专利名称：一种抗肿瘤融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
(二)
背景技术：
肿瘤坏死因子超家族(TNF superfamily, FNFSF )成员众多，空间结
构相似，有不同程度的同源性。配体为n型跨膜蛋白，能以膜结合或可溶
性形式发挥作用；受体为I型或III型膜蛋白，受体与配体结合，启动下游 信号转导，诱导细胞生长、分化和凋亡，在组织自稳、炎症的免疫调节中 发挥重要作用。
TNFSF10最初是利用与FasL、 TNF的同源性从人的表达序列标签 (EST)文库中发现的。与TNF超家族中的其它成员一样，TNFSF10属 典型的II型5争膜蛋白，由281个氨基酸组成，分子量为32KDa。 N端第 15-40位氨基酸残基为疏水区，形成^争膜结构；C端(胞外区)可4皮金属 蛋白酶从细胞膜上切下，得到具有生物学活性的可溶性分子。重组人可溶 性TNFSF10蛋白在体外能诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括肺癌细胞、乳腺 癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞以及结肠癌细胞等，而对大多数正常组 织细胞则无诱导凋亡作用。
研究资料表明，TNFSF10有五种受体，包括DR4(death receptor 4 or TNFSF10-R1) 、 DR5(TNFSF10-R2) 、 DCR1(TNFSF10-R3)、 DCR2(TNFSF10-R4)以及OPG(osteoprotegerin)。 DR4和DR5属于TNFR 超家族成员中的死亡受体，细胞内区域含有高度保守的与TNFR、 Fas同 源的死亡结构域(DD, death domain),可诱导细胞凋亡；DCR1和DCR2
3尽管细胞外区域和死亡受体高度同源，但是细胞内区域要么结构域不完整
(DCR2)，要么根本就没有(DCR1),因此，二者均不能传导凋亡信号， 被称为诱骗受体；OPG则是一种特殊受体，以分泌糖蛋白形式存在；后 三种受体可通过竟争性抑制TNFSF10与死亡受体的结合来调控其诱导的 细胞凋亡。
为进一步研究TNFSF10蛋白的作用机理以及在抗肺瘤药物方面的应 用潜力，研究人员利用基因工程重組技术，构建了多种可溶性TNFSF10 蛋白，包括含胞外区95 281位氨基酸残基的TNFSF1095-2引蛋白(SEQLD NO: 2)、含胞外区114 281位氨基酸残基的TNFSF10114-281蛋白(SEQID NO: 3)以及融合有标签蛋白(如His、 FLAG)的TNFSF10融合蛋白。 动物实验表明，重组人可溶性TNFSF10蛋白对多种移植到小鼠体内的月中 瘤模型有显著疗效,且对鼠科及非人灵长类动物的正常组织器官无明显毒 副作用，显示出其在抗肿瘤药物领域具有巨大的应用前景。目前，重组人 可溶性TNFSF10114_281蛋白在国内外均已进入临床研究阶段。
晶体结构显示，可溶性TNFSF10蛋白呈同源三聚体结构， 一个Zn" 隐藏在三聚体的中心，与三个Cys230残基及一个氯原子配对，Zn"的存 在对维持人可溶性TNFSF10蛋白的结构和功能具有重要作用。另有研究 资料表明，天然重组人可溶性TNFSF10蛋白在溶液中有多种存在形式， 主要包括三聚体、二聚体以及单体，其中最主要的及活性最高的形式是同 源三聚体。然而，研究表明相当一部分可溶性TNF超家族蛋白，在溶液 中仅仅由细胞外区域构成的同源三聚体是不稳定的。例如，人们在比较 TNFa和LT功能时就曾发现天然可溶性的TNFa三聚体在生理条件下是 不稳定的；又如，人们在试图将CD40L开发成治疗药物的研究过程中发 现，CD40L可溶性三聚体活性较低的重要原因之一是其在溶液中的稳定性较差。实验发现TNFSF10蛋白也存在同样的稳定性不理想的问题，这 不仅影响其保存，且可能与其在动物体内的半衰期短等问题有关。
为了提高具有医疗价值蛋白质的生物学活性，包括提高单位活性、热 力学稳定性、血液半衰期、保质期。人们常常对天然蛋白进行修饰。目前 有多种途径可以改善药用蛋白的生物活性，一种方法是通过化学结合诸如 PEG这样的试剂来提高蛋白分子量，从而提高生物学活性的方法。该法 也叫PEG化，起初是为了降低免疫原性。据报道，已有多种蛋白药物进 行PEG化。另一种方法是将目标蛋白和人血清白蛋白(HA)融合，形成 一特殊氨基酸序列。专利WO01/79840就是用这种方法来提高hGH蛋白 稳定性和半衰期，据报道其生物学活性提高是由hGH-HA融合蛋白稳定 性增加造成的。
发明内容
本发明目的是提高TNFSF10蛋白稳定性和抗肿瘤活性，提供一种新 型的抗肿瘤融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 本发明采用的技术方案是
