专利名称：：中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，特别地，本发明涉及一种中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因及其编码蛋白。更具体地说，本发明涉及中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7(Mainroyaljellyprotein)基因的cDNA序列，该cDNA序列编码的AccMRJP7是西方蜜蜂"/w'5/ze"j'/era)AmcMRJP-7蛋白的同系物，该AccMRJP7经过翻译后加工所得到的蛋白是西方蜜蜂AmcMRJP7蛋白(AmcMRJP7)的同系物。本发明还涉及有该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和蛋白的应用，以及所述多核苷酸和所述蛋白的制备方法。
背景技术：
：蜂王浆(RJ)是由成年工蜂头部的外分泌腺体分泌的一种化合物，它是蜂群用于哺育蜂幼虫的食物的重要组分，是促进幼虫产生级型分化的最重要的营养因素。蛋白质是蜂王浆最主要的组分之一，占王浆干重的50y。(Klaudiny"a/.1994,JApicRes.33:105-111.)。一般王浆蛋白由水溶性蛋白(WSPs)和非水溶性蛋白组成，其中水溶性蛋白占总蛋白含量的46%-89%CTomodawW.1977,/z'c16:125-130;TakenakaandEchigo1983,A^ppowiVoge汰(3gaA:wXa油..57:1203-1209)，为王浆蛋白的主要部分，称MajorRoyalJellyProteins(MRJPs)(LenskyandRakover1983,0附;？尸/j^z'o/.75:607-615)。此外，Schmitzova等根据研究结果推测蜂王浆蛋白中MRJPs的含量可能达到90%(Schmitzovada/.1998,Ce〃Mo/h/e54(9):1020-1030)。Drapeau等通过对西方蜜蜂基因组研究确定，西方蜜蜂MRJPs家族有9个成员，即MRJP1MRJP9(Drapeau"a/.2006，GenomeResearch，16:1385-1394)。王浆酸(10-羟基-2-癸烯酸)曾是历史上最早明确具有抗菌活性和抗肿瘤作用的王浆活性成分，迄今一直作为国际贸易中鉴别王浆质量的特征指标应用。随白组分具有护肝、免疫调节、抗疲劳等功能。据报道Watanabe等报道，西方蜜蜂MRJP1能无血清培养中人淋巴细胞生长(Watanabewa/.1998.Cyotec/wo/ogy.26:23-27.);Kamakura等发现分子量为57kD的MRJP1蛋白具有促进小鼠原代肝细胞DNA合成和抗疲劳作用(Kamakura"a/，2001，JNutrSciVitaminol(Tokyo).47(6):394-401.);Majtan等发现体外表达的MRJP1具有刺激老鼠巨噬细胞释放肿瘤坏死因子"(TNF")，提高肝细胞的增殖功能，对老鼠还有抗疲劳的作用(Majtan"a/,2005，IntImmunopharmacol.6(2):269-278)。Okamoto等报道MRJP3具有抗过敏和免疫调节功能，可能是王浆中的抗炎因子(Okamoto"a/2003，LifeSci.73(16):2029-2045)。因此，MRJPs蛋白己显示出重要的营养学价值。在目前全世界己报道的9个蜜蜂属(j;^)成员中，只有西方蜜蜂(j;^swe仏/era,分布最广的常见亚种为意大利蜜蜂Ame//^ra^/^)和东方蜜蜂04.cem^)是得到人工驯化和规模化人工养殖，并用于蜂蜜生产。相对于西方蜜蜂来说，东方蜜蜂，包括我国特有的亚种中华蜜蜂(Acera"acera"a)因生产性能低，蜂群数量在原产地处于萎縮状态。但国内外研究表明，因中华蜜蜂因长期适应于我国地理气候，具有西方蜜蜂所不具备的抗病性、耐寒性等抗逆性能，其生物学特点也多不同于前者,在蜜蜂育种和生态多样性保护等方面具有非常重要的利用价值。根据Pothichot等研究发现，东西方蜜蜂的王浆营养功能存在差异把东西方蜜蜂1日龄以内的幼虫转移到西方蜜蜂蜂群中培育王台，初始的王台接受率无明显差异，均接受良好，到3-4日龄时中蜂王台中的幼虫出现死亡而被意蜂清除，死亡率很高，而意蜂王台则一切正常(PothichotandWongsiri.1993，AsianApic.128-133);东方蜜蜂和西方蜜蜂王浆中各组分的含量以及蜂王交叉词养试验也验证了东方蜜蜂和西方蜜蜂的王浆成分不同这一观点(TakenakaandTakenaka1996,BiosciBiotechBiochem.60:518-520)。蜜蜂种间蜂王浆，包括蛋白营养功能差异客观存在，对西方蜜蜂MRJPs的广泛研究不能取代东方蜜蜂MRJPs的相关研究和开发利用。泰国学者近年来从分布于泰国的另一个东方蜜蜂亚种印度蜜蜂04.cemmZm^'ca)王浆腺cDNA文库中克隆到了主要王浆蛋白AcMRJPl、AcMRJP2、AcMRJP5基因序列，未能得到AcMRJP4、AcMRJP6AcMRJP8基因序列(Srisuparbh&<2/2003，JBiochemMolBiol.36(6):572-579;Imjongjiraketal2005,JBiochemMolBiol.38(1):49-57)。近年来我国苏松坤等从构建的中华蜜蜂8曰龄工蜂头部的cDNA文库中获得了中华蜜蜂编码AccMRJPl、AccMRJP2、AccMRJP3和AccMRJP5的完整cDNA序列(苏松坤等2004，遗传学报；31(11):1248-1253;苏松坤等2005，中国农业科学.38(3):612-618;Suda/.2005.Apidologie.36:389-401)，并发布于国际GenBank。苏松坤等已申报了关于AccMRJPl的两项发明专利(1)中华蜜蜂AccMRJPl表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法(申请号200810061679.X)，(2)促进细胞生长的中华蜜蜂AccMRJPl真核表达产物的制备方法(申请号200810061679.X)。但是，对于AccMRJPs中cDNA含量相对较少的基因，如AccMRJP4，一直未克隆成功，AccMRJP6和AccMRJP7均只有获得部分序列(Su"a/.2005.Apidologie.36:389-401)，因技术原因未能得到全长基因序列。如他们在GenBank中只公布了编码AccMRJP7蛋白的220个氨基酸序列的核苷酸序列(GenBank序列号GI:AY862496)，而根据发明人研究结果，AccMRJP7的完整蛋白实际全长有449个氨基酸，即苏松坤等发布的蛋白序列缺少249个个氨基酸，而这部分序列是不可能在科研和应用中实现重组表达的。本发明获得完整的AccMRJP7基因序列，为实现其生物工程利用提供了技术关键，具有十分重要的创新价值。