具有增强的产量相关性状的植物及其生产方法

专利名称：具有增强的产量相关性状的植物及其生产方法
具有增强的产量相关性状的植物及其生产方法 本发明一般涉及分子生物学领域，并涉及通过在植物中提高编码铵转运蛋白 (MPonium transporter, AMT)多肽之核酸序列的表达而提高多种植物产量相关性状的方 法。本发明还涉及具有表达编码AMT多肽之核酸序列提高的植物，所述植物与对照植物相 比具有提高的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明方法的构建体。持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。 常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术来鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此 类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经 常含有异源性遗传组分，这可能不总是导致所希望性状从亲代植物中传递。分子生物学进 展已经允许人类改良动物及植物的生殖质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质 (一般处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备 多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为作物产生的可测量的经 济价值。这可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的 数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐 性和早期活力(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。因此，优化前述因素可以对 增加作物产量有贡献。种子产量是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言 至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半 以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。 它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的枝条和根的 来源)和胚乳(萌发和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因， 并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，同化糖类、油类和蛋白 质的代谢前体，将其合成为贮存性高分子，以充盈谷粒。植物生物量为饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草的产量。在谷物作物中使用产量 的许多替代参数。其中首要的是估算植物大小。根据物种以及发育阶段的不同，可以通过 许多方法测量植物大小，但是包括植物总干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物 高度、莲座植物直径、叶长、根长、根生物量、分蘖数和叶数。许多物种在给定的发育阶段维 持植物不同部分大小间的保守比。利用这些异速生长关系而对这些有关大小的测量结果进 行由此及彼的外推(如 Tittonell 等 2005 Agric Ecosys & Environ 105:213)。早期发 育阶段的植物大小通常将与晚期发育阶段的植物大小有关。具有更大叶面积的较大植物 通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica50 :39)。除了植物所具有的最初达到较大大小的微环境或遗传优 势的潜在延续，此为其附加效应。植物大小和生长速率存在着强遗传组分(如terSteege 等2005 Plant Physiology 139 1078)，且迄今为止，种种多样化基因型植物在一种环境 条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小有关(Hittalmani等2003 Theoretical Applied Genetics 107 :679)。以这种方式，使用标准环境作为田地中作物在不同时间和地点所遭遇的多样化动态环境的替代参数。对于众多作物的另一个重要性状是早期活力。改进早期活力是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固着是重要的。在将稻直 接播种至涝田的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与萌发势相 关。在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要 的。人工改造植物内早期活力的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期活力已 经限制了基于玉米带生殖质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)杂种在欧洲 大西洋地区的引种。收获指数为种子产量与地上干重的比值，其在许多环境条件下相对稳定，因此在 植物大小和谷物产量之间通常能够获得比较稳固的相关性(如Rebetzke等2002 Crop Science 42:739)。这些方法固有地联系在一起，因为大多数谷物生物量取决于植物叶和 莲当前或C存的光合作用生产力(Gardener等1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press，pp68_73)。因此，对植物大小的选择，甚至是在发育早期阶段的 选择，已经用作为未来潜在产量的指标(如Tittonell等2005 Agric Ecosys &Environ 105 :213)。当测试遗传差异对胁迫耐性的影响时，温室或植物培养室与田地相比具有固有 的优势即能够使土壤性能、温度、水和养分的可用性以及光强度标准化。不过，因缺乏风力 或昆虫导致不良授粉，或由于空间不足以让成熟根或冠层生长等等，对产量造成的这些人 工局限性会限制这些控制环境在测试产量差异中的应用。因此，在培养室或温室标准条件 下测量早期发育阶段的植物大小，是提供潜在遗传产量优势指标的标准方法。又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物 损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50% (Wang等、 Planta(2003) 218:1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性、养分(大量 元素和/或微量元素)过剩或缺乏、辐射和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性 的能力将在世界范围对农民具有极大的经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽 培否则是不可能的陆地上栽培作物。作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应 用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应 用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某 些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论 形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。增加植物中产量相关性状(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节 植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号途径。现已发现可以通过提高植物中的编码铵转运蛋白(AMT)多肽的核酸序列在植物 中表达而改进植物中的多种产量相关性状。所述提高的产量相关性状包括以下一种或多 种提高的早期活力、提高的地上部分生物量、提高的根生物量、提高的每株植物种子总产 量、提高的种子饱满率、提高的饱满种子数和提高的收获指数。背景铵和硝酸盐是植物生长和发育的主要氮源。植物需要转运蛋白来获得铵和硝酸盐。铵和硝酸盐的转运蛋白不仅存在于植物中，而且存在于几乎所有生物中。铵转运蛋白 (AMT)通常在基因组中作为基因家族存在，例如至少在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中 有6种，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中有8种(Gonzales-BalIester等(2004) Plant Molec Biol 56 :863_878)，杨中有 14种(Couturier等(2007)NewPhytologist 174 137-150)，三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)这种硅藻中有 6 种(Allen (2005) J Phycology 41)。基于系统进化分析，鉴定了铵转运蛋白的3个亚家族(Loqu6& vonffiren(2004) J Exp Bot 55(401) 1293-1305)1. AMT亚家族，包括植物AMTl型转运蛋白和蓝细菌铵转运蛋白；2. MEP亚家族，包括植物AMT2型转运蛋白、酵母MEP转运蛋白、大肠杆菌AmtB和其 他原核同源物；3. Rh亚家族，仅包括人和动物RH血型抗原。所有AMT多肽都是高度疏水的膜蛋白，具有至少10个(通常11个)推定的跨 膜 螺旋。许多报道显示AMT多肽能在宽浓度范围内摄入铵，但亲和力在不同生物之间有差异。 在某些生物(如植物)中，鉴定了高亲和力和低亲和力铵转运蛋白(Gazzarini等(1999) Plant Cell 11:937-47)。除了亲和力特性以外，还鉴定了铵摄取的其他调节机制，例如在 转录和转录水平上(Yuan 等(2007)Plant Phys 143:732-744)。使用组成型表达的玉米泛素启动子，在两个稻栽培种(Taipei 309和Jarrah) 中过表达了来自稻的编码AMTl的核酸序列。与野生型相比，转基因株系的嫩枝和根的 生物量在幼苗和早期营养阶段出现下降，特别是在高铵营养下培养时(Hoque等(2006) Functional Plant Biol 33 153-163)。作者推断，转基因植物在早期生长阶段的生物量下 降可能是因为由于铵同化不能与更高的铵摄取相匹配而导致铵在根中积累。美国专利6，620，610描述了编码来自拟南芥的AMTl多肽的核酸序列、包含所述编 码AMTl之核酸序列的用于在酵母和细菌中表达的载体。美国专利6，833，492描述了编码来自大豆、玉米、小麦和稻的AMTl多肽的核酸序 列。描述了编码AMTl多肽或者与分离的大豆AMTl多肽具有90%氨基酸序列同一性之AMT 多肽的核酸序列。描述了包含编码这些多肽序列的重组核酸序列的植物和种子，以及产生 这些植物的方法。意想不到的是，现在发现提高编码AMT多肽之核酸序列的表达给予植物与对照植 物相比提高的产量相关性状。根据一个实施方案，提供了在植物中与对照植物相比提高产量相关性状的方法， 包括在植物中提高编码本文所述AMT多肽之核酸序列的表达。提高的产量相关性状包括以 下一种或多种提高的早期活力、提高的地上部分生物量、提高的根生物量、提高的每株植 物种子总产量、提高的种子饱满率、提高的饱满种子数、提高的每花序花数和提高的收获指 数。定义多肽/蛋白质术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指处于任意长度聚合形式中的通 过肽键连接在一起的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”在本文中可互换使用并且 指处于任意长度聚合无分支形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组合。对照植物选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或 无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评价植物相同的植物物种或甚至是相同的品 种。对照植物也可以是待评价植物的失效合子。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株 植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。同源物蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的 所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与衍生其的非修饰蛋白质具有相似生 物学活性和功能活性。缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个 或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部 的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白 或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬 菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、 二氢叶酸还原酶、Tag · 100表位、c-myc表位、FLAG⑧"表位、IacZ, CMP (钙调蛋白结合 肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。替换指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋结 构或β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残 基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨 基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域众所周知 的(见例如 Creighton (1984) Proteins W. H. Freeman and Company 编辑禾口下表 1)。表1 保守性氨基酸替换的实例 氨基酸替换、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合 成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入 或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生替换突 变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB， Cleveland, OH)、QuickChange 位点定向诱变法(Stratagene, San Diego, CA)、PCR-介导的 位点定向诱变或其它位点定向诱变法。衍生物“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白 质)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的替换或非天然存 在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天 然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷 酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的 氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个 非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报 道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。直向同源物/旁系同源物直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是 相同物种内起源于祖先基因复制的基因，直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的 基因，并且也来源于共同的祖先基因。结构域术语“结构域”指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组 氨基酸。尽管在其它位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保 守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过 在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任 意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。基序/共有序列/标签术语“基序”或“共有序列，，或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。 基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结 构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
