信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途的制作方法

专利名称：信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途的制作方法
技术领域：
合成了新的信使RNA帽的抗-反向(anti-reverse)硫代磷酸类似物，并且显示在 mRNA的翻译中是有用的。
背景技术：
在真核细胞中，大多数信使RNA (mRNA)的5'末端被封闭，或“帽化(加帽)”。此 外，还存在有一些也被帽化的其他形式的RNA，例如核内小RNA(snRNA)。所述帽包含有在两 个核苷部分之间的5' -5'三磷酸键合和远端鸟嘌呤环上的7-甲基。mRNA和snRNA的帽 化促进其在细胞中的正常功能。能够在体外合成加帽的RNA分子是有用的，因为这使得工作人员能够制备在各种 生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产，例如，在无 细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培养的细胞中产生就其 活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中，合成进行显著更长的时间，并因 此产生更多的蛋白质。最经常用来在体外制备加帽的RNA的方法是，在所有四种核糖核苷三磷酸和帽二 核苷酸例如m7G(5' )ppp(5' )G(此后，m7GpppG)存在下用细菌或噬菌体RNA聚合酶来转 录DNA模板。聚合酶以下列方式来起始转录m7GpppG的Guo部分的3' -0H对于下一个由 模板所决定的核苷三磷酸上的a "磷酸发动亲核攻击，从而导致产生初始产物m7GpppGpN。 通过在转录反应混合物中将m7GpppG与GTP的比率设定为在5和10之间来遏制备选的、由 GTP起始的产物pppGpN。合成RNA可以通过DNA模板的无细胞转录来合成。参见R. Contreras等人， "Simple,efficient in vitro synthesis of capped RNAuseful for direct expression of cloned eukaryotic genes, " Nucl. AcidsRes.,第 10 ， % 6353-6362 M (1982)； J. Yisraeli "Synthesis of long, capped transcripts in vitro by SP6 and T7 RNA polymerases，第 42_50 页，在 J. Dahlberg 等人(编辑)，Meth. Enzymol.，第 卷，第42-50 页(1989)中；禾口 D. Melton 等人，“Efficient in vitro synthesis ofbiologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmidscontaining a bacteriophage SP6promoter, ” Nucl. Acids Res.，第 12 卷，第 7035-7056 页(1984)。如此产生的加帽的RNA在体外进行的剪接反应中是有活性的。参见M. Konarska等 人,"Recognition of cap structure in splicing invitro of mRNA precursors. Cell,第 38 卷，第 731-736 页(1984)；和 I. Edery 等人，“Cap-d印endent RNA splicing in a HeLa nuclearextract, ” Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 82 卷，第 7590-7594 页(1985)。加帽的mRNA在无细胞翻译体系中比非加帽的mRNA更有效地被翻译。参 见 S.Muthukrishnan 等 人，“5 ‘ -Terminal 7-methy1guanosinein eukaryotic mRNA is required for translation, "Nature,第 255 ，第 33-37 M (1975)； L.Chu 等 人，"Paradoxical observations on the 5 ' terminus of ovalbumin messenger ribonucleic acid，” J. Biol.Chem.，第 253 卷，第 5228-5231 页(1978)； E. Darzynkiewicz 等人，“旦-GlobinmRNAs capped with m7G, m22'7G or m32' 2' 7G differ in intrinsictranslation efficiency, "Nucl. Acids Res.，第 16 卷，第 8953-8962 页(1988)； 禾口 E.Darzynkiewicz 等 A “Inhibition of eukaryotic translationby nucleoside 5' -monophosphate analogues of mRNA 5' -cap :Changesin N7substituent affect analogue activity, ”Biochem.，第 28 卷，第 4771-4778 页(1989)。5'-未甲基化的mRNA在翻译上的活性比5‘-甲基化的mRNA低。参见G. Both ^A "Methylation-dependent translation of viralmessenger RNAs in vitro, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第 72 卷，第 1189-1193 页(1975)。通过电穿孔引入培养的哺乳动物细胞中的加帽的mRNA比非加帽的mRNA更有 效地被翻译。参见 E.Grudzien 等人，"Differentialinhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,，，J. Biol. Chem.,第 281 卷，第 1857-1867 页(2006)。A. Pasquinelli 等人，"Reverse 5' caps in RNAs made in vitro byphage RNA polymerases, ” RNA,第1卷，第957-967页(1995)报道了，噬菌体聚合酶使用m7GpppG的 7-甲基鸟嘌呤部分的3' -0H来起始转录，这证明用该帽类似物制备的RNA产物中的大约 三分之一至一半实际上包含相反方向的帽，即Gpppm7GpN。此类反向帽化的RNA分子表现 异常。相同的作者报道，当将反向帽化的pre-UlsnRNA转录物注射入光滑爪蟾(Xenopus laevis)细胞核中时，它们比天然转录物更慢地被输出。类似地，细胞质中的胞质反向帽化 的UlsnRNA不被正确地输入到细胞核中。mRNA上帽的存在强烈地刺激mRNA转录物翻译成蛋白质。E. Grudzien等人， "Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAswith high translational efficiency，”RNA，第10卷，第1479-1487页(2004)证明，包含有专一地以相反方向掺入的 帽的mRNA在无细胞体系中仅以包含有专一地以正常方向掺入的帽的mRNA的效率的4%进 行翻译。J. Stepinski 等 人，"Synthesis and properties of mRNAs containingthe novel 'anti-reverse' cap analogues 7-methyl (3 ' -0-methy1)GpppGand 7-methyl(3' -deoxy)GpppG，” RNA，第 7 卷，第 1486-1495 页(2001)报道了不能以相反方 向掺入的两种新型帽类似物，m73' dGpppG和m/’3’_°GpppG，的合成和用途。用这些“抗-反向帽类似物” (anti-reversecap analog, ARCA)帽化的mRNA在体外体系中比用常规类似物 m7GpppG帽化的mRNA更有效地被翻译。还可参见，美国专利号7，074，596，和美国专利申请 公开 2003/0194759。Z.Peng 等 A "Synthesis and application of a chain-terminatingdinucleotide mRNA cap analog，，，Org. Lett ，第 4 卷，第 161—164 页 (2002)报道了 m/’3’_°GpppG的合成以及其在均一地加帽的RNA的体外转录中的用途。J. Jemielity 等人，“Novel ‘ anti-reverse ‘ cap analogues withsuperior translational properties, “ RNA，第 9 卷，第 1108-1122 页(2003)报道，用-0CH3 或 _H 在2’位进行取代以分别产生m/’2’_°GpppG或m72’ dGpppG，这产生了具有与在3’位取代的 ARCA的性质相等或稍微更有利的性质的ARCA，如通过与翻译帽结合蛋白eIF4E的结合，在 体外转录期间向mRNA中的正确掺入，以及在无细胞体系中所得的mRNA的翻译效率这样的 标准所测量的。从引入培养的哺乳动物细胞中的合成mRNA所产生的蛋白质的量受限于通过 天然周转过程的mRNA降解。mRNA降解的主要体内途径通过由特异的焦磷酸酶Dcpl/ Dcp2(其在a和0磷酸之间进行切割)从完整的mRNA上去除帽来起始。E. Grudzien 入〃 Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs, “ J. Biol. Chem.，第281卷，第1857-1867页(2006)设计并合成了其中亚甲基替 代了 a和3磷酸基团之间的0原子的帽类似物，m27’3’-°GppeH2pG，用该类似物帽化的mRNA 在体外对于通过重组人Dcp2的水解具有抗性。当引入培养的细胞中时，用m27’3’_°GpPc:H2pG 帽化的mRNA比用m/’3’ _°GpppG帽化的mRNA更为稳定。存在两种已知的脱帽酶DCpl/DCp2，其作用于完整的mRNA以起始5’一 3’降解；和 DcpS，其作用于由于3’一 5’降解而产生的短的加帽的寡核苷酸。因为Dcpl/Dcp2或单独的 Dcp2从加帽的mRNA上释放m7GDP，所以切割可能发生在a -和0 -磷酸之间。参见Z. Wang等 人，"The hDcp2 protein is a mammalian mRNA decapping enzyme," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，第99卷，第12663-12668页(2002)。先前，显示了，核苷5，-单硫代磷酸以及三 磷酸类似物例如ATP yS.GTP Y S和⑶P0 S，对于磷酸酶是稳定的。参见F. Eckstein等人，‘‘ Guanosine5' -0-(2-thiodiphosphate). An inhibitor of adenylate cyclasestimulation by guanine nucleotides and fluoride ions" , J. Biol. Chem.,第 254卷，第9829-9834页 (1979)，禾口D.Cassel等入，〃 Activation ofturkey erythrocyte adenylate cyclase and blocking of thecatecholamine-stimulated GTPase by guanosine 5' - (gamma-thio) triphosphate “ ，Biochem Biophys Res Commun，第 77 卷，第 868—873 页(1977)。此夕卜， 还发现包含硫代磷酸核苷酸间键合的多核苷酸比其天然对应物更缓慢地被降解。参见 H. Matzura 等人’ “Apolyribonucleotide containing alternation P = 0 and P = S linkages"，Eur. J. Biochem.，第 3 卷，第 448-452 页(1968)。令人感兴趣的是，硫代 磷酸的非对映异构体可以显示出不同的对于核酸酶的敏感性。核酸酶P1水解Sp非对映 异构体比 Rp 更‘决。参见 B. Potter 等人，‘‘Synthesis and configurational analysis of a dinucleoside phosphateisotopically chiral at phosphorus. Stereochemical course ofPenicillium citrum nuclease PI reaction. “ ，Biochemistry，第 22 卷，第 1369-1377页(1983)。相比于Sp，核糖核酸酶T1和蛇毒磷酸二酯酶优先切割Rp非对映异构体。