示明Pro-upA对P-uPA /叩AR结合的抑制，图9A中的点显示 P-uPA/upAR结合受抑制的区域。相应地，亲和素-HRP在这些区域不 结合。因此，HRP不与底物胶中的OPD反应产生颜色。图9B是显示同 样的CCD图象数据的替代方法，这样增强了人眼观察定量滴定的能力。 实施例4:蛋白-蛋白相互作用抑制剂的直接放射性探测方法 T细胞激活是身体免疫应答的一个组成部分。在T细胞激活中为了 发生下游事件，p561ck (LCK， 一种蛋白)必需与T细胞抗原受体的胞 浆内结构域中的ITAM区(基于酪氨酸的免疫球蛋白相关激活片段，immunoglobulin related tyrosine based activation motif)反应。抑制这种 蛋白-蛋白相互作用的化合物是潜在的免疫抑制剂。本发明的发明者应 用CF-HTS来检测这种蛋白-蛋白相互作用，其中LCK被固定到膜上LCK基质将11c迈x2cm的条带用5ml溶于含5mM DTT (二硫苏糖醇)的PBS 的3jiM LCK淹没，室温放置10分钟，将緩冲液除去，从而将生物素标 记的LCK固定到生物素捕获膜上(SAM膜)(Promega Corp., WI )。这 一步骤要控制好时间，以便SAM膜能随后立刻(几分钟以内)用于下述 的检测实验中。ITAM头基质含放射性标记的ITAM (ITAM* )琼脂凝胶是通过混合O.lg琼脂糖 和10ml水，加热至熔化，然后倒入8x7xO.l灌胶装置中而制备的。在 灌胶之前加入或在凝固后渗透加入ITAM、使其终浓度为10nM。样品基质待筛选的测试样品分加到塑料表面上或PVDC膜上并干燥以形成样品基质o温育ITAM、 LCK和待测样品并显现结果样品基质与ITAM矢凝胶的一侧接触，使得测试样品扩散到ITAM头凝 胶中。然后将ITAMA凝胶的另一侧与固定LCK的SAM膜接触。温育 15-45分钟后，移开SAM膜，洗涤，并用磷成像仪或胶片成像。图象 上较低的信号强度对应较低的放射性，这意味着存在ITAM - LCK相互 作用的抑制剂。ITAM*/LCK结合的对照实验琼脂凝胶是通过混合O.lg琼脂糖和10ml水，加热至熔化，然后倒入 8 x 7 x 0.1灌胶装置中而制备的。凝固后从凝胶中打孔取出直径lcm的凝 胶并用400nl(U、 0.3、 1、 3、 10和20111111251标记的ITAM (Amersham， Arlington heights, IL) 4°C浸泡过夜。从溶液中取出凝胶块并在RT干燥 20分钟。然后放在固定LCK的膜上并在RT温育45分钟。除去凝胶并 用緩冲液洗涤4次。SAM膜干燥后用磷成像仪成像.图IO表明125I-ITAM和固定在SAM膜上的LCK之间的结合是剂 量依赖性的。图11示明每块125I-ITAM的凝胶平均象素值(减去背景)(利用 Molecular Dynamics的ImageQuant软件检测磷成像仪的数字化图象而得 到)对每块凝胶中125I - ITAM的浓度作图。从凝胶中释放到固定的LCK 上的125I - ITAM表现出典型的受体-配基结合曲线。实施例5:用凝J3^/滤器联合方式检测全细胞报告基因用含有融合到荧光酶基因(荧光酶报告基因来自Promega)上的环 腺苷酸应答元件(CREB)启动子的质粒转染肾细胞，如HEK细胞。当 用毛喉素处理转染细胞时，荧光酶^^艮告基因诱导表达。然后往HEK细胞 中加入含有荧光酶底物(甲虫荧光素，Promega)和适当辅助因子(20mM 苜蓿素(Tricine) pH 7.8， O.lmM EDTA， 33mM辅酶A， 0.5mM ATP， lmMMgCI2)的生物缓冲液，可利用常规的仪器检测产生的光子发射。 发明者将这种检测实验改造成了 CF-HTS。细胞基质用胰蛋白酶处理培养基中的细胞，转移到Corning/Costar TRANSWEL1/m膜上(带有塑料支持圈的3微米聚碳酸酯滤膜)上，并 在含5。/。C02组织培养基中37。C温育过夜。