真菌PepC抑制剂的制作方法

专利名称：：真菌PepC抑制剂的制作方法真菌PepC抑制剂涉及序列表本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过弓I用并入本文。发明领域本发明涉及具有P印C抑制活性的分离的多肽。本发明还涉及表达P印C抑制剂的宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。
背景技术：
：在表达异源蛋白中重组宿主细胞的使用在近年来大大简化了具有商业价值的蛋白质的大量生产，否则只能通过由其天然来源纯化而获得。一个经常遇到的问题是由指定宿主细胞或在培养基中产生的高水平蛋白分解酶。先前已经报道了失去产生特定蛋白分解化合物的能力的宿主生物体的几个实例。例如，国际专利申请WO90/00192描述了不能分泌酶活性天冬氨酸蛋白酶的丝状真菌宿主，并且EP574347描述了缺少枯草杆菌蛋白酶类型的丝氨酸蛋白酶ρ印C或ρ印D的黑曲霉(Aspergillusniger)宿主。Frederick等，Gene，125(1993)57-64中已经描述了黑曲霉的ρ印C基因的克隆和表征。至今为止，所有涉及ρ印C突变体和它们在丝状真菌(特别是曲霉属)中产生异源多肽的用途的所有已知现有技术，都优选地涉及缺失突变体。这需要对宿主细胞进行基因操作。因此理想的是找到其它方法用于降低特定蛋白酶的活性，例如以抑制剂的形式进行。本发明的目的是通过提供编码曲霉属丝氨酸蛋白酶抑制剂，具体为P印C抑制剂的DNA分子，从而提供可替代的解决方案。在酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，已经描述了蛋白酶yscB(pepC同源物)的抑制剂(Schu等，1991，Eur.J.Biochem,197:1_7)。发现这种抑制剂位于细胞质。曲霉属中的P印C蛋白已知为在液泡中产生的蛋白酶。然而，当使用曲霉属作为产生宿主时，遇到的与P印C有关的问题通常是可在上清中发现P印C。依赖于产生的产物，这可成为得率/稳定性的问题。发明概述本发明提供编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的DNA分子。更具体地，本发明的第一方面提供具有P印C抑制活性的分离的多肽，所述多肽选自下组(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO6的成熟多肽具有至少85%，优选至少90%，并且最优选至少95%同一性；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在优选至少高严紧条件下与以下杂交(i)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDNO17中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQIDNO17的成熟多肽编码序列具有优选至少至少85%，更优选至少90%，和最优选至少95%同一性的核苷酸序列；(d)变体，其包含取代、缺失和/或插入一个或几个氨基酸的SEQIDNO6的成熟多肽。在第二方面，本发明涉及用于在曲霉属宿主细胞中产生目的异源多肽的方法，其包括(a)在有益于表达由第一和第二核酸序列编码的多肽的条件下培养包含所述第一和第二核酸序列的曲霉属宿主细胞，并且其中第一核酸序列编码目的异源多肽，而第二核酸编码本发明的抑制剂多肽，并且其中抑制剂多肽由重组核酸构建体表达，导致与不包含重组核酸构建体的曲霉属宿主细胞相比，抑制剂多肽水平增加；和(b)回收所述异源多肽。在第三方面，本发明涉及本发明的多肽用于枯草杆菌蛋白酶类型(subtilisin-type)的丝氨酸蛋白酶的体外或体内抑制的用途。发明详述本发明提供去除不理想的蛋白酶活性的替代方法，其不涉及编码蛋白酶的基因的操作，例如通过突变或缺失蛋白酶基因。取而代之的是，现在已经发现，丝状真菌并且特别是曲霉属具有能抑制丝氨酸蛋白酶如P印C的内源抑制剂活性。根据本发明的内源P印C抑制剂与任何已知的蛋白酶抑制剂不具有任何实质的同一性程度。与酵母蛋白酶yscB抑制剂PB12相比(Schu,P.Wolf,D.H.；Eur.J.Biochem.1971-7(1991))，曲霉属P印C抑制剂只表现出19%的同一性。此外，分泌抑制剂，并且因此能在宿主细胞的生长培养基的上清中发现抑制剂。如果与几乎唯一地定位于细胞质的yscB抑制剂(Schu等，见上文)相比，这本不是所期望的。P印C抑制活性术语“抑制活性”在本文中定义为可作为P印C的抑制剂的多肽。抑制剂是可逆或不可逆地防止酶正常作用而又不破坏酶的物质；通过与活性位点结合并防止结合底物而起作用的竞争性抑制剂；和通过与酶的其它部分结合而起作用的非竞争性抑制剂。根据实例中描述的过程，如材料与方法中所述，由径向扩散分析确定P印C抑制活性。本发明的多肽具有SEQIDNO:6的成熟多肽的P印C抑制活性的至少20%，优选至少40%，更优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少100%。分离的多肽术语“分离的多肽”用于本文中指，如通过SDS-PAGE测定的，其为至少20%纯，优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，最优选至少90%纯，并且甚至最优选至少95%纯的多肽。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%,更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%纯，最优选至少99.5%纯，并且甚至最优选100%纯。本发明的多肽优选为基本上纯的形式。具体地，优选的是多肽为“基本上纯的形式”，即，多肽制备物基本上不含与其天然结合的其它多肽材料。这可以通过如下实现例如，通过公知的重组方法或经典的纯化方法制备多肽。成熟多肽术语“成熟多肽”在本文中定义为具有P印C抑制活性的多肽，所述多肽以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个优选的方面，根据预测SEQIDNO6的氨基酸1至17是信号肽的SignalP预测程序，成熟多肽是SEQIDNO6的氨基酸18至89。这与显示N-末端为SPIVVTYPID的纯化的抑制剂一致。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有P印C抑制活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，根据信号序列的长度和EST序列、SEQIDNO:3与基因组DNA序列SEQIDNO17的比对，成熟多肽编码序列是SEQIDNO:17的核苷酸64至141，204至228，306至315，和416至481。因此，SEQIDN0:17的核苷酸13至63编码预测的信号肽。同一性参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度通过Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443_453)使用EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276_277)的Needle程序来测定，优选3.0.0版本或更高版本。