专利名称：：病原微生物dna的提取方法病原微生物DNA的提取方法
技术领域：
本发明涉及的是一种病原微生物DNA的提取方法，属微生物化学中分离DNA的
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背景技术：
分子生物学技术的广泛应用有力促进了微生物快速诊断技术的发展，改变了传统病原微生物鉴定需经过分离培养、生化反应与血清疑集等一系列操作复杂耗时长久的实验，传统方法已远远不能适应突发公共卫生事件应急处理要求。在病原微生物各种快速鉴定技术中，实时荧光PCR技术是目前国际上公认的最灵敏、特异、重复性最好的核酸定性、定量检测方法，已广泛应用于突发公共卫生应急处理中病原微生物的检测。但现有的实时荧光PCR模板制备即病原微生物DNA提取方法所需时间都在30分钟以上，其中目前最先进的柱式核酸提取法用于细菌与病毒DNA提取需10个步骤共计40~60分钟时间；经典的煮沸裂解法用于细菌DNA^是取需菌液浓缩、裂解与分离3个步骤，需30~35分钟，用于病毒DNA提取可省去浓缩，需20~25分钟。所以如何」提高病原微生物DNA提取速度是当前急需解决的技术问题。
发明内容针对上述不足，本发明为解决上述技术问题提出一种新的快速的病原微生物DNA的提取方法。本发明提供的病原微生物DNA的提取方法，用于细菌DNA提取时，先取样品悬浮液上清lml放入1.5ml的微量离心管中在15000r/min转速条件下离心lmin,然后倒去上清后加入5(M提取剂混匀，再将微量离心管置沸水中7K浴2min,再在15000r/min转速条件下离心lmin，最后移取上清即为病原孩￡生物DNA溶液；所说提取剂由重量体积百分比为0.9%的NaCl、重量体积百分比为0.01%的SDS、体积百分比为0.1%的P-巯基乙醇、其余为水构成。SDS为十二烷基硫酸钠的缩写。本发明提供的病原微生物DNA的提取方法，用于病毒DNA提取时，先取样品悬浮液上清5(W放入1.5ml的微量离心管中，然后加入5(Vl提取剂混匀，再将微量离心管置沸水中水浴2min,再在15000r/min转速条件下离心lmin,最后移取上清即为病原微生物DNA溶液；所说提取剂由重量体积百分比为0.9°/。的NaCl、重量体积百分比为0.01%的SDS、体积百分比为0.1%的|3-巯基乙醇、其余为水构成。以上方法中提取细菌DNA或病毒DNA的第一步的不同是因为对于细菌来说，离心可以使它们浓缩，而对于病毒来讲，离心方法尚不能使它们浓缩，所以在提取病毒DNA时不用浓缩一步而直接采用样品上清进行提取。本发明提供的病原微生物DNA的提取方法，用于细菌DNA提取需45分钟，用于病毒DNA提取需3~4分钟。使提取时间从现有技术需要30分钟以上缩短至5分钟以内。与实时荧光PCR技术配合可在15~30分钟内完成病原菌的诊断检测。经实际试用，本发明方法的效果不低于现有技术的煮沸裂解法、柱式核酸提取试剂盒的效果，并略胜于某些品牌的柱式核酸提取试剂盒的效果，而且操作十分简便、成本低廉。本发明提供的病原微生物DNA的提取方法，使实时荧光PCR的检测速度有了质的飞越，对今后食物中毒、传染病爆发等突发公共卫生事件的病原菌快速诊断具有重要的应用价值，为正确制订突发公共卫生事件的处置方案、及时采取针对性控制措施、临床病人抢救治疗及预后评估提供科学依据。具体实施方式以粪便为样品的实时荧光PCR模板制作，即粪侵_样品病原微生物DNA的提取过程是1、取粪便悬浮液上清lml放入1.5ml的微量离心管中，在离心机中以15000r/min的转速离心lmin;2、倒去上清加入50jnl以9gNaCl、0.1gSDS、lmlP画巯基乙醇配制成1000ml水溶液为提取剂混匀，置沸水中进行水浴2min;3、在离心才几中以15000r/min的转速离心lmin，移取上清即为该粪4更样品中病原孩i:生物的DNA溶液。以上共用时不足5min。以本发明方法提取的病原微生物DNA与其他方法提取的病原微生物DNA经实时荧光PCR后用结果比较其效果，比较时按上例重复三次获得三管DNA溶液一、比较用病原微生物进行病原微生物DNA的提取以金黄色葡萄球菌(ATCC26112)、副溶血弧菌(ATCC17802)、肠出血型大肠埃希菌(0157:H7)(DEL933)、乙型肝炎病毒(HBV)与白斑综合症病毒(WSSV)为样品，提取过程按本发明方法进行。每个样品重复三次各得三管DNA溶液。二、用比较方法对同一样品进行病原孩i生物DNA的提取柱式核酸提取试剂盒分别采用QIAGEN公司生产的MiniKit(批号74104)、日本Takara公司生产的DV801A、DV818并按试剂盒说明书对上述样品进行操作。每个样品重复三次各得三管DNA溶液。