参见 F. Eckstein 等人，“Stereochemistryof the transesterif ication step of ribonuclease T 1 〃，Biochemistry,第 11 卷，第 3507-3512 页(1972)，和 P. Burgers 等 人’ “AbsoluteConfiguration of the Diastereomers of Adenosine5' -0_(1-thiotriph osphate) Consequences for the stereochemistry ofpolymerization by DNA-dependent RNA polymerase from Escherichiacoli " , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,第 75 卷，第 4798-4800 页(1978)。虽然用m27’3’-°GppeH2pG帽化的mRNA在培养的细胞中更为稳定，但是它具有较低的 翻译效率，推测这是因为m/’3’_°GpPc:H2pG在体外以比m/’3’_°GpppG显著更低的亲和力与eIF4E 结合。因此，即使它在培养的细胞中更为稳定，但这个优点却被较低的翻译效率给抵消了。J. Kowalska等人〃 Synthesis and properties of mRNA capanalogs containing phosphorothioate moiety in 5' ,5' -triphosphatechain, " Nucleos. Nucleot. Nucl. Acids，第24卷，第595-600页(2005)报道了其中用S替代a、0或Y磷酸部分中的0的 三种帽类似物的合成，例如m7GpsppG、m7GpppsG和mtppp^pG。这些合成的硫代磷酸帽类似 物是帽依赖性翻译的更加稳定的抑制剂，并且对于DcpS脱帽酶具有抗性。然而，无论在体 外还是在体内，这些化合物并没有显示出比平常ARCA更高的翻译效率，因为它们可能在很 大程度上以相反方向掺入。存在对于这样的修饰的需要，所述修饰将可能达到更高的翻译效率和增加对于体 内和体外降解的抗性。本文所报道的独特的化合物可以做到这两者。

发明内容
我们发现，在一个或多个磷酸处的S-取代连同2’ -0甲基取代一起产生具有令人 惊讶的性质的被称为S-ARCA的新型类似物。所述新的ARCA修饰确保，a、0和Y硫代磷 酸基团在翻译和脱帽机器(machinery)中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。这些 类似物中的至少一些对于Dcpl/Dcp2具有抗性。有些S-ARCA具有相比于缺乏硫代磷酸基 团的相应类似物而言高得多的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S-ARCA的mRNA引入培 养的细胞中时，有些mRNA以相比于用常规类似物m7GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度 更有效地进行翻译。此外，用有些S-ARCA帽化的mRNA的半寿期长至用未修饰的帽合成的 mRNA的半寿期的三倍。更有效地进行翻译的mRNA和更稳定的mRNA的组合导致在经转染的 细胞中获得比使用常规的合成mRNA或者使用以早期ARCA帽化的mRNA更高的报道蛋白的 总产量。S-ARCA增加了体内稳定性和令人惊讶地增加了翻译效率，这是由于与Dcpl/Dcp2 抗性相组合的更高的对于eIF4E的亲和力。令人惊讶地，在生理条件下对于通过Dcp2的水 解的抗性与三磷酸中的硫代磷酸基团相关，并且预期也与四磷酸中的硫代磷酸基 团相关。另一个相比于平常ARCA而言的优点是出现P-非对映异构现象，这归因于硫代磷酸 部分。在当硫代磷酸部分准确地定位于a-、或位置处时的每种情况下，仍然存在 两种可能性来放置硫原子(proR和proS)，这导致获得具有可能不同的生物学活性的两种 不同的非对映异构体。例如，在对应物D1和D2非对映异构体和还有用m/’2' _°GppspG(Dl) 帽化的mRNA之间存在有对于eIF4E的结合亲和力的显著差异，并且该D1相比于其D2对应 物而言对于Dcp2易感得多。因此，可以采用非对映异构体纯的S-ARCA作为P-手性探针， 其可用于研究牵涉帽的酶促工艺步骤的立体化学过程。
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附图简述图 1 描绘了 a S-ARCA m27’2’ _°GpppsG (D1 和 D2)的合成。图2 描绘了 Y S-ARCA m/’2’ _°GpsppG(Dl 和 D2)的合成。图 3 描绘了 3 S-ARCA m27’2’ _°GppspG(Dl 和 D2)的合成。图4 描绘了 四磷酸 Y S-ARCA，m/’2’、ppsppG (D1 和 D2)的合成。图5描绘了在三磷酸桥的a和0位置处具有两个硫代磷酸部分的S-ARCA，m/‘ 2、°GppspsG(Dl、D2、D3*D4)的合成。图6A-6H描绘了用hDcp2消化的体外合成的寡核苷酸的阴离子交换HPLC分析。图7描绘了用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA在HC11细胞中的衰变。图8描绘了用S-ARCA帽化的mRNA在HC11细胞中的翻译效率。图9A-9E描绘了用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA在HC11细胞中的多核糖体分布， 显示为在蔗糖梯度中的沉降，通过监测260nm处的吸光度(A)，和通过使用实时PCR以显示 萤光素酶mRNA (B、C和D)和GAPDH mRNA (E)的分布。

图10描绘了在用经S-ARCA帽化的mRNA对HC11细胞进行核穿孔 (nucleoporation)后萤光素酶表达的时间过程。本发明的实施方式材料和方法实施例1一般的化学操作程序使用在去离子水中的三乙基铵碳酸氢盐(TEAB)的线性梯度，在DEAD-S印hadex A-25(HC03_形式)柱上通过离子交换色谱法来分离开中间体核苷酸，并且在通过添加乙醇 在减压下进行蒸发后，将其分离为三乙基铵盐。通过分析型或半制备型RP HPLC来分离开 终产物(帽类似物)，并且在反复的冷冻干燥后，将其分离为铵盐。分析型HPLC在装备有 Supelcosil LC-18-T反相柱(4. 6x250mm，流速为 1. 3ml/分钟)的Spectra-Physics SP8800 装置上进行，其中使用在PH 5. 9的0. 05M乙酸铵缓冲液中的0-25%甲醇线性梯度，并且采 用在260nm处的UV-检测。半制备型HPLC在装备有WatersHR-C_18反相柱(19x300mm，流速 为 5.0m/分钟)的 Waters 600EMultisolvent Delivery System 上进行，其中使用在 0. 05M 乙酸铵缓冲液(PH 5.9)中的甲醇线性梯度，并且采用在260nm处的UV-检测。GMP和GDP购自Sigma-Aldrich，并且通过使用Dowex 50 WX 8离子交换树脂而转 化为三乙基按盐。如先前在 J. Jemielity 等人〃 Novel' anti-reverse' cap analogues with superior translationalproperties, “ RNA，第 9 卷，第 1108—1122 页(2003)中所 报道的那样来制备其他核苷酸，即m7GMP、m/’2' -°GMP、m7OTP、m/’2' _°GDP。硫代磷酸三乙基铵 盐通过下列方式而从妝#503制备在Dowex 50WX 8离子交换树脂上进行转化，并且(在蒸 发至干后)用贮存于_20°C的99. 8%醇进行再度蒸发。参见J Kowalska等人“A simple andrapid synthesis of nucleotide analogues containing a phosphorothioatemoiety at the terminal position of the phosphate chain，，，TetrahedronLett ，第 48 卷，第 5475-5479页(2007)。如先前所报道的那样来制备7-甲基鸟苷，除了使用DMF而非DM 之夕卜(参见 J. Jones 等人，"Purine Nucleosides. 111. Methylation Studies of Certain NaturallyOccurring Purine Nucleosides”，J. Am. Chem. Soc.，第 85 卷，第 193-201 页
14(1963))。通过类似的操作程序，从2’ -0-甲基鸟苷来合成7，2’ -0-二甲基鸟苷。根据 J. Kusmierek 等人，"A new route to2‘ (3‘ ) -0-alkyl purine nucleosides，，，Nucleic Acids Res.，第1卷，第73-77页，特别出版号4(1978)来制备2，-0-甲基鸟苷。通过在RP HPLC上的再次色谱法(re-chromatography)、使用负电喷雾电离的质 谱法(MS ESI-)以及1H NMR和31P NMR光谱学，来确认最终化合物的结构和均一性。(结 果显示在表1中)分别在399. 94MHz和161. 90MHz处在Varian UNITY-plus光谱仪上于 25°C记录了屮NMR和31P NMR谱。报告了相对于在D20中的3-三甲基甲硅烷基-[2，2，3， 3-D4]-丙酸钠(TSP)(作为内标)的1H NMR化学位移。报告了相对于在D20中的20%磷酸 (作为外标)的31P NMR化学位移。使用负电喷雾电离(ESI-)，在Micromass QToF IMS光 谱仪上记录了质谱。实施例2用于核苷酸的N-酰化咪唑(imidazolide)衍生物(GMP-Im、m/’2"°GMP-Im、⑶P_Im 和 m/’2’_°GDP-Im) (7、8 和 12-15)的一般操作程序0 JAL T. Mukaiyama 等人 〃 Phosphorylation by oxidation-reduction condensation. Preparation of active phosphorylatingreagents" , M. Bull. Chem. Soc. Jpn，第44卷，2284 (1971)。在DMF (约2. 5ml/100mg核苷酸)中混合合适的核苷酸(1当量 的TEA盐)、咪唑(8当量)和2，2’ -联硫基二吡啶(3当量)。添加三乙胺(2当量)和三 苯膦(3当量)，并搅拌混合物6-8小时。用溶解在干燥的丙酮(约8ml/lml DMF)中的无 水高氯酸钠(1当量/ 一个负电荷)从反应混合物中沉淀出产物。在冷却至4°C后，过滤沉 淀物，用冷的干燥的丙酮反复洗涤，并在真空中通过P401(l进行干燥。产率为80-100%。在 m7GMP的情况下，由于其较低的在DMF中的溶解度，使用2倍过量的试剂，并且将反应时间延 长至24小时。实施例3用于核苷5' -0-硫代磷酸(9-11)的一般操作程序将合适的核苷(1当量，在真空中通过P401(l过夜干燥)在磷酸三甲酯 (1. 5ml/100mg核苷)中的悬浮液在冰/水浴上冷却至0°C。添加2，6- 二甲基吡啶(3当 量)和PSC13(1.5当量)。反应在0°C下维持过夜，然后用0.35M TEAB猝灭并在室温下搅 拌1小时。使用0-0. 7MTEAB的线性梯度，通过DEAE Sephadex色谱法来分离开产物。产 率(9)380mg(0. 67mmol)，从 257mg(0. 91mmol)鸟苷开始(74 % ) ； (10)57mg(0. lOmmol), 从 120mg (0. 42mmol)7-甲基鸟苷开始(24% ) ； (ll)75mg (0. 13mmol)，从 70mg (0. 23mmol)7, 2' -0-二甲基鸟苷开始(53% )。实施例4 核苷5 ‘ - (2-0-硫代二磷酸)的合成7,2' -0-二甲基鸟苷 5，-0-(2_硫代二磷酸)(17)。向 14 (100mg，0. 21mmol)和硫 代磷酸三乙基铵盐(220mg)在5ml DMF中的悬浮液之中添加无水ZnCl2(190mg，1. 40mmol)。 将所得的溶液在室温下搅拌20分钟。通过添加EDTA(520mg，1. 40mmol)在50ml水中的溶 液来猝灭反应，并用固体NaHC03进行中和。使用0-1.0M的TEAB梯度，在DEAE S印hadex上 分离产物。产率106mg(0. lSmmol)的(I7)，作为 TEA 盐(了1%)。7-甲基鸟苷5' -0-(2_硫代二磷酸)(16)。如对于(17)所描述的那样，从(13) (40mg,0. 089mmol)和硫代磷酸三乙基铵盐(lOOmg)开始来合成该化合物。产率 31mg(0. 046mmol)的(16)，作为 TEA 盐(52%)。实施例5帽S-ARCA的合成下面是对于各种帽S-ARCA的合成的描述。合成途径描绘在图1、2和3中。(数 字)是指在图1、2和3中进行编号的化合物。m7GpppsG D1 和 D2 (la, lb)。向(9) (10mg, 0. 