使用的可选参数为缺口罚分(gappenalty)10，缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longestidentity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下(同样的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度通过Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)使用EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，见上文)的Needle程序来测定，优选3.0.0版本或更高版本。使用的可选为参数缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下(同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)同源序列术语“同源序列”在本文中定义为在用SEQIDNO:6中包含的米曲霉PepC白勺tfasty(Pearson,W.R.，1999,ψBioinformaticsMethodsandProtocols中，S.Misener和S.A.Krawetz编，pp.185-219)中E值(或期望值)小于0.001的预测蛋白质。多肽片段术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQIDNO:6的成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有P印C抑制活性。亚序列术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQIDNO17的5，和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亚序列编码具有P印C抑制活性的多肽片段。等位变体(allelicvariant)术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。分离的多核苷酸术语“分离的多核苷酸”用于本文中指由其来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，多核苷酸为至少纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯的多核苷酸。基本上纯的多核苷酸术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%，并且甚至最优选至少99.5%纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式，即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。编码序列当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的核苷酸序列。核酸构建体术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列(controlsequence)术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)0修饰术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQIDNO6的成熟多肽组成的多肽或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。人工变体当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有P印C抑制活性的多肽，所述多肽由表达SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列或其同源序列的修饰的多核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(humanintervention)，通过修饰公开于SEQIDNO:17或它的同源序列的多核苷酸序列来获得。具有P印C抑制活性的多肽在第一方面，本发明涉及包含氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO6的成熟多肽具有优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多肽具有P印C抑制活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，其与SEQIDNO:6的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。本发明的多肽优选包含SEQIDNO6的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有P印C抑制活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。在另一个优选方面，多肽包含SEQIDNO:6的成熟多肽。在另一个优选方面，多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸18至89，或其等位变体；或它们的具有P印C抑制活性的片段。在另一个优选方面，多肽包含SEQIDNO6的氨基酸18至89(对应于由纯化抑制剂的N-末端测序确认的预测成熟多肽)。在另一个优选方面，多肽由SEQIDNO6的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有P印C抑制活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQIDNO:6的氨基酸序列组成。在另一个优选方面，多肽由SEQIDNO:6的成熟多肽组成。在另一个优选方面，多肽由SEQIDNO:6的氨基酸18至89或其等位变体；或它们的具有P印C抑制活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQIDNO6的氨基酸18至89组成。本发明涉及具有P印C抑制活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件下，更优选中严紧条件下，更优选中_高严紧条件下，甚至更优选高严紧条件下，并且最优选非常高严紧条件下，与以下杂交(i)SEQIDNO17的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDNO:17的序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)⑴、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，Ε·F.Fritsch,禾口Τ·Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor，NewYork)。SEQIDNO:17的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有P印C抑制活性的多肽片段。在一个具体的实施方案中，SEQIDNO17的成熟多肽编码序列包含SEQIDNO17的核苷酸64至141，204至228，306至315，和416至481。在另一个具体的实施方案中，SEQIDNO17中包含的cDNA序列包含SEQIDNO17的核苷酸13至141，204至228，306至315，和416至481。