杂交如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的 过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸分子均处于溶液中。杂交过程 也可以在互补性核酸分子之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Si5Pharose)珠或任何其他树脂 的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸分子之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜 或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸序列 阵列或微阵列或称作核酸序列芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将 核酸分子热 变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸分子的发夹或其它 二级结构。术语“严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、 离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及PH时 低于特定序列热解链温度(Tm)约30°C。中等严格性条件是此时温度低于Tm约201，高严 格性条件是此时温度低于Tm约10°C。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有 高序列相似性的杂交序列。然而，核酸分子可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性 而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件来鉴定此类核酸 序列分子。Tm是在确定的离子强度及pH下50%的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。 Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂 交。从低于1约161直至32°C获得最大杂交速率。一价阳离子在溶液中的存在降低了两 条核酸序列链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于至多0. 4M的钠浓度是 明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解 链温度，每百分数甲酰胺降低0. 6-0. 7°C，并且添加50%甲酰胺允许在30-45°C进行杂交， 虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对 于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1°C。取决于杂交分子的类型，1可以使用下列等 式计算1)DNA-DNA 杂交分子(Meinkoth 和 Wahl，Anal. Biochem.，138 :267_284，1984)Tm = 81. 50C +16. 6 X Iog10 [Na+] a+0. 41X % [G/Cb] -500 X [LT1-O. 61 X % 甲酰胺2) DNA-RNA 或 RNA-RNA 杂交分子Tm = 79. 8+18. 5 (Iog10 [Na+]3) +0. 58(% G/Cb)+ll. 8(% G/Cb) 2_820/Lc3)寡DNA或寡RNAd杂交分子对于< 20个核苷酸Tm = 2 (In)对于20_35 个核苷酸Tm = 22+1. 46 (In)a或对于其它一价阳离子，但是仅在0. 01-0. 4M范围内是精确的。b仅对于％ GC在30% -75%范围内是精确的。cL =双链体的长度(以碱基对计)。dOligo,寡核苷酸；In，引物的有效长度=2X (G/C数)+ (A/T数)。可以众多已知技术的任何一种来控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭 薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性 探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行(i)逐渐降低退火温度(例如从68°C至42°C)或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50%至0%)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异 性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的 离子强度及温度盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂 交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常， 用于核酸序列杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更 严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件 的多种参数。例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在 65°C于IXSSC中或在42°C于IXSSC和50%甲酰胺中杂交，随后在65°C于0. 3 X SSC中洗 涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的实例包括在55°C 于4X SSC中或在40°C于6 X SSC和50%甲酰胺中杂交，随后在50°C于2 X SSC中洗涤。杂 交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸分子杂交时，可以通过比对序列 并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1\33(是0.1511 NaCl和15mM柠檬酸 钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5XDenhardt氏试剂、0. 5-1.0% SDSUOOy g/ml 变性的片段化鲑精DNA、0. 5%焦磷酸钠。为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning :a laboratory manual,第三版 Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, CSH, New York 或参考 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 禾口每年更新 版本)。剪接变体如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含 子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本 上保留了蛋白质的生物活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实 现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的 方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex(2005)，BMC Bioinformatics. ；6 25)。等位变体等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体 包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于lOObp。 SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。基因改组/定向进化基因改组或定向进化的组成为反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编 码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸序列或其部分的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674) 1151-4 ；美国专利 5，811，238 和 6，395，547)。调节元件/调控序列/启动子术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”均在本文中可互换使用，并且在广义上 意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其它蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸序列调控序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需 的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部 刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉 默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35盒序列 和/或-10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸序列分子在细 胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。“植物启动 子”优选源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所 转化的植物。这也适用于其它“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中 的核苷酸序列上游的启动子可以由一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失而受到修饰， 但不干扰启动子、开放阅读框(ORF)或3'调节区如终止子或远离ORF的其它3'调节区的 功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更具活性的启动子、甚 至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸序列 分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要 的空间表达模式表达基因。为了鉴定功能等价启动子，可以分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式， 例如通过将该启动子与报告基因有效连接并测定该报告基因在多种植物组织中的表达水 平和模式。合适的熟知报告基因包括如葡糖醛酸糖苷酶或半乳糖苷酶。通过测量
葡糖醛酸糖苷酶或半乳糖苷酶的酶活性来测定启动子活性。接着可以将启动子强 度和/或表达模式与参考启动子(例如用于本发明方法中的)进行比较。或者，可以通过定 量mRNA水平或者将本发明方法中所用核酸序列的mRNA水平与持家基因(如18SrRNA)mRNA 水平进行比较来测定启动子强度，其中使用本领域熟知的技术，例如通过放射自显影的密 度分析进行的Northern印迹或者定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996 Genome Methods 6 =986-994) 0通常，“弱启动子”指驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”指每个细 胞中约1/10000的转录物至约1/100000的转录物至约1/5000000的转录物的水平。相反， “强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者每个细胞中约1/10的转录物至约1/100的转录 物至约1/1000的转录物的水平。通常，“中等强度启动子”指这样的启动子，其在所有情况 下均驱动编码序列以低于35SCaMV启动子调控的水平进行表达。有效连接如本文中所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以 至于启动子序列能够启动目的基因转录。组成型启动子“组成型启动子”指在至少一种细胞、组织或器官中在其大多数(但不一定是全 部)生长和发育阶段并在大多数环境条件下有转录活性的启动子。下表2a给出了组成型 启动子的实例。表2a 植物组成型启动子的实例 遍在启动子遍在启动子在生物的基本上全部组织或细胞中有活性。发育调节性启动子发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。诱导型启动子诱导型启动子在应答化学品(综述见Gatz 1997, Annu. Rev. PlantPhysiol. PlantMol.Biol. ,48 :89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是 “胁迫诱导型”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导型”，即当植物 暴露于多种病原体时受到激活。器官特异性/组织特异性启动子 器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组 织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的 启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何 泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异性”。根特异性启动子的实例列于下表2b 表2b 根特异性启动子的实例 种子特异性启动子主要在种子组织中有转录活性，但不一定仅在种子组织中 有(泄漏表达的情况)。种子特异性启动子可在种子发育和/或萌发过程中有活性。种 子特异性启动子的实例示于下文表2c。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和 Takaiwa(Plant Biotechnol. J. 2，113-125，2004)中给出，其公开内容通过整体引入本文作 为参考。
表2c 种子特异性启动子的实例 如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的 启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何 泄露表达。可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例在下表2d中显示。表2d 绿色组织特异性启动的实例 组织特异性启动子的另一个实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生性组织 中具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内 允许任何泄露表达。可用于实施本发明方法的分生组织特异性启动子的实例示于下文表 2e。表2e 分生组织特异性启动子的实例 终止子术语“终止子”包括这样的调控序列，其是在转录单位末端的DNA序列，发出对原 始转录物进行3’加工并多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以来自天然基因、来自 多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶 基因，或者来自其它植物基因或较不优选地来自任何其它真核基因。调节
术语”调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物 相比因所述基因的表达而改变，优选地，表达水平增加。原先未受调节的表达可以是结构 RNA(rRNA.tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。术语“调节活性”应当意指本发明 核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的产量和/或增加的生长。增加的表达/过表达如本文中所用的术语”增加的表达”或“过表达”意指对于原有野生型表达水平是 额外的任何形式表达。在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如， 由适宜启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷 酸的适宜位置(一般是上游)内导入作为启动子或增强子元件的分离核酸序列，以便上调 编码目的多肽的核酸序列的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或置换而在 体内改变(见Kmiec，US 5，565，350 ；Zarling等，W09322443)，或可以将分离的启动子以相 对于本发明基因的正确方向及距离导入植物细胞，以便控制基因表达。若需要多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3’末端包括多聚腺苷化区。多聚 腺苷化区可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的3’末端序列 可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一植物基因或更不优选来自 任何其它真核基因。内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上， 以增加在胞质溶胶内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动 物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000 倍(Buchman 和 Berg(1988)Mol. Cell biol. 8 :4395_4405 ;Callis 等(1987)Gens Dev 1: 1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单位5'末端附近时最强烈。 使用玉米内含子Adhl-S内含子1、2和6、Bronze-I内含子是本领域已知的。对于一般信 息，见《玉米手册》，第 116 章，编者 Freeling 和 ffalbot, Springer, N. Y. (1994)。内源基因本文中提及的“内源”基因不仅仅指如在植物中以其天然形式(即没有任何人类 干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后(再)导入植物(转基因)的相同基 因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表 达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。降低的表达本文中提及的“降低的表达”或者“降低或基本去除”的表达意指内源基因表达和 /或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，降低或基本去除以 递增优选顺序是至少 10%、20%、30%、40%或 50%、60%、70%、80%、85%、90%，或 95%、 96%、97%、98%、99%或更多的降低。为了降低或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本 上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’ UTR，部分或 全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白质的核酸序列(靶基因)或来自 能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸序列。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核 苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50%、60%、70%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列 不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去 除内源基因表达的一种方法是使用通过RNA介导的沉默，其中使用核酸序列或其部分(在 此情况下是从目的基因或从任何核酸序列中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中 所述的任何核酸能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重复 序列(优选能够形成发夹结构)。RNA沉默方法的另一个实例包括以有义方向导入核酸 序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷 酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植 物内。RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。基因沉默也可以通过插入诱变 (例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angel 1和Baulcombe( (1999) Plant J. 20(3) 357-62)、(AmpliconVIGS WO 98/36083)或 Baulcombe (WO 99/15682)及其它人描述的策略 而实现。