018mmol)禾口 7 (15mg, 0. 027mmol)在 DMF(0. 8ml)中的悬浮液之中添加无水ZnCl2 (30mg，0. 22mmol)。反应在室温下维持2天。通 过添加在10ml水中的90mg EDTA来猝灭反应，并用固体NaHC03进行中和。通过分析型RP HPLC来分离开非对映异构体(la)和(lb)。产率0. 8mg(la)和1. Omg (lb)，作为NH4+盐。 合成的流程图显示在图1中。m7GppspG D1和D2 (2a，2b)。如对于1所描述的那样，从在2ml DMF中的16 (20mg, 0. 030mmol)、15(23mg，0. 053mmol)、ZnCl2 (60mg, 0. 44mmol)开始来合成该化合物。产率 2. 2mg(2a)和1. 8mg (2b)，作为NH4+盐。合成的流程图显示在图3中。m7GpsppG D1和D2 (3a，3b)。如对于(1)所描述的那样，从在3. 5ml DMF中的(10) (58mg，0. 090mmol)、(12) (120mg，0. 22mmol)、ZnCl2 (249mg，1. 8mmol)开始来合成该化合物。 产率14. 7mg(3a)和10. lmg(3b)，作为NH4+盐。合成的流程图显示在图2中。m27’2' -0GpppsG D1 禾口 D2 (4a，4b)。将化合物(9) (48mg,0. 084mmol)禾口 (8) (57mg, 0. lOmmol)悬浮在2ml DMF中。随后，添加无水ZnCl2 (115mg，0. 84mmol)。将所得的溶液在 室温下维持2天。通过添加在30ml水中的350mg EDTA来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进 行中和。在45分钟内，使用在0.05M乙酸胺(pH = 5.9)中的0-50%的甲醇线性梯度，通过 半制备型RP HPLC来分离开产物。产率5. 2mg(4a)和7. 4mg(4b)，作为NH4+盐。合成的流 程图显示在图1中。m/’2' _°GppspG D1和D2(5a，5b)。如对于(4)所描述的那样，从在5ml DMF中的 (17) (106mg，0. 16mmol)、(15) (103mg，0. 24mmol)和 ZnCl2 (260mg，1. 9mmol)开始来合成该化 合物。用在100ml水中的800mg EDTA来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进行中和。使用等度 的0. 05M乙酸铵(pH = 5. 9)，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率10. Omg (5a)和 12. lmg(5b)，作为NH4+盐。合成的流程图显示在图3中。m/’2' _°GpsppG D1和D2 (6a，6b)。如对于(4)所描述的那样，从在3ml DMF中的 (11) (70mg，0. 15mmol)、(12) (107mg，0. 20mmol)和无水 ZnCl2 (220mg, 1. 6mmol)开始来合成 该化合物。用在70ml水中的650mg EDTA来猝灭反应。在45分钟内，使用在0. 05M乙酸 铵(pH = 5. 9)中的0-50%的甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率 15mg(6a)和20mg(6b)，作为NH4+盐。合成的流程图显示在图2中。通过在RP HPLC上的再次色谱法(re-chromatography)、使用负电喷雾电离的质 谱法(MS ESI-)以及1H NMR和31P NMR光谱学，来确认上述最终化合物的结构和均一性。结 果显示在下表1中。表 1相对于内标3-三甲基甲硅烷基-[2，2，3，3_2H4]-丙酸钠的以百万分率表示的屮NMR化学位移(士 0. 01)
以及相对于外标H3P04的以百万分率表示的31P NMR化学位移(士 0. 01) 实施例6四磷酸S-ARCA的合成通过m/’2' '°GpPsPPG的合成显示了用于合成含有5' ,5'-四磷酸桥的S-ARCA的 所开发出的策略的效用(图4)。通过类似的方法可得到三种其他四磷酸S-ARCA(即，m/‘ 2' -0GpspppG、m/'2' -0GpppspG、m/'2' _0GppppsG)的合成。 将7，2，-0_ 二甲基鸟苷5，-(硫代二磷酸)(20mg，0. 029mmol)和鸟苷5，-二磷酸 N-酰化咪唑(30mg, 0. 056mmol)悬浮在 2ml DMF 中。随后，添加无水 ZnCl2 (61mg, 0. 45mmol)。 在室温下搅拌所得的溶液3天。通过添加在20ml水中的EDTA(166mg，0. 45mmol)来猝灭反 应，并用固体碳酸氢钠进行中和。使用0-1.2M的TEAB梯度，通过离子交换DEAE Sephadex 色谱法来分离开产物。收集包含m/’2’-°GppsppG的非对映异构体混合物的级分，倒在一起， 并在减压下通过反复添加乙醇来进行蒸发。在60分钟内，使用在0. 05M乙酸铵(pH = 5.9)中的0-25%甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来达到最后的纯化。产率7mg m/‘ 2' _°GppsppG (非对映异构体混合物)，作为NH4+盐。MS ESI (-)关于 C22H30N10017P3S 的计算值897. 02 ；测定值879. 09D1 ^ NMR 8 (ppm) 9. 14 (1H, s) 8. 08 (1H, s)，5. 99 (1H, d) ,5. 813 (1H, d) ；4. 70 (1H ； t)，4. 64 (1H, t)，4. 54 (1H, t)，4. 45 (1H, m)，4. 35 (2H, m)，4. 29 (3H, m)，4. 07 (3H, s)，3. 60 (3H, s) ；31P NMR 8 30. 2 (IP, t,Py),-ll. 1 (IP, dd,P 8 ) ,-11. 9 (IP, dd，P a )，-23. 8 (IP, d，P 旦)D2 ^H NMR 8 (ppm) 9. 16 (1H, s) 8. 08 (1H, s)，6. 03 (1H, d)，5. 83 (1H, d) ；4. 70 (1H ； t)，4. 60 (1H, t)，4. 54 (1H, t)，4. 45 (1H, m)，4. 35 (2H, m)，4. 29 (3H, m)，4. 07 (3H, s)，3. 58 (3H, s) ；31P NMR 8 30. 2 (IP, t,Py),-ll. 1 (IP, dd,P 8 ) ,-11. 9 (IP, dd, P a )，-23. 8 (IP, d，P 旦)实施例7具有两个硫代磷酸部分的S-ARCA的合成所开发出的策略还提供了用于合成在5' ,5' _多磷酸桥中含有多个硫代磷 酸部分(这可以通过图5中所建议的合成路线来达到)的化合物(例如，化合物m/’ 2' _°GppsPsG)的方法。将与先前对于腺苷5' -0-硫代磷酸的N-酰化咪唑衍生物所 才艮道的操作程序[M. Shimazu 等人，‘‘Regio—and stereocontrolled synthesis of 2 ‘ -5 ‘ -1inkedphosphorothioate oligoadenylates by uranyl ion catalyst in aqueoussolution"，J. Chem. Soc.，Perkin Trans. 1，2002，1778-1785]相类似地来制备鸟 苷5' -0-硫代磷酸的N-酰化咪唑衍生物，并用三乙基铵碳酸氢盐的线性梯度(在去离子 水中的0至0. 5M TEAB)在DEAES印hadex A-25上进行纯化。关于该合成的描绘显示在图 5中。鸟苷5' -0-(1，2_ 二硫代二磷酸)。将鸟苷5' -0-单硫代磷酸的N-酰化咪唑衍生物(三乙基铵盐，53mg，0. lmmol)与硫代磷酸三乙基铵盐(320mg，约1. 2mmol)相混合， 并将所得的混合物悬浮在3. 5mLDMF中。随后，添加无水氯化锌(55mg，0. 4mmol)和氯化锰 (50mg，0. 4mmol)。通过添加EDTA溶液(270mg，0. 8mmol，在35mL水中)来猝灭反应，并用碳 酸氢钠调至pH 7。用三乙基铵碳酸氢盐的线性梯度(在去离子水中的0至0.9M TEAB)，在 DEAE-Sephadex A_25柱上进行色谱法分离。收集包含鸟苷5 ‘ -0- (1，2- 二硫代二磷酸)的 级分并通过添加乙醇在减压下进行蒸发，并且将所得的固体在真空中通过P401(l进行干燥。m/’2' _°GppspsG。将7，2 ‘ _0_ 二甲基鸟苷5 ‘ _0_单磷酸的N-酰化咪唑衍生物(钠 盐，23mg，0.05mmol)与鸟苷 5' _0_ (1，2-二硫代二磷酸)(三乙基铵盐，39mg，0. 05mmol) 相混合，并将所得的混合物悬浮在1. 5mL DMF中。随后，添加无水氯化锌(55mg，0. 4mmol)。 通过添加EDTA溶液(13511^，0.4讓01，在201^水中)来猝灭反应，并用碳酸氢钠调至pH 7。 m27'2' _°GppspsG非对映异构体(D1、D2、D3、D4)的色谱法分离和分开通过半制备型RP HPLC 来进行。实施例8细胞培养HC11乳腺上皮细胞以克隆方式衍生自C0MMA-1D小鼠乳腺细胞系。参见， K.Danielson 等 人’ “Epithelial mouse mammary cell lineexhibiting normal morphogenesis in vivo and functionaldifferentiation in vitro," Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A.，第 81 卷，第 3756-3760 页(1984)。细胞在含有 10%牛生长血清(HyClone)、 5iig/ml 牛胰岛素(Sigma)、10ng/ml 重组 EGF(BD Biosciences)的 RPMI1640 培养基中进行 生长。实施例9mRNA的体外合成在所有四种核苷三磷酸和不同的帽二核苷酸存在下，用T7聚合酶在编码萤 光素酶的质粒(pluc-A6C1)存在下通过体外转录来合成加帽的RNA。参见J. Jemielity 等人， “Novel ‘ anti-reverse ‘ cap analogueswith superior translational properties, “ RNA,第9卷，第1108-1122页(2003)。典型的转录反应包含 40mM Tris-HCl(pH 7. 9)、6mMMgCl2、2mM 亚精胺、10mM DTT、0. lmg/ml BSAUU/u 1 的 RNasin(Promega)、0. 5mM ATP、0. 5mM CTP、0. 5mM UTP、0. ImM GTP、ImM 帽类似物、15 ii g/ml DNA 和 1U/ ill 的 T7 聚合酶(Promega)。pluc_A6(l (其包含有在 pGEM4 (Promega)中的整 个萤火虫萤光素酶编码序列和3’ -末端的60-nt poly (A)束(tract)(参见E. Grudzien 等人’ “Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novelcap analogs，" J. Biol. Chem.，第 281 卷，第 1857-1867 页(2006))用 Hpal 进行消化以合成萤 光素酶mRNA，并且用Ncol进行消化以合成加帽的寡核苷酸。在10iiCi/iil的[a」2P]GTP(ICN)存在下，在于37°C温育45分钟的50-yl反 应混合物中合成短RNA(约48nt的加帽的寡核苷酸)。用苯酚和氯仿对反应混合物进行提 取，然后根据制造商的实验方案，使用旋转柱(spin column) (Ambion)将RNA与未掺入的核 苷酸分离开。通过契仑科夫(Cerenkov)计数法来测定mRNA的浓度，其中将最终转录反应 混合物中[a "32P]GTP的比放射性活度用于使cpm转换为pmol。在于37°C温育45分钟的200- u 1反应混合物中合成mRNA。温育后，将200- u 1反应混合物在37°C下用3个单位的DNA酶RQ1 (Promega)处理20分钟，并使用制造商的实 验方案，用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)来纯化RNA。采用分光光度测定法来测定RNA的浓度。实施例10体外RNA脱帽测定法使用加帽的48-nt寡核苷酸(萤光素酶mRNA的截短形式(48个核苷酸))作为底 物来测量Dcp2活性。在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达GST_hDcp2并进行纯化，如 Z. Wang 等人，“The hDcp2 proteinis a mammalian mRNA decapping enzyme, " Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，第99卷，第12663-12668页(2002)所描述的。