SEQIDNO17的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQIDNO6的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有P印C抑制活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针的长度可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，或更优选至少400个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有P印C抑制活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQIDNO17或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列；包含于SEQIDNO17中的cDNA序列；其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-rayfilm)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。在一个优选的方面，核酸探针是SEQIDNO17的成熟多肽编码序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQIDNO17的核苷酸13至141，204至228，306至315，和416至481(cDNA).在另一个优选方面，核酸探针是编码SEQIDNO:6的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严紧性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2XSSC、0.2%SDS优选至少在450C(非常低严紧性)，更优选至少在50°C(低严紧性)，更优选至少在55°C(中严紧性)，更优选至少在60°C(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65°C(高严紧性)，并且最优选至少在70°C(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比牛艮据Bolton禾口McCarthy计算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)得出的Tm低大约5°C至大约10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，ΙπιΜ舞酸二Mi内(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口0·2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6XSSC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟，并用6XSSC在比计算的Tm低5°C至10°C的温度洗涤两次，每次15分钟。在另一个方面，本发明涉及由包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的多核苷酸编码的具有P印C抑制活性的分离的多肽，所述核苷酸序列与SEQIDNO17的成熟多肽编码序列具有优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，97%，98%或99%的同一性程度，其编码活性多肽。在进一步的方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQIDNO:6的成熟多肽；或其同源序列。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或结合域(bindingdomain)。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/lle、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烧羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适PH等。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science244:1081_1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，P印C抑制活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899_904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309:59_64。必需氨基酸的同一性也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(sbuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson禾ΠSauer,1988，Science241:53_57；Bowie禾ΠSauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；WO95/17413；或W095/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美国专利号5，223，409；WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定目的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。SEQIDNO6的成熟多肽，如SEQIDNO6的氨基酸18至89的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。具有P印C抑制活性的多肽的来源本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是分泌的。本发明的多肽可以是真菌多肽，并且更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、,廉抱属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨抱菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)多月太。在另一个优选的方面，所述多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、^^ffiβ(Aspergillusawamori)Λffiβ(Aspergillusfumigatus)、1ffiβ(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、杆抱状,廉抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉红德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱,廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆,廉抱(Fusariumtorulosum)、拟丝抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、^■€β(Mucormiehei)、口f%罾M胃(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、哈茨木毒(Trichodermaharzianum)、康宁木毒(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)多月太。