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因及其编码蛋白。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种中华蜜峰王浆主蛋白AccMRJP7基因，它具有SEQIDNo.5所示的序列。一种上述中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因的编码蛋白，它具有SEQIDNo.6所示的氨基酸序列。上述中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因的编码蛋白在制备抗体方面的应用。本发明的有益效果是:本发明首次提取分离中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的基因，该基因所编码的AccMRJP7蛋白是一种生物活性物质，可应用于功能或营养食品，可作为抗原用于蜂王浆质量快速检测试剂的制备，用其作为抗原制备的抗体适合于作蜜蜂MRJPs家族蛋白的分子生物学科研，为开发蜂王浆蛋白深加工和营养产品开发提供新的依据。图1是中华蜜蜂头部cDNA文库克隆内扩增出的AccMRJPs家族及相关王浆多肽PCR产物片断琼脂糖凝胶电泳检测图，其中，15-16泳道为AccMRJP7;图2是中华蜜蜂AccMRJP7的PCR扩增结果及重组质粒双酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测图，其中，A图为AccMRJP7PCR产物；B图为pMD18-T-AccMRJP7双酶切(Sam/H&J^oI)琼脂糖凝胶电泳鉴定图；C图为pGEX-4T-2-AccMRJP7双酶切(SflmT/I&^/zoI)琼脂糖凝胶电泳鉴定图；M为DNAMarker;箭头所示为目的基因片段；图3是不同IPTG浓度下中华蜜蜂AccMRJP7基因重组表达产物的SDS-PAGE分析电泳图；其中，M为标准蛋白分子量Marker;泳道1为未转化任何载体的大肠杆菌BL21(DE3);泳道2为质粒pGEX-4T-2在大肠杆菌BL21(DE3)中表达；泳道3-6为GST-AccMRJP7融合蛋白(箭头所示)在不同浓度IPTG(0.004g/L、0.04g/L、0.08g/L、0.32g/L)诱导下的表达情况；图4是中华蜜蜂GST-AccMRJP7多克隆抗体与西方蜜蜂王浆蛋白样品和中华蜜AccMRJP5和AccMRJP3a真核表达产物的Westernblot印迹分析电泳图；其中，图A为西方蜜蜂王浆蛋白样品的SDS-PAGE电泳图，M为标准蛋白分子量Marker,RJ所示为西方蜜蜂王浆蛋白样品。图B和C为Westemblot印迹分析结果；RJ所示为西方蜜蜂王浆蛋白；泳道1和2为对照，分别为正常粉纹夜蛾(7hWz印/,'am',Tn)细胞抽提物和Tn细胞感染对照病毒后抽提物；泳道3为Tn细胞感染Accmrjp5重组病毒后的表达产物；泳道4为Tn细胞感染AccMRJP3a重组病毒后的表达产物。箭头所示为AccMRJP5和AccMRJP3a表达产物的位置AmMRJPs各成员位置的标示参照Schmitzova等发表的西方蜜蜂蜂王浆(Schmitzova"a/1998,CellMolLifeSci.54(9):1020-1030)。具体实施例方式本发明提取分离的中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因全长为1350个核苷酸，其详细序列见SEQIDNo.5，开放读框位于11350位核苷酸。在本发明中，"分离的"、"纯化的"或"基本纯的"DNA是指，该DNA或片段己从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，术语"中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7编码序列"指编码具有中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的核苷酸序列，如SEQIDNo.5中11350位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQIDNo.5序列的编码框11350位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNo.5中11350位核苷酸序列同源性低至约70%简并序列也能编码出SEQIDNo.6所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳地在高度严谨条件下，与SEQIDNo.5中从核苷酸11350位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNo.5中从核苷酸1234位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7相同功能蛋白的、SEQIDNo.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5'和/或3'端添加数个核苷酸。在本发明中，"基本纯的"蛋白质是指其占样品总物质的至少20%，较佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层折、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本发明中，术语"中华蜜蜂王桨主蛋白AccMRJP7"指具有中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7活性的SEQIDNo.6序列1-439的多肽。该术语还包括具有与中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7相同功能的、SEQIDNo.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7蛋白的活性片段和活性衍生物。该蛋白的变异形式包括:同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的抗血清获得的蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7蛋白片段的融合蛋白。发明还提供中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的类似物，这些类似物与天然中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。修饰(通常不改变一级结构)形式包括；体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中.或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。