然后从膜上除去培养基，并 将细胞结合的滤膜在空气中干燥15分钟，随后立刻用于以下的步骤中。诱导剂基质将12pl 10mM毛喉素(Sigma，储存于乙醇中)储存液加入到6ml1 % 低熔点琼脂糖凝胶中制备含有荧光酶表达诱导剂的凝胶。该凝胶在室温 凝固，毛喉素的终浓度为20pM.样品基质将可能阻止毛喉素诱导的样品高密度地分加到PVDC膜上的离散位置。反应物的温育和抑制的检测将PVDC膜的抑制剂侧与诱导剂凝胶温育。然后，将舍有毛喉素诱 导剂的凝胶放置在上文制备的细胞基质的非细胞侧。在37°C, 5% C02 的条件下温育20分钟。然后除去毛喉素凝胶，在37。C， 5%002的条件 下再温育4小时使荧光酶构建体最大量地表达。为了探测焚光酶酶学活 性(或对其酶学活性的抑制)，将细胞基质滤膜从其塑料支持环上移开并 放置在有盖培养皿中。有盖培养亚中倒满溶于生物緩冲液的荧光酶底物 (甲虫荧光素，Promega)和恰当的辅助因子以产生光信号。因为信号是位于表达荧光酶的固定细胞内的，初始诱导步骤的抑制剂将产生低光 子发射区域。实施例6:凝JK7滤器CF - HTS直接检测配基-细胞相互作用的抑制剂细胞表面上的配基/受体结合启动细胞中的信号通路，最终导致功能 性应答(例如，细胞增殖或分泌生物活性物质)。为了调节疾病状态细胞 的生物应答，经常需要抑制配基和细胞表面的结合。评测配基/细胞受体 结合抑制剂的 一种常规方法为评测抑制剂降低放射性标记的天然配基和 细胞结合的能力。这需要将细胞和放射性配基和抑制剂温育，然后通过 洗涤除去未结合的和非特异性结合的放射性配基，然后测量结合的放射 性。白介素-8 (IL-8)是一种趋化性的趋化因子，通过和多种细胞的 受体结合而参与炎症反应。本发明的发明者发展了 一种CF - HTS配基-受体细胞检测法来评测这种相互作用的抑制剂。细胞基质表达IL - 8a受体的HEK细胞(ATCC， Bethesda， MD )铺在75mm 直径的transwell膜滤器上(Corning Costar Corp， Cambridge, MA )，密 度为大约2千万个细胞每板。在含有10mM H印es (Sigma, St Louis, MO)， pH7.2的缓冲液(RPMI， Life Technologies, Grand Island, NY) 37。C过夜 使细胞结合到滤器上。细胞和滤器结合后除去培养基，用新鲜的緩冲液 洗涤细胞除去任何未结合的细胞。将滤器倒置，使细胞侧向下并以一定 的角度放置，使得培养基流干，然后干燥20分钟。这一步骤要控制好时 间，使得细胞基质能马上用于下述的步骤中。配基基质配基基质的制备是通过将125I标记的IL-8 (Amersham， Inc., Arlington heights, IL)浸泡到琼脂糖凝胶中，琼脂凝胶是通过混合O.lg 琼脂糖和10ml水，加热至熔化，然后倒入8x7x0.075灌胶装置中而制 备的。凝胶在室温浸泡过夜并在旋转平台(New Brunswick Scientific Co, Inc，Edison，NJ)上緩慢地混合。浸泡后，在使用前将凝胶RT干燥20min ,这一步要计划好时间，以便凝胶可马上被用于以下的检测中。样品基质在没有结合IL-8/细胞受体的已知抑制剂的情况下，未放射性标记的IL-8 (Genzyme.， Cambridge, MA)被用作对照样品抑制剂，以观察对125I -IL - 8和HEK细胞结合的抑制作用。在塑料片如PVDC上分加1微 升浓度为0， 0,03， O，l， 0，3 1, 3， 10，和100nM的IL>8并在室温下真空干燥1小时。、、曰玄 /皿g将样品基质放在配基基质的一侧，使得干燥的IL-8点和凝胶表面 接触。翻转凝胶使得另一侧室温干燥10分钟并使"抑制剂"扩散到凝胶 里。随后将凝胶放在细胞基质无细胞的一侧。然后在室温温育45分钟进 行结合反应。此后将凝胶移开，将膜无细胞的一侧用緩冲液洗涤4次。 在膜完全干燥后将其从塑料支持环上取下。