在另一个优选的方面，所述多肽是米曲霉或黑曲霉多肽。在更优选的方面，所述多肽是米曲霉多肽，并且最优选米曲霉(NBRL4177)多肽，例如SEQIDNO6的多肽或SEQIDNO6中包含的成熟多肽。可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfectandimperfectstates)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的同一性。这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)、农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)禾口国立技术与评价ff胃ML罾(NationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenter)(NBRC)。此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。多核苷酸本发明的具有P印C抑制活性的多肽由下述分离的多核苷酸编码。在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO17或由SEQIDNO17组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQIDN0:17的成熟多肽编码序列或由SEQIDNO17的成熟多肽编码序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQIDN0:17中所包含的cDNA序列，或由SEQIDNO17中所包含的cDNA序列组成，具体为由SEQIDN0:17的核苷酸13至141，204至228，306至315和416至481组成的cDNA。本发明还包含核苷酸序列，其编码的多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO:6的氨基酸序列或其成熟多肽组成，由于遗传密码的简并性，所述氨基酸序列不同于SEQIDN0:17或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQIDN0:17的亚序列，所述亚序列编码具有P印C抑制活性的SEQIDNO6的片段。本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQIDNO171的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，或由具有至少一个突变的SEQIDNO:171的成熟多肽编码序列组成，其中所述突变核苷酸序列编码SEQIDNO:6的成熟多肽。用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork0可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从曲霉属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(speciesvariant)。本发明还涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQIDN017的成熟多肽编码序列具有至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的同一性程度，其编码活性多肽。修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适PH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQIDNO:17的成熟多肽编码区存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，ProteinExpressionandPurification2一107。对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上文)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的P印C抑制活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，deVos等，1992，见上文；Smith等，1992，见上文；Wlodaver等，1992，见上文)。本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件，更优选中等严紧条件，更优选中_高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下序列杂交(i)SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列，()包含于SEQIDNO:17中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的互补链；或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，见上文)，如本文所定义的。在一个优选的方面，互补链是SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列的全长互补链。本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸通过以下获得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下序列杂交(i)SEQIDNO17的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDNO:17中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有P印C抑制活性的多肽。在一个优选的方面，互补链是SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列的全长互补链。核酸构建体本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片镰孢Daria(WC)00/56900)、镶片镰孢Quirm(W000/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUPl)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992,Yeast8:423_488描述。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得米曲霉IAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYCl)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3，末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码区。