首先使加帽的寡核 苷酸在37°C下在脱帽缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7. 5)、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁、0. 5mM MnCl2、2mM 二硫苏糖醇和0. ImM精胺)中经历使用GST_hDcp2来进行的消化2小时。参见 C. Piccirillo等人，〃 Functional characterization of the mammalian mRNAdecapping enzyme hDcp2，" RNA，第9卷，第1138-1147页(2003)。然后，将反应混合物用等体积的苯 酚提取一次和用氯仿提取两次，并且用乙醇来沉淀出RNA。将脱帽反应的产物进一步用核糖 核酸酶的混合物(RiboShredder ；Epicentre)在37°C下消化1小时。产物在4. 6X250_mm Partisil 10SAX/25柱(Whatman)上通过阴离子交换HPLC进行解析。梯度的组成如下水， 1分钟；至112mM KH2P04的线性梯度(pH 4. 5)，20分钟；112-450mM KH2P04的线性梯度，15 分钟；450mM至1. 5M KH2P04的线性梯度，15分钟；和以1. 5M KH2P04的等度洗脱，9分钟；全 部以1ml/分钟的流速。实施例11在HC11细胞中的翻译效率和mRNA衰变的测量使用两种方法(电穿孔和核穿孔)来将RNA递送入细胞中。在电穿孔的情况下， 用 Bio-Rad Genepulser 设备，以 0. 22kV 和 960 ii F，在 Gene pulser 杯池(cuvette) (4mm 间隙)中，在总体积400 u 1的血清减少的RPMI 1640培养基中，将5 y g RNA引入107个 HC11细胞中。在放电后，细胞用PBS洗涤两次，在室温下以300 X g离心2分钟，重悬浮在预 热的完全培养基中，并放置于37°C。根据制造商的建议，用Amaxa Nucleofector II(Amaxa Biosystems)来进行核穿孔。使用Nucleofector溶液V和一套所建议的方案(程序T-024)， 将1微克的RNA引入106个HC11细胞中。为了测量翻译效率，将细胞划分入几个Eppendorf管中，放置在37°C的水浴中，并 摇动。为了测量mRNA稳定性，将细胞分配入35-mm细胞培养皿中，并且放置于37°C和在5% C02潮湿气氛中。在各个不同的时间处收获细胞，并用PBS洗涤两次。为了细胞质 RNA 的提取，在 175 ill 裂解缓冲液(50mM Tris_HCl(pH 8. 0) U40mM NaClU. 5mM MgCl2,0. 5% (v/v) Igepal (Sigma)和 ImM 二硫苏糖醇)中裂解 2X105 个细胞。 RNA用RNeasy小型试剂盒来进一步进行纯化。为了蛋白质的提取，在200 yl萤光素酶细胞 培养物裂解试剂(Promega)中裂解2X105个细胞。根据制造商的实验方案(Promega)，测 量细胞提取物的萤光素酶活性。实施例12多核糖体的制备为了分离开核糖体亚基和起始复合物，用包含0. lmg/ml放线菌酮的冰冷的PBS处理4 X 106个HC11细胞2分钟，用相同的培养基洗涤两次，并且在600 ill的0. 3M NaCl、15mM Tris-HCl (pH 7. 6)、15mM MgCl2、1 % Triton X-100、lmg/ml 肝素和 0. lmg/ml 放线菌酮中进 行裂解。在以14，OOOXg离心10分钟后，将上清液铺层在15-45%蔗糖梯度(在相同的但 缺少Triton X-100的缓冲液中)上，并且在Beckman SW41Ti转子中于4°C以38，OOOrpm离 心2小时。通过连续监测在260nm处的吸光度来使梯度分级分离。从每个级分(1ml)中分 离出RNA，并通过实时PCR来进行分析。实施例13实时PCR为了测量mRNA稳定性，将从HC11细胞中分离并用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)纯 化的约2 u g每种总RNA样品在37°C下用3个单位的DNA酶RQ1 (Promega)处理20分钟。在包 含5. 5mM 1%(12、50011]\1每种(1^1\2.511]\1随机六聚体、0.2个单位的1 ^酶抑制剂和0.8个 单位的MultiScribe反转录酶(Applied Biosystems)的20_ii 1反应混合物中对400ng RNA 进行反转录。将反应混合物于25°C温育10分钟，于48°C温育30分钟，和于95°C温育5分钟。 使用以BeaconDesigner工具(Bio-Rad)对于每种mRNA而设计的特异引物来进行定量实时 PCR。关于检测萤光素酶mRNA的5，-末端的序列，引物为5，-CGTTCGGTTGGCAGAAGCTA_3，(SEQ ID NO 1)和 5，-ACTGTTGAGCAATTCACGTTCATT-3，(SEQ ID NO :2)。从帽结构至 3，-末端同 聚物束的开始处，萤光素酶mRNA由1714个核苷酸组成。这些引物扩增出核苷酸226-398。 使用引物 5，-CAATGTGTCCGTCGTGGATCT-3，(SEQ ID NO 3)和 5，-GAAGAGTGGGAGTTGCTGTTGA -3’ (SEQ ID NO :4)，通过相同的方法和在相同的RNA样品中测量小鼠GAPDH mRNA水平。用iCycler IQ实时PCR检测系统，在包含5 u 1转录反应混合物(50ng cDNA)、 12. 5u 1 IQ SYBRgreen Supermix 和 0. 3mM 引物(Bio-Rad)的 25_ii 1 反应混合物中进行扩 增和检测。温育条件是在95°C下3分钟以用于聚合酶活化，以及在95°C下15秒和在60°C 下1分钟的40个循环。使用如在关于ABI Prism 7700 Sequence Detection System 的第 2 号用户公报 中所描述的绝对标准曲线方法来计算萤光素酶mRNA水平。在从标准曲线计算出萤光素酶 mRNA的量后，将其对于每个样品中小鼠GAPDH mRNA的量进行标准化。将在每个时间点处存 留的萤光素酶mRNA的量转换为在零时存在的RNA的百分比，并将结果以“log1(l([RNA])对 时间”的形式进行作图以测定半寿期。为了分析来自多核糖体梯度的RNA，在RNA分离之前， 向每个级分中添加体外合成的GFP mRNA作为内标以检验RNA产量的变化。使用GFP mRNA 水平来使萤光素酶和GAPDH mRNA的水平标准化。实施例14对于eIF4E的结合亲和力通过荧光猝灭来测定S类似物对于鼠类eIF4E的结合亲和力。在LS-50B分光荧光 计(Perkin Elmer Co.)上，于 20. 0 士 0. 2°C，在 50mMHEPES/K0H(pH 7. 2) UOOmM KC1、0. 5mM EDTAUmM DTT中进行荧光滴定测量。向1. 4ml的0. 1蛋白质溶液中添加1 P 1浓度递增 的帽类似物溶液的等份试样。考虑到样品稀释和内滤效应，对荧光强度(用2.5nm带宽在 280nm处进行激发，和用4nm带宽和290nm截止滤光片在337nm处进行检测)进行修正。通 过将荧光强度对于帽类似物总浓度的理论依赖性(theoretical dependence)与根据先前 所描述的方程(参见 A. Niedzwiecka 等人，"Biophysical studies ofeIF4E cap-bindingprotein :recognition of mRNA 5' cap structure andsynthetic fragments of eIF4G and 4E-BP1 proteins，”J. Mol. Biol.，第 319 卷，第 615-635 页(2002))的实验数据点相拟 合，来测定平衡缔合常数(Kas)。将蛋白质浓度作为显示“活性”蛋白质的量的平衡方程的自 由参数进行拟合。将最终的Kas计算为3至10次独立滴定的加权平均值，其中将所述权重 作为数值标准差平方的倒数。使用0RGIN 6. 0(Microcal Software Inc.，USA)来进行数值 非线性最小二乘回归分析。根据标准方程AG° =_RTlnKAS，从KAS值来计算结合的吉布斯 自由能。实施例15通过人和秀丽隐杆线虫(C. elegans) DcpS来进行的酶促水解根据先前所描述的操作程序(L.S. Cohen等人，“Nematodem7GpppG and m3(2，2，7) GpppG decapping :activities in Ascarisembryos and characterization of C. elegans scavenger DcpS，” RNA，第10卷，第1609-1624页(2004))，在大肠杆菌中表达人和线虫 DcpS。这两种蛋白质都于 _80°C在含有 50mM KC1、0. 2mM EDTA、lmMDTT、0. 5mM PMSF 禾口 20% 甘油的20mM Tris缓冲液(pH 7. 5)中进行贮存。在37°C下，用5. 0或7. 0 yl的在500 yl 含有 20mM MgCl2 和 60mM (NH4) 2S04 的 50mM TRIS 缓冲液(pH = 7. 9)中的 DcpS (分别来自人 或秀丽隐杆线虫)处理浓度为ImM的合适的帽类似物60-90分钟。每15-20分钟从反应混 合物中收集100 yl样品，并通过在90°C下温育3分钟来使其失活。不经进一步处理，通过 分析型RP HPLC来分析所收集的样品，其中在15分钟内使用在0. 1M KH2P04(pH = 6. 0)中 的0-50%甲醇线性梯度，并在260nm处进行UV-检测。实施例16帽依赖性翻译的抑制将经微球菌核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物用于体外翻译(A.Cai等人， "Quantitative assessment of mRNA cap analogues asinhibitors of in vitro translation, ”Biochemistry，第 38 卷，第 8538-8547 页(1999))。在 100mM 乙酸钾和 1. 4mM氯化镁时，取得最佳的帽依赖性翻译。为了测定由各种帽类似物引起的翻译的抑制， 以g/ml的浓度向裂解物中添加天然的兔珠蛋白mRNA，并通过[3H]Leu的掺入来测量蛋 白质合成。如先前所描述的(Cai等人，1999)，进行&数据的标准化。使用入= 255nm和 ￡ M = 22. 6X 10_3M，在pH 7. 0下通过UV吸收来测量二核苷酸帽类似物溶液的浓度。结果实施例17帽类似物的合成导致获得在三磷酸链的a、Y和0位置处拥有硫代磷酸基团的类似物的合成途 径分别描绘在图1、2和3中。我们合成了一系列的6种帽类似物，其在5’，5’ -三磷酸链的a、0或Y位置处 携带有单个硫代磷酸部分。(参见下文)。由于致立体性(Stere0genic)P-中心的存在，每 种S-类似物以两种非对映异构体(根据它们在RP HPLC期间的洗脱顺序而命名为D1和 D2)的混合物形式而获得。通过RP HPLC成功地对每种S-类似物进行了拆分，从而提供了 12种化合物，随后对这12种化合物在生物物理学和生物化学方面进行了表征。这些S-类 似物中的6种包含ARCA修饰，即在m7Guo部分中的2 ‘ -0-甲基，并因此称为S-ARCA。在3位置处引入硫代磷酸基团产生了对于Dcp2的抗性，增加了半寿期，和改善了翻译效率c
n.a.-未指定S-ARCA的该化学合成是最初对于具有未修饰的5’，5’ -多磷酸桥的帽类似 物所幵发的化学合成的修改形式。参见M.Kadokura等人，“Efficient synthesis of y-methyl-capped guanosine 5 ' -triphosphate as a5 ' -terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bondformation involving activation of methyl phosphorimidazo1idate usingZnCl2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions, 〃 TetrahedronLett.，第 38 卷，第 8359-8362 页(1997) ；J. Stepinski 等人， 〃 Synthesisand properties of mRNAs containing
the novel
anti-reverse
capanalogues 7-methyl(3
-0-methyl)GpppG
