专利名称：地衣芽孢杆菌外膜蛋白提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制品领域，具体的说是提供一种作为微生物添加剂的地衣芽孢杆
菌外膜蛋白的提取方法。
背景技术：
药物饲料添加剂的广泛运用，尤其是抗生素饲料添加剂的利用，在动物防病治病 等方面发挥重要作用的同时，也给畜牧生产和人类带来了一定的副作用。首先是抗生素在 杀灭致病菌的同时，也杀灭了对动物机体的有益菌，破坏肠道内微生物的微生态平衡，导致 动物，特别是幼畜禽对病原微生物的易感性。另外，长期饲喂抗生素会使动物机体内产生具 有耐药性的细菌，这些细菌对人畜均有害。为此，各国都在积极进行各种新型抗生素替代品 的研究开发，其中微生态制剂已目前研究的主要热点之一。 微生态饲料添加剂是根据微生态学理论研制的含有对动物有益微生物的活菌制 剂，它们通过维持动物肠道内微生态平衡而发挥作用，具有促进动物生长发育，提高动物机 体免疫力等多种功能，且无污染、无残留、无耐药性和对环境无害等，是一类新型绿色环保 饲料添加剂。这些禽畜用的益生菌制剂含有芽孢杆菌，乳酸杆菌，粪链球菌，双歧杆菌，酵母 等，光合细菌和梭状芽胞杆菌属的部分菌株及噬菌蛭弧菌等也偶然被用做益生菌添加到仔 猪和仔鸡饲料中。 微生态制剂的作用机理一般认为微生态制剂对促进畜禽健康的作用机理包括以 下几个方面l.帮助寄主肠道有益菌群尽快达到或者维持其生态平衡；2.饱和肠粘膜的吸 附位点，致使病原菌无法在肠粘膜上定植；3.发酵碳水化合物，产生短链脂肪酸等代谢产 物，降低肠道内pH值，从而抑制肠道内发酵蛋白质的菌群活性，控制其发酵速度；4.剌激寄 主免疫细胞的活性，提高免疫球蛋白的水平；5.剌激寄主产生多种消化酶，协同寄主增加 对维生素等营养物质的消化吸收。 活菌微生态制剂在动物养殖中的作用活菌制剂始于上世纪初，有人用酸牛奶来 调整幼畜腹泻出现的肠道微生物菌群失调。后来，在研究中人们发现用活菌制剂可防止畜 禽的腹泻和肠炎，继之又发现活菌制剂还可改善动物对饲料的利用，并有利于促进畜禽的 生长发育和肠道健康，从而扩大了活菌制剂在畜牧生产中的作用和应用前景，概括起来，主 要有以下几个方面的作用。 改善动物胃肠道微生态环境研究表明，动物自身及许多致病菌不会产生各种有 毒物质，如胺、氨、细菌毒素、氧自由基等代谢产物。有些有益菌可以阻止毒性胺和氨的合成 或把它们分解中和细菌毒素，从而避免这些有害物质对动物机体组织细胞的损害作用。一 些好氧菌则通过产生超氧化物歧化酶来消除氧自由基，减少或消除氧自由基对细胞及细胞 器膜质结构的损害。乳酸菌能够产生有机酸和抗菌物质，降低肠道内pH值和氧化还原电 位，有利于宿主生长发育和维持肠道健康。 产生有益物质动物微生态活菌制剂能够在动物体内产生各种消化酶，合成B族 维生素、维生素K等动物所必需的营养物质；同时能促使动物体增加对肠道内容物中钙、镁
3等营养物质的吸收。 建立和维持肠道微生态平衡研究表明，动物肠道内寄居的微生物，主要为厌氧 菌。通常情况下，肠道内有益菌和致病菌会保持一定比例，当条件发生改变时，致病菌大量 繁殖引起平衡失调，从而导致动物体患病。当需氧型益生菌进入消化道后，生长繁殖消耗肠 道内大量氧气，通过"生物夺氧"使需氧型致病菌大幅度下降，因而起到防止动物患病的作 用。研究还发现，益生菌能够有秩序地定植于粘膜、皮肤等表面或细胞之间形成生物屏障， 这些屏障可以阻止病原微生物的定植，起着占位、争夺营养。互利共生或拮抗作用，形成保