煮沸裂解法提取剂选用上海之江生物科技有限公司产品并按其说明书对上述样品进行操作。每个样品重复三次各得三管DNA溶液。三、DNA实时荧光PCR法测定吸每管DNA溶液2nl进行实时荧光PCR,取实时荧光PCR的ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定阀值时所经历的循环数)作为提取效果的评价指标。DNA实时荧光PCR基础试剂盒为日本Takara公司生产DRR039s、特异性引物与Taqman探针由大连宝生物工程有限公司制作，LightCycler实时荧光PCR仪购自瑞士罗氏公司。实时荧光PCR反应条件:按试剂盒DRR039s说明书要求进行95。C预变性10s，然后95。C5s,60°C20s扩增40个循环，共计25分钟。四、三种方法的提取效果比较1、对用QIAGEN柱式核酸提取试剂盒法、煮沸裂解法与本发明方法提取的白斑综合症病毒的DNA提耳又液和副溶血弧菌的DNA提取液进行实时荧光PCR,取ct值作比较参数，结果显示三种方法对同一种病原菌的扩增曲线形态、灵敏度与重复性均高度一致，详见表l、表2。表l:白斑综合症病毒(拷贝数5x107/ml)的三种方法提取效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2:副溶血弧菌(菌落数5xl03/ml)的三种方法提取效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>2、对用本发明方法与用TaKaRa柱式核酸提取试剂盒提取的白斑综合症病毒的DNA提取液与0157:H7的DNA提取液进行实时荧光PCR,结果显示前法略优于后法，详见表3、表4。表3:白斑综合症病毒(拷贝数5x107/ml)的两种方法提取效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表4:0157:H7(菌落数5x107/ml)的两种方法提取效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>3、对用本发明方法与煮沸裂解法提取的金黄色葡萄球菌的DNA提取液、0157:H7的DNA提取液以及HBV的DNA提耳又液进行实时荧光PCR,经统计分析结果显示两种方法的扩增曲线形态一致，说明本发明方法对不同结构的病原微生物DNA的提取效果与经典的煮;弗裂解法具有相同效果。详见表5、表6、表7。表5:金黄色葡萄球菌(菌落数5x108/ml)的两种方法提取效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表6:0157:H7(菌落数5xl07/ml)的两种方法提取效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种病原微生物DNA的提取方法，其特征是用于细菌DNA提取时，先取样品悬浮液上清1ml放入1.5ml的微量离心管中在15000r/min转速条件下离心1min，然后倒去上清后加入50μl提取剂混匀，再将微量离心管置沸水中水浴2min，再在15000r/min转速条件下离心1min，最后移取上清即为病原微生物DNA溶液；所说提取剂由重量体积百分比为0.9％的NaCl、重量体积百分比为0.01％的SDS、体积百分比为0.1％的β-巯基乙醇、其余为水构成。2、一种病原微生物DNA的提取方法，其特征是用于病毒DNA提取时，先取样品悬浮液上清50nl放入1.5ml的微量离心管中，然后加入5(Vl提取剂混匀，再将微量离心管置沸水中水浴2min,再在15000r/min转速条件下离心lmin，最后移取上清即为病原微生物DNA溶液；所说提取剂由重量体积百分比为0.9%的NaCl、重量体积百分比为0.01%的SDS、体积百分比为0.1%的P-巯基乙醇、其余为水构成。全文摘要本发明提供的病原微生物DNA的提取方法，先取样品浓缩液加入50μl提取剂混匀，再将微量离心管置沸水中水浴2min，再在15000r/min转速条件下离心1min，最后移取上清即为病原微生物DNA溶液；所说提取剂由重量体积百分比为0.9％的NaCl、重量体积百分比为0.01％的SDS、体积百分比为0.1％的β-巯基乙醇、其余为水构成。本发明提供的病原微生物DNA的提取方法，提取DNA时间仅需3～5分钟。使提取时间从现有技术需要30分钟以上缩短至5分钟以内。经实际试用，本发明方法的效果不低于现有技术且略有胜出，而且操作十分简便、成本低廉。文档编号C07H21/04GK101402663SQ20081012131公开日2009年4月8日申请日期2008年10月6日优先权日2008年10月6日发明者王建跃,王忠发,薛超波申请人:舟山市疾病预防控制中心