and 7-methyl (3 ! -deoxy) GpppG， “ RNA,第 7 卷，第 1486-1495 页(2001)；和 J.Jemielity 等人， “Novel ‘ anti-reverse ‘ cap analogues with superior translationalproperties, “ RNA，第 9 卷，第 1108-1122 页(2003)。将两个单核苷酸种类(其中之一首先转化为反应性N-酰化咪唑衍生物)在DMF中进行偶联。通过8倍 过量的ZnCl2来促进反应，所述8倍过量的ZnCl2显著地改善反应物在有机介质中的溶解 度，防止N-酰化咪唑衍生物的水解，和加速反应速率。在该合成中的重要步骤是在DMF中 在ZnCl2存在下合适的N-酰化咪唑衍生物与核苷5’ -硫代磷酸或核苷5’ -(2-硫代二磷 酸)的偶联。在类似的、最近开发出的反应(其采用硫代磷酸阴离子(PS033—)作为亲核体) 中有效地获得中间体核苷5’ -(2-硫代二磷酸)。参见J. Kowalska等人，“A simple and rapid synthesis of nucleotideanalogues containing a phosphorothioate moiety at the terminalposition of the phosphate chain，，，Tetrahedron Lett,第 48 卷，2007, 5475-5479。我们所开发出的反应策略使得能够在多磷酸链的所选位置处引入硫代磷酸部 分，以及产生中间体核苷5’ _(2_硫代二磷酸)。如上文所显示的和如在权利要求书中所使用的，称为“a ”的磷酸部分是对于 7-甲基鸟苷部分来说最远端的磷酸部分。称为“0 ”的位置是在朝向7-甲基鸟苷部分移 动的方向上的下一个磷酸，和称为“ Y，，的位置是在朝向7-甲基鸟苷部分移动的方向上的 下一个磷酸。在三磷酸ARCA中，如上文所显示的，“ Y ”是最靠近7-甲基鸟苷部分的磷酸。 在四磷酸ARCA中，“ S ”磷酸将“ Y ”与7-甲基鸟苷相隔开。(在没有7-甲基鸟苷部分的 ARCA中，将会理解，应当修改前面的定义以换而涉及具有这样的位置的部分，即该位置类似 于在本文所给出的实施例中的7-甲基鸟苷的位置)。导致获得在5'，5'-三磷酸桥的a-位置处经修饰的类似物1和4(即， m7GpppsG*m/’2' _°GpppsG)的合成途径描绘在图1中。在这两个最后的偶联反应中，都使 用了 1. 5至2倍过量的磷酸N-酰化咪唑(phosphorimidazolide)以确保核苷5'-硫代 磷酸的完全消耗。偶联稳步地进行，这导致在1-2天内几乎完全消耗掉底物。在Y位置 处经修饰的类似物3和6(8卩，m7GpsppG和m/’2' _°GpsppG)的合成(描绘在图2中)与上 文所描述的相似。在每种情况下，如图2中所显示的那样，通过RP HPLC来指示两种非对 映异构体的形成。中间体核苷5'-硫代磷酸9、10和11经过合适的核苷的硫代磷酸化 来合成，所述硫代磷酸化于0°C在2，6_ 二甲基吡啶存在下在磷酸三甲酯中通过？5(13来 进行，类似于先前报道的操作程序(J. R.Moran等人，“Apractical enzymatic synthesis of (S[P])-adenosine 5 ' -0-(1-thiotriphosphate)((S[P])-ATP-d-S)，” J. Org. Chem.， 第49卷，第704-706页(1984))。在化合物10和11的情况下，N7位处的甲基化必须在 硫代磷酸化步骤之前在核苷阶段进行，这是因为否则甲基碘优先使硫原子烷基化(未发表 的发现)。通过采用2，2'-联硫基二吡啶/三苯膦活化体系，经过与咪唑的反应而容易 地达到将核苷5 ‘ - 二磷酸转化为其N-酰化咪唑衍生物(7、8和12-15) (T. Mukaiyama等 A "Phosphorylation by oxidation-reduction condensation. Preparationof active phosphorylating reagents，”Bull. Chem. Soc. Jpn ，第 44 卷，第 2284 页(1971))。如图 3 中所描绘的那样，合成在位置处经修饰的类似物，即m7GppspG(2)和m/’2' _°GppspG(5)。 最终的偶联的HPLC分析揭示了两种P-非对映异构体的形成。但是，它们的保留时间 非常相似。为了获得中间体核苷5' -0-(2-硫代二磷酸)16和17，我们采用了最近开 发出的在核苷5'-单磷酸N-酰化咪唑和作为亲核体的硫代磷酸(PS033—)三乙基铵盐 之间的偶联反应(J. Kowalska 等人，"A simple and rapid synthesis of nucleotide analogues containing aphosphorothioate moiety at the terminal position of the
24phosphatechain”，Tetrahedron Lett，第 48 卷，2007，5475-5479)。在所有导致获得帽类似物1-6的反应中，HLPC分析都揭示，作为主要产物形成了 所希望的化合物，只有适度量的副产物。尽管如此，制备性的产量令人惊讶地低于由HPLC 所指示的那些，在总体10-20%的范围内。这可能是由于在长时间的通过RP HPLC来分离开 非对映异构体的过程中材料的大量损失所致，RP HPLC在许多情况下重复进行以便获得非 对映异构体纯的样品。实施例18体外脱帽反应我们就通过重组hDcp2的水解而测试了用任一种S-ARCA帽化的寡核苷酸，以测试 用m/’2’ _°GpppsG和m/’2’ _°GppspG的各种非对映异构体帽化的mRNA在它们对于通过Dcpl/ Dcp2的切割的敏感性方面是否不同。一般地，参见，Z.Wang等人，‘‘The hDcp2 protein is amammalian mRNA decapping enzyme, " Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,第 99 卷，第 12663-12668 页(2002)；和 Z. Wang 等人，“An mRNAStability Complex Functions with Poly (A) -Binding Protein ToStabilize mRNA In Vitro “，Mol. Cell. Biol.，第 19 卷，第 4552-4560页(1999)。所使用的帽类似物在最初是未标记的，因此为了追踪消化反应的产 物，我们在[a "32P]GTP和DNA模板(其中G是在启动子之后指定的第一个核糖核苷酸)存 在下合成了加帽的寡核苷酸。用所述S-ARCA中的任一种帽化的寡核苷酸经历体外Dcp2消 化，之后用核糖核酸酶混合物(来自Epicenter的RiboShredder)进一步消化所述产物。通 过最近邻转移(nearest-neighbor transfer)，在核糖核酸酶消化后，在G残基的5’-侧处 的任意核苷酸获得32P_标记的3’ -磷酸基团。然后，使用阴离子交换色谱法将在RNA中的 内部位置处的经标记的3’ -核苷单磷酸(3’ -NMP * )与经标记的5’ -末端产物解析开(图 6)。后者分别包括源自未帽化的转录物的p3Gp *和m/’2’_°Gp3Gp * (当使用m/’2’_°Gp3G时)， 或者由对于酶促切割具有抗性或不具有抗性的帽化的RNA而产生的pGp *。所使用的所有 帽类似物是ARCA，其确保它们仅以正确的方向掺入RNA中。这进一步保证了，在核糖核酸酶 处理后只观察到一种5’ -末端产物(m/’2’ _°Gp3Gp * )。未帽化的RNA不是Dcp2的底物，这 解释了为什么在Dcp2消化后观察到p3Gp *产物。为了确定哪些帽类似物保护mRNA免于hDcp2切割，我们用重组hDcp2消化加 帽的、32P_标记的短RNA，其中采用这样的条件，即在所述条件下⑴用m/’2’-°Gp3G帽化 的寡核苷酸完全被hDcp2消化(图6A)，和(ii)用m/’3’_°GppCH2pG帽化的寡核苷酸具有 抗性(图6B)。先前显示，m/’3’-°GppeH2pG保护mRNA免于hDcp2降解。参见E. Grudzien 等人’ “Differential inhibition of mRNA degradationpathways by novel cap analogs, “ J. Biol. Chem.，第 281 卷，第 1857-1867 页(2006)。我们发现，只有m/’2’_°GppspG 的D2异构体使RNA对于hDcp2水解保持稳定(图6F)。用m/’2’_°GpppsG和m/’2’_°GpsppG的 异构体帽化的寡核苷酸不显示在对于hDcp2的稳定性方面的增加(图6C、6D、6G和6H)。实施例19用硫代磷酸帽类似物帽化的mRNA的5’降解由于用m/’2’_°GppspG(D2)帽化的短RNA对于hDcp2水解具有抗性，我们预测，该 帽类似物的存在会影响细胞中mRNA的稳定性。我们使用核穿孔或电穿孔来将合成的萤光 素酶mRNA引入HC11小鼠乳腺上皮细胞中。这些方法允许几乎紧接在放电后，就测量细胞中的萤光素酶合成和萤光素酶mRNA水平。对于电穿孔，我们使用先前优化的条件。参见 E. Grudzien等人，“Differential inhibition of mRNAdegradation pathways by novel cap analogs, “ J. Biol. Chem.，第 281 卷，第 1857-1867 页(2006)。对于核穿孔，我们遵 循由Amaxa Biosystems建议的条件(参见“材料和方法”)。由于Amaxa实验方案给出了 最高的转染效率以及还有最高的细胞生存力，因而其被用于本文所描述的大多数实验。在体外合成了包含各种5’ -末端帽和3’ -末端60-nt poly (A)束的萤光素酶 mRNA(Luc-A60)。在核穿孔后，以直至90分钟的间隔取出细胞以便测量翻译效率，其中使用 萤光素酶活性增加的速率；或者以直至8小时的间隔取出细胞以通过实时PCR来测量萤光 素酶mRNA稳定性。如果从包含经翻译的和未翻译的mRNA两者的细胞中回收mRNA，那么翻 译效率和mRNA稳定性的测定可能会是错误的。为了解决这个问题，我们测定了总胞质mRNA 的降解速率，相比于多核糖体mRNA。将用m/’2’_°Gp3G帽化的萤光素酶mRNA核穿孔入HC11 细胞中，然后在各个不同时间处裂解所述细胞并且铺层在蔗糖梯度上以将多核糖体与起始 复合物分离开。合并多核糖体级分，并纯化RNA。为了追踪胞质mRNA降解，我们使用从总细 胞提取物中分离出的mRNA。在这两种情况下，均使用针对荧光素酶mRNA的5’ -末端的引 物对，通过实时PCR来定量萤光素酶mRNA。与多核糖体相联合的转录物以大约与总胞质mRNA相同的速率被降解(数据未显 示)。这暗示，即使在任何给定时间处存在经翻译的和未翻译的荧光素酶mRNA池(pool)， 但mRNA在它们之间自由交换。该观察结果验证了翻译效率和降解速率的测量结果。在核穿孔入HC11细胞中后，测定了用各种S-ARCA帽化的Luc-A6(1的稳定性。通 过实时PCR测定了在各个不同时间处存留在细胞中的mRNA。用m/’2’_°GppspG(D2)帽化的 Luc-A60 (t1/2 = 257 分钟)比用天然帽 m7Gp3G (t1/2 = 86 分钟)或亲本化合物 m/’2’_°Gp3G (t1/2 =155分钟)帽化的mRNA更为稳定(图7和表2)。这暗示，mRNA稳定性的增加是由于 对于通过Dcpl/Dcp2的水解的抗性而引起的。m/’2’_°GpppsG(Dl) (t1/2 = 169分钟)和m/’ 2’_°GppspG(Dl) (t1/2 = 185分钟)都没有赋予比m27’2’-°Gp3G(t1/2 = 155分钟)显著更大的稳 定性(表2)。值得注意的是，m/’2’-°GpppsG(Dl)和m/’2’-°GppspG(Dl)对于eIF4E的亲和力 都为m/’2’ _°Gp3G的3倍。人们可能预期，用这些类似物帽化的mRNA将会更稳定，如果关于 eIF4E和Dcpl/Dcp2之间的竞争的假说是正确的话。参见E. Grudzien等人，“Differential inhibition of mRNA degradation pathways bynovel cap analogs," J. Biol. Chem. ,M 281卷，第1857-1867页(2006)。对于用这些类似物帽化的mRNA，我们没有观察到稳定性 或翻译效率的增加(参见下文)。这可以表明，虽然m/’2’_°GpppsG(Dl)和m/’2’_°GppspG(Dl) 更强地结合eIF4E，但存在有上限，超过了该上限，对于eIF4E的高亲和力不加速总体翻译。 根据这个解释，当帽结合的速率变得足够高时，蛋白质合成起始中的一些其他步骤就成为 是限速的。实施例20在HC11细胞中用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA的翻译效率对于用S-ARCA帽化萤光素酶mRNA，我们还测定了在培养的细胞中的翻译效率。这 涉及在核穿孔后的各个不同时间处进行的两个测量在经澄清的细胞裂解物中通过发光测 定法而测量的萤光素酶活性，和通过实时PCR而测量的Luc-A6(i水平。通过已被递送入细 胞中的萤光素酶mRNA的量来使萤光素酶活性标准化。为了测定在紧接于核穿孔后的时间处(即在出现任何衰变之前)在细胞中存在的RNA的量，在核穿孔后2至8小时的各个不 同时间处收获细胞，并且提取胞质RNA。