一种抗肺瘤融合蛋白，包括至少一个生物活性分子和巻曲螺旋结构 域，所述生物活性分子源自TNFSF10或其改构体，所述巻曲螺旋结构域 源自能天然形成多聚体的蛋白质，或者源自才艮据能天然形成多聚体蛋白质 的巻曲结构域进行人工合成的多肽。
所述生物活性分子源自TNFSF10,是指所述生物活性分子可为 TNFSF10的全部或部分氨基酸序列的片段(尤其是胞外多肽片段，优选 为95~281或114~281位的多肽片段)，所述"改构体"指相对于原始 TNFSF10的全部或部分多肽序列，仅涉及单个或多个氨基酸的点突变， 突变后多肽的功能发生了变化，但主要的序列和结构未发生明显改变。这里的TNFSF10蛋白是按照TNF超家族(TNFSF )统一命名法则得 来的，其序列如SEQIDNO: 1所示。
所述巻曲螺旋结构域，是一种能与其它类似或相同的巻曲螺旋相互作 用的肽、多肽。这里的相互作用是指能形成多肽或蛋白质多聚体的类型， 这种相互作用是由多聚体结构域之间的共价健、氢键、疏水作用、范得华 力以及盐桥等作用力共同作用形成的。巻曲螺旋(coiled coil)是存在于 多种天然蛋白质中的结构模式，巻曲螺旋的 一个共同特点是在它们的 一级 结构中含有多个重复的由7个氨基酸组成的"七肽单元"(abcdefg)。每个单 元中的a、 d位多为非极性疏水氨基酸残基，如亮氨酸(Leu)、异亮氨酸
(lie)、缬氨酸(Val)等，这些位置的氨基酸残基特异性地位于巻曲螺 旋结构的内侧；e、 g位多为极性带电氨基酸，如赖氨酸(Lys)、谷氨酸
(Glu)等，这些氨基酸残基位于a、 d位氨基酸残基相互作用所形成的疏 水核心的外侧。巻曲螺旋结构域能天然形成稳定的二聚体、三聚体、多聚 体。
本发明人发现，将至少一个TNFSF10多肽分子和巻曲螺旋结构域融 合而构成的抗肿瘤融合蛋白，其生物学活性有明显提高。因此本发明为肿 瘤治疗提供另 一种潜在的可供选择的新型抗肿瘤融合蛋白。
所述"生物活性提高"包括根据本发明生产的融合蛋白比天然 TNFSF10蛋白具有更高的抗胂瘤活性。
所述"生物活性提高"也包括比天然TNFSF10蛋白具有更高的热力 学稳定性、制备过程抗理化因素影响能力较强、具有更长的保质期等。
所述"生物活性提高"还包括几种功能的结合，例如，新型抗肿瘤融 合蛋白抗肺瘤活性提高的同时，稳定性也有明显提高。可以预料，本发明 提供的融合蛋白与天然TNFSF10蛋白相比，血液半衰期也将会延长、有 效用药量将会减少。优选的，所述生物活性分子为具有下列氨基酸序列的多肽之一① SEQIDNO: 1 (TNFSF10);②SEQIDNO: 2 (TNFSF1095.281 );欲EQID NO: 3 (TNFSF10 4-281 )。
优选的，所*曲结构域源自Al申表面活性蛋白D( S^factoW Prated D )， 或者源自根据/J市表面活性蛋白D的巻曲结构域人工合成的多肽。所i^4曲 螺旋结构域还可以来源于其它能天然形成多聚体的蛋白质，包括 tetranectin、 collectin等蛋白家族中的巻曲螺旋结构域。
优选的，所述巻曲结构域为具有SEQIDNO: 4所示的tt酸序列的多肽 或其改构体。所述"改构体"指相对于SEQ ID NO: 4所示的ttH序列，仅 涉及单个或多个氨基酸的点突变，突变后多肽的功能发生了变化，但主要 的序列和结构未发生明显改变。
优选的，所述巻曲螺旋结构域来自人SPD蛋白中的巻曲螺旋结构， 简称SPDcc。该结构域能形成三聚化的a螺旋巻曲螺》走结构，其氨基酸序 列如SEQ ID NO: 4所述。该巻曲螺:旋的三聚化作用是通过一个SPDcc 中的巻曲螺旋和另外两个SPDcc中的巻曲螺旋形成3a螺旋三聚体，该三 聚体出人意料的在相对较宽的pH条件下仍很稳定。术语SPDcc也可指 SPD蛋白家族中天然巻曲螺旋的改构体，包括不损害其形成a螺旋三聚 体能力、在氨基^列上有变化的改构体。由此，本发明中的融合蛋白可 以包含SPD中的巻曲螺旋结构域，具有氨基S交序列同SEQ ID NO: 4至 少有72%同源的多肽，优选79%,进一步优选85。/。，更优选95%,最优 选为990/。。
优选的，所述巻曲结构域为SEQIDNO: 6所示核苷酸序列编码的多肽。 优选的，所述抗肿瘤融合蛋白具有SEQIDNO: 5所示的萄JJ愛序列。在已
知其tt酸序列的情况下，本领域技术人员可按照本领域常规方法方便的合成
所需要的融M白、达到相应4支术承文果。
7<植的，所述抗肿瘤融M白为SEQIDNO: 7所示核苦ii^列编码的多肽。
生物活性分子连接于所述巻曲螺旋结构域的N端或C端，所述生物 活性分子与所述巻曲螺旋结构域之间可通过柔性连接链共价连接，所述连 接链为1 20个氨基酸组成的多肽，优选连接链为2 10个氨基酸残基， 更优选为3 7个氨基酸残基。连接链在本质上是无免疫原性的，不易被 蛋白酶水解以及不含易与其它残基发生作用的氨基酸(如Gly)。优选的， 连接链不损害连接蛋白的功能，或至少不明显损害连接蛋白中的 一种蛋白 功能。更加优选的连接链被用于连接包含巻曲螺旋结构的蛋白。