然后用X-光胶片或磷成像 仪(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)成像。图12示明从琼脂扩散到细胞基质的12SI -IL-8和表达IL - 8a受体 的HEK细胞结合的剂量反应。将几个1平方厘米的琼脂方块浸泡在图中 所示的各种浓度的125I - IL - 8中。随后浸泡了配基的方块如上文描述那 样与细胞基质接触。温育后，从细胞基质上移走方块，将膜的无细胞侧 用緩冲液洗涤。用磷成像仪定位结合^I-IL-8的细胞，结果表明在这 种以凝胶为基础的细胞检测中直接读出的放射性值定量地依赖于受体配 基结合的程度。图12还表明结合区域在形状上是清楚的，确证了信号的 侧向扩散在#测实验中不是问题。图13示明竟争抑制实验的结果。对125I - IL - 8和HEK细胞结合的 抑制表现为较亮的点。显然，未标记EL-8的抑制也是可量化的剂量依 赖性的。这些数据表明以此例中未标记DL-8为例子的抑制剂能穿过细 胞基质降低125I -IL-8和细胞之间的结合。实施例7:基于滤器的无凝胶功能性细胞检测实验细胞功能的改变通常是通过观察化合物或样品对构建于细胞中的报 告系统的影响而测量的。具体实例包括观察对细胞内荧光蛋白如绿色荧 光蛋白(GFP)、细胞外蛋白如受体或粘附分子、或特定酶如荧光酶、氯 霉素酰基转移酶或P-半乳糖苷酶(Promega)合成的影响，首先将待测样 品与细胞温育。然后在适当的时间内(可以是几分钟、几小时或几天) 使细胞表达报告蛋白。然后用直接方法(例如GFP)或间接方法(例如 膜结合蛋白的ELISA技术)检测报告蛋白的水平，进而，在酶的情况下， 可破碎细胞提取报告蛋白并检测酶活性。其它功能性细胞检测测量受体受刺谢物的行为或位置的变化。一种测量化合物对细胞间粘附分子1 (ICAM-1)的影响的ELISA 检测可如下被改造成CF - HTS方式。将表达ICAM - 1的内皮细胞铺在 聚碳酸酯趋化膜(Neuro Probe)上，密度为每 mm 5，000个细胞。细胞 在培养基中温育过夜.将培养基除去并使膜在室温部分干燥10分钟。用 于测试对ICAM-1的诱导的样品或化合物被加到塑料片上干燥并使之 与潮湿膜的无细胞侧接触，化合物和细胞在潮湿的小室里37。C反应1小 时，随后细胞用培养基淹没并在37°C温育5小时。在足够细胞合成诱导蛋白的一段时间之后，将培养基从膜上除去并 在含抗ICAM - 1抗体的緩冲液中温育细胞(Genzyme， R&D系统)，抗 体用异硫氰酸荧光素或生物素标记或不用之标记。室温温育30分钟后， 除去緩冲液并洗涤细胞数次以除去未结合的抗ICAM - 1抗体。在FITC 标记抗体的情况下，用CCD相机(Stratagene， Imaging Research )在485nm 激发520nm发射下对膜成像。由于FITC -抗ICAM - 1 -抗体的结合， 刺激ICAM- 1表达的化合物将导致荧光增强的区域。在生物素标记抗体 的情况下细胞在含亲和素-HRP的緩冲液中室温温育10分钟。除去緩冲 液并洗去未结合的亲和素-HRP。然后将膜浸泡在含沉降性HRP底物， 如四氯二M联苯胺的緩冲液中，并观察诱导表达ICAM 一 1的潜在细胞 区域的显色。在未标记的抗ICAM - 1抗体的情况下，用标记的抗抗ICAM -1抗体的二抗与细胞反应，然后用标记物的适当底物显现信号。用CCD 相机捕获图象。所有的这些变例(FITC、亲和素-HRP、和抗抗ICAM - 1抗体)都是应达到相同定性结果-即信号增强或减弱的区域能与影响 ICAM - 1表达的样品相联系-的不同报告标记。值得注意的是此例中连续式基质是膜或塑料片。凝胶对于CF-HTS 并不是必需的。实施例8: CF - HTS检测离散样品对神经氨酸苷酶的抑制样品基质利用CF-HTS测试了 528种离散的、结构上相关的化合物的文库。 用Packard Multiprobe MP204-DT将化合物从小瓶中稀释到96孔板并将 化合物稀释和转移到塑料片上。