其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所 述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。人工和/或天然的微RNA(miRNA) 可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单 链小RNA。通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNA)可以遗传改造以特异性地负调节 单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。 用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA(Schwab等，(2005) Dev Cell 8(4) :517_27)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的 (Schwab 等，(2006)PlantCell 18(5) :1121_33)。为最佳性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子 叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植 物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列导入同一个物种内。例如，将来自稻的核 酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待导入的核酸序列起源于与该核酸序列将要导 入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸序列之间存在相当大的同源 性就足够了。上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本 领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而 实现在整株植物或在其部分中降低内源基因的表达。选择标记(基因)/报告基因“选择标记”、“选择标记基因”或“报告基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其 中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸序列构建体所转 染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸序列分子的成功转移。 合适的标记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标 记。选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的 nptll或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉 素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin) (G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta #C性的bar ；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对 例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使 用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗 性)。视觉标记基因的表达导致形成颜色(例如0 -葡糖醛酸糖苷酶、⑶S或0 -半乳糖 苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白 GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生 物和选择方法，优选不同的标记。已知当核酸序列稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并 且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并 选择这些整合体，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起引入 宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中 使用。此外，编码选择标记的核酸序列分子可以引入宿主细胞中，其与包含编码本发明多肽 或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸序 列稳定转染的细胞可以例如通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而 其它细胞死亡)。因为一旦已经成功引入了核酸序列，则转基因宿主细胞中就不再需要或不希望有 标记基因，尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，因此用于引入核酸序列的本发明方法 有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法 使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸序列而另一种载体携带标记基 因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40%或更多的转化体)这两种 载体。在用农杆菌转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序 列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一 种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸序列一起进行转化(称作Ac/Ds技 术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体用导致转座酶表达的核酸序列构建体瞬 时或稳定地转化。在一些情况下(大约10%)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细 胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因 必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一 个有利的方法依赖于已知的重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最 知名系统称作Cre/lox系统。Crel是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因 整合于loxP序列之间，一旦已经成功发生转化时，则通过重组酶表达而去除标记基因。其 它重组系统是 HIN/HIX、FLP/FRT 和 REP/STB 系统(Tribble 等，J. Biol. Chem.，275，2000 22255-22267 ；Velmurugan 等，J. Cell Biol.，149，2000 :553_566)。有可能将本发明核酸序 列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌 或细菌。转基因的/转基因/重组为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就例如核酸序列而言意指包含此 核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物， 所有这些构建均通过重组方法产生，其中(a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传调控序列，例如启动子，或(c)a)和 b)不处于其天然遗传环境中或已经通过遗传操作方法修饰，修饰有可能采用例如替 换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源 植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在。在基因组文库的情 况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核 酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少lOOObp，最优选至少 5000bp的序列长度。天然存在的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中 所用多肽的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义-在这种表达盒通过非天然的 合成(“人工”)方法(如诱变处理)而受到修饰时，变成转基因表达盒。合适方法例如在 US 5，565，350 或 WO 00/15815 中描述。为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本发明方法中所用的核酸序列不 位于所述植物基因组中该核酸的天然基因座内，所述核酸序列有可能同源或异源地表达。 然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸序列或在本发明方法中所用核酸序列处于植 物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或 所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸序列在基因 组中的非天然基因座内表达，即发生核酸序列的同源表达或优选异源表达。优选的转基因 植物为本文中所提到的。转化如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括将外源性多核苷酸转移至宿主细胞 内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生) 的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织 将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括 叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已有的分生组织(例如顶端分生组织、 腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷 酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。或者，多核苷酸 可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方 式再生出转化植物。
外来基因转化至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技 术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用 于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物的所述方法可以用于瞬时转化或用于稳定 转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射 至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微注射。转化方法可以选自用于 原生质体的钙 / 聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，72-74 ;NegrutiuI 等 (1987)Plant Mol Biol 8:363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R. D.等(1985)Bio/ Technol 3，1099-1102)；对植物材料的显微注射(Crossway A 等，(1986)Mol. Gen Genet 202 179-185)；包被有 DNA 或 RNA 的粒子轰击法(Klein TM 等，(1987) Nature 327:70)、 (非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的 转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使 转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续 培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J. (1998) 16，735-743)。用于农 杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方 法欧洲专利申请 EP 1198985 Al，Aldemita 和 Hodges (Planta 199:612-617,1996) ；Chan 等(Plant Mol Biol 22(3) :491_506，1993)，Hiei 等(Plant J 6(2) :271_282，1994)，其 公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如 Ishida 等(Nat. Biotechnol 14(6) :745_50，1996)或 Frame 等(Plant Physiol 129(1) 13-22,2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例 方式进一步由 B. Jenes 等，Techniques for Gene Transfer,出自 Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering and Utilization，编者 S. D. Kung 和 R. ffu, AcademicPress (1993) 128—143 及在 Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Molec. Biol. 42(1991)205-225)中描 述。待表达的核酸序列或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如 pBinl9 (Bevan 等，Nucl. Acids Res. 12 (1984)8711)。由这种 载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟 南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农 杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育而进行转化。 植物通过根癌农杆菌的转化例如由Hijfgen和Willmitzer在Nucl. Acid Res. (1988) 16， 9877 中描述或尤其从 F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ；在 Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering and Utilization,编者 S. D. Kung 禾口 R. Wu, Academic Press, 1993，第 15—38 页中获知。 除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生 组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的 植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中 获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD (1987) Mol GenGenet 208 274-289 ；Feldmann K(1992)。出自 C Koncz，N_H Chua 禾口 J Shell 编著，Methods in Arabidopsis Research, Word Scientific, Singapore,第 274-289 页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌孵 育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J. 5 551-558 ； Katavic (1994)Mol Gen Genet, 245 =363-370) 然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入 法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理 [Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，316 :1194_1199]，而在“花浸染法，， 的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育[Clough，SJ和 Bent, AF (1998) The Plant J. 16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子， 并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体 的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经 花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22 (2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择标记 基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至质体基因组内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自 Bock (2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenicplastids in basic research and plant biotechnology). J Mol Biol. 2001 年 9 月 21 日；312(3) :425_38 或 Maliga, P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastid transformationtechnology). Trends Biotechnol. 21, 20-28。进一步生物技术进 展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共 整合的标记基因产生(Klaus 等，2004，Nature Biotechnology 22 (2)，225-229)。T-DNA激活标签化T-DNA激活标签化(Hayashi等Science (1992) 1350-1353)涉及在目的基因的基因 组区域内或基因编码区上游或下游IOkb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可 以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然 启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因 处在新引入的启动子控制下。 