本发明还包括中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7编码序列及其片段的反义序列，这种反义序列可用于抑制细胞内中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的表达。本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7编码序列的8100个，较佳地150个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7核苷酸分子。本发明还包括检测中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为1550个核苷酸。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞，较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、CHO细胞、COS细胞等。另一方面，本发明还包括对中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能结合于中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因产物或片段。较佳地，指那些能与中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的分子，也包括那些并不影响中华蜜蜂王桨主蛋白AccMRJP7功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的中华蜜蜂王桨主蛋白AccMRJP7基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladneretal，美国专利No.4，946，778);或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自中华蜜蜂王浆主蛋白的抗体部分的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备，例如，纯化的中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来制备抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohlera/1975，Nature256:495，；Kohler"1976，Eur丄Immimol,6:511;Kohleretal1976,Eur.J.Immunol，6:292;Hammerlinge"/1981,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier,N.Y.)。本发明的抗体包括能阻断中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7功能的抗体以及不影响中华蜜蜂王桨主蛋白AccMRJP7功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术而获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如五.co/f)中制备的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。在本发明的一个实施例中，中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以在1、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27和30日龄的中华蜜蜂工蜂头部混合样本(每个日龄各取IO个头)抽提总RNA，反转录成cDNA建立文库，通过文库大规模表达序列片断(EST)的DNA测序，用生物信息学软件进行有效性处理、功能基因序列拼接和功能注释，建立EST数据库。获得AccMRJP家族成员，包括2个AccMRJP7功能基因的完整编码序列。然后根据功能基因的EST来源和编号，从EST数据库查出具有5'端起始序列EST的30个对应克隆，抽提目标质粒作为模板，用载体中的一对M13通用引物，艮卩5，端引物GTAATACGACTCACTATAGGGCG，3，端引物GGAAACAGCTATGACCATGA进行PCR扩增，PCR产物电泳鉴定，对其中2个AccMRJP7克隆测定cDNA全长，将所得DNA序列与AmMRJP7和拼接序列AccMRJP7进行比对和同源分析获得编码完整AccMRJP7蛋白序列的开放阅读框(ORF)，其扩增产物测序后得到的全长cDNA序列见SEQIDNo.5。以一个具有完整AccMRJP7核苷酸序列的克隆为模板，用一对根据AccMRJP7核苷酸序列设计的一对寡核苷酸为引物，即5'端引物5，-GGATCCATGGCCATTGTTCGAAAAAATTC-3，，3，端弓|物5'-CTCGAGCTAATTAATTAAAGAGTTTATTG-3'，进行PCR扩增。将扩增产物插入pMD18-T载体，进行阳性克隆测序后确认得到SEQIDNo.5的全长cDNA序列。引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pGEX-4T-3上的限制性内切酶的酶切位点。将从pMD18-T载体双酶切获得的AccMRJP7基因片断插入PGEM-4T-2(带GST编码序列)载体，阳性克隆转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，加IPTG进行诱导表达，获得分子量为66kDa的AccMRJP7-GST融合表达蛋白，将诱导表达产物用超声波破碎后，取沉淀进行SDS-PAGE电泳。用GST单克隆抗体对AccMRJP7-GST融合表达蛋白SDS-PAGE胶进行Western-blot检测，66kDa蛋白印迹呈特异性条带。从SDS-PAGE凝胶中切下特异性表达的蛋白条带，进行透析，冷冻干燥，用生理盐水溶解纯化蛋白作为抗原免疫白毛黑眼兔，6.1周后，从兔颈动脉收集血液，制取抗血清，-70'C保存备用。采用间接ELISA法。以免疫前采集的正常兔血清为阴性对照，经高速离心的西方蜜蜂蜂王桨溶液上清为抗原，HRP标记的羊抗兔IgG做酶标二抗，对所制备多克隆抗体进行酶联免疫吸附试验，OPD显色后在492nm下测定OD值，确定抗体的效价正常。用AccMRJP7-GST多克隆抗体作为一抗，对西方蜜蜂王浆蛋白，以及同中华蜜蜂AccMRJP-3a和AccMRJP-5基因的重组杆状病毒-昆虫细胞表达蛋白SDS-PAGE胶进行Westernblot检测，西方蜜蜂分泌王浆中的AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3和AmMRJP5，重组表达中华蜜蜂AccMRJP-3a和AccMRJP-5蛋白印迹均有特异性条带，提供了用一种MRJP成员抗体检测MRJP家族多种蛋白的新方法。