最初将小瓶中溶于DMSO的40mM化合 物用DMSO在96孔板上稀释到4mM。将两份ljil样品转移到8cmx8cm的塑料片上，样品间的间隙平均为5mm(BioRadcat#165-2956)，每块塑 料片总共192个样品，因此，每个lpl的点大约含有200pmol来自上述文 库的一种特定样品。稀释一系列2，3-脱氢-2脱氧-N -乙耽基神经氨酸 (DANA ), —种已知的神经氨酸苦酶抑制剂(Boehringer Maimheim#528544 )，手工分加到每块塑料片上与化合物相邻的位置，作 为对照。在真空炉中干燥塑料片，4吏得每种化合物在其自身的位置上被 干燥到塑料表面上。 酶基质检测在40X:下前将25 %甘油、磷酸盐緩沖液中的流感病毒神经氨酸 苷酶按1500倍稀释到液态的琼脂凝胶中，该凝胶中含有1%琼脂糖、 50mM柠檬酸钠，pH6,0， 10mM氯化钠。灌制8cmx8cmx0.075mm的酶 凝胶并将温度降低到4tM吏之凝固。底物凝胶将DMSO中浓度为3mM的流感病毒神经氨酸苷酶合成底物，2， - 4 -甲基^散形基(4methylumbelifeyl) - ct-D-N-乙酰神经氨酸(Sigma cat#M-8639)，用液化琼脂糖凝胶稀释到30pM并以和上文描述的酶凝胶 类似的方式灌制。温育和检测酶基质放在样品基质上所感兴趣的化合物被干燥的一侧。然后将底 物基质迭放在酶基质上。将这些基质RT温育30分钟。在这段时间内淬 灭荧光底物和酶在两块胶之间扩散到一起，然后底物被酶水解，使得荧光 强度增加，监测在340nm激发和450nm发射进行。能抑制酶活性的化合 物使荧光的增加程度减小。凝胶在大多数部位荧光都增加，但酶抑制剂 从塑料片扩散到凝胶的部位荧光较弱、较暗。通过适当的滤光镜控制发 射和激发波长，这样容易用CCD相机监测.表现出抑制性区域的化合物 的成分可通过确定该区域在抑制剂基质上对应的位置而确定。通过比较 DANA对照和已知量的各种测试抑制剂的荧光强度可定量地估计每种成 分的IC50.所有的538种化合物都进行了双份测试。所用的酶凝胶总体积为 33ml，或每次测试用31.25^1。进而，所有的化合物都同时测试，与传统 的96孔检测方法相比检测条件是恒定的。进而，如图14所示，该检测 灵敏得足以探测含量少到100pM的抑制剂。每种活性化合物的ICso估计值和用96孔方法观察到的同一测试化合物的相同，但96孔方法费用更 昂贵，每次测试需要20(Hil。参见定量凝胶检测结果表，这个实施例表明 测试高密度排列的化合物减少了费用和时间。例如，仅仅将间距有5mm 减小到2.5mm就能使得每单位体积的测试样品数量提高4倍.在本实验 中这将使得每种化合物的体积减小到10nl。但是试剂是以批量的形式操 作的，不需要小型化筛选中常用的小体积液体操作装置。定量凝脱检测结果样品#凝胶实验得到的近似 最大Ki (pM)从96孔实验估计的 IC50 ( pM)34100>1003580>10036804237100>10038100>10039100>10040403241100>10042405043100>10044>200>10045100>10046100>10047107.548100>10049100>10050100>100用总体积17毫升的酶凝胶通过CF - HTS检测了 10, 080种离散化 合物(每次检测小于2pl)，以此为例说明这种小型化的优点。用Packard Multipette分加30^1体积的每种样品，样品之间的间隔为lmm。分加的化合物溶于DMSO中，浓度为5mM,使得大约150pmol的每种样品被 分加到塑料表面上。再一次用DANA作为对照。除了象通常那样在化合 物排列的外边进行对照滴定外还在排列之中包括了对照滴定，作为盲试 (blind test);在盲试中对照样品以和10， 080种未知样品一样的方式加 到塑料表面上。如上文所述，塑料片干燥后用于神经氨酸苷酶检测。利 用这种方法，在不到1个小时内同时筛选了所有的10，080种化合物。除 了在将初始的化合物分加到塑料片上时，本实验再不需要微量流控和/或 小体积操作。本实验中极其高的密度并未干扰对抑制剂的探测。进而， 高密度并未使活性化合物的鉴定复杂化，甚至在荧光化合物(在凝胶上 为亮点，很容易观察到)与活性化合物紧邻时也是如此。参见图15。