启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并 导致在所插入T-DNA附近的基因的修饰表达。因靠近所引入启动子的基因的修饰表达，产 生的转基因植物表现显性表型。TILLING术语TILLING是“基因组内定向诱导的局部损伤”的缩写，指用于产生和/或鉴 定核酸序列的诱变技术，其中所述的核酸序列编码具有修饰表达和/或活性的蛋白质。 TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位 置方面或在时间方面修饰的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由 处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法 组合。一般在TILLING中遵循的步骤是(a)EMS诱变(Redei GP和KonczC(1992)在Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, SchellJ编辑，Singapore, World Scientific Publishing Co，第 16-82 页；Feldmann 等，(1994)在 Meyerowitz EM, Somerville CR编辑， Arabidopsis. ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY, % 137-172 Μ ；Lightner J 禾口 Caspar T (1998) ^ J Martinez-Zapater, J Salinas ^m^, Methods on Molecular Biology 第 82 卷，Humana Press，Totowa，NJ，第 91-104 页)；(b)个体的 DNA 制 备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和退火以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中在 汇集物中存在的异源双链体被检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对 突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)Nat Biotechnol 18 :455_457 ；综述见 Stemple (2004) Nat Rev Genet5 (2) 145-50)。同源重组同源重组允许选择的核酸序列在基因组中于确定的所选择位置内引入。同源重 组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技 术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10) 3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada 等(2002)Nat Biotech 20(10) 1030-4 ； Iida 和 Terada(2004) Curr Opin Biotech 15(2) 132-8)进行了描述。产量术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接对产量有贡献，或实际产量 是对于某作物和一年的每英亩产量，这通过总产量(包括收获的和评价的产量)除以种植 的英亩数而确定。术语植物的“产量”可以与该植物的营养体生物量、繁殖器官和/或繁殖 体(例如种子)有关。早期活力“早期活力”指活跃、健康、良好平衡的生长(特别是在植物生长早期期间)，并可 以因植物适合度增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用 和苗与根之间的分配)。具有早期活力的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这 往往导致高度均勻的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发 育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期活力可以通过多种因子如千粒重、萌发 百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其它因素而确定。
增加/改善/增强术语“增加”，“改善”或“增强”是可互换的并且应当在本申请含义上指与如本文 中定义的对照植物相比至少5%、6%、7%、8%、9%或10%、优选至少15 %或20 %、更优选 地25%、30%、35%或40%更多的产量和/或生长。种子产量增加的种子产量本身可以表现为下列一种或多种指标a)种子生物量(种子总重 量)增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每公顷或每英亩；b)每个花序和/或 每株植物增加的花数；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表述为饱满种 子数与种子总数之间的比率)；e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与 总生物量的比率；和f)增加的原发花序(primary panicles)数；g)增加的千粒重(TKW)， 这从计数的饱满种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种 子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，产量的增 加本身也可以自我表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增 力口。增加的种子产量也可以产生改良的结构，或可以因改良的结构而出现。绿度指数如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标 的每一个像素，计算绿色值相对于红色值(在用于编码颜色的RGB模型中)之比。绿度指 数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、在 养分利用度下降的生长条件下，测量开花前末次成像时的植物绿度指数。相反，在干旱胁迫 生长条件下，测量干旱后首次成像时的植物绿度指数。_如本文中所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括 种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/ 核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子 体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部 植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种 (Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股 颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、览属物种(Amaranthus spp.)、欧 洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荡枝属物禾中(Annonaspp.)、 IrM (Apium graveolens) > ^^^M^ft (Arachis spp.)、7KMPM 禾中(Artocarpus spp.)、石习柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avenaspp.)(例如燕麦(Ayena sativa)、里予燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina) > Avena fatua var. sativa、 杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoacarambola)、箣竹属物种(Bambusa sp.)、冬 /R (Benincasa hispida) > Ei Hf^ (Bertholletia excel sea)、舌甘胃(Beta vulgaris) > ^ 笞属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、宪青物种(Brassica rapa ssp.)!!^!^^、油胃(oilseed rape) W (turnip rape)]) >Cadaba farinosa>^ (Camellia sinensis) > ^ A ^ (Canna indica) > i\ (Cannabis sativa) > M M ft (Capsicum spp. ) > Carex elata>#7K/R (Carica papaya) ^^v^jixlm^ll (Carissa macrocarpa) > lilt^ 杉匕属物禾中(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物禾中(Castaneaspp.)、美沙l、| 木棉(Ceiba pentandra)、苦宦(Cichorium endivia)、樟属物禾中(Cinnamomum spp.)、西 瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属 物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻 M 禾中(Corchorus sp.)(Coriandrumsativum)(Corylus spp.)、山丰查M
物禾中(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物禾中(Cucurbita spp.)、香瓜 属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属 物禾中(Desmodium spp.)、龙目艮(Dimocarpus longan)、薯蓣属物禾中(Dioscorea spp.)、t市 树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油
(Elaeis guineensis)、油胃 Elaeis (oleifera))、禾參〒(Eleusine coracana) > DS 禾中(Erianthus sp.)(Eriobotrya japonica)(Eucalyptus sp.) ^^LiJ-
果(Eugenia unifiora)、荞麦属物种(Fagopyrumspp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状 羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金結属物禾中(Fortunella spp.)、 草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)(例如 大豆、大豆(Sojahispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属 (Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocal 1 isfulva)、 木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、 L (Ipomoea batatas) > ^ M ^ ft (Juglans spp.)、豸■ (Lactuca sativa) > Lij M 豆属物禾中(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris) > (Linum usitatissimum) > M 枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotusspp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、 习习扇豆属物禾中(Lupinus spp. )、Luzulasylvatica、番 属物禾中(Lycopersicon spp.) (例如番爺(Lycopersiconesculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎 尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangiferaindica)、木 WM^ft (Manihot spp.(Manilkara zapota)^^!! (Medicago sativa)
(Melilotus spp.)、_^M 禾中(Menthaspp.) >￡ (Miscanthus sinensis) >瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物 种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足 豆属物种(Ornithopusspp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、
(Panicummiliaceum)(Panicum virgatum)(Passiflora edulis) >
防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鍔梨属物种(Perseaspp.)、 (Petroselinum crispurn) > H^ft (Phalaris arundinacea) > ^iiMft (Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、朿 lj 奏属物禾中(Phoenixspp.)、南方声華(Phragmites australis)、酸菜属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物禾中(Populus spp.)、牧 豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、 石 (Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、t乐属物禾中(Quercus spp.)、萝卜 (Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶蔴子属物禾中(Ribesspp.)、蓖麻 (Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔴属物种(Saccharum spp.)、柳属 物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种 (Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红爺(Solanumintegrifolium)或番爺(Solanum lycopersicum))、两色蜀 黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物禾中(Syzygium spp.)、万 胃胃M 禾中(Tagetes spp. ) > ii (Tamarindus indica) > bJ bJ W (Theobroma cacao) > $车由胃M 禾中(Trifolium spp.) > Triticale sp. > Triticosecale rimpaui、/]、胃M 禾中 (Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱 小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦 (Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金 莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、 豇豆属物种(Vignaspp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍、 Zizaniapalustris、^^属 禾中(Ziziphus spp.)等等。发明详述现已惊奇地发现提高编码本文所述AMT多肽的核酸序列在植物中的表达产生了 相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据一个实施方案，本发明提供了相对 于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括提高编码AMT多肽的核酸序列在植物 中的表达。用于增加编码AMT多肽的核酸序列表达的优选方法是在植物中引入并表达编码 AMT多肽的核酸序列。下文中对“可用于本发明方法的蛋白质”的任何提及均指本文定义的AMT多肽。下 文中对“可用于本发明方法的核酸序列”的任何提及均指编码该AMT多肽的核酸序列。待 引入植物(因此可用于实施本发明方法)的核酸序列是编码现将描述的多肽类型的任何核 酸序列，下文也称为“AMT核酸序列”或“AMT基因”。本文定义的“AMT多肽”指包含与SEQ ID NO 33所示保守结构域(⑶)具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更高(优选程度逐 渐提高)氨基酸序列同一性的结构域的任何多肽。