使用扩增5’ -末端附近序列的引物，通过实时PCR 来测量萤光素酶mRNA的量。将在每个时间点处存留的萤光素酶mRNA以“log1(1([RNA])对 时间”的形式进行作图以测定t1/2。将曲线外推至0小时，并计算出递送入细胞中的RNA的 量。我们定义了这样的条件，在所述条件下，在 30分钟的最初的延滞期后，萤光素酶的积 累随着时间是线性的，所述延滞期用于将mRNA募集至核糖体，完成第一条多肽链，和将萤 光素酶释放到细胞溶胶中。用m/’2’_°GppspG (D1)和 m/’2’_°GppspG (D2)帽化的 Luc_A6(lmRNA 以分别为用 m7Gp3G 帽 化的mRNA的2. 8倍和5. 1倍的程度更有效地进行翻译(图8和表2)。对于在兔网织红细胞 裂解物体系中的无细胞翻译，用m/’2’_°GppspG(Dl)和m/’2’_°GppspG(D2)帽化的Luc-A6(1mRNA 仅以为用m7Gp3G帽化的LUC-A6QmRNA的2. 3倍的程度更有效地进行翻译(数据未显示)。 该差异暗示，在培养的细胞中翻译效率的增加与更高的mRNA稳定性(其不是无细胞翻译体 系的因素)相关，这是因为只有用对于hDcp2具有抗性的类似物帽化的mRNA被更有效地翻 译。表2在HC11细胞中具有硫代磷酸帽类似物的萤光素酶mRNA的翻译效率和稳定性 a在20 °C下小鼠eIF4E (氨基酸28-217)与各种帽类似物的相互作用的 平衡缔合常数。在大肠杆菌中表达小鼠eIF4E(残基28-217)，并且进行荧光时间 同 步滴定(fluorescence time-synchronized titration)，如在 J. Zuberek 等 人，“Phosphorylation of eIF4E attenuates its interaction withmRNA cap analogs by electrostatic repusion :Intein-mediated proteinligation strategy to obtain phosphorylated protein, “ RNA,第 9 卷，第 52-61 页(2003)；和 A. Niedzwiecka 等 人， ” Biophysical studies of eIF4Ecap_binding protein -recognition of mRNA 5' cap structure and syntheticfragments of eIF4G and 4E—BP1 proteins，" J. Mol.Biol.，第319卷，第615-635页(2002)中所描述的。b使用图4的数据来估计用各种类似物帽化的寡核苷酸对于hDcp2水解的易感性。 将在44分钟处(未消化的帽)和在38分钟处(pGp * )洗脱出的峰中的放射性活度对于背 景放射性活度进行修正，并相加以代表帽中的总放射性活度。通过作为总放射性活度的百 分比来表示的在pGp *中的放射性活度来给出Dcp2易感性。(ND)未测定。c通过实时PCR(其使用针对萤光素酶mRNA的5’ -末端的引物)来测定用所示的 类似物帽化的LuC-A6(lmRNA中5’ -末端序列的降解。d显示了在HC11细胞中用所示的帽类似物帽化的Luc-A6(1mRNA的翻译效 率。通过细胞中萤光素酶RNA的量来对萤光素酶活性进行标准化。如由J. Jemielity 等人， “Novel ‘ anti-reverse ‘ cap analogues with superiortranslational properties" RNA，第9卷，第1108-1122页(2003)所描述的，计算出相对翻译效率。*指明了与用m/’2'_°Gp3G帽化的mRNA显著不同(p < 0. 05)的半寿期。实施例21在HC11细胞中用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA更有效地被募集至多核糖体我们采用了独立的方法来验证这样的观察结果用m/’2°GppspG帽化的mRNA更有 效地被翻译，即它们的多核糖体分布(图9A-9E)。相对于延伸或终止而言起始的速率的 增加导致mRNA从较轻的多核糖体移动至较重的多核糖体。参见H.Lodish，“ Model for theregulation of mRNA translation applied to haemoglobin synthesis, " Nature, 第251卷，第385-388页(1974)。未预期帽结构的类型会影响延伸的速率。因此，移动至更 高的多核糖体表明了更快的起始。将用m7Gp3G、m/’2’ _0Gp3G 或 m/’2’ —GppspG (D2)帽化的 LucA6(1mRNA 电穿孔入 HC11 细 胞中。在电穿孔后4小时，裂解这些细胞，并将经澄清的上清液铺层在蔗糖梯度上以将多 核糖体与起始复合物分离开。萤光素酶mRNA主要地存在于多核糖体中(图9A和9B，级分 6-11)，尽管有些也存在于起始复合物的区域中(级分3-5)。小的萤光素酶mRNA存在于未 翻译的信使核糖核蛋白复合物(mRNP)池中(图9A和9B，级分1-2)。用标准ARCA即m/’ 2’_°Gp3G帽化的mRNA移动至更高的多核糖体(图9C)。然而，用m/’2’ _°GppspG (D2)帽化的 mRNA移动至更加高的多核糖体，并且同时从mRNP区域中丢失(图9D)。在相同的实验条件 下，内源的GAPDH mRNA被有效地翻译(图9E)，尽管有些也沉积在起始复合物的区域中。总 之，这些结果暗示，萤光素酶转录物的5’-末端处m/’2’-°GppspG(D2)的存在增加它们的起始 速率，从而确认了基于萤光素酶活性的积累的结果。实施例22S-ARCA萤光素酶mRNA的更大的稳定性和更大的翻译效率的组合在HC11细胞中产 生更多的总体蛋白质表达我们还测定了通过其酶促活性来测量的总的萤光素酶积累，作为关于用m/’ 2’ "°Gp3G> m/’2’ _°GppspG(Dl)禾P m/’2’ _°GppspG(D2)帽化的 mRNA 的时间的函数。对 HC11 细胞 进行核穿孔，然后在直至10小时的各个不同时间处进行裂解。将在上清液中测量得到的萤 光素酶活性对于递送入细胞中的Luc-A6(i的量进行标准化。如图10中所显示的，HC11细胞 中的萤光素酶活性在3小时处达到最大，然后在经过10小时下降至1/10。表达的动力学与 荧光素酶蛋白质的半寿期(其为约180分钟)(参见J. Thompson等人，“Modulation offireflyluciferase stability and impact on studies of gene regulation, " Gene, 第103卷，第171-177页(1991))和各种萤光素酶mRNA的半寿期(其分别为155、185和 257分钟)相一致。对于用m/’2’_°GppspG(D2)帽化的LuC-A6(l (其具有最高的翻译效率和最 大的稳定性)来说，大多数萤光素酶发生积累。预测对于具有更长半寿期的蛋白质来说，来 自用该类似物帽化的mRNA的总体蛋白质表达的增加是更加大的。实施例23对于eIF4E的结合亲和力所述S-类似物的KAS值和结合自由能(AG° )，以及关于它们的未修饰的亲本 化合物的同样的数据显示在表3中。令人惊讶地，不但硫代磷酸部分的存在没有降低对于 eIF4E的结合亲和力，而且在有些情况下，亲和力还显著增加了。KAS值强烈地依赖于硫代磷 酸修饰的位置和在不对称P-中心周围的绝对构型。有趣的是，在每对非对映异构体中，D1 成员以D2成员或亲本类似物的2. 3至4. 5倍的亲和力与eIF4E结合。例如，m27,2' _°GpsppG 的D1异构体的Kas为D2或m27,2' _°GpppG的3倍。类似地，m27’2' _°GppspG的D1异构体的KAS 为D2的2倍和为m/’2' _°GpppG的4. 5倍。对于、-修饰的类似物，观察到最大的在D1/D2 非对映异构体之间的结合亲和力的差异。在另一个方面，对于取代的类似物，观察到最 大的在经修饰的和未修饰的对之间的差异。表3鼠类eIF4E(28_217)与硫代磷酸帽类似物的结合的平衡缔合常数(KAS)和结合自 由能(AG° )，其通过荧光猝灭来测定。
m对于非对映异构体混合物所测定的实施例24对于通过人和秀丽隐杆线虫DcpS的酶促水解的易感性使新系列的S-类似物经历由来自人和秀丽隐杆线虫来源的DcpS所催化的体外酶 促水解。在所有实验中，将相应的未修饰的帽类似物用作阳性对照，即对于非ARCA S-类似 物来说为m7GpppG，和对于S-ARCA来说为m/’2' _°GpppG。优化DcpS酶的量以提供在40-90 分钟内对照底物的完全降解。通过RP HPLC来分析以各个不同时间间隔从反应混合物中收 集的样品(如在“材料和方法”中所描述的)。在表4中，在导致于40-90分钟内未修饰的亲本化合物(即，对于非ARCA S-类似 物来说为m7GpppG，和对于ARCA来说为m/’2' _°GpppG)完全降解的条件下，使4 y M浓度的帽 类似物经历通过DcpS的酶促消化。如在“材料和方法”中所描述的，采用在260nm处的UV 检测通过RP HPLC来分析以各个不同时间间隔从反应混合物中收集的样品。在表4中，被 指定为“具有抗性”的类似物在所应用的条件下保持完全未被消化，而被指定为“被水解”的 类似物以与各自未修饰的亲本化合物相当的效率被DcpS水解。发现在位置处经修饰 的S-类似物对于水解具有抗性，这不依赖于P-中心绝对构型(表4)。即使将反应时间延 长至24小时，使用各种不同的酶量，和修改反应缓冲液的组成，结果也不变。所有其他S-类 似物以与未修饰的亲本类似物相当的效率被hDcpS水解。对于通过来自人和秀丽隐杆线虫 来源的DcpS来进行的S-类似物水解，没有观察到显著的差异。对在a-位置处经修饰的类似物的DcpS降解产物的分析使得我们能够确定它 们在不对称P-中心周围的绝对构型。我们发现，通过DcpS来进行的m7GpppsG(Dl)或 m7GpppsG (D2)的水解导致获得m7GMP和鸟苷5 ‘ -0- (1-硫代二磷酸)(OTP a S)的D1或D2 异构体，而 m/’2' _°GpppsG(Dl)或 m/’2' _°GpppsG(D2)的水解导致获得 m/’2' _°GMP 和 GDP a S 的D1或D2异构体(数据未显示)。表4S-类似物在体外对于通过DcpS (来自人和秀丽隐杆线虫)的酶促水解的易感性 实施例25作为帽依赖性翻译的抑制剂的帽类似物在用天然兔珠蛋白mRNA进行规划的兔网织红细胞裂解物体系中检验了所述新的 S-类似物抑制帽依赖性翻译的能力。在所述12种S-类似物中，选择出在位置处经修 饰的两种，即m7GpsppG(Dl)和m7GpsppG(D2)，这是因为发现它们对于DcpS具有抗性和因为 它们在体内可能更稳定。将关于翻译抑制的数据与理论曲线相拟合，所述理论曲线描述了 作为mRNA结合的竞争性抑制剂的函数的帽依赖性翻译(Cai等人，1999)。这使得我们能够 测定&，即在帽依赖性翻译被抑制50 %时的帽类似物浓度(表5)。发现这两种S-类似物都 是比m7GpppG更好的帽依赖性翻译的抑制剂，这构成了关于硫代磷酸部分通常使帽_eIF4E 相互作用稳定化的额外的证据。此外，m7GpsppG(Dl)比其D2对应物显著地更具有抑制性
= 4. 1 士0.之！^对!^ = 12. 1 士3. 2iiM)，这与其更高的对于eIF4E的结合亲和力(KAS = 30. 8 士 0. 5 对 Kas = 10. 0 士 0. 2)相一致。表 5在兔网织红细胞切割液翻译体系中通过、-修饰的S-类似物的帽依赖翻译的抑 制的抑制常数og 实施例26作为帽依赖性翻译的体内抑制剂的用S-ARCA帽化的mRNA片段S-ARCA，尤其是其中硫代磷酸修饰出现在Y位置处的三磷酸，例如在实施例17下 的化合物6a和6b的未来应用可能是作为帽依赖性翻译的抑制剂。已充分证明，在癌细胞 中帽依赖性翻译被上调，并且eIF4E的下调逆转恶性表型。在可能出现完全降解成核苷酸之前，当它们达到小于25nt的长度时，由于加帽的mRNA的3’ 一 5’降解而产生的片段必须 进行脱帽。预期用在Y位置处包含硫代磷酸修饰的三磷酸S-ARCA帽化的此类片段对于 DcpS具有抗性，类似于对于帽二核苷酸自身所显示的(表4，见上)。因此，预期他们在细 胞中积累并且与正常mRNA竞争募集至翻译机器。我们将用在Y位置处进行取代的三磷酸 S-ARCA(在实施例17下的化合物6a和6b)帽化的mRNA或mRNA片段引入培养的细胞中。 然后，我们使用报道构建体来测量帽依赖性翻译对帽非依赖性翻译。我们预期前者优先被 抑制。应当注意的是，ARCA修饰是在掺入mRNA中后这些S-ARCA的正确方向所必需的，这 是因为否则硫代磷酸部分可能不处于使得mRNA片段对于DcpS具有抗性的正确位置。类似地，我们分析作为帽依赖性翻译的潜在抑制剂的四磷酸S-ARCA。我们预期，四 磷酸S-ARCA，尤其是包含8 -硫代磷酸基团的那些，将不会在生理条件下被DcpS水解，并且 将会抑制帽依赖性翻译。实施例27权利要求书详细说明了三磷酸和四磷酸帽类似物二核苷酸的硫代磷酸修饰的所 有组合，类似于下面所列出的那些。m7Guo的核糖部分的修饰是2’ -脱氧、3’ -脱氧、阿拉 伯糖、2’ -0-乙基和3’ -0-乙基。G的7-取代基的修饰是甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经 取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基和其他经取代或未取代的C1至C10脂肪族或芳 香族基团。鸟嘌呤部分的修饰是使用腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶或m7G。可以合成这些各种修饰 物，如本申请中所公开的和另外从本领域(例如美国专利申请公开2003/0194759)已知的 方法改编的。