权利要求
1.一种检测测试样品的生物学或生物化学活性的方法，该方法包括，a)将多种测试样品引入到多孔检测基质之中或之上，检测基质任选地含有一种或多种检测组分，b)使用至少一种基质将一种或多种检测组分引入到检测中，其中所述基质可以是也可以不是多孔检测基质，c)进行以下另加步骤，i)洗涤检测中用的任一基质以除去多余的测试样品、检测组分或两者；或者ii)使检测中使用的任一基质和批量溶液或其本身为液体另加试剂接触。
2. 权利要求1中的方法，其中测试样品是分加到含有配基的多孔检测 基质上的，另一种检测基质含有固定的受体，并且另一种另加的试剂为 显现溶液(visualizing solution )。
3. 权利要求1中的方法，其中另加的试剂可以在一种细胞检测中探测 报告基因的表达。
4. 权利要求1中的方法，其中一种多孔检测基质是在一面带有全细胞 的膜，并且另加的步骤包括加入含有能与报告蛋白交联的化合物的批量 溶液；报告蛋白是由于测试样品和细胞之间的阳性反应而产生的。
5. 权利要求1中的方法，其中另加的试剂是显现试剂。
6. 权利要求1中的方法，其中的洗涤步骤除去多余的用于显现检测结 果的检测组分'
7. —种检测测试样品生物学或生物化学活性的方法，该方法包括，a) 将多种测试样品引入到多孔检测基质之中或之上，检测基质任选地 含有一种或多种检测组分，b) 使用至少两种另加的基质进4亍检测。
8. —种检测离散测试样品生物学或生物化学活性的方法，该方法包括，a) 将96种以上测试样品引入到多孔检测基质之中或之上，检测基质 任选地含有 一种或多种检测组分，b) 进行检测。
9. 权利要求1、 7或8中的方法， 质的步骤。
10. 权利要求1、 7或8中的方法，
11. 权利要求l、 7或8中的方法，
12. 权利要求1、 7或8中的方法， 混合物或抽提物。
13. 权利要求1、 7或8中的方法，胞。
14. 权利要求1、 7或8中的方法，
15. 权利要求1、 7或8中的方法， 定了的检测组分上的液体薄膜。
16. 权利要求1、 7或8中的方法，权利要求书第2/4页 还包括分加测试样品到测试样品基其中多孔检测基质含有靶大分子。 其中多孔检测基质含有酶。 其中多孔检测基质含有粗制的生物其中多孔检测基质含有细胞器或细其中多孔检测基质是滤器或膜。 其中多孔检测基质是一层覆盖在固其中另加基质含有固定的大分子靶
17. 权利要求1、 7或8中的方法，其中另加检测基质含有显现试剂。
18. 同时检测多种不同物质样品增强或抑制生物学过程能力的方法， 该方法包括，a) 96种以上独特样品，每种以一小份体积加到含有或带有均一分布 的试剂的平面多孔基质上形成排列，使得每种独特物质以其自身的独特 位点为中心，并且能根据加样位点确定每种物质的身份，b) 观察每种物质和所述的检测试剂的相互作用，并且将这种相互作用 与该物质增强或抑制生物学过程的能力相联系。
19. 同时检测多种不同物质样品增强或抑制生物学过程能力的方法， 该方法包括，a) 96种以上独特样品，每种以 一小份体积加到平面基质上形成排列， 使得每种独特物质以其自身的独特位点为中心，并且能根据加样位点确 定每种物质的身份，b) 使上述基质和含有或带有均一分布的检测试剂的多孔基质接触，并 使每种物质各有一部分扩散到上述多孔基质，其扩散的方式可以保证每 种扩散物质的位置能与上述平面基质上上述物质最初加样的位置相关 联，c) 进行接触以测定每种扩散物质增强或减弱上述生物学过程的能力。