作为替代或补充，本文定义的“AMT多肽”指包含以下的任何多肽⑴InterPro登录号IPR0001905的铵转运蛋白结构域；和(ii)至少10个跨膜螺旋。作为替代或补充，本文定义的“AMT多肽”指当用于构建AMT系统发生树(如图2 所示)时，与包含SEQ ID NO :2(图2中以圆圈示出)所示多肽序列的AMT多肽的进化枝而 不是任何其他AMT进化枝聚类的任何多肽序列。作为替代或补充，本文定义的“AMT多肽”指与SEQ ID NO :2所示AMT多肽或任 何本文表A所给出多肽序列具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、98%、99%或更高(优选程度逐渐提高)氨基酸序列同一性的任何多肽。作为替代或补充，"AMT多肽”能补救缺少所有3种天然酵母铵转运蛋白的酵母菌 株 MLY131(Hildebrand(2005)J Phycol 41 :105_113)。术语“结构域”和“基序”在本文“定义”章节中定义。存在用于鉴定结构域的 专门数据库，例如 SMART (Schultz 等(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,5857-5864 ； Letunic 等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)， InterPro(Mulder 等，(2003) Nucl. Acids. Res. 31,315-318), Prosite(Bucher 禾口 Bairoch(1994)， A generalized profile syntax for biomolecular sequencesmotifs and its function in automatic sequence interpretation. (In)ISMB-94 ；Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology. Altman R. , Brutlag D. , Karp P., Lathrop R. ,Searls D.编著，第 53—61 页，AAAI Press, Menlo Park ；Hulo φ, Nucl. Acids. Res. 32 :D134-D137, (2004)或者 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1) 276-280(2002)。用于计算机分析蛋白质序列的一组工具可获得自ExPASY蛋白组服务器 (Swiss Institute of Bioinformatics(Gasteiger等，ExPASy :theproteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, NucleicAcids Res. 31 :3784_3788(2003))。 对SEQ ID NO :2的多肽序列的分析示于本文的实施例4。例如，SEQ ID NO :2所示AMT多 肽包含InterPro登录号IPR0001905的铵转运蛋白结构域。还可以使用常规技术(如序列 比对)来鉴定结构域。本文表A多肽的比对示于图3。这种比对可用于鉴定AMT多肽之间 最为保守的结构域，例如SEQ ID NO 33所示保守结构域(⑶)(包含于SEQ ID NO :2中)。比对序列以进行比较的方法为本领域所熟知，这些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、 FASTA 禾口 TFASTA。GAP 利用 Needleman 和 Wunsch ((1970) J Mol Biol 48 :443_453)的算法 来寻找两序列间使匹配数最高并使空位数最少的全局比对(即在完整序列上)。BLAST算法 (Altschul等(1990) J Mol Biol 215 :403_10)在两序列间计算百分比序列同一性并进行 相似性的统计学分析。用于进行BLAST分析的软件在National Centre forBiotechnology Information(NCBI)向公众提供。可以使用如默认配对比对参数的ClustalW多重序列 比对算法(1.83版)和百分比评分法来容易地鉴定同源物。也可以使用MatGAT软件 包(Campanella 等(2003)，BMCBioinformatics. 10 29. MatGAT :an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences)中提供的 方法之一确定全局相似性和同一性百分比。本领域技术人员会意识到，可以进行少量手动 编辑以优化保守性基序之间的比对。此外，还可以使用特定的结构域代替全长序列来鉴定 同源物。序列同一性值可使用默认参数的上述程序在完整的核酸序列或多肽序列上或在选 定的结构域或保守性基序上测定。本文的实施例3在表B中描述了 SEQ ID NO :2所示AMT多肽与表A所列AMT多肽之间的百分比同一性，其可低至44%的氨基酸序列同一性。如果 在SEQ ID NO 33所示保守结构域(CD)(包含于SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :4中)与表A 及图3所示AMT多肽的保守结构域之间进行同一性计算，则百分比同一性可提高。这些计 算的结果示于本申请的表Bi。蛋白质亚细胞定位预测的工作是很重要的，并已充分研究。了解蛋白质的定位有 助于阐明其功能。蛋白质定位实验方法的范围从免疫定位到使用绿色荧光蛋白(GFP)或 β _葡糖醛酸糖苷酶(GUS)标记蛋白质。这些方法很准确，但与计算机方法相比需要大量劳 动。从序列数据对蛋白质定位进行计算机预测近来已取得很大进展。本领域技术人员熟知 的可获得算法包括Swiss Institute for Bioinformatics提供的ExPASy蛋白质组学工具， 例如 PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTSl、SignalP、 TMHMM等。本申请的实 施例5描述了对SEQ IDNO 2所示AMT多肽的亚细胞定位的预测。此外，可用于本发明方法的AMT多肽(至少其天然形式)通常能对铵进行跨膜转 运。有许多测定来测量这种摄取活性，包括内源性铵转运蛋白缺陷型酵母菌株的补救测定 (Ninneman 等(1994)EMBO J 13 :3464_3471)，酵母、非洲爪蟾卵母细胞(Ludewig 等(2003) J Biol Chem 278 :45603_45610)、植物细胞、植物根(Yuan 等(2007)Plant Phys 143 732-744)和完整植物(Hoque 等(2006) Functional Plant Biology 33:153-163)中的摄 取测定。本发明以SEQ ID NO 3所示的核酸序列(包含于SEQ ID NO 1中)转化植物来进 行举例说明，其编码AMT多肽序列SEQ ID N0:4(包含于SEQ ID NO :2中)。然而，本发明 的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的任何AMT多肽编 码核酸序列来实施。AMT多肽编码核酸序列的实例在本文实施例1的表A中给出。这样的核酸序列可 用于实施本发明的方法。实施例1的表A中给出的多肽序列为SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示AMT多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系 同源物”如本文所定义。可以通过进行所谓的交互BLAST检索容易地找到更多直向同源物 和旁系同源物。通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例1的表A所列的任一序列)针 对任何序列数据库如可公众获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST。当从核苷酸序列 开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX (利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使 用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的 结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次 BLAST)(在查询序列为SEQ ID NO 1或SEQ IDNO 2的情况下，二次BLAST将会针对三角褐 指藻序列)。然后比较首次和二次BLAST的结果。如果首次BLAST中高排名的命中来自查 询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中之中，则鉴定 到旁系同源物；如果首次BLAST中高排名的命中不来自查询序列源自的相同物种，且优选 地在反向BLAST时导致查询序列为最高命中，则鉴定到直向同源物。高排名的命中是E值低的命中。E值越低，分值越显著(或者换句话说，偶然发现 此命中的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了 E值之外，比较结果还由同一 性百分数评分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核 苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻接树来以便辅助相关基因的聚类可视化，和以便鉴定直向同源物和旁系同源物。核酸变体也可用于实施本发明的方法。这类核酸变体的实例包括编码实施例1的 表A中所示任一多肽序列的同源物和衍生物的核酸序列，其中“同源物”和“衍生物”如本 文所定义。同样可用于本发明方法的核酸序列是编码实施例1的表A所示任一多肽序列的 直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸序列。可用于本发明方法的同源物和衍 生物与其源自的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物活性和功能活性。可用于实施本发明方法的其他核酸变体包括AMT多肽编码核酸序列的部分、与 AMT多肽编码核酸序列杂交的核酸序列、AMT多肽编码核酸序列的剪接变体、AMT多肽编码 核酸序列的等位变体，以及通过基因改组获得的AMT多肽编码核酸序列的变体。术语杂交 序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。AMT多肽编码核酸序列无需是全长核酸序列，因为本发明方法的实施不依赖于全 长核酸序列的使用。根据本发明，提供了在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中 引入和表达实施例1的表A所示任一核酸序列的部分、或者编码实施例1的表A所示任一 多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的部分。例如，可以通过对核酸序列进行一个或多个缺失来制备所述核酸序列的“部分”。 “部分”可以以分离的形式使用，或者可将其与其他编码(或非编码)序列融合，以便例如， 产生组合了若干活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比 针对该蛋白质部分所预测到的要大。可用于本发明方法的“部分”编码如本文所定义的AMT多肽，并与实施例1表A中 给出的多肽序列具有基本上相同的生物活性。优选“部分”是实施例1表A中给出的任一核 酸序列的部分，或是编码实施例1表A中给出的任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物 的核酸序列的部分。按照递增的优先度顺序，优选该“部分”长度为至少400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1380 或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸是实施例1表A中给出的任一核酸序列，或者是编码 实施例1表A中给出的任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列。优选“部分” 是编码包含下述结构域的多肽序列的核酸序列的部分，所述结构域与SEQ ID N0:33所示保 守结构域(CD)按照递增的优先度顺序具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、98%、99%或更多的氨基酸序列同一性。更优选“部分”是SEQ ID NO 1 的核酸序列的一部分。最优选“部分”由SEQ ID N0:3表示。可用于本发明方法的另一类核酸序列变体为在降低的严格条件下、优选在严格条 件下，能够与本文所定义的AMT多肽的编码核酸序列或者本文所定义的“部分”杂交的核酸 序列。根据本发明，提供了增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达能 够与实施例1表A中所示任一核酸序列杂交的核酸序列，或者包括在植物中引入和表达能 够与编码实施例1表A中所示任一多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序 列杂交的核酸序列。可用于本发明方法的杂交序列编码如本文所定义的AMT多肽，并与实施例1表A 中所示多肽序列具有基本上相同的生物活性。优选杂交序列能够与实施例1表A中所示任 一核酸序列杂交、或与任一前述序列的部分杂交，其中部分如上文所定义；或者其中杂交序列能够与编码实施例1表A中所示任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列 杂交。优选杂交序列能够与编码包含下述结构域的多肽序列的核酸序列杂交，所述结构域 与SEQ ID NO :33所示保守结构域(⑶)按照递增的优先度顺序具有至少50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多的氨基酸序列同一性。最优选杂 交序列能够与SEQ IDN0 1所示核酸序列或其部分杂交。可用于本发明方法的另一类核酸序列变体为编码前文所定义的AMT多肽的剪接 变体，其中剪接变体如本文所定义。根据本发明，提供了增强产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1 表A中所示任一核酸序列的剪接变体、或编码实施例1表A中所示任一多肽序列的直向同 源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接变体。优选的剪接变体是SEQ ID N0:1所示核酸序列的剪接变体，或编码SEQ ID NO 2 的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选剪接变体是编码包含下述结构域 的多肽序列的核酸序列的剪接变体，所述结构域与SEQ ID NO :33所示保守结构域(CD)按 照递增的优先度顺序具有至少 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%, 98%,99%或更多的氨基酸序列同一性。可用于实施本发明方法的另一类核酸序列变体为前文所定义的AMT多肽编码核 酸序列的等位变体，其中等位变体如本文所定义。根据本发明，提供了增强产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1 表A中所示任一核酸序列的等位变体，或者包括在植物中引入和表达编码实施例1表A中 所示任一多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的等位变体。可用于本发明方法的等位变体与SEQ ID NO 2的AMT多肽和实施例1表A中所述 任何多肽序列具有基本上相同的生物活性。等位变体天然存在，并且本发明的方法中包含 使用这些天然等位基因。优选等位变体为SEQ IDN0 1的等位变体，或编码SEQ ID NO 2的 直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位变体。优选等位变体是包含下述结构域的多肽 序列的等位变体，所述结构域与SEQ ID NO :33所示保守结构域(CD)按照递增的优先度顺 序具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更多的 氨基酸序列同一性。基因改组或定向进化也可用于产生上文所定义的AMT多肽编码核酸序列的变体； 其中术语“基因改组”如本文所定义。根据本发明，提供了增强产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1 表A中所示任一核酸序列的变体，或者包括在植物中引入和表达编码实施例1表A中给出 的任一多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变体，其中所述变体核 酸序列通过基因改组获得。优选地，通过基因改组获得的变体核酸序列编码包含下述结构域的多肽序列，所 述结构域与SEQ ID NO :33所示保守结构域(CD)按照递增的优先度顺序具有至少50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更多的氨基酸序列同一性。此外，还可利用定点诱变获得核酸序列变体。若干方法可用来实现定点诱变，最常 见的是基于 PCR 的方法(Current Protocols in MolecularBiology，Wiley 编辑)。
编码AMT多肽的核酸序列可以来自任何天然或人工的来源。核酸可以通过有意的人为操作对在组成和/或基因组环境中的其天然形式进行修饰。编码AMT多 肽的核酸序列来自真核生物领域，优选地来自囊泡藻界(Chromalveolata kingdom), 更优选来自不等鞭毛门(HeterokontophytaphyIum)。更优选编码AMT多肽的核酸序 列来自硅藻纲(Bacillariophyceae(diatoms)class)，和例如来自以下目曲壳藻目 (Achnanthales)、硅藻目(Bacillariales)、中心目(Centrales)(例如假微型海链藻 (Thalassiosirapseudonana))、桥弯藻目(Cymbellales)、短缝藻目(Eunotiales)、胸隔 藻目(Mastogloiales)、舟形藻目(Naviculales)、羽纹目(Pennales)(例如三角褐指藻 (Pheaodactylum tricornutum))、棒杆藻目(Rhopalodiales)、双菱藻目(Surirellales) 或Thalassiophysales。最优选编码AMT多肽的核酸序列来自三角褐指藻。本发明方法的实施产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。在本文 中的“定义”部分中更详细地描述了术语“产量”和“种子产量”。以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标每公顷或英亩中已建立 植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/ 直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其 它。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加每公顷或英亩植物 数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种 子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子 总数并乘以100)、千粒重的增加及其它。本发明提供了相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，所述方法包括提 高植物中本文所定义的AMT多肽的编码核酸序列的表达。由于本发明的转基因植物具有增强的产量相关性状，因而在其生活周期中的对应 阶段上相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能表现增加的生长速率(在其生活周期 的至少部分期间)。增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可 以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生 活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种 子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期活力、生长速率、绿度 指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶 段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速 率可以反映提高的(早期)萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物 较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得，延迟 的开花时间通常不是作物中想要的性状)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种 相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其它稻植物，全部稻植物 均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植 物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何 其它合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改 变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并 收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或 在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。 