异源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶和疏棉状腐质霉脂肪酶。在一个优选的方面，信号肽包含SEQIDNO17的氨基酸13至63，其编码SEQIDNO6的氨基酸1至17。对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos等，1992，见上文，描述。调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))0前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(W095/33836)的基因获得前肽编码区。同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(withheavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，使得该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA)，或可以使用转座子(transposon)。本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。条件必需的基因可以作为非抗生素选择性标记。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitratereductase),PyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脱羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10，000碱基对，优选400至10，000碱基对，并且最优选800至10，000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序15列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(r印licator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分离AMAl基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝和由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，其包括本发明的多核苷酸，所述多核苷酸可以有利地用于P印C抑制剂和任选的另一种目的多肽的重组生产中。具体而言，这另一种目的多肽是对P印C降解易感的异源多肽。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，使载体如前所述保持为染色体整合体或自复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何祖先，其由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同。宿主细胞的选择很大程度上依赖于编码多肽的基因和它的来源。宿主细胞可以真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)禾口接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UKtPPJf^JC)U及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢^^^(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995,)。在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内抱霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽抱纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.，Passmore,S.Μ.，禾口Davenport,R.R.编，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。在甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescar1sbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是Yarrowialipolytics细胞。在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta),Ceriporiopsisaneirina>Ceriporiopsisaneirina>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa或Ceriporiopsissubvermispora，灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺序侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉、Trametesvillosa、Trametesversicolor、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton^,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.编，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194，pp182—187，AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983，JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o产生方法本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是曲霉属的细胞。在更优选的方面，所述细胞是米曲霉。在另一个实施方案中，本发明的多肽可以如前所述从核酸构建体重组产生。因此在进一步的实施方案中，本发明涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养包含本发明的核酸构建体的宿主细胞；和(b)回收所述多肽。具体地，P印C抑制剂可以在共表达目的异源多肽的宿主细胞中表达。更具体地，目的异源多肽易由P印C降解，从而与不表达P印C抑制剂的宿主细胞相比，增加异源多肽的产量。产生异源多肽的这种方法可为使用P印C基因突变体如缺失突变体的替换方案。就这个具体目的而言，本发明的P印C抑制剂多肽应优选以比正常更高的水平表达。P印C抑制剂通常存在于宿主细胞中，除此之外，在表达某些异源多肽时，P印C仍然是个问题。在一个优选的实施方案中，因此应过表达P印C抑制剂，优选由强启动子过表达。为了能控制表达水平，可以从诱导型启动子或组成型启动子表达P印C抑制剂。在一个具体实施方案中，可以失活编码P印C抑制剂的基因的内源拷贝。优选地，因此P印C抑制剂由重组核酸构建体表达。