20. 同时检测多种不同物质样品增强或抑制生物学过程能力的方法，该方法包括，a) 96种以上独特样品，每种以一份小体积加到平面基质上形成排列， 使得每种独特物质以其自身的独特位点为中心，并且能根据加样位点确 定每种物质的身份，b) 使上述基质和含有或带有均一分布的检测试剂的第一多孔基质接 触，并使每种物质各有一部分扩散到上述多孔基质，其扩散的方式可以 保证每种扩散物质的位置能与上述平面基质上上述物质最初加样的位置 相关联，c) 使上述第一多孔基质和含有或带有第二种均一分布的检测试剂的 第二多孔基质接触，并使第二种检测试剂扩散到第一多孔基质，或使每 种物质和第一种试剂扩散到笫二多孔基质，在后一种情况下确保扩散的 方式使得每种扩散物质在第二基质中的位置能与上述物质在上述平面基 质上的最初加样位置相关联，以及d) 评测每种物质增强或抑制所述生物学过程的能力。
21. 同时检测多种不同物质样品增强或抑制生物学过程能力的方法， 该方法包括，a) 96种以上独特样品，每种以一份小体积加到含有或带有均一分布 的第 一检测试剂的第 一平面多孔基质上形成排列，使得每种独特物质以 其自身的独特位点为中心，并且能4艮据加样位点确定每种物质的身份，b) 使上述第一多孔基质和含有或带有第二种均一分布的检测试剂的 第二平面基质接触，并使第二种检测试剂扩散到第一多孔基质，或使每 种物质和第一种试剂扩散到第二平面基质，在后一种情况下确保扩散的 方式能使每种扩散物质在第二基质之中或之上的位置可与上述物质在上 述第一多孔基质上的最初加样的位置相关联，以及c) 评测每种物质增强或抑制生物学过程的能力。
22. 权利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的检测试 剂是有一种大分子。
23. 权利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的检测试 剂有一种是酶。
24. 权利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的检测试 剂有 一种是粗制的生物抽提物。
25. 权利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的检测试剂有一种是细胞器。
26. 权利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的检测试 剂有一种是全细胞。
27. 权利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的检测试 剂是平面多孔基质一个表面上携带的全细胞。
28. 权利要求27中的方法，其中所述的相互作用是通过使上述多孔基 质和一种试剂溶液或悬液或含有该试剂的多孔基质接触，上述试剂在随 便那种情况下都可促进一种蛋白的显现，上述蛋白在上述全细胞中的表 达即是被评测的生物学过程。
29. 权利要求21中的方法，其中第一检测试剂是标记的配基，而第二 检测试剂是针对上述配基的固定后的受体。
30. 权利要求29中的方法，其中笫二平面基质被洗涤以除去扩散到上 述第二平面基质之上或之中但不与上述固定受体结合的任一标记配基。
31. 权利要求30中的方法，其中所述笫二平面基质与一种试剂的溶液 或悬液或含有该试剂的多孔基质接触，上述试剂在随便那种情况下都促 进未在洗涤中被除去的标记配基的显现。
全文摘要
本发明发明名称为连续式高处理量筛选。本发明涉及应用了至少一种多孔基质的连续式高处理量筛选方法(CF-HTS)，该方法使得制药工业能够同时对大量生物学或生化活性分布广泛的化学实体进行筛选。此外，CF-HTS也可用于进行多步骤的检测实验。
文档编号C07B63/00GK101256187SQ20081008176
公开日2008年9月3日 申请日期1998年12月11日 优先权日1997年12月12日
发明者B·A·比特尔, D·J·布尔恩斯, M·E·舒达克, M·J·沃二巴斯, M·K·约瑟夫 申请人:艾博特公司