m27RGpspppsG m27'RGppsPspG m27RGppsppsG m27'RGpppspsG m27RGpspspspG m27,RGpspsppsG m27RGpsppspsG m27RGppspspsG
m27，RGpsPsPsPsG 本说明书中所引用的所有参考文献的全部公开内容通过提及而合并入本文。还 通过提及而合并入了关于本发明者自己工作的下列出版物的全部公开内容，其不是本 串请的现有技术J. Kowalska 等人，"Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containingphosphorothioate substitutions that bind tightly to eIF4E and areresistant to the decapping pyrophosphatase DcpS, ” RNA, % 14 卷，第 1119-1131 页(2008) ；E. Grudzien-Nogalska 等 人，”Phosphorothioatecap analogs stabilize mRNA and increase translational efficiency inmammalian cells，，，RNA，第 13 卷， 第 1745-1755 页(2007)；禾口 E. Darzynkiewicz 等人，“Methylene and phosphorothioate capdinucleotides :useful tools to study decapping and translantion",RNA
Meeting, Seattle,Washington, June 20-25,2006的摘要和海报。但是，在另外出现相矛盾 的冲突的情形下，应当以本说明书为准。
权利要求
组合物，其包含其中每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；R1选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；R2选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；n是3或4；和如果R1是OH，那么R2不是OH。FPA00001029574100011.tif
2.权利要求1中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
3.权利要求1中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一 非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在 手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相 同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
4.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求1的组合物。
5.用于在体外合成权利要求4中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、 UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶 将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会 掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
6.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质 合成体系中翻译权利要求2中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述 条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质 或肽。
7.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求4中 所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述 RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
8.权利要求1中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团， 或者其中η是4并且所述组合物包含Y -硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件 下不被Dcp2水解。
9.权利要求1中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团， 或者其中η是4并且所述组合物包含δ -硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
10.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端 掺入有权利要求8中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放 阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编 码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
11.组合物，其包含 其中每个Y选自O和S;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ；Rl 选自 H、OH、OCH3 禾P OCH2CH3 ；R2 选自 H、OH、OCH3 禾口 OCH2CH3 ；n是3或4 ；和如果Rl是0H，那么R2不是OH ；和B选自
12.权利要求11中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
13.权利要求11中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第 一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体 在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
14.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求11的组合物。
15.用于在体外合成权利要求14中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些 将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
16.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白 质合成体系中翻译权利要求14中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋 白质或肽。
17.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求14 中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所 述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
18.权利要求11中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被Dcp2水解。
19.权利要求11中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
20.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端 掺入有权利要求17中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放 阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编 码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
21.组合物，其包含 其中每个Y选自O和S;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ；Rl 选自 H、OH、OCH3 禾P OCH2CH3 ；R2 选自 H、OH、OCH3 禾口 OCH2CH3 ；η是3或4 ；和如果Rl是0Η,那么R2不是OH ；和B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及 其他经取代和未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基团。
22.权利要求21中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
23.权利要求21中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第 一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体 在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
24.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求21的组合物。
25.用于在体外合成权利要求24中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些 将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
26.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白 质合成体系中翻译权利要求24中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框， 所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋 白质或肽。
27.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求24 中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所 述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
28.权利要求21中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被Dcp2水解。
29.权利要求21中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
30.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端 掺入有权利要求28中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放 阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编 码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
31.组合物，其包含 其中每个Y选自O和S;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ；η是3或4 ；B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及 经取代或未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基团。
32.权利要求31中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