下面是连接链的实例，据信这些连接链适合TNFSF10蛋白与巻曲螺 旋结构域之间的连接。
基于Fibronectin的连接链优选的氨基酸序列为PGTSGQQPSVGQ Q,对应于Fibronectin第2037 - 2049位氨基酸残基，更加优选的片断为 GTSGQ,对应第2038-2042位氨基酸残基。这种构建的优点是/>认对蛋 白酶水解具有很强抗性，同时因为Fibronectin在血液中浓度高，因此被 认为不会产生很高的免疫原性。
基于人IgG3铰链上面部分的连接链来源于IgG3 4交链区上面部分 的10个氨基酸残基，PKPSTPPGSS，已被应用于通过巻曲螺旋形成二聚 体的抗体。该序列被认为在人体中不会产生免疫原性。
可能的连接链还包括SGGTSGSTSGTGST、 AGSSTGSSTGPGSTT或 GGSGGAP。这些序列以前已一皮应用于巻曲螺旋和其它蛋白结构域之间的 连接。
本发明融合蛋白可按照本技术领域常规方法进行制备，具体为利用基 因工程技术将具有生物学活性的多肽或蛋白与巻曲螺旋结构域重组为一特殊 M酉银列，其中所述的巻曲螺旋结构域能天然形成稳定的3a螺旋，从而 并维持整个新型融合蛋白形^l定的三聚体或多聚体结构。具体的，本发明提供了一种新型抗肿瘤融合蛋白的制备方法，即将编
码人肺表面活性蛋白巻曲螺旋结构域的核苷酸序列和编码TNFSFIO细胞 外114 281位氨基酸序列的cDNA以及一个哺乳动物蛋白基因表达载体 连接起来，转化或转染到宿主细胞，然后通过发酵培养制得，该融合蛋白 命名为SPDcc-TNFSFlO,其^tJ^酸序列如SEQIDNO: 5所示。
所述"载体"是指能在宿主细胞中扩增的任何核酸实体。因此，该载体
可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖 于染色体复制，例如质粒。或者，该载体可以是导入宿主细胞时整合进宿 主细胞基因且与其所整合的染色体一起复制的载体。载体的选择通常取决 于其将要导入的宿主细胞。载体包括，但不限于质粒、噬菌体、病毒或粘
粒o
所述"宿主"包括细菌、酵母以及高等动物和植物细胞。 本发明中"肽"、"多肽"和"蛋白质"在全文可以相互交换使用。本发明
所述的多肽的氨基酸位点序列号遵循天然完整蛋白的常规序列计数方法。
本发明还涉^J斤述的抗肿瘤融M白在制备抗肿瘤药物中的应用。所述应
用包括用根据本发明提供的抗肿瘤融合蛋白即多肽复合物治疗哺乳动物
疾病以及作为治疗药物的 一种成分。
经实验验证，本发明提供的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10蛋白 在体外的稳定性明显优于天然TNFSFIO。
经实验验证，本发明提供的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10蛋白 在体外对多种人体肺瘤细胞具有显著的凋亡诱导作用，且其抗胂瘤活性明 显优于天然TNFSFIO。具体的，本发明提供的新型重组人可溶性 SPDcc-TNFSFlO蛋白对接种于棵鼠体内的人结肠癌(HCT-8 )具有明显 地肺瘤生长抑制作用，且其抗肿瘤效果优于天然TNFSFIO。剂量为10 mg/kg的SPDcc-TNFSFlO蛋白的抗肺瘤活性与30 mg/kg的天然TNFSFIO相当。
本发明的有益效果主要体现在提供了一种新型融合蛋白，其中巻曲
螺旋结构域能天然形成稳定的3a螺旋，从而促进融合蛋白形成稳定的三 聚体结构，相比于天然TNFSF10,稳定性好、半衰期长、利于保存，在 体外对多种人体肺瘤细胞具有更显著的凋亡诱导作用，其抗肺瘤活性有明 显提南。
(四)
图1为pET-28a- SPDcc-TNFSFlO质粒的酶切鉴定；其中M表示Marker, 1表示没有酶切的pET-28a-SPDcc-TNFSF10质粒，2表示双酶切后的 pET-28a- SPDcc-TNFSFlO质粒。
图2为新型重组人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白制备及纯度分析。其 中M表示蛋白Marker, 1诱导前菌体总蛋白；2表示诱导6h后菌体总蛋 白；3~6表示纯化过程中的SPDcc-TNFSFlO融合蛋白；7表示纯化后的 SPDcc-TNFSFlO融合蛋白，经Bio-red凝胶成像分析软件分析，其纯度为 96.2% (上样量30ug，考马斯亮兰染色)。