中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7为中华蜜蜂王浆腺表达的蛋白，本发明的中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7为研究中华蜜蜂王浆主要蛋白，乃之西方蜜蜂主要蛋白相关的分子机理提供了基础。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例1:中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因的克隆和测定1.cDNA文库构建用油漆笔标记当日羽化的中蜂工蜂，在1、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27和30日龄期进行回捕，-8(TC保存。分别从每个日龄工蜂样品取10个头部，加液氮匀浆，加TRIZOL进行总RNA提取。用试剂盒分步纯化出mRNA，合成cDNA第一链和第二链。然后用末端补平酶将双链cDNA末端补平，加上五"iI接头并将其磷酸化，再经屈ol酶切处理，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，再用MinEluteGelExtraction试剂盒进行凝胶回收。将cDNA与载体pBluescriptIISK(+)相连，用电击反应法转化￡.co//DH10B感受态菌，加SOC培养基，3'7"C摇床复苏1h，取50菌液涂布含有IPTG/X-gal的LB培养基，37'C培养过夜。从生长转化菌的平板上随机挑取若干个菌落，培养，抽提质粒，采用M13通用引物进行PCR扩增鉴定文库质量。2.cDNA文库测序从文库挑取单克隆接种在含LB培养基的96孔板，37'C培养18小时左右，提取质粒作为模板，用通用引物M13进行PCR扩增，样品经纯化后放入Megabace1000中进行测序，得到SEQIDNo.5所示的基因序列。3.EST功能注释、芯片用EST筛选与数据库构建利用浙江大学生物信息服务平台服务器进行EST片段处理和拼接，phrap软件作有效性处理.。选出具有独立功能的Contig、Siglet序列，用Ontology(GO)和Blast软件进行功能注释。用DNAstar软件选出与Contig、Siglet序列相匹配的EST代表性序列。从中选出代表性AccMRJP家族成员，包括AccMRJP7功能基因的完整编码序列。然后根据功能基因的EST来源和编号，从EST数据库查出具有5'端起始序列王浆腺分泌的AccMRJP家族成员及相关多肽的EST对应克隆，抽提目标质粒作为模板，用载体中的一对M13通用引物，即5'端引物GTAATACGACTCACTATAGGGCG,3，端引物GGAAACAGCTATGACCATGA进行PCR扩增，PCR产物电泳鉴定，所选30个克隆有29个呈现0.5-2.5kb的DNA片断(见附图l)。其中2个AccMRJP7克隆显示大小为1.5kb的DNA片断。对2个AccMRJP7克隆测定cDNA全长，将所得DNA序列与AmMRJP7和拼接序列AccMRJP7进行比对和同源分析，均显示编码完整AccMRJP7蛋白序列的开放阅读框，其扩增产物测序后得到的全长cDNA序列见SEQIDNo.5。根据得到的全长cDNA序列推导出中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的氨基酸序列，共449个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQIDNo.6。实施例2:同源比较用本发明的中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用Blast程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它与西方蜜蜂王桨主蛋白AmMRJP7(GenBank发布的序列号GI:40949636)有显著的同源性。AccMRJP7与AmMRJP7的氨基酸序列联配结果(见表1)。AccMRJP7与AmMRJP7氨基酸序列的长度分别为449aa和443aa，两者的同源性为84.2%，AmMRJP7中一些对应于AccMRJP7Asn位点的序列由Asp取代，但是AccMRJP7氨基酸序列中Asp的含量(6.4%)只是较AmMRJP7中偏低(8.1%)。两个氨基酸序列C末端的差异较大，AmMRJP7氨基酸序列较AccMRJP7在426aa-431aa位点间缺失了NQNNNI六个氨基酸。从序列整体上看，AccMRJP7中多个Asn(N)位点在AmMRJP7中被Asp(D)位点取代。对AccMRJP7的氨基酸组成进行分析后发现，整个序列中Asn含量高达13.6%，而AmMRJP7中Asn含量仅为9.5%。另外，引起两者中Asn含量差异悬殊的原因可以由AccMRJP7C末端出现的多个Asn位点来解释。如前所述，东西方蜜蜂的王浆成分不同，相对应的单个MRJPs成员也存在或多或少的差异，两MRJP7氨基酸序列C末端的不同，AccMRJP7的氨基酸序列中的RGD位点在AmMRJP7中也不存在。同时用本发明的中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用Blast程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，苏松昆提交的编码中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的部分核苷酸的蛋白序列的氨基酸序列的长度为220aa(在GenBank发布的序列号GI:AY862496),该序列是参考意大利蜜蜂王浆主蛋白AmMRJP7核苷酸序列，由不同王浆腺cDNA文库克隆的测序获得的6个EST拼接而成，而不是一个连续而完整的cDNA序列。相对于本发明的完整蛋白序列，苏松昆的序列缺少了第110和300-449氨基酸序列，且其中两者还有3个氨基酸不同(见表2)。其序列比完整序列缺少50%以上，如应用于重组表达将缺乏生物不能显示生活活性，因而不能应用于科研和应用。