33.权利要求31中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体 在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
34.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求31的组合物。
35.用于在体外合成权利要求34中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些 将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
36.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白 质合成体系中翻译权利要求34中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框， 所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋 白质或肽。
37.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求34 中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所 述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
38.权利要求31中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被Dcp2水解。
39.权利要求31中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
40.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端 掺入有权利要求38中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放 阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编 码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
41.组合物，其包含 其中每个Y选自O和S ；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ；和η是3或4 ；和X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及 经取代或未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基团；各个X可以是相同的或不同的。
42.权利要求41中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
43.权利要求41中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第 一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体 在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
44.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求41的组合物。
45.用于在体外合成权利要求44中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些 将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
46.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白 质合成体系中翻译权利要求44中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框， 所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋 白质或肽。
47.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求44 中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所 述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
48.权利要求41中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被Dcp2水解。
49.权利要求41中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
50.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端 掺入有权利要求48中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放 阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编 码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
51.组合物，其包含 其中每个Y选自O和S ；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ；和η是3或4。
52.权利要求51中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
53.权利要求51中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第 一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体 在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
54.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求51的组合物。
55.用于在体外合成权利要求54中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ΑΤΡ、 CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些 将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
56.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白 质合成体系中翻译权利要求54中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框， 所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋 白质或肽。
57.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求54 中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所 述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
58.权利要求51中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被Dcp2水解。
59.权利要求51中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基 团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条 件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
60.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端 掺入有权利要求58中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放 阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编 码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
61.组合物，其包含一种或多种选自下列的化合物m/’2'-0GpPsPG ；m27'3' _°GppspG ； m27，2 ‘ "°GpppspG ；m27，3 "0GpppspG ；m27，2 ‘ °GppsppG ；m27，3 ‘ °GppsppG ；m27，2 ‘ "°GpspspG ； m27，3 ‘ "°GpspspG ；m27，2 ‘ °GppspsG ；m27，3 ‘ °GppspsG ；bn7m2 ‘ °GppspG ；bn7m3 ‘ °GppspG ； bn7m2 ‘ "°GpppspG ；bn7m3/ "°GpppspG ；bn7m2/ °GppsppG ；bn7m3/ °GppsppG ；bn7m2/ "°GpspspG ； bn7m3' -OGpspspG ；bn7m2/ °GppspsG ；禾口 bn7m3/ —0GppspsGo
62.权利要求61中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由所述化合物之一的单种 立体异构体组成。
63.权利要求61中所描述的组合物，其中所述组合物包含所述化合物之一的至少两种 非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第 二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构 体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
64.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求61的组合物。
65.用于在体外合成权利要求64中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些 将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
66.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白 质合成体系中翻译权利要求64中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框， 所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋 白质或肽。
67.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求64 中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所 述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
全文摘要
公开了新的RNA帽类似物，其包含一个或多个硫代磷酸基团。所述类似物还在7-甲基鸟苷的2’-O位置处包含修饰，其防止它们在mRNA的体外合成过程中以相反的方向掺入，并因此是“抗-反向帽类似物”(anti-reverse cap analog，ARCA)。所述ARCA修饰确保，S原子在翻译和脱帽机器中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。所述新的S-ARCA类似物对于体内脱帽酶具有抗性。有些S-ARCA具有相比于不包含硫代磷酸基团的相应类似物而言更高的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S-ARCA的mRNA引入培养的细胞中时，有些mRNA以相比于用常规类似物m7GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度有效地进行翻译。
文档编号C07H19/207GK101855231SQ200880102959
公开日2010年10月6日 申请日期2008年6月19日 优先权日2007年6月19日
发明者E·M·戈鲁德琪恩-诺加尔斯卡, E·达琴奇维克孜, J·克瓦尔斯卡, J·杰米利迪, R·E·罗德斯 申请人:路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会;华沙大学