图3稳定性比较。正方形和圆形曲线分别代表SPDcc-TNFSFlO和天然 TNFSF10,纵坐标表示在4。C保存不同时间后溶液上清残余蛋白浓度。 图4为不同肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性比4交。图4A: HL-60,图4B: A549,图4C: HCT-8;正方形和圓形曲线分别代表SPDcc-TNFSFlO和天 然TNFSF10,横坐标表示加入样品的浓度，纵坐标表示样品加入后作用 72h的抑瘤率。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围 并不仅限于此实施例1: 一种新型重组人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白基因工程菌 的构建
按大肠杆菌密码子偏好性人工合成编码人SPD蛋白N端221~252位 氨基酸序列的核苷酸序列(见SEQIDNO: 8),其5，端包含一个Ncol酶 切位点和一个起始氨基酸Met的序列，3'端包含编码TNFSF10胞外 114 118位氨基酸序列的核苷酸序列。
设计引物扩增SPDcc-WFSF10融合序列(见SEQIDNO: 9)，引物
为
Pl: 5， AAAATTCCATGGTTGCTTCTCTGCGT P2: 5， ACCTCTTTCTCTCACAGGGAACAACTCA P3: 5， TGAGTTGTTCCCTGTGAGAGAAAGAGGT P4: 5， CGCCCGAATTCTTAGCCAACTAAAAA
利用重叠PCR技术扩增SPDcc-TNFSFlO融合序歹'j ，即先以人工合成 的人SPD螺旋结构域(见SEQIDNO: 8)为模板，用Pl、 P2扩增SPD 螺旋结构域序列；再以pET-28a-TNFSF10为模板，用P3 、 P4扩增 TNFSF10cDNA片断。将扩增得到的片段割胶回收，然后以回收得到的两 个从cDNA片断为模板、以Pl 、 P4为引物扩增融合序列。
融合序列的5，和3'端分别包含Nco I和Eco R I酶切位点。融合序列 和原核表达载体pET-28a经酶切、回收、连4妄后转化大肠杆菌感受态细胞， 挑取阳性转化克隆，抽提质粒，经双酶切、DNA测序等方法鉴定，得到 阳性重组表达载体质粒pET-28a-SPDcc-TNFSF10,(图1，图1为pET-28a-SPDcc-TNFSF10质粒的鉴定)。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),得到 表达SPDcc-TNFSF10融合蛋白的工程菌。挑取大量单菌落，经诱导、筛选，最终得到一株稳定的、表达量高的工程菌，命名为pET-28a-SPDcc-TNFSF 10-BL21 (DE3)。
实施例2:新型重组人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白的制备 发酵培养基组成
甘油2.5mL
蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl5g
K2HP044g
KH2P042g
Na2HP047g
MgS04.7H20lg
泡敌(GPE )1.5mL
自来水定容至IL。
发酵培养过程
种子培养取-80。C保存的pET-28a-SPDcc-TNFSF10-BL21(DE3)工程 菌保藏液1支，从中挑取1环，划线至含Kan(Kan)的LB平板，37。C培 养过夜。次日挑取一个边缘整齐、生长良好的单菌落接种到含50昭/mL Kan的LB液体培养基中，培养基装量为摇瓶的20 % ,摇床转速200rpm, 37。C培养12h。
罐上发酵按l: 50接种量将过夜培养物接种到含3.5L发酵培养基 的NBS Bioflo 110发酵罐中发酵，37。C培养至OD600达到0.6 ~ 0.8左右 后，力。IPTG至终浓度为1 mM诱导表达，同时添加ZnS04至终浓度为
1280uM。继续培养6h放罐。中途补料约200mL25%( v/v)甘油、150mL 17% (w/v)的酵母提取物和150mL 17% (w/v)的蛋白胨，发酵过程中pH控 制在7.0、溶氧控制在50%。
每升发酵液可得50 80g湿菌体，目标蛋白的表达量占菌体总蛋白的 50%以上。将100g菌体用IO倍体积的50mMTris-HCl(pH7.0)破壁缓冲液 悬浮，超声破碎，离心、去除沉淀。上清先用0.45uM膜过滤，再用3KD Pall超虑膜超虑至200ml,用200ml 50mM PB(pH6.4)稀释后继续超虑至 200ml,重复上述步骤直至溶液pH达到6.4为止。将超虑后的样品上到 已用50mM PB(pH6.4)緩冲液平纟軒好的SP离子交换柱上，；降样品上完后 分别用50mM PB(pH6.4)和50mM PB(pH6.4) + 300mM NaCl两种緩冲液清 洗去杂，然后用50mM PB(pH6.4) + 600mM NaCl緩冲液将目标蛋白洗脱 下来。往SP柱洗脱样品緩慢添加硫酸铵至60%饱和度，4。C静置2h， 10000rpm离心20min,去上清；蛋白沉淀用20mMPB(pH7.5)重悬，用 0.45uM膜过滤后，分多次上到已用同样緩冲液平衡好的Superdex75分子 筛上，收集洗脱峰。通过上述纯化步骤得到的新型重组人可溶性 TNFSF10-SPD融合蛋白(见SEQIDNO: 5)电泳纯度达96.2% (见图2, 图2为新型重组人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白制备及纯度分析)。