生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是T-Mid(植物达到 其50%最大尺寸所花费的时间)和T-90 (植物达到其90%最大尺寸所花费的时间)，等等。根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括增加本文中 所定义的编码AMT多肽的核酸序列在植物中的表达。与在可比条件下生长的对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露 于多种胁迫下，都发生增强的产量相关性状。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作 出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中 定义为植物对其暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生 长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生 长降低小于40%、35%或30%，优选小于25%、20%或15%，更优选小于14%、13%、12%、 11%或10%或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物 中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。 轻微胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱 或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可 以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫 一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。如本文中所用的术语“非 胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正 常土壤条件和气候条件。本发明方法的实施相对于在可比条件下培育的对照植物，赋予在非胁迫条件下或 在温和胁迫条件下培育的植物增强的产量相关性状。因而根据本发明，提供用于在非胁迫 条件下或温和胁迫条件下培育的植物中增强产量相关性状的方法，所述方法包括提高编码 AMT多肽的核酸序列在植物中的表达。本发明方法的实施相对于在可比胁迫条件下培育的对照植物，赋予在非生物胁迫 条件下培育的植物增强的产量相关性状。如在Wang等(Planta (2003) 218:1-14)中报道， 非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化 学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机 制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol (2003) 133 1755-1767)描述 了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“交叉”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗 透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧 化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的 细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑 制。由于不同的环境胁迫激活相似的途径，因此本发明就干旱胁迫进行的示例不应看作局 限在干旱胁迫，而是更应看作表明上文定义的AMT多肽在一般性非生物胁迫下参与相对于 在相当胁迫条件下培养的对照植物而提高产量相关性状的显示。本文定义的术语“非生物胁迫”指以下任何一种或多种水胁迫(由于干旱或水过 多)、缺氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(由于热、冷或冰冻温度)、化学毒性胁迫和氧化胁迫。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，其选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁 迫。优选地，水胁迫为干旱胁迫。术语“盐胁迫”不仅限于常见盐(NaCl)，而是可以为由以 下一种或多种引起的任何胁迫NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等。本发明方法的实施赋予在非生物胁迫条件下培养的植物相对于在相当条件下培 养的对照植物而言提高的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了在非生物胁迫条件下培 养的植物中提高产量相关性状的方法，该方法包括在植物中提高编码AMT多肽的核酸序列 的表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，其选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫 和离子胁迫的一种或多种。 非生物环境胁迫的另一实例是植物生长和发育的同化所需的一种或多种养分利 用度的降低。由于养分利用效率对植物产量和产品质量有显著影响，因此在田间使用了大 量肥料来优化植物生长和质量。植物的生产力一般受限于三种主要养分磷、钾和氮，在这 三者中，氮通常是植物生长的限速元素。因此，植物生长所需的主要养分元素是氮(N)。这 是可见于活细胞中的多种重要化合物的组分，所述化合物包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸 和叶绿素。植物干物质的1.5%至2%以及总植物蛋白质的约16%是氮。因此，氮的利用度 是作物植物生长和生产的主要限制因素(Frink等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(4) 1175-1180)，并也对蛋白质积累和氨基酸组成有重大影响。因此，在氮有限条件下培养时具 有提高的产量相关性状的作物植物是很有意义的。本发明方法的实施赋予在养分利用度降低条件下(特别是在减少的氮利用度的 条件下)培养的植物相对于在相当条件下培养的对照植物而言具有提高的产量相关性状。 因此，根据本发明，提供了在养分利用度降低条件下(优选在降低的氮利用度的条件下)培 养的植物中提高产量相关性状的方法，该方法包括在植物中提高编码AMT多肽的核酸序列 的表达。降低的养分利用度可能是由于养分(如氮、磷和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、 锰、铁和硼等)的缺少或过剩所致。优选地，降低的养分利用度是降低的氮利用度。本发明包括可由根据本发明的方法获得的植物或其部分(包括种子)或其细胞。 所述植物或其部分或其细胞含有编码如上文所定义的AMT多肽的核酸转基因。本发明还提供遗传构建体和载体，以利于在植物中引入如上文所定义的AMT多肽 的编码核酸序列和/或提高其表达。可以将基因构建体插入适于转化进入植物并用于在转 化的细胞中表达目的基因的载体中，该载体可以是可商购的载体。本发明还提供了如本文 所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。更具体地，本发明提供这样的构建体，其含有(a)编码如上文所定义的AMT多肽的核酸序列；(b) 一个或多个能够提高(a)中核酸序列表达的控制序列；和任选的(c)转录终止序列。优选编码AMT多肽的核酸序列如上文中定义。术语“控制序列”和“终止序列”如 本文所定义。优选构建体的控制序列之一是从植物基因组中分离的组成型启动子。植物组成 型启动子的一个例子是G0S2启动子，优选为稻G0S2启动子，更优选为SEQ ID N0:34所示 G0S2启动子。使用含有任何上述核酸序列的载体转化植物。技术人员充分知晓载体中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择并繁殖含目的序列的宿主细胞。将目的序列有效连接 于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。有利地，任何类型的启动子，无论是天然或是合成的，均可用于提高核酸序列的表 达。组成型启动子、优选从植物基因组分离的组成型启动子尤其适用于本发明的方法。植 物组成型启动子驱动编码序列以下述水平表达，在所有情况下所述水平低于在35S CaMV病 毒启动子的控制下获得的水平。其他器官特异性启动子，例如在叶、茎、块茎、分生组织、种子(胚和/或胚乳)中 优先表达的启动子可用于实施本发明的方法。多种启动子类型的定义见本文“定义”部分。应当明确，本发明的适用性不限于如SEQ ID N0:1或SEQ ID N:3所示的编码AMT 多肽的核酸序列，本发明的适用性也不限于由组成型启动子驱动时AMT多肽编码核酸序列 的表达。任选地，可在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。其他调节元件可 包括转录及翻译增强子。本领域技术人员会了解适于实施本发明的终止子和增强子序列。 也可如定义部分中所述，将内含子序列添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加在 胞质溶胶中累积的成熟信息的量。其它控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、 3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道 或可以容易地获得此类序列。本发明的遗传构建体还可以包括需要用于在特定细胞类型中维持和/或复制的 复制原点序列。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例 如质粒或粘粒分子)时。优选的复制原点包括但不限于fl-ori和colEl。为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序 列的转基因植物，使用标记基因(或报告基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包 含选择标记基因。选择标记在本文“定义”部分中有更详细的描述。已知当核酸序列稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并 且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并 选择这些整合体，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起引入 宿主细胞。这些标记可以例如在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变 体中使用。此外，编码选择标记的核酸序列分子可以引入宿主细胞中，与编码本发明多肽或 本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸序列 稳定转染的细胞可以例如通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其 它细胞死亡)。一旦不再需要，可以从转基因细胞中去除或切除标记基因。用于标记基因去 除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。本发明还提供生产相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方 法，其包括在植物中引入和表达编码上文所定义AMT多肽的任何核酸序列。更具体地，本发明提供了生产相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因 植物的方法，所述方法包括(i)向植物、植物部分或植物细胞中引入和表达处于植物组成型启动子控制下的 编码AMT多肽的核酸序列；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞、植物部分或植物。
(i)的核酸序列可以是能够编码上文定义的AMT多肽的任何核酸序列。可以将核酸序列直接引入植物细胞或植物本身(包括引入植物的组织、器官或任 何其它部分)。根据本发明优选的方面，优选通过转化将核酸序列引入植物。术语“转化” 在本文“定义”部分有更详细的说明。遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于 上述 S. D. Kung 和 R. Wu、Potrykus 或者H6fgen和 Willmitzer 的出版物。通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与 目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。为选择转化 的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与 非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通 过喷雾对其进行合适的选择。另一可能方案是使用合适的选择剂，将种子(适当时在灭菌 之后)种在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对转化的植物筛选可选 择标记(如上文所述标记)的存在。DNA转移和再生之后，还可评价推定转化的植物，例如用Southern分析(DNA印 迹)，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选地或额外地，可用Northern和 /或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普 通技术人员所熟知的。产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例 如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进 一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化 细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞经转化含有表达盒)；转化和非 转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根状茎嫁接到非转化的接穗上)。本发明显然延及由本文所述任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植 物部分及其繁殖体。本发明还延及由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器 官或整个植物的后代，唯一的要求是所述后代呈现出与在本发明方法中产生的亲本相同的 基因型和/或表型特征。本发明也包括含有分离的编码上文所定义的AMT多肽的核酸序列的宿主细胞，所 述核酸序列与植物组成型启动子有效连接。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。对于 用于本发明方法的核酸序列或载体、表达盒或构建体或载体的宿主植物，其原则上有利地 为能够合成在本发明方法中使用的多肽的所有植物。本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物 界超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮 食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大 豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单 子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、 粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。本发明也扩展至包含与植物组成型启动子有效连接的分离的AMT(如上文定义) 编码核酸序列的植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和球茎。 本发明进一步涉及衍生自、优选直接衍生自这种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。用于提高核酸序列或基因或基因产物表达的方法均已记载于本领域中，其例子在 定义部分中提供。如上文所述，用于提高AMT多肽编码核酸序列表达的一种优选的方法是通过在 植物中引入和表达AMT多肽编码核酸序列；然而，也可以使用其他公知的技术来实现实 施所述方法的效果(即增强产量相关性状)，所述技术包括但不限于T-DNA激活标签化、 TILLING、同源重组。这些技术的描述在定义部分中提供。本发明还包括如本文所述AMT多肽编码核酸序列和这些AMT多肽在正常生长条件 下、在非生物胁迫生长(优选渗透胁迫生长条件)条件下，和在降低的养分利用度的生长条 件下，优选在降低的氮利用度的条件下，提高植物中任何前述产量相关性状的用途。