表1:中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7与意大利蜜蜂主蛋白AccMRJP7(GenBank发布的序列号GI:40949636)的比较进行同源比较的两个序列是:AccMRJP7与AmMRJP7AccMRJP7残基总数449AmMRJP7残基总数443表示一致残基的符号为AccMRJP7AmMrjp7AccMRJPAraMrjp7AccMRJP7AmMRJP7AccMRP7AmMRJP7AccMRJP7Am服JP7AccMRjP7AmMRJP7AccM!UP7AmMRJP77i:MTKWLFMVVCLGIACQGAIVRKNSARNLENSLNVLHEWKYIDYDFGSEERRQAAIQSGEYDHTKNYPFDV701:MTRWLFMVACLGIACQGAILRENSA亂KNSLKVMHEWKYIDYDFGSEEK職AIQSDEYDHTKNYPFDV70*************************************************************771:DQWRDKTFVTVLRYDGVPSSLNVISDKTGNGG虹QPYP亂沐TKYKDCSGI糧而AVmYDRLWVLD140771:DQ卿KTFVTVLRYDGVPSSLNVISEKTGNGGRLLQPYPDWSWTKYKDCSGIVSAYSIA皿FDRLWVLD140****************************************************************141:SGLINNIQPMCSPKLLVFDL,NSSQLLKQVDIPHDIAVNTTTENGRLASLVVQAMNPMNTLVYLSDNRGDA210211:LIVYQNSDDSFHRLTSNTFNYDPRYTKMTVEGESFTVQDGIYGMALSPMTNNLYYSPLASRDLYYVNTKP280***************************************************************281:FMKSEYGE丽QYKGVQNIFNTQSTAKAVS跳VLFFGLV丽AVGCWNEHQTLQRENTDMVAQNEETLQ350281:FIKSEYGENKVQYNGVQDVFNTQTTAKAVSKNGILFFGL丽TAVGCWNEHQT攀NT丽AQNEETLQ350***************************************************************351:MIVGMKIKELLPHIVIIDINNIINNEYMLVLSNRMQKILNNDLNFNDINFRILIGGVTDLLENTRCANSN420351:MIVGMKIKQLLPHIVIIDIDNIINDEYMLVLTNRMQKILNNDLNFNDINFRILIGGVSDLLENTRCTNFN420***************************************************************421:IQNNNNQNNNI,QNNDNNLKITINSLIN449421:IQNDDSDENNDD------SIRITIDASFN443由表1可见，中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7与意大利蜜蜂主蛋白AccMRJP7的同源性为84.2%。表2:本发明中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7(Shen7)与苏松昆在GenBank发布的中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7部分氨基酸序列(Su-7)，在GenBank发布的序列号GI:AY862496)的比较进行比较的两个序列是Shen7与Su-7Shen7残基总数449Su-7残基总数220表示一致残基的符号为Shen71:MTKWLFMVVCLGIACQGAIVRKNSARNLENSLNVLHEWKYIDYDFGSEERRQAAIQSGEYDHTKNYPFOT70Su-71:C---------LGIACQGAIVRKKSARNLENSLNVLHEWKYIDYDFGSEERRQMIQSGEYDHTKNYPFDV61*氺氺氺*氺水氺氺*氺*氺*氺*氺氺*氺氺氺氺氺氺氺氺氺**氺*氺氺氺氺氺氺*氺氺氺氺氺;{:氺氺氺氺氺氺*氺氺*氺氺氺氺Shen7Su-7Shen7Su-7Shen7Su-7211:LIVYQNSDDSFHRLTSNTFDYDPKY丽TIEGESFTTQNGISG亂SPLTNNLYYSPLASRDLYYVNTKP280202:LIVYQNSDDSF亂SSNTL---------------------------------------------------220281221Shen7Su-7Shen7351Su-7221Shen7421Su-7221FMKSEYGENNVQYKGVQNIFNTQSTAKAVSKNGVLFFGLVNNTAVGCWNEHQTLQRENTDMVAQNEETLQ350----------------------------------------------------------------------221MIVGMKIKELLPHIVIIDINNIINNEYMLVLSNRMQKILNNDLNFNDINFRILIGGVTDLLENTRCANSN420----------------------------------------------------------------------221IQNNNNQN,INNQNNDNNLRITINSLIN449实施例3，中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7在大肠杆菌中的表达在该实施例中，以实施例1中具有完整AccMRJP7核苷酸序列的克隆为模板，用一对根据AccMRJP7核苷酸序列设计的一对寡核苷酸为引物扩增的AccMRJP7基因在在大肠杆菌中进行重组表达。PCR反应中使用的5'寡核苷酸引物序列为5，端弓l物5，-GATCCATGGCCATTGTTCGAAAAAATTC-3，(SEQIDNo.1)，该引物含有Bam/fl限制性内切酶的酶切位点，翻译起始密码子和AccMRJP7的部分编码序列；3'端引物序列为3'端引物5'画TCGAGCTAATTAATTAAAGAGTTTATTG-3'(SEQIDNo.2)该引物含有XhoI限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和AccMRJP7的部分编码序列。引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pGEX-4T-2上的限制性内切酶的酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(Ori)、一个IPTG可调启动子/操纵子(P/0)，一个凝血酶识别位点，一个谷光甘肽S转移酶(GST)融和蛋白标记物以及限制性内切酶克隆位点。以具有完整AccMRJP7核苷酸序列的克隆AccMRJP7为模板进行PCR扩增，经电泳检测，得到如图2A所示的目的DNA片断。阳性克隆测序后测序得到SEQIDNo.5的全长cDNA序列。将扩增产物纯化，插入pMD18-T载体。对连至pMD18-T载体的连接产物pMD18-T-Accm咖7用万amHI和WoI进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见前者在约2700bp和1300bp处(图7-lB)与预期载体和目的片段大小相符的片段。