护屏障，阻止病原菌的侵入，从而对致病菌的定植产生抑制作用。 增强动物免疫能力和促进动物生长微生态制剂可作为非特异性免疫调节因子， 增强吞噬细胞的吞噬能力和细胞产生抗体的能力，剌激动物产生干扰素，从而增强抗病能 力。据报道，用活菌微生态制剂——益生素饲喂哺乳仔猪，添加组腹泻率明显比对照组减少 (3.91%，P < 0.01)，成活率提高79%。在10 28日龄的仔猪饲料中添加益生素，试验组 采食量平均比对照组增加70g/d，增重提高4. 2%。又有研究报道，在雏鸡中分别饲喂和不 饲喂乳酸杆菌制剂两个组的基础上，进行鸡的白痢沙门氏菌攻毒试验。结果表明，饲喂乳酸 杆菌雏鸡组与对照组相比，死亡率明显降低了 20%。还有报道称在鱼虾饲料中添加微生态 制剂，可使鱼虾增重提高10% 20%。 在畜牧生产中常用的微生态添加剂，乳酸菌和芽胞杆菌类益生菌为主要的微生态 添加剂。细菌细胞膜中的一种重要组成成分外膜蛋白(outer membrane Protein, 0MP)的 免疫作用越来越受到科技人员的关注，并进行了研究。实验证明，0MP具有良好的免疫原性， 不仅可剌激体液免疫，而且也可剌激细胞免疫作用。0MP有多种提取方法，张晓华等认为不 同研究者得到的同一种细菌0MP的SDS-PAGE图谱之所以有所不同，与细菌的培养条件、0MP 的制备方法以及菌株的不同有关。不同研究者制备的OMP其免疫效果也不同。本试验采用超声 波破壁、离心粗提、SDS沉淀、SDS和PBS再次沉淀、透析、超滤纯化提取的地衣芽孢杆菌株0MP。
益生菌膜蛋白的提取方法有多种，在水提醇沉的基础上，常采用反复冻融、酶解、 超声波、膜处理等方法进行辅助提取或精制。但这些方法均有一些不足之处反复冻融的缺 点在于费时费力，且细胞破裂率低，有效利用低，不易纯化；超声波提取膜蛋白的优势是提 取时间短，勿须加热，提取量多；酶解法提取缺点在于必须要有合适的pH、温度，有效破比 率低，提取量有限不利于工业化生产；超滤膜技术应用的缺点是必须知道目的膜蛋白的相 对分子质量才能选取有效超滤膜，否则须预选确定选膜，单采用一种膜分离效果有限。超滤 与微滤、纳滤、反渗透及电渗析等多种性能的膜技术进一步联用，取代能耗大、费用高、周期 长且处理不彻底的传统工艺操作，将是多糖提取工艺发展的新趋势；离子交换技术缺点在 于根据膜蛋白特性选择不同的柱型、洗脱剂种类、pH值和洗脱速率，同样提取量有限不利于 工业化生产。 因此，为了在最大限度保持蛋白活性的基础上提取乳酸杆菌外膜蛋白，使多糖的 生物学功能研究更为准确，同时为了适用于工业化生产的需求，需要一种简单、实用、经济、 高效的乳酸杆菌外膜蛋白的提取方法。
发明内容
本发明的第一个发明目的是提供一种地衣芽孢杆菌外膜蛋白的提取方法，包括
(1)利用超声波进行地衣芽孢杆菌细胞的破壁；(2)粗提物进行6000rpm， 15min离心，取上清液2L ; (3)在上清中加15ml 2%十二烷酰肌氨酸钠溶液充分混匀，室温作用lh，于 4°C 100， OOOr/min超速离心lh ; (4)将沉淀用0. 6mL 0. lmoL/L PBS(pH7. 4)和等量2%十二烷酰肌氨酸钠溶解，室 温作用2h，于4t: 100， OOOr/min超速离心lh，将沉淀适量的溶于0. lmoL/L PBS(pH7. 4)中;
(5)经过透析、超滤处理后，分装。 在一个具体实施方案中，所述的高压细胞破碎机的工作参数，优选功率450w、破碎 时间2s、间断ls、反复破碎80次。 在另一个具体实施方案中，所述的超滤，优选使用0. 45 ii m的微孔滤膜或截留分 子量为8600道尔顿的超滤膜(层析柱等)。
有益效果 1、超声波提取时间短，勿须加热，破壁效果好，破壁率高，因此能获得较多的膜蛋 白粗提物； 2、超声波提取过程是一个物理过程，破壁过程会产热，因此要在盛放菌的容器外 放冰水降温，超声过程中无化学反应，破壁物在短时间内保持不变，生物活性不减，同时提 高了破碎速度，縮短了破碎时间，可极大地提高提取效率； 3、经过几次离心后去除大量破壁后的细胞碎片及一些杂蛋白，再经过超滤后达到 了有粗提到精提的效果； 4、经过试验发现，所得的地衣芽孢杆菌外膜蛋白产量为0. 4kg/L，活性为1. 5X 107 活性单位/mg，完全满足生产需要。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1 :地衣芽孢杆菌外膜蛋白的提取 实施方案将地衣芽孢杆菌及培养大量后，先用超声波破壁，将粗提物进行 6000rpm， 15min离心，取上清液，在上清中加2%十二烷酰肌氨酸钠溶液充分混匀，室温作 用lh，于4°C 100， OOOr/min超速离心lh，将沉淀用0. lmoL/L PBS(pH7. 4)和等量2%十二 烷酰肌氨酸钠溶解，室温作用2h，于4°C 100， OOOr/min超速离心lh，将沉淀适量的溶于 0. lmoL/L PBS(pH7. 4)中，经过透析、超滤处理后，分装。