身，其中 鉴定可能与AMT多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。可以使用所述基因/核酸序列或所述 AMT多肽本身定义分子标记。接着可以将此DNA或蛋白质标记在育种程序中使用，以在本发 明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。编码AMT多肽的基因/核酸序列等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。这 种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物作诱变处理而引入等位基因变异；备 选地，该程序可以从非人为引起的所谓“自然”起源的一组等位变体开始。随后进行等位变 体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论及导致增强的产量相关性状的序列的 优异等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而 实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其它任选步骤包括将鉴定出优异等位变体 的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。编码AMT多肽的核酸序列也可以用作探针以便对基因进行遗传作图和物理作图， 所述探针作为所述基因的一部分及与这些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物 育种中，以便开发具有想要表型的株系。编码AMT多肽的核酸序列的这种用途仅需要具有 至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码AMT多肽的核酸序列可以用作限制性片段长度多 态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(SambrookJ，Fritsch EF 禾口 Maniatis T (1989)Molecular Cloning, A LaboratoryManual)可以用编码 AMT 多月太 的核酸序列探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker (Lander等(1987) Genomics 1 174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸序列可以用来探测含 有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组 个体代表亲代和具有确定的遗传杂交的后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码 AMT多肽的核酸序列在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980) Am. J. Hum. Genet. 32 314—331)。在Bernatzky 禾口 Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4 :37_41 中描述了植 物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的 方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、 邻近纯合系和其它个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。所述核酸序列探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel 等在Non-mammalian Genomic Analyasis :A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。在另一实施方案中，核酸序列探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法 (Trask(1991)Trends Genet. 7 149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法偏好使用大型 克隆(几个kb至几百个kb ；见Laan等(1995)GenomeRes. 5 13-20)，然而灵敏度的改善可 以允许使用更短探针进行FISH作图。用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。实例包括等位基因特异的扩增法(Kazazian(1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95-96)、PCR 扩增片段的多态性(CAPS !Sheffield 等(1993)Genomics 16 :325_332)、等 位基因特异性连接(Landegren等(1988) Science 241 1077-1080)、核苷酸延伸反应 (Sokolov(1990)Nucleic acidsequence Res. 18 :3671)、放射杂交作图(Walter 等(1997) Nat. Genet. 7 22~28)禾口 Happy 作图法(Dear 禾口 Cook(1989)Nucleic acid sequence Res. 17 :6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸序列的序列来设计并产生在扩增反应或 在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。在使用 基于PCR遗传作图的方法中，可能必须鉴定在对应于当前核酸序列的区域内作图交叉亲代 间的DNA序列差异。然而，这对于作图法而言通常不是必需的。本发明方法产生具有如前文所述的产量相关性状提高的植物。这些性状也可以与 其它经济有利的性状组合，如其它的产量增强性状、对非生物胁迫和生物胁迫的耐性、对除 草剂、杀虫剂的耐性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。


现将参考以下附图描述本发明，在附图中图1代表用于SEQ ID NO 2的TMHMM2. O算法的图形输出。根据算法的预测，该多 肽的N端位于膜外侧(胞质溶胶外)，然后是11个跨膜螺旋，该多肽的C端位于膜的内侧 (胞质溶胶)。图2显示来自多种来源生物的AMT多肽的系统发生树。第I组代表可用于实施本 发明方法的多肽序列聚类，以括号示出。圆圈代表可用于实施本发明方法的多肽与其他AMT 多肽之间在树中的分支点。图 3 显示对表 A 中 AMT 多肽的 AlignX(来自 Vector NTI 10. 3，Invitrogen Corporation)多序列比对。保守结构域(CD)的起点和终点以括号显示，如SEQ ID NO :33所 示，并在共有序列下方以X标出。框出了参与正常AMT功能的保守性G(Gly)残基(Ludewig 等(2003)J Biol Chem278 :45603_10)。图4显示用于在稻G0S2启动子(pG0S2)控制下在稻(Oryza sativa)中提高编码 AMT多肽之核酸序列的表达的二元载体。图5详细示例了可用于实施本发明方法的序列。
实施例本发明将参考以下实施例来描述，所述实施例仅用于阐述。以下实施例不旨在全 面定义或者以其他方式限制本发明的范围。DNA 操作除非另有说明，根据(Sambrook (2001) Molecular Cloning :alaboratory manual,第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York)或 Ausubel 等(1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols 第 1 卷和第2卷中所述标准方案进行重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法描述 于 BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)禾口 Blackwell Scientific Publications(UK) 出版的由 R. D. D 编著的 Plant Molecular Biology Labfax (1993)中。实施例1 鉴定与本发明方法中使用的核酸序列相关的序列使用数据库序列检索工具，如基本局部比对工具(BLAST) (Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 403-410 ；和 Altschul 等(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402)在 国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与本 发明方法中使用的核酸序列相关的序列(全长cDNA、EST或者基因组序列)。该程序用来 通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列 间具有局部相似性的区域。例如，对本发明核酸序列所编码的多肽使用TBLASTN算法，采用 默认设置和过滤以忽略低复杂性序列启动(set off)。分析的结果通过配对性比较显示，并 根据概率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越 低，命中的显著性越高)。除了 E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数 指两个所比较核酸序列(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸) 数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节检索的严格性。例如，可以提高E-值来显 示更少的严格匹配。藉此可以鉴定短的接近精确的匹配。表A提供了与本发明方法中使用的核酸序列相关的核酸序列的列表。表A :AMT多肽序列和编码核酸序列的例子 在一些情况下，相关的序列由研究协会例如基因组研究协会(TIGR)暂时组合并 对公众公开。可以使用真核基因直向同源物(EGO)数据库鉴定这类相关序列，用感兴趣的 核酸序列或多肽序列进行关键词搜索或BLAST算法。在其他情况下，针对具体的生物创建 了特定的核酸序列数据库，例如由接合基因组协会(Joint Genome Institute)例如针对假 微型海链藻和三角褐指藻创建。实施例2 =AMT多肽序列的比对使用AlignX 算法(来自 Vector NTI 10. 3, Invitrogen Corporation)进行表 A 中所有AMT多肽序列的多序列比对。比对结果展示于本申请的图3中。使用括号展示例 如如SEQ ID NO :33所示的保守结构域(⑶)的开始和结束，并用X在共有序列下标记。用 方框标出涉及正确的AMT功能的保守G(Gly)残基(Ludewig等(2003) J Biol Chem 278 45603-10)。实施例3 计算用于实施本发明方法的多肽序列之间的全局同一件百分比使用本领域可获得的方法之一 MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics. 2003429. MatGAT :an application that generatessimilarity/ identity matrices using protein or DNA sequences. CampanelIaJJ, Bitincka L, Smalley J.；软件由Ledion Bitincka提供)确定用于实施本发明方法的全长多肽序列之 间全局相似性百分数和同一性百分数。MatGAT软件为DNA序列或蛋白质序列产生相似性/ 同一性矩阵，无需数据的预比对。该程序使用Myers和Miller全局比对算法(空位打开罚 分12和空位延伸罚分2)执行一系列逐对比对，使用例如Blosum 62 (对于多肽)计算相似 性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在分界线的下半部分中显示，序列同一性在对角分界线的上半部分中显示。比较中所用的参数是评分矩阵Blosum62第一空位12延伸空位2
多肽序列(排除部分多肽序列)全长上的全局相似性和同一性软件分析结果在表 B中显示。在SEQ ID NO 33所示(并包含于SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :4中)的保守结构 域(CD)和表A多肽的保守结构域(如图3中突出显示的)之间进行相同的分析，结果展示 于表Bl中。
如表Bl中所示，SEQ ID NO :33所示(并包含于SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4中) 的保守结构域(CD)和表A多肽的保守结构域(如图3中突出显示的)之间的同一性百分 比提高至55%的氨基酸同一性。实施例4 鉴定可用于实施本发明方法的多肽序列中包含的结构域蛋白质家族、结构域和位点集成资源(InterPro)数据库是基于文本和序列的检 索的通常所用标签数据库的集成界面。InterPro数据库组合了这些数据库，所述的数据库 使用不同方法学和不同程度的有关已充分表征蛋白质的生物学信息以得到蛋白质标签。合 作数据库包括 SWISS-PROT、PROS ITE, TrEMBL, PRINTS、Panther、ProDom 和 Pfam、Smart 禾口 TIGRFAMs。Interpro由英国的欧洲生物信息研究所提供。InterPro扫描如SEQ ID NO 2所代表的多肽序列的结果在表C中。
表C =SEQ ID NO 2所示多肽序列的InterPro扫描结果 实施例5 可用于实施本发明方法的多肽序列的亚细胞定位预测蛋白质定位实验方法的范围从免疫定位到使用绿色荧光蛋白(GFP)或β _葡糖醛 酸糖苷酶(GUS)标记蛋白质。例如，使用GFP融合实验将来自拟南芥的AMT转运蛋白定位 于质膜中(Yuan 等(2003)Plant Cell 19:2636-2652)。还进行了从序列数据对蛋白质定位的计算机预测。本领域技术人员熟知的算法可 获得自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute forBioinformatics)提供的ExPASy蛋白 组学工具，例如 PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTSl、 SignalP、TMHMM 和其他。跨膜结构域通常表示跨膜蛋白质的单个跨膜α螺旋。因为膜中的α-螺旋能够 独立于蛋白质的剩余部分进行折叠，所以其被称作“结构域”。更广义地，跨膜结构域是在膜中热力学稳定的任何三维蛋白质结构。这可以是短杆菌肽A的单个α螺旋、若干个跨膜α 螺旋的稳定复合物、跨膜β桶、螺旋或任何其他结构。跨膜螺旋通常长度约20个氨基酸，尽管它们可以长得多或短得多。ΤΜΗΜΜ2. 0是 一种能够预测蛋白质中跨膜螺旋的算法。该算法在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上托管。下表D展示了使用SEQ ID NO :2的多肽序列信息得到的 TMHMM2.0输出结果。根据预测，多肽的N-端位于膜的外侧(胞质溶胶外)，之后是11个跨 膜螺旋，多肽的多肽C-端位于膜的内侧(胞质溶胶中)。相同的构型适用于SEQ IDNO 4, 不同之处是第一外部更小。图1是表D中输出结果的图示。表D 使用SEQ ID NO 2的多肽序列信息得到的TMHMM2. 0输出结果。
使用TMHMM2. 0算法对SEQ ID NO 4所示AMT多肽预测的亚细胞区室是膜。实施例6 与可用于实施本发明方法的多肽序列相关的测定法AMT多肽能够跨膜运输铵。存在测量这类摄取活性的许多测定法，包括具有内源 性铵转运蛋白缺陷的酵母菌株的互补测定法(Nirmeman等(1994)EMBO J 13 =3464-3471), 酵母、爪蟾卵母细胞(Ludewig等(2003) JBiol Chem 278 :45603_45610)、植物细胞、植物根 (Yuan 等(2007) Plant Physl43 :732_744)和整株植物(Hoque 等(2006) Functional Plant Biology 33 =153-163)中的摄取测定。本领域技术人员公知测量AMT活性(包括SEQID NO 2所示AMT多肽的AMT活性)的这类实验步骤。实施例7 克隆SEQ ID NO 1所示核酸序列除非另外说明，否则根据以下所述的标准方法进行重组DNA技术 (Sambrook(2001)Molecular Cloning -.a laboratory manual,^IH ColdSpring Harbor Laboratory Press, CSH, New York)或者 Ausubel 等(1994), Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols的第1和2卷。用于植物分子工程的标准材料和 方法描述于 R. D. D. Croy 的 PlantMolecular Biology Labfax (1993)，由 BIOS Scientific Publications Ltd (UK)禾口 Blackwell Scientific Publications (UK)出版。使用从不同繁殖阶段以及不同生长条件下的三角褐指藻提取的mRNA合成的cDNA 作为模板，通过PCR扩增编码SEQ ID NO 4所示AMT多肽序列的拟南芥cDNA。PCR扩增中 使用包含用于Gateway重组的AttB位点的以下引物l)Prm09458(SEQ ID N0:35，有义)5，-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgatgcaggccggg-3，2) Prm09459 (SEQ ID NO: 36，反义，互补)5' -ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacacgagcagcaattaaacc-3‘在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。还使用标准方法扩增并纯化具 有期望长度(包括attB位点)的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反 应，在此期间PCR片段与pD0NR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”。质粒PD0NR201作为Gateway 技术的部分从Invitrogen购买。实施例8 使用SEQ ID NO 1所示核酸序列的表达载体构建 随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用包含SEQ ID NO 3的进入克 隆。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的植物可选择标记；可筛选标记表达盒 和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用 于组成型表达的稻G0S2启动子(SEQ ID NO 34)位于这种Gateway盒的上游。在LR重组步骤后，产生的表达载体pG0S2: :AMT(图4)根据本领域众所周知的方 法转化至农杆菌菌株LBA4044中。实施例9 植物转化稻转化含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本栽培品种Nipponbare的成 熟干燥种子脱壳。通过在70%乙醇中孵育一分钟，随后在2% HgCl2中30分钟，随后用无 菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组 织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将胚发生性来自小盾片的愈伤组织切下并 在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上亚培养另外2周而繁殖或 增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上亚培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活 性)。含有每个个体表达载体的农杆菌菌株LBA4404独立地用于共培育。农杆菌接种在 含有适宜抗生素的AB培养基上并在28°C培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育 培养基中至密度(0D_)约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡 15分钟。愈伤组织组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中 于25°C孵育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28°C在选择剂存在下于含有2，4-D的培 养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再 生培养基并在光线下孵育后，胚发生潜力释放并且苗在随后4-5周发育。将苗从愈伤组织 中切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2-3周，其中将苗从所述的培养基上转移至 土壤。硬化的苗在高湿度和短日照下于温室中培育。对每个构建体产生约35个独立的TO稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至 温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷 贝转基因植物用于收获Tl种子。种子随后在移植后3-5月收获。本方法以超过50%的比 率产生单一基因座转化体(Aldemita 和 Hodgesl996，Chan 等 1993，Hiei 等 1994)。实施例10:表型评价方法10. 1评价准备产生大约35个独立的TO稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室用于 生长和收获Tl种子。留下6个事件，其中所述事件的Tl后代对转基因的存在/不存在以 3 1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择含有转基因的 大约10株Tl幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株Tl幼苗(失效合子)。 转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)， 在光照下28°C和在黑暗中22°C以及相对湿度70%。4个Tl事件在T2世代中按照如用于Tl世代的相同评价方法作进一步评价，但每个事件采用更多的个体。使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点 上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