在这个实施方案中，控制P印C抑制剂表达的启动子是外源启动子。通过“外源”，表示通常不调控P印C表达的启动子。在进一步的实施方案中，本发明因此涉及用于在曲霉属宿主细胞中产生目的异源多肽的方法，包括(a)在有益于表达由第一和第二核酸序列编码的多肽的条件下培养包含所述第一和第二核酸序列的曲霉属宿主细胞，并且其中第一核酸序列编码目的异源多肽，第二核酸编码本发明的抑制剂多肽，并且其中抑制剂多肽由重组核酸构建体表达，导致与不包含重组核酸构建体的曲霉属宿主细胞相比，抑制剂多肽的水平增加；和(b)回收所述异源多肽。用于控制P印C抑制剂表达的特别合适的启动子是从下列酶的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片镰孢Daria(W000/56900)、镶片镰孢Quinn(W000/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。为了将上清中P印C失活而需要的P印C抑制剂的确切水平可以不同。技术人员了解如何选择合适的启动子并如本文所述测定P印C活性。当目的异源多肽由P印C降解时，技术人员能测试可用的启动子，以找到提供必需抑制的表达水平。这可以依赖于目的多肽和生长条件而不同。在具体的实施方案中，异源多肽是抗体。具体地，抗体是IgG，更具体为IgGl。在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzymeassay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden编)。实施例材料与方法材料菌株大肠杆菌DB6507(ATCC35673)米曲霉NBRC4177(IF04177)可由Instituteforfermentation,Osaka；17_25JusoHammachi2-ChomeYodogawa-Ku,Osaka,Japan获得。JaL507在W020060211089，实施例2中描述。JaL601在实施例3中描述。JaL909在实施例5中描述。JaL940在实施例7中描述。JaL942在实施例7中描述。PM-8在W02001051646实施例7中描述JaLl182在实施例12中描述。JaLl157和JaLl158在实施例13中描述。基因pyrG该基因编码乳清苷_5’-磷酸脱羧酶，这个酶与尿苷的生物合成有关。niaD:该基因编码硝酸还原酶，这个酶与硝酸(盐)的代谢有关。V039蛋白在W02006069290实施例4表5中描述。这是由微小根毛霉(Rhizomucurpusillus)α-淀粉酶催化域、黑曲霉淀粉葡糖苷酶接头序列和碳结合模块(CBM)组成的融合蛋白。此外，专利W08901969权利要求17中所述的黑曲霉α-淀粉酶信号用作信号序列。表达构建体pHUda667的完整序列，及其中个体元件的解释在实施例11中描述。质粒pJaL485在专利W02003008575实施例3中描述。pJaL1030在实施例6中描述。pJaL1035在实施例2中描述。pJaL790在W02005070962实施例1中描述。pNZ-3在W02005070962实施例2中描述。pNZ-4在W02005070962实施例3中描述。ρJaLlOOO在实施例8中描述。pHUda737在实施例9中描述。pHUda753在实施例10中描述。pHUda667在实施例11中描述。质粒与DNA序列ESTZY029357(SEQIDNO1)ESTZY097797(SEQIDNO2)ESTZY106022(SEQIDNO3)AAZY029357(SEQIDNO4)AAZY097797(SEQIDNO5)AAZY106022(SEQIDNO6)引物ZY106022_b(SEQIDNO7)引物ZY106022_c(SEQIDNO8)ZY106022DNA(SEQIDNO9)IgGl氨基酸(SEQIDNO:10)引物8653(SEQIDNO11)引物FG_30(SEQIDNO12)引物FG_31(SEQIDNO13)引物8654(SEQIDNO14)IgGlDNA(SEQIDNO15)引物ZY106022_d(SEQIDNO16)ZY106022基因组DNA(SEQIDNO17)引物opyrGF(SEQIDNO18)引物opyrGR(SEQIDNO19)pHUda667(SEQIDNO20)方法PCR、克隆、连接核苷酸等常用方法为本领域技术人员所熟知，并且可以在例如"Molecularcloning:Alaboratorymanual，，，Sambrook等(1989),ColdSpringHarborlab.,ColdSpringHarbor,NY；Ausube1,F.M等(编)；“Currentprotoco1sinMolecularBiology”，JohnWiley和Sons，(1995)；Harwood,C.R.和Cutting，S.M.(编)；"DNACloning:APracticalApproach,VolumesIandII",D.N.Glovered.(1985)；"OligonucleotideSynthesis",M.J.Gait编(1984)；"NucleicAcidHybridization",B-D-HiimesfeHHigginsII(1985)；"APracticalGuideToMolecularCloning",B.Perbal，(1984)中找到。DNA杂交简而言之，所有DNA杂交在5XDenhart溶液，5xSSC、0.02MEDTAU%SDS,0.15mg/ml多聚ARNA和0.05mg/ml酵母tRNA的标准杂交缓冲液中在65°C进行16小时。杂交后，将滤膜在2XSSC加0.SDS中在65°C洗涤两次，并暴露于X-射线片。PCR扩增所有PCR扩增在100微升体积中进行，其中在反应缓冲液中包含2.5单位Taq聚合酶，IOOngpS02，250nM各种dNTP，和IOpmol上述两种引物中的每一种，反应缓冲液为50mMKClUOmMTris-HClρΗ8.0，1.5mMMgC12。扩增在Perkin-ElmerCetusDNATermal480中进行，由下述组成94°C3分钟的一个循环，之后为94°C1分钟，55°C30秒和72°C1分钟的25个循环。曲霉属转化如Christensen等；Biotechnology1988，61419-1422所述进行曲霉属转化。简言之，米曲霉菌丝在富营养培养液中生长。通过过滤从培养液分离菌丝体。向渗透压稳定缓冲液中的菌丝体加入50mgβ-葡聚糖酶(GLUCANEXTM，NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)，所述缓冲液如用磷酸钠缓冲至ρΗ5.O的1.2MMgSO40在37°C搅拌温育悬浮液60分钟。通过mira-cloth滤布过滤原生质体，去除菌丝体碎片。收获原生质体并用STC(1.2M山梨醇，IOmMCaCl2,IOmMTris-HClρΗ7.5)洗涤两次。最后将原生质体重悬于200-1000微升STC中。为了进行转化，向100微升原生质体悬浮液中加入5微克DNA，然后加入200微升PEG溶液(60%PEG4000,IOmMCaCl2,IOmMTris-HClρΗ7.5)，并在室温温育混合物20分钟。收获原生质体并用1.2M山梨醇洗涤两次。最后将原生质体重悬于200微升1.2M山梨醇中。根据在基本平板上使用硝酸盐为唯一氮源的能力选择包含完整niaD基因的转化子(CoveD.J.1966.Biochem.Biophys.Acta.113:51_56)，所述平板包含1.OM蔗糖为碳源，IOmM硝酸钠为氮源。在37°C生长4-5天后，稳定的转化子表现为生长旺盛并萌发孢子的菌落。通过分生孢子将转化子纯化两次。