实施例3:稳定性比较
将天然TNFSF10蛋白和实施例2得到的新型重组人可溶性 SPDcc-TNFSF10融合蛋白分别用20mM PBS (pH7.4)稀释到3mg/ml，用 0.2pm膜过滤除菌后，置于4。C水箱中保存。分别于不同时间取样， 10000rpm离心20min,测上清中残余的蛋白浓度。结果(图3，稳定性比 较)表明，天然TNFSF10蛋白在4。C保存一天后，浓度由3mg/ml快速降到1.3mg/ml,而新型重组人可溶性SPDcc-TNFSF10融合蛋白在整个实验 观察期内蛋白浓度无明显变化。表明添加SPD蛋白螺旋结构域后， TNFSF10蛋白稳定性在4 °C中有显著提高。
实施例4:体外生物学活性
将对数生长期的肿瘤细胞(人白血病细胞HL-60，人肺癌细胞A549 以及人结肠癌细胞HCT-8),用0.25%胰酶消化后，加入含10%胎牛血清 的RPMI-1640培养基中，吹打细胞使形成细胞悬液，计数，以lxl05cell/ml 重新接种于96孔细胞培养板，100pd/孔。同时加入对倍连续稀释的实施 例2得到的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白。37。C培养72 小时后，弃上清加入MTT，继续孵化6小时，加入DMSO，振荡IO分钟， 用酶标4义测570 nm处的OD值。结果(图4,图4为体外抗肿瘤活性比 较)显示二者对不同肿瘤细胞的生长均有一定程度的抑制作用，并呈剂量 依赖性。虽然对细胞生长的抑制效果和肿瘤类型有关，但是 SPDcc-TNFSFlO的抗肺瘤效果均明显强于天然TNFSF10 。 SPDcc-TNFSFlO抑制50%人白血病细胞HL-60生长所需的浓度只需约 lng/ml，而天然TNFSF10则需要10ng/ml左右。
实施例5:体内动物实验，
无菌条件下取生长旺盛的人体肠癌HCT-8体内第三代肺瘤模型，采 用插块法约2mm^中瘤组织/鼠，异种移植于T细胞免疫缺陷棵小鼠右腋 皮下，棵小鼠置于层流架中飼养，所用的飼料、垫料、笼具及接触的器械 等均应高压消毒后使用。待肿瘤生长至50~70 mm3后(胂瘤接种后7天)， 开始给药空白对照(生理盐水，连续给药IO天)、实施例2得到的新型重组人可溶性SPDcc-TNFSFlO (30、 10mg/kgiv连续10天)以及阳性对 照天然TNFSF10 ( 30、 10mg/kg iv连续10天)。其间每3~5天体外对肿 瘤(以卡尺测量肿瘤长径a、短径b，肿瘤体积axb2)进行动态测量。 结果显示SPDcc-TNFSFlO分别给药30和10mg/kg静脉注射连续给药10 天后，人体肠癌HCT-8异种移植于T细胞免疫缺陷棵小鼠模型的相对肺 瘤增长率分别为22.97%和30.07%;而天然TNFSF10分别30 mg/kg和 10mg/kg静脉注射连续给药10天后，相对肿瘤增长率分别38.22%和 64.22%，表明SPDcc-TNFSF10体内抗肺瘤效果明显优于天然TNFSFIO。序列表—ST25
<110>
<120〉
〈130〉
<160〉
<170>
<210> <211〉 〈212〉 <213〉
SEQUENCE LISTING
浙江大学
一种抗肿瘤融合蛋白及其应用
Patentln version 3.4
1
281 PRT
Human astrovirus
<400〉 1
Met Ala Met Met Glu Val Gin Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gin Thr Cys 15 10 15
Val Leu lie Val lie Phe Thr Val Leu Leu Gin Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gin Met Gin Asp Lys 35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly lie Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gin Val 65 70 75 80
Lys Trp Gin Leu Arg Gin Leu Val Arg Lys Met lie Leu Arg Thr Ser 85 90 95