10. 2统计分析F-检验使用双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的整体评价。对 用本发明基因转化的全部事件的全部植物的所有测量参数实施F检验。实施F检验以检查 基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作全局基因作用)。用于真实 全局基因作用的显著性的阈值对于F检验设置在5%概率水平上。显著性F检验值标示基 因作用，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。10. 3测量的参数生物量相关参数的测量从播种期直至成熟期，使植物通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物 从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数在来自植物地上部分的数字图像上区 别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化 并且通过校正转化成以平方毫米表达的物理表面值。实验证实以这种方式测量的地上部分 植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量 的时间点上时所测量的面积。早期活力是萌发后3周时植物(幼苗)地上面积。根生物量 的提高被表述为总根生物量(测量为植物寿命中观察到的根的最大的生物量)的提高；或 者表述为根/枝条指数(测量为根和枝条活性生长期中根质量和枝条质量的比例)的提 尚ο种子相关参数的测量将成熟的原发花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内在37°C干 燥3日。随后将花序脱粒并且收集及计数全部种子。使用吹气装置分开饱满粒与空粒。弃 去空粒并再次对剩余部分计数。饱满粒在分析天平上称重。饱满种子数通过计数分离步骤 后的饱满粒数而确定。每株植物的种子总重量通过称量从一株植物中收获的全部饱满粒而 测量。每株植物种子总数通过计数从植物中收获的壳粒数目而测量。根据计数的饱满种子 数及其总重量外推得出千粒重(TKW)。收获指数(HI)在本发明中定义为每株植物的种子总 重量和地上面积(mm2)之间的比值再乘以因子106。每个花序的花总数在本发明中定义为 种子总数与成熟的原发花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种 子(或小花)总数的比例(以％表示)。实施例11 表达编码SEQ ID NO 2所示AMT多肽的核酸序列的转基因稻植物的表 型评价结果下文展示了在正常生长条件下生长的，在用于组成型表达的G0S2启动子控制下 表达编码SEQ ID NO :2所示AMT多肽的核酸序列的转基因稻植物的T2代评价结果。如表E中所示，与相应的失效合子(对照)相比，转基因植物的早期活力、地上部 分生物量、根生物量、每株植物的种子总产量、种子饱满率、饱满种子数量、每个花序的花数 量和收获指数存在显著的提高。表E 在用于组成型表达的G0S2启动子的控制下，表达编码SEQ IDNO 2所示AMT 多肽的核酸序列的T2代转基因稻植物的评价结果。
实施例12 转化其他作物的例子玉米转化玉米的转化根据对Ishida等(1996. Nature Biotech 14(6) :745_50)描述方法的 改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再 生。近交系A188 (明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好 来源，但是其它基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP) 收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1. 2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培 育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米 再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种 选择标记)。培养板在25°C于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移 至玉米生根培养基并在25°C培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。 从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生Tl种子。小麦转化小麦的转化用Ishida 等 Ishida 等(1996) Nature Biotech 14(6) :745_50 描述的 方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟 胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌 孵育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养 基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25°C于光照下培 养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25 °C培养2-3周，直至 根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插 入物的植物中产生Tl种子。
大豆转化根据对Texas A&M美国专利5，164，310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack (从Illinois种子基金会可 获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根 和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有 表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将 再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过Icm的苗置于生根培养基上直至根发 育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的 植物中产生Tl种子。油菜籽/芸苔转化使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic 等(1998，Plant Cell Rep 17 :183_188)转化。商业栽培品种Westar (Agriculture Canada) 是用于转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对芸苔种子作表面消毒以便体外播种。 从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并与(含有表达载体的)农杆菌通过叶 柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/l BAP、3%蔗糖、0.7% 植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23°C，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共 培育2日后，将叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/ 1)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的 MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培 养基(含0. 5mg/l BAP的MSBAP-0. 5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养 基(MSO)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插 入物的植物中产生Tl种子。苜蓿转化苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119:839-847)的方法 加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得 再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Range lander (Agriculture Canada)或如 Brown DCW 与 AAtanassov (1985. Plant Cell Tissue Culture 4:111—112) 描述的任何其它商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织 培养中(Walker等，1978Am J Bot 65:654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农 杆菌 C58C1 pMP90 (McKersie 等，1999Plant Physiol 119 :839_847)或 LBA4404 的过夜培 养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4. 35g/L K2S04和 100 μ m乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天。外植体在半浓缩Murashige-Skoog培 养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂 和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不 含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的B0i2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半 浓缩Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从 表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生Tl种子。棉花转化使用根癌农杆菌在下胚轴外植体上进行棉花(陆地棉(Gossypiumhirsutum L.)转化。市售栽培种如Coker 130或Coker 312 (SeedCo，Lubbock，TX)是用于转化的标准变 种，但是也可以使用其他变种。将种子表面灭菌并在暗中萌发。从萌发的幼苗上切下长度 约1-1. 5厘米的下胚轴外植体。将下胚轴外植体在含有表达载体的根癌农杆菌接种物中浸 渍5分钟，然后在MS+1.8mg/l KN03+2%葡萄糖上于24°C下暗中共同培养约48小时。将外 植体转移至含有适当的细菌和植物可选择标记物的相同培养基(更新若干次)，直至观察 到胚发生性的愈伤组织。将愈伤组织分离并传代培养，直至出现体细胞胚。使来自体细胞 胚的小植株在生根培养基上成熟，直至发育出根。将生根的苗移植至温室中的盆栽土壤中。 Tl种子由对选择剂显示耐性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。实施例13 非生物胁迫筛选的实例 干旱筛选在正常培养条件下在盆土中培养来自选定事件数的植物，直至到达抽穗阶段。接 着将其转移至停止浇水的“干旱”部分。在随机选择的盆中插入湿度探测器，以检测土壤含 水量(SWC)。当SWC低一定阈值时，自动对植物持续再浇水直至再次达到正常水平。接着将 植物再转移至正常条件。其余培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养 的植物相同。如正常条件下培养所详细描述的那样记录生长和收获参数。盐胁迫筛选在由椰子纤维和argeX(3 1比例)构成的基质上培养植物。在将小植株移植到 温室后的前两周使用正常营养液。前两周之后，向营养液中加入25mM盐(NaCl)，直至收获 植物。如正常条件下培养所详细描述的那样记录生长和收获参数。养分(氮)利用度降低筛选在除营养液以外均为正常的条件下在盆土中培养来自6个事件的植物(T2种子)。 从移植到成熟均使用特定的营养液对盆浇水，其中含有降低的氮(N)含量，通常降低7至8 倍。其余培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如正常 条件下培养所详细描述的那样记录生长和收获参数。
权利要求
与对照植物相比在植物中提高产量相关性状的方法，其包括在植物中提高编码铵转运蛋白(AMT)多肽之核酸序列的表达；以及任选地选择具有提高的产量相关性状的植物，其中所述AMT多肽包含与SEQ IDNO33所示保守结构域(CD)以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性的结构域。
2.根据权利要求1的方法，其中所述AMT多肽包含(i)InterPro登录号IPR0001905 的铵转运蛋白结构域，和(ii)至少10个跨膜螺旋。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述AMT多肽在用于构建AMT系统发生树例如图 2所示系统发生树时，与包含SEQ ID NO 2所示多肽序列的AMT多肽进化枝(图2中以圆 圈示出)聚类，而不与任何其他AMT进化枝聚类。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述AMT多肽与SEQIDNO :2所示AMT多肽 或本文表A中给出的任何多肽序列以递增优选顺序具有至少40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更高的氨基酸序列同一性。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码AMT多肽的核酸序列表示为表A 所给出任一核酸序列SEQ ID NO或其部分，或是能与表A所给出任一核酸序列SEQ ID NO 杂交的序列。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A所给出任一多肽序 列SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述提高的表达通过以下任何一种或多种 来实现T-DNA激活标签化、TILLING或同源重组。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述提高的表达通过在植物中引入并表达 编码AMT多肽的核酸序列来实现。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述提高的产量相关性状为以下一种或多 种提高的早期活力、提高的地上部分生物量、提高的根生物量、提高的每株植物种子总产 量、提高的种子饱满率、提高的饱满种子数或提高的收获指数。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸序列与组成型启动子有效连接， 优选与植物组成型启动子有效连接，更优选与G0S2启动子有效连接，最优选与如SEQ ID NO 34所示的来自稻的G0S2启动子有效连接。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码AMT多肽的核酸序列来自不等 鞭毛门，优选来自硅藻纲，更优选来自羽纹目，最优选来自三角褐指藻。
12.可通过前述权利要求中任一项获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞，其中 所述植物、其部分或细胞包含编码AMT多肽的分离的核酸转基因，其与植物组成型启动子 有效连接。
13.构建体，其包含(a)编码权利要求1至6中任一项所定义AMT多肽的核酸序列；(b)能驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的(c)转录终止序列。
14.根据权利要求13的构建体，其中所述控制序列为植物组成型启动子，优选G0S2启 动子，更优选如SEQ ID NO 34所示的G0S2启动子。
15.根据权利要求13或14的构建体在用于产生与对照植物相比具有提高的产量相关 性状之植物的方法中的用途，其中所述提高的产量相关性状为以下一种或多种提高的早 期活力、提高的地上部分生物量、提高的根生物量、提高的每株植物种子总产量、提高的种 子饱满率、提高的饱满种子数或提高的收获指数。
16.转化有根据权利要求13或14的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
17.用于产生与对照植物相比具有提高的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括(i)在植物、植物部分或植物细胞中引入并表达编码权利要求1至6中任一项所定义 AMT多肽的核酸序列，其处于植物组成型启动子的控制之下；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞、植物部分或植物。
18.由于提高了编码权利要求1至6中任一项所定义AMT多肽之核酸序列的表达而与 对照植物相比具有提高的产量相关性状的转基因植物，或者来自所述转基因植物的转基因 植物细胞或转基因植物部分，其中所述核酸序列与植物组成型启动子有效连接。
19.根据权利要求12、16或18的转基因植物或者来自所述转基因植物的转基因植物细 胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、黍、黑麦、黑 小麦、高粱和燕麦。
20.根据权利要求19的植物中包含编码AMT多肽之分离核酸序列的可收获部分，其中 所述可收获部分优选为种子。
21.来自根据权利要求19的植物和/或根据权利要求20的植物可收获部分的产品。
22.编码权利要求1至6中任一项所定义AMT多肽的核酸序列在提高产量相关性状中 的用途，所述提高的产量相关性状包括以下一种或多种提高的早期活力、提高的地上部分 生物量、提高的根生物量、提高的每株植物种子总产量、提高的种子饱满率、提高的饱满种 子数和提高的收获指数。
全文摘要
本发明一般涉及分子生物学领域，并涉及通过在植物中提高编码铵转运蛋白多肽之核酸序列的表达而提高多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有提高编码AMT多肽之核酸序列表达的植物，所述植物与对照植物相比具有提高的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明方法的构建体。
文档编号C07K14/405GK101874116SQ200880117394
公开日2010年10月27日 申请日期2008年11月21日 优先权日2007年11月22日
发明者A·艾伦, C·鲍勒, V·弗兰卡德 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司