LB脱脂乳琼脂平板为包含脱脂乳(Difco232100)和1.5%细菌用琼脂的LB-培养基。通过径向扩散进行蛋白酶抑制剂测试将待分析的样品(20μ1)载入LB脱脂乳琼脂平板上的钻孔中。在37°C温育平板20小时。然后测定晕圈(halo)。包含PepC蛋白酶的发酵培养液包含P印C蛋白酶的发酵培养液如W02005070962，实施例15，发酵方法J3所述制备。用于测定完整人I甙的ELISA使用ELISA测定完整IgG，所述方法使用羊抗人IgG(Fe特异性)作为捕获抗体，与碱性磷酸酶缀合的羊抗人kappa链作为检测抗体。使用纯化自人细胞质的人骨髓瘤IgGl，kappa作为标准。ELISA过程为标准规程。21抗体稳定件测试在室温温育发酵培养液24小时，并通过ELISA测定完整抗体。培养基和试剂Cove-N342.3g/L蔗糖，20ml/LCOVE盐溶液，3g/LNaNO3,30g/Lnoble琼脂。COVE盐溶液每升26gKCl、26gMgSO4·7H20、76gKH2PO4和50mlCOVE痕量金属。Cove痕量金属每升0.04gNa2B4O7·10Η20、0·4gCuS04·5Η20、1·2gFeSO4·7Η20、0·7gMnSO4·H20,0.7gNa2MoO2·2H20和0.7gZnSO4·7H20。YPG:4g/L酵母提取物，lg/LKH2PO4,0.5g/LMgS04_7H20，5g/L葡萄糖，pH6.0。STC:0.8M山梨醇，25mMTrispH8,25mMCaCl20STPC:STC缓冲液中的40%PEG4000。Cove-N顶层琼脂糖342.3g/L蔗糖，20ml/LCOVE盐溶液，3g/LNaNO3,lOg/L低熔点琼脂糖。MLC(葡萄糖40g/L，大豆粉50g/L，柠檬酸4g/L，pH5.0)。MU-I(麦芽糊精260g/L，MgSO4.7H203g/L，K2SO46g/L，KH2PO45g/L，痕量金属溶液0.5m/L，脲2%(w/v),pH4.5)。实施例1米曲霉DeoC抑制剂的鉴定用酿酒酵母蛋白酶yscB抑制剂(PBI2)氨基酸(aa)序列(UNIPR0T:P01095)对米曲霉EST数据库进行tBLASTn搜索，将三个不同的EST鉴定为酵母yscB抑制剂推定的同源物。三个EST，ZY029357(SEQIDNO1)、ZY097797(SEQIDNO2)和ZY106022(SEQIDNO:3)分别是长70aa(SEQIDNO:4)、71aa(SEQIDNO5)和89aa(SEQIDNO6)的编码蛋白。同源性示于表1中。表1%相同位置(X)%共有位置比较3个米曲霉EST，表明ZY106022根据signalP(BendtsenJD,NielsenH,vonHeijneG禾口BrunakS(2004)Improvedpredictionofsignalpeptides-SignalP3.0.J.Mol.Biol.，340783-795)，在23个氨基酸(SEQIDNO4中的位置1-23)上具有推定的信号序列。这表明分泌了蛋白(抑制剂)。对于其它两个推定的抑制剂，没有发现信号序列，表明它们位于胞内。实施例2用于ZY106022p.TaL1035的曲霉属表汰盒的构津以如下方法构建曲霉属表达盒pJaL1035，其适合在黑曲霉中性淀粉酶启动子(NA2)和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子的控制下表达目的基因，并且具有米曲霉niaD基因的截短型3’部分，其允许与只具有niaD基因的5’部分的曲霉属niaD突变体发生单交换事件，由此产生完整的niaD，用于在硝酸盐上生长的筛选(可与GomiK，IimuraY和HaraS(1987)IntegrativetransformationofAspergillusoryzaewithaplasmidcontainingtheAspergillusnidulansargBgene.Agric.Boil.Chem.51:2549_2555中所述可比的系统)。通过PCR，用米曲霉基因组DNA为模板，使用引物ZY106022-b(SEQIDNO7)和ZY106022-c(SEQIDNO8)扩增719bp片段。这用BamHI和XhoI消化，得到715bp片段(SEQIDNO9)。将715BamHI-XhoI片段克隆入pJaL485的BamHI-SalI位点，得到质粒pJaL1035。实施例3DyrG阴件米曲霉菌株TaL601的构津为了去除位于米曲霉菌株JaL507中碱性蛋白酶基因中的缺陷pyrG基因，进行下述步骤根据对5-氟-乳清酸(FOA)的抗性筛选米曲霉菌株JaL507，在补加1.0M蔗糖作为碳源，IOmM硝酸钠作为氮源和0.5mg/mlFOA的基本平板(CoveD.J.1966.Biochem.Biophys.Acta.113:51_56)上鉴定自发的pyrG突变体。将一株菌株JaL601鉴定为pyrG阴性。JaL601为尿苷依赖型，因此能用野生型pyrG基因转化，并且通过在缺少尿苷时生长的能力筛选转化子。实施例4ZY106022在米曲霉中的表达如方法部分所述，用表达质粒pJaL1035转化菌株JaL601。用来自10个转化子和母体菌株JaL601的孢子接种含10mlYPM培养基(2g/l酵母提取物，2g/l蛋白胨和2%麦芽糖)的摇瓶，并在30°C，200rpm温育4天。实施例5通过抑制PepC蛋白酶进行抑制剂ZY106022表达的检测通过在脱脂乳琼脂平板上ρ印C蛋白酶不产生晕圈或产生更小的晕圈，检测推定的P印C蛋白酶抑制剂的表达。如下进行蛋白酶抑制剂测试将10μ1PepC发酵培养液与来自由pJaL1035表达P印C抑制剂的转化子的10μ1上清混合(参见实施例4)，并且作为对照，将10μ1P印C发酵培养液与ομ1发酵培养液(YPM培养基)混合。在室温进行30分钟温育。将20μ1载入LB脱脂乳琼脂平板的钻孔中。平板在37°C温育20小时。然后测定晕圈。这些结果显示，ZY106022是米曲霉P印C抑制剂。选择一个可产生足够的抑制剂ZY106022而见不到晕圈的转化子(JaL909)进行进一步的实验。实施例6天然IgGl重链曲霉属表达质粒p.TaL1030的构建修饰人IgGl重链氨基酸序列SEQIDNO10，使位置236处的精氨酸通过SOEPCE改变成赖氨酸。使用质粒PNZ-3作为模板，使用正向引物8653(SEQIDNO=Il)和反向引物FG-30(SEQIDNO12)，通过PCR扩增第一序列，可产生805bp产物。使用质粒pNZ_3作为模板，使用正向引物re-31(SEQIDNO13)和反向引物8654(SEQIDNO14)，通过PCR扩增第二序列，可产生795bp产物。混合两个PCR片段，并使用正向引物8653和反向引物8654进行第三次PCR，可产生1600bp产物。纯化1600bp的PCR产物，并用限制性内切酶BamHI和XhoI剪切。将得到的1419bp片段(SEQIDNO15)克隆进pJaL790的相应位点中以产生pJaL1030。pJaL1030中插入的序列通过测序验证。实施例7IgGl抗体在米曲霉菌株TaL909中的表汰以一比一的比例用表达质粒pJaL1030和NZ-4，如Christensen等；Biotechnology198861419-1422所述转化米曲霉菌株JaL909。用来自产生的转化子和宿主JaL909的孢子接种包含IOmlYPM培养基(2g/l酵母提取物，2g/l蛋白胨和2%麦芽糖)的摇瓶，并在30°C震荡(200rpm)温育4天。如方法部分所述描述通过ELISA在上清中筛选完整IgGl。选择两个名为JaL940和JaL942的转化子进行实验室-发酵罐发酵。如W02005070962，实施例15，方法J3中所述进行发酵。