实施例2 :外膜蛋白的产量和活性鉴定 根据实施例1的方法，利用Bradford法测外膜蛋白含量，每2L菌液，最终能得到 0. 8kg外膜蛋白。 另外，根据MTT法活性测定的方法，鉴定外膜蛋白或含有外膜蛋白的微生物添加 剂的活性，操作步骤如下 1、接种细胞用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的 RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103-104个细胞接种于96孔板中，每孔体积 200 ii 1。 2、培养细胞将培养板移入C02培养箱中，在37°C、5% C02及饱和湿度条件下，培
5养3-5天。培养时间取决于实验目的和要求。 3、呈色培养第3-5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20 yl， 37°C ，继续孵育4h， 终止培养，小心吸弃孔内培养液上清。每孔加入150iilDMS0(二甲基亚砜)，振荡10min，使 结晶物充分溶解。 4、比色选择490nm波长，在酶标仪上测定个孔吸收值，记录结果。
结果发现外膜蛋白原液的活性为1. 5X 107活性单位/mg ;含有外膜蛋白的微生
物添加剂溶液4X 105活性单位/mg，完全能满足生产需要。
权利要求
一种用于地衣芽孢杆菌外膜蛋白的提取方法，步骤包括(1)利用超声波进行地衣芽孢杆菌细胞的破壁；(2)粗提物进行6000rpm，15min离心，3次，取上清液2L；(3)在上清中加15ml 2％十二烷酰肌氨酸钠溶液充分混匀，室温作用1h，于4℃100,000r/min超速离心1h；(4)将沉淀用0.6mL 0.1moL/L PBS(pH7.4)和等量2％十二烷酰肌氨酸钠溶解，室温作用2h，于4℃100,000r/min超速离心1h，将沉淀适量的溶于0.1moL/L PBS(pH7.4)中；(5)经过透析、超滤处理后，分装。
2. 权利要求1的方法，其中所述的超声波的工作参数，优选功率450w、破碎时间2s、间 断ls、反复破碎80次。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述的超滤，优选使用0. 45 ii m的微孔滤膜或截留分子 量为8600道尔顿的超滤膜(层析柱等)。
全文摘要
本发明提供一种作为微生物添加剂的地衣芽孢杆菌外膜蛋白的提取方法，包括超声波破壁、离心粗提、SDS沉淀、SDS和PBS再次沉淀、透析、超滤纯化。其中，所述的超声波的工作参数，优选功率450w、破碎时间2s、间断1s、反复破碎80次，超滤优选使用0.45μm的微孔滤膜或截留分子量为8600道尔顿的超滤膜(层析柱等)。本发明方法去除大量破壁后的细胞碎片及一些杂蛋白，再经过超滤后达到了有粗提到精提的效果，并且，浸提物在短时间内保持不变，生物活性不减，同时提高了破碎速度，缩短了破碎时间，可极大地提高提取效率，能满足工业生产的需要。
文档编号C07K1/34GK101759771SQ200810154338
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者李旭东, 王小娥, 苏建东 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司