Glu Glu Thr lie Ser Thr Val Gin Glu Lys Gin Gin Asn lie Ser Pro 100 105 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His lie Thr Gly 115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val lie 165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190
Gin Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin 195 200 205
Tyr lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys 210 215 220Ser Ala Arg 225AsnSerCys 230TrpSerLysAspAla 235序列表—ST25 Glu Tyr Gly LeuTyr 240
Ser lie TyrGinGly 245GlyliePheGluLeu 250LysGlu AsnAspArg 255lie
Phe Val SerVal 260ThrAsnGluHisLeu 265lieAspMet AspHis 270GluAla
Ser Phe Phe 275GlyAlaPheLeuVal 280Gly
<210> 2 〈211> 187 <212〉 PRT <213〉 Human astrovirus
<400〉 2
Thr Ser Glu 1GluThr 5lieSerThrValGin 10GluLys GinGinAsn 15lie
Ser Pro LeuVal 20ArgGluArgGlyPro 25GinAxgVal AlaAla 30Hislie
Thr Gly Thr 35ArgGlyArgSerAsn 40ThrLeuSerSer Pro 45AsnSerLys
Asn Glu Lys 50AlaLeuGlyArg 55LyslieAsnSerTrp Glu 60SerSerArg
Ser Gly His 65SerPheLeu 70SerAsnLeuHisLeu 75Arg AsnGlyGluLeu 80
Val lie HisGluLys 85GlyPheTyrTyrlie 90TyrSer GinThrTyr 95Phe
Arg Phe GinGlu 100GlulieI>ysGluAsn 105Thrl>ysAsn AspLys 110GinMet
Val Gin Tyr 115lieTyrLysTyrThr 120SerTyrProAsp Pro 125lieLeuLeu
Met Lys Ser 130AlaArgAsnSer 135CysTrpSerLysAsp Ala 140GluTyrGly
Leu Tyr Ser 145lie丁yrGin 150GlyGlyliePheGlu 155Leu LysGluAsnAsp 160
Arg lie PheValSer 165ValThrAsnGluHis 170Leulie AspMetAsp 175His
Glu Ala SerPhePheGlyAlaPheLeuValGly
180
185
<210〉 3
<211> 168
<212〉 PRT
<213〉 Human astrovirus
17序列表一ST25
<400> 3
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His lie Thr Gly Thr 15 10 15
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys 20 25 30
Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His 35 40 45
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val lie His 50 55 60
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin 65 70 75 80
Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr 85 90 95
lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys Ser 100 105 110
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser 115 120 125
lie Tyr Gin Gly Gly lie Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg lie Phe 130 135 140