如方法部分所述，在脱脂乳琼脂平板上检查来自发酵物最后一部分的样品的蛋白酶活性。结果显示，JaL940展示的晕圈和对照一样大小，而JaL942则没有见到晕圈，与母体菌株JaL909相似。这表明JaL940已经丢失了抑制剂ZY106022的基因拷贝。使用Southern印迹证实这一结果。印迹结果显示，JaL909在niaD基因座具有多于一个整合拷贝，并且JaL942保留了这一基因数目，而JaL940只保留了一个拷贝。来自菌株JaL942、JaL940和表达抗体的对照菌株JaL601的完整抗体的稳定性分别为100%、50%和50%。实施例8用于ZY106022p.TaLlOOO的曲霉属表达盒的构建以如下方法构建曲霉属表达盒pJaLlOOO，其适合在黑曲霉中性淀粉酶启动子(NA2)和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子的控制下表达目的基因，并且具有构巢曲霉amdS基因，其用于选择曲霉属中的转化子。用米曲霉基因组DNA为模板，使用引物ZY106022-b(SEQIDNO7)和ZY106022-d(SEQIDNO16)通过PCR扩增487bp片段。用BamHI和XhoI消化PCR产物，得到481bp片段(SEQIDN0:17)。将481bpBamHI-XhoI片段克隆进入pJaL790的BamHI-SalI位点，得到质粒pJaLlOOO。实施例9构建pHUda737表达载体质粒pHUda737包含表达盒，其基于与构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译前导序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Na2/tpi启动子)和黑曲霉淀粉转葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，来自米曲霉使pyrG缺陷宿主能生长的选择性标记pyrG，和来自酿酒酵母使PyrF缺陷型大肠杆菌菌株DB6507能生长的URA3标记。以下述方式构建曲霉属表达载体pHUda737使用分别引入XbaI和SphI位点的引物opyrGF和opyrGR，扩增米曲霉pryG，其编码乳清苷-5’_磷酸脱羧酶，该酶参与尿苷的生物合成。所述引物根据黑曲霉基因组数据库的核苷酸序列信息而设计。opyrGF:tttctagacccaagccgctgctggaa(SEQIDNO18)opyrGRtttgcatgccgagcgtaaccgctgcctca(SEQIDNO19)用米曲霉IF04177的基因组DNA作为模板，使用opyrGF和opyrGR，用ExpandTMPCR系统(RocheDiagnostics,Japan)进行PCR反应。扩增反应物(50μ1)由IX缓冲液(RocheDiagnostics,Japan)中的Ing模板DNA每μ1，250mM各种dNTP，250ηΜ引物opyrGF，250nM引物opyrGR，0.IUTaq聚合酶每μ1组成。在DNAEnginePTC-200(MJ-Research,Japan)中温育反应物，程序如下94°C2分钟的1个循环；92°C1分钟，55°C1分钟和72°C2分钟的30个循环；72°C10分钟的1个循环；并保持在4°C。使用TAE缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶切除2.5kb的产物条带，并使用QIAquickTM凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.，Valencia,CA)，根据生产商的说明纯化。用XbaI和SphI消化2.5kb扩增的DNA片段，并连接入用XbaI和SphI消化的曲霉属表达盒pJaL790中。使用酿酒酵母URA3基因作为选择性标记，将连接混合物转化入大肠杆菌DB6507(ATCC35673)，产生表达质粒pHUda737。使用QIAprepSpinMinipr印试剂盒(QIAGEN，Chatsworth,CA)，根据生产商的说明回收扩增的质粒。将得到的质粒测序并与公共序列数据库比较，表明克隆编码米曲霉pyrG基因。实施例10PHUda753表达载体的构建构建表达载体pHUda753，用于来自米曲霉的蛋白酶抑制剂基因的转录。用BamHI和XhoI消化携带蛋白酶抑制剂的质粒pJaLlOOO。将481bp片段凝胶纯化并连接入用BamHI和XhoI消化的曲霉属表达盒pHUda737中。使用酿酒酵母URA3基因作为选择性标记，将连接混合物转化入大肠杆菌DB6507(ATCC35673)，以产生表达质粒pHUda753。使用QIAprepSpinMiniprep试剂盒(QIAGEN，Chatsworth,CA)，根据生产商的说明回收扩增的质粒。质粒pHUda753包括表达盒，其基于与构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译前导序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Na2/tpi启动子)和黑曲霉淀粉转葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，来自米曲霉可使pyrG缺陷突变体生长的选择性标记pyrG，和来自酿酒酵母可使PyrF缺陷大肠杆菌菌株DB6507生长的URA3标记。实施例11用于表达V039蛋白的曲霉属质粒pHUda667的说明为了表达和分泌蛋白V039，黑曲霉α-淀粉酶信号与V039融合。然后将基因克隆入曲霉属表达盒pJaL790，产生质粒pHUda667(SEQIDNO:20)。序列中的不同元件在下面的表2中描述。质粒PHUda667是表达盒，其基于与构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译前导序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Na2/tpi启动子)和黑曲霉淀粉转葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，来自构巢曲霉可以以乙酰胺(aceteamid)作为唯一氮源生长的选择性标记amdS，和来自酿酒酵母可使pyrF缺陷大肠杆菌菌株DB6507生长的URA3标记。25表2Pna2是来自黑曲霉的经过修饰的中性淀粉酶II启动子。tpi是构巢曲霉丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子的5’非翻译区。AA是微小根毛霉α-淀粉酶。Tamg是黑曲霉的淀粉转葡糖苷酶终止子。pUC19是包括复制起点的PUC19载体的片段。复制起始位点的起点(colEl起点)在位置7357。amdS是来自构巢曲霉的乙酰胺基因(包括启动子和终止子)。Pura3、URA3和Tura3分别是酿酒酵母URA3启动子、编码序列和终止子。实施例12&ΡΜ-8Φ表汰α-浦隨隨CBM艦舶隱隨纖白_聿如方法中所述用质粒pHUda667转化黑曲霉菌株ΡΜ-8，方法进行如下修改用IOmM乙酰胺代替硝酸钠，用于选择能使用乙酰胺作为氮源的转化子，并向选择平板加入20mM尿苷，用于补足PM-8的pyrG阴性基因型。选择一个可产生α-淀粉酶CBM融合蛋白的转化子，并命名为JaL1182。实施例13自雜_舶__細白腫汰禾口α-浦ISCBM艦舶HffiSΡΜ-8如方法中所述用质粒pHUda667和pHUda753转化黑曲霉菌株PM_8，方法进行如下修改用IOmM乙酰胺代替硝酸钠，用于选择能使用乙酰胺作为氮源的转化子。选择两个可产生α-淀粉酶CBM融合蛋白和米曲霉抑制剂的转化子，并命名