用I禾H屈oI消化pMD18-T载体及插入片段，随后将插入片段连接到pGEX-4T-2载体并保持开放读框在凝血酶识别位点起始点(Ori)。随后用连接混合物转化商品名为BL21的￡.//菌株，BL21含有多拷贝的重组质粒，其表达laclq阻遏物并携带抗性(Ampr)，在含有Ampr的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒。用万amHI和loI双酶切所得质粒，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在约4900bp和1300bp处有与预期载体和目的片段大小相符的片段(图2C)。测序验证中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的cDNA片段，该序列为SEQIDNo.5序列的11350，与已正确插入了载体。将鉴定正确的重组表达质粒转化人BL21(DE3)感受态细胞中，涂布菌液于含IOO"g/mlAmp的LB平板中，挑取白色菌落，接种于含同等质量浓度Amp的LB液体培养基中，37"C振荡培养过夜活化。按每支试管6ml含Amp的LB液体培养基加入IOOul菌液的量，转接活化菌液，共接四支试管，37°C、220r/min振荡培养至OD600:0.6-1.0，按一定浓度梯度加入IPTG(每支试管中加入IPTG的终浓度分别为0.004g/L、0.04g/L、0.08g/L、0.32g/L，)，37。C、180r/min诱导培养4h。每个浓度梯度下分别取1ml菌液，8000r/min离心5min收集菌体，弃上清后，加入PBS200tU震荡悬浮沉淀，8000r/min离心5min，弃上清，再加入等体积的PBS和2XSDS凝胶加样缓冲液，混匀后IOO°C煮沸10min，12000r/min离心1min，取其上清液。诱导产物经10%的SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝R-250染色2h后，室温摇床上脱色至背景色脱尽观察。鉴定表达该蛋白的分子量大小为约66kDa。SDS-PAGE和薄层扫描结果显示，不同IPTG浓度下表达量不同，在IPTG终浓度为0.08g/L条件下，表达量最高，此时，表达产物占细胞总蛋白的22.8%(图3，泳道5)。实施例4:制备抗体将实施例3中获得的重组蛋白亲和层析法进行分离，或SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离用来免疫动物以产生抗体。具体方法如下将诱导表达产物用超声波破碎后，取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果表明表达产物主要在沉淀中，即主要以包涵体形式存在。沉淀经SDS-PAGE电泳后，从凝胶中切下特异性表达的蛋白条带，装入透析带中，置于透析槽透析过夜，将透析液转入1.5mleppendorf管中，冷冻干燥，用0.9%的生理盐水溶解纯化的蛋白，从而完成GST-AccMRJP7抗原的制备。具体抗体制备步骤如下(1)选取14-16周龄的健康白毛黑眼兔，每次注射0.5mg左右纯化的融合蛋白抗原。免疫前，从兔耳抽取血样，作为阴性对照。(2)融合蛋白抗原溶于700pl生理盐水，加700pl弗氏完全佐剂和适量青霉素、链霉素溶液乳化，皮下多点注射免疫。(3)3.3周后，融合蛋白抗原溶于700)il生理盐水，加700pl弗氏不完全佐剂和适量青霉素、链霉素溶液乳化，皮下多点注射免疫。(4)4.2周后，融合蛋白抗原溶于1ml生理盐水肌肉注射免疫。(5)5.1周后，再次用1ml溶有融合蛋白抗原的生理盐水加强免疫。同时，从兔耳抽血样，采用间接ELISA方法进行多抗血清效价测定。(6)6.l周后，颈动脉收集血液，置室温下使其凝固。(7)将凝固的血液放入37。C温箱内半小时，再置4'C冰箱过夜，使血块收縮，抗血清析出；(8)吸出抗血清，3000r/min离心10min，吸上清液分装，-70T保存备用。采用间接ELISA法。以免疫前采集的正常兔血清为阴性对照，经高速离心的蜂王浆溶液上清为抗原，HRP标记的羊抗兔IgG做酶标二抗，对所制备多克隆抗体进行酶联免疫吸附试验，OPD显色后在492nm下测定OD值，确定抗体效价。多克隆抗体的稀释采用倍半法，第一次稀释100倍，第二次200倍，依次类推。所表达蛋白在抗体稀释倍数为1.024X1()S时，多克隆抗体OD492平均值仍大于阴性对照OD492值的两倍(表3)。为MRJPs的研究和检测提供了材料。表3:本发明中GST-AccMRJP7融合蛋白多克隆抗体效价的ELISA检测<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例5:以中华蜜蜂王浆主蛋白GST-AccMRJP7抗体检测MRJPs将实施例4中获得的-GSTAccMRJP7抗体，通过Westernblot检测在杆状病毒-昆虫细胞系统中表达的AccMRJP-3a和AccMRJP-5蛋白。具体方法如下在无血清条件下，用Lipofectin介导重组的Bacmid-AccMRJP-3a和Bacmid-AccMRJP-5基因组DNA转染生长状态良好的粉纹夜蛾细胞Tn-5Bl-4。转染72h后收获呈球形的细胞，进行蛋白样品SDS-PAGE电泳。将实施例4中制备的GST-AccMRJP7多抗与西方蜜蜂王浆蛋白样品和中蜂主要王浆蛋白基因AccMRJP5和AccMRJP3a的真核表达产物进行Westernblot分析。方法如下1.蛋白样品经SDS-PAGE后，剪取与分离胶相同大小的PVDF膜，将分离胶、3MM滤纸及PVDF膜置Transferbuffer中平衡1520min。2.将3MM滤纸、PVDF膜、分离胶和3MM滤纸依次装入转移夹中，用Bio-RadTrans-BlotCell半干转移系统，转移条件为恒电压15V20min。3.带样品的PVDF膜用封闭液(用lxPBST溶解的4%脱脂奶粉)室温封闭lh。4.弃封闭液，加入一抗于4y。脱脂奶粉中室温反应lh或4t:反应过夜；5.洗涤液洗涤3次，每次10min;6.加HRP酶标二抗于lxPBST中室温反应lh。7.洗涤液洗涤3次，每次10min;8.将PVDF膜置于10mlHRP反应底物DAB溶液中显色，待阳性条带显示后用ddH20中止反应，PVDF膜自然干燥后保存或拍照留作数据。结果显示AccMRJP-5多克隆抗体能与西方蜂王浆蛋白样品中多种主要王浆蛋白产生免疫反应，如显示出明显的AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3、AmMRJP5印迹，与在真核系统中表达的AccMRJP5和AccMRJP3a蛋白特异性结合(图4)。在NCBI中对AccMRJP7蛋白序列进行BLAST搜索后发现，AccMRJP7与西方蜜蜂四种主要王浆蛋白AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3和AmMRJP5的氨基酸序列同源性分别为67%、72%、66%和78%，与已报道的AccMRJP5蛋白序列的同源性为73%。