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu lie Asp Met Asp His Glu Ala Ser 145 150 155 160
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 165
〈210> 4 <211> 32 <212> PRT
<213〉 Hu脇n astrovirus 〈400〉 4
Val Ala Ser Leu Arg Gin Gin Val Glu Ala Leu Gin Gly Gin Val Gin 15 10 15
His Leu Gin Ala Ala Phe ,Ser Gin Tyr Lys Lys Val Glu Leu Phe Pro 20 25 30
<210> 5 <211> 200 <212〉 PRT
〈213〉 Human astrovirus <400> 5
Val Ala Ser Leu Arg Gin Gin Val Glu Ala Leu Gin Gly Gin Val Gin 15 10 15
His Leu Gin Ala Ala Phe Ser Gin Tyr Lys Lys Val Glu Leu Phe Pro 20 25 30序列表一ST25
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His lie Thr Gly Thr35 40 45
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys50 55 60
Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His65 70 75 80
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val lie His85 90 95
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin100 105 110
Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr115 120 125
lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys Ser130 135 140
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser145 150 155 160
lie Tyr Gin Gly Gly lie Phe Glu Leu Lys Glu Asn A印Arg lie Phe165 170 175
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu lie Asp Met Asp His Glu Ala Ser180 185 190
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly195 200
<210〉 6
<211〉 96
<212〉 DNA
<213> Unknown
〈220〉
<223>人工合成
〈400〉 6
gttgcttctc tgcgtcagca ggttgaggcccttcagggtc
gctttctctc aatacaagaa agttgagttgttccct
〈210〉 7
<211> 600
〈212〉 膽
<213> .Human astrovirus
<400> 7
6096
gttgcttctctgcgtcagcaggttgaggcccttcagggtc aagttcaaca cctccaggct60
gctttctctc3atac犯g犯ag"ttgagUgttccctgtga gagaaagaggtcctcagaga120
gtagcagctcacataactgggaccagaggaeLgeiagceL￡LC￡L cattgtcttctccaaactcc180
aagaatgaaaaggctctgggccgcaaaata aactcctggg aatcatcaaggagtgggcat240
tcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactgg tcatccatga300序列表—ST25
atactttcgatttc鄉agg360
aacgsc肌acaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattg420
ttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgc解朋tatggactctattcc480