本发明利用GST-AccMRJP7多克隆抗体成功检测了多个西方蜜蜂MRJPs成员，以及中华蜜蜂AccMRJP5和AccMRJP3a的真核表达产物，也进一步证明了蜂王浆主要蛋白各成员之间具有较高的同源性。提供了用一种MRJP成员抗体检测MRJP家族多种蛋白的新方法。实施例6:中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7在真核细胞(Tn细胞株，即粉纹野蛾细胞株)中的表达在该实施例中，以AccMRJP7的PCR扩增产物作为插入片段。PCR反应中使用的5'寡核苷酸引物序列为5'陽CTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3'(SEQIDNo.3)，该引物含有屈ol限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是起始密码子开始的中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7编码序列的24个核苷酸；3'端引物序列为5，-AAGCTTCTAATTAATTAAAGAGTTTATTG-3'(SEQIDNo.4),该引物含有w/""m限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的部分编码序列。引物上限制性内切酶酶切位点对应于Tn细胞表达载体pBacFastHTb上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Gm1)，一个噬菌体复制起点(Ori)、一个病毒复制起点(SV40)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)，一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。用^70//和历^/III消化pBacFastHTa载体及插入片段，随后用连结混合物转化ETGI菌株，在含有Ampr和Gmf的LB培养皿上筛选转化子，补加Ampr和Gmr的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，测序验证大中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7的cDNA片段已正确插入了载体。随后用重组质粒转化Eco//DH10Bac菌株，在含有Amp\Gmf、四环素的LB培养皿上筛选转化子，在补加Ampr、Gmr、四环素的LB液体培养基中培养(0/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，经Sepharose2B柱纯化，回收质粒-70'C保存。2B柱纯化，回收质粒-7(TC保存。质粒转染Tn细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBcoLife)进行的。转染48小时后，收集细胞及细胞上清，含重组病毒粒子的细胞上清用于下一轮感染。经2-3周的TC-100连续传代培养，收集细胞，用超声裂解法破碎细胞，以含NaCl0.5mM、imidazola5mM、PMSF1mM的20mMTris-CI(PH8.0)溶液为平衡液及洗脱液，蛋白液用经预平衡的Ni2+Sepharose6B柱过柱；再用含imdazola50mM、NaC10.5mM、PMSFlmM的20mMTris-CI(PH8.0)的溶液，洗去杂蛋白，专一性的吸附的6XHis的融合蛋白，再用含imdazola500mM、NaCl0.5mM、PMSFlmM的20mMTris-CI(PH8.0)的溶液进行洗脱.然后以PBS(PH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。用10%的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定的6XHis的融合蛋白的分子量大小约为51KDa。用6XHis单克隆抗体和GST-AccMRJP7多抗进行Westernblot检测，均显示51KDa印迹。中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因及其编码蛋白基因序列表SEQUENCELISTING<110〉浙江大学<120〉中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因及其编码蛋白<160〉6〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉28〈212〉腿<213〉ApisceranacerariamainRoyaljellyprotein7〈400〉1gatccatggccattgttcgaaaaaattc28〈210〉2<211〉28〈212〉DNA〈213〉Apisceranaceranamainroyaljellyprotein7<400>2tcgagctaattaattaaagagtttattg28<210〉3〈211〉30〈212〉DNA<213〉Apisceranaceranamainroyaljellyprotein7<400>3ctcgagatgaagaactattcaaaaaatgca30〈210>4<211〉29〈212〉■<213〉Apisceranaceranamainroyaljellyprotein7<400〉4aagcttctaattaattaaagagtttattg29〈210〉5〈211〉1350〈212〉腿〈213>Apisceranaceranamainroyaljellyprotein7〈400〉5atgacaaagtggttgtttatggtggtatgccttggcatagcttgtcaaggcgccattgtt60cgaaaaaattctgcacgaaacttggaaaattcgttgaacgtacttcacgaatggaaatat120atcgattatgatttcggtagcgaagaaagaagacaagctgcgattcaatctggcgaatac1.80gatcatacgaaaaattatcccttcgatgtcgatcaatggcgtgataagacttttgtcacc240gtattaagatacgatggtgtgccttcttctttgaacgtgatatctgataaaactggcaac300ggtggacgacttctacaaccgtatcctgattggttgtggacgaaatataaagattgctct360ggaatcgtgaacgcttacaatattgcggtcgataaatacgELcagattgtgggttttggat420tcaggtcttatcaacccatgtgttccccaaaattgcttgtctttgatcta480aattgctcaagcaagtggatataccgcsLCgatattgccgtaaataccacc540acagaaaacggaagattagcatctttagttgtccaagctatgaatcctatgaatactctg600gtgtatttgtcagacaacagaggtgacgctttaatcgtctaccaaaattccgacgattcc660ttccatcgattgacttccaacactttcgattacgatcccaaatataccaaaatgacgatt720gtttcacaaca_C3￡L3￡Ltggaatttctggaatggctcttagtcccctgaca780aacaatctttattacagtcctctcgcttctcgcgatttgt840ttcatgaaatcagaatatggagaaaataatgtccaatataaaatattttc■caaccgctaaagcggtatcg3a^6Ltggcgttcttttcttcggtctcgtg960ctgttggttgttggaacgag1020atggtcgctcaaaatg犯g3atgatcgttgt犯gg^tt6L1080cttccacatatcgtcattattatgttagta1140g3atgc犯a^aatattaaacaBtgELtCtt3tattaacttc1200cga^ttttgattggaggtgtgaccgacttgctcgttgcgc1260ataacaatcaaaataacaatattaacaatctaacaat11a1320agaatcacaataaactctttaMtaattag1350〈210>6〈211〉449〈212〉PRT〈213〉Apis〈400〉6MetThrLys1GlyAlalieAsnValLeu35GluArgArg50AsnTyrPro65ValLeuArgLysThrGlyTrpThrLys115AlaValAsp130AsnAsnlie145AsnSerSerceranaceranamainroyaljellyprotein7TrpLeuPheMetValValCysLeuGlyVal20HisGinPheTyrAsn100TyrLysGinGinLeu5ArgGluAlaAspAsp85GlyLysTyrProLeu165LysTrpAlaVal70GlyGlyAspAspMet150LeuAsnLyslie55AspValArgCysArg135CyslysSerTyr40GinGinProLeuSer120LeuSerGinAla25lieSerTrpSerLeu105GlyTrpProValCys10ArgAspGlyArgSer90GinlieValLysAsp170AsnTyrGluAsp75LeuProValLeuLeu155lieLeuAspTyr60LysAsnTyrAsnAsp140LeuProlieAlaCysGin15GluAsnSerLeu30PheGlySerGlu45AspHisThrLysThrPheValThr80VallieSerAsp95ProAspTrpLeu110AlaTyrAsnlie125SerGlyLeulieValPheAspLeu160HisAsplieAla175ValAsnAlaMetAspAla210ThrSer225GluGlySerProLeuTyrAsnAsn290ThrAla305AsnAsnGluAsnValGlylieAsn370MetGin385ArglieAlaAsnAsnGinAsnThrAsn195LeuAsnGluLeuTyr275ValLysThrThrMet355AsnLysLeuSerAsn435Thr180ProlieThrSerThr260ValGinAlaAlaAsp340LyslielielieAsn420AsnThrMetValPhePhe245AsnAsnTyrValVal325MetlielieLeuGly405lieAspGluAsnTyrAsp230ThrAsnThrLysSer310GlyValLysAsnAsn390GlyGinAsnAsnThrGin215TyrThrLeuLysGly295LysCysAlaGluAsn375AsnValAsnAsnGlyLeu200AsnAspGinTyrPro280ValAsnTrpGinLeu360GluAspThrAsnLeu440Arg185ValSerProAsnTyr265PheGinGlyAsnAsn345LeuTyrLeuAspAsn425LeuTyrAspLysGly250SerMetAsnValGlu330GluProMetAsnLeu410AsnlieAlaSerLeuSerAspSer220TyrThr235lieSerProLeuLysSerliePhe300LeuPhe315HisGinGluThrHislieLeuVal380PheAsn395LeuGluGinAsnThrlieUuValValGin190AspAsnArgGly205PheHisArgLeuLysGlyAlaGlu285AsnPheThrLeuVal365LeuAspAsnAsnAsn445MetMetSer270TyrThrGlyLeuGin350lieSerlieThrAsn430SerThrlie240AlaLeu255ArgAspGlyGluGinSerLeuVaJ320GinArg335MetlielieAspAsnArgAsnPhe400ArgCys415lieAsnLeulie权利要求1.一种中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因，其特征在于，它具有SEQIDNo.5所示的序列。2.—种权利要求1所述中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因的编码蛋白，其特征在于，它具有SEQIDNo.6所示的氨基酸序列。3.—种权利要求2所述中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因的编码蛋白在制备抗体方面的应用。全文摘要本发明公开了中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因及其编码蛋白，该基因具有SEQIDNo.5所示的DNA序列；该基因的编码蛋白具有SEQIDNo.6所示的氨基酸序列，该编码蛋白能制备抗体；本发明为MRJP7的生物工程应用奠定了一定基础，特别是提供了一种用一种MRJPs成员抗体检测MRJP家族蛋白的新方法，在蜂王浆科研和生产领域具有广泛用途。本发明为进一步研究MRJP相关的蛋白活性分子机理，开发与MRJPs相关的功能食品、诊断试剂及生物试剂打下了基础。文档编号C07K14/435GK101434954SQ20081016361公开日2009年5月20日申请日期2008年12月22日优先权日2008年12月22日发明者张传溪,艳李,沈立荣,程家安,邢丽苹申请人:浙江大学