atct3tcaaggggg组atttgagctt犯ggaatttttgtttctgtaaca540
aatga^gcacttgatagacatggaccatgaagccagtttttttggggcctttttagttggc600
<210> 8 <211> 118 〈212> 腿 <213> Unknown
<220> 〈223〉 人工序列
〈400〉 8 aattccatggttgcttctctgcgtcagcaggttgaggcccttxagggtcaagttcaacac60
ctccaggctgctttctctcagttgagttgttccctgtgag柳a卿g118
<210> 9 <211〉 632 〈212〉 腿 〈213〉 Unknown
〈220〉 〈223〉 人工序列
〈400〉 9 aattccatggttgcttctc"tgcgtcagcaggttgaggcccttcagggtcaagttcaacac60
CtCC3ggCtgc"tttctc"tcaatac犯gaaagttgagttgttccctgtgag120
cctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttct180
ccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaagg240
agtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccstg犯300
aaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaa360
acg3caaac￡iaatggtccaaaatacacaagttatcctgac420
cctatattgttgatgaa肪gtgctagaaatctaaagatgcagaatstgga480
ctctattccatctatxaagggggaatatttgagcttaaggaatttttgtt540
atgagcacttgatagacatggaccatgaagccagtttttttggggccttt600
ttagttggctaagaattcgtcgacctgcatat632
20
权利要求
1. 一种抗肿瘤融合蛋白，包括至少一个生物活性分子和卷曲螺旋结构域，所述生物活性分子源自TNFSF10或其改构体，所述卷曲螺旋结构域源自能天然形成多聚体的蛋白质，或者源自根据能天然形成多聚体蛋白质的卷曲结构域进行人工合成的多肽。
2. 如权利要求1所述的抗肿瘤融合蛋白，其特征在于所述生物活性分子 为具有下列氨基酉拼列的多肽之一①SEQIDNO: 1;②SEQIDNO: 2; ③SEQIDNO: 3。
3. 如权利要求1所述的抗肺瘤融好白，^^4于所錄曲结构域源自A^ 表面活性蛋白D (&咖cto"/D),或者源自根据A^申表面活性蛋白 D的巻曲结构域进行人工合成的多肽。
4. 如权利要求3所述的^y中瘤融M白，其特4i^于所i^4曲结构域为具有 SEQ ID NO: 4所示的MS菱序列的多肽或其改构体。
5. 如权利要求3所述的抗肿瘤融M白，^4村球于所tt曲结构域为SEQ ID NO: 6所示核普S錄列编码的多肽。
6. 如权利要求1所述的抗肿瘤融M白，^4寺4球于所述抗肿瘤融M白具有 SEQIDNO: 5所示的MJ錄列。
7. 如权利要求1所述的抗月中瘤融M白，^#4￡^于所述抗月中瘤融^"白为SEQ ID NO: 7所示核苷l姊列编码的多肽。
8. 如权利要求1 7之一所述的抗肿瘤融好白，^^#棘于所述生物活性分子 与所述巻曲螺旋结构域之间通过柔性连接链共价连接，所述柔性连接 链为1~20个氨基酸组成的多肽。
9. 如权利要求8所述的抗肿瘤融M白，^4^碌于所述柔性连接链为2 10 个氨基酸组成的多肽。
10. 如权利要求1 7之一所述的^U中瘤融M白在制备抗月中瘤药物中的应用。
全文摘要
提供一种新型的抗肿瘤融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤融合蛋白包括至少一个生物活性分子和卷曲螺旋结构域，所述生物活性分子源自TNFSF10或其改构体，所述卷曲螺旋结构域源自能天然形成多聚体的蛋白质，或者源自根据能天然形成多聚体蛋白质的卷曲结构域进行人工合成的多肽。本发明新型融合蛋白中的卷曲螺旋结构域能天然形成稳定的3α螺旋，从而促进融合蛋白形成稳定的三聚体结构，相比于天然TNFSF10，稳定性好、利于保存，在体外对多种人体肿瘤细胞具有更显著的凋亡诱导作用，其抗肿瘤活性有明显提高。
文档编号C07K19/00GK101456913SQ20081012147
公开日2009年6月17日 申请日期2008年10月14日 优先权日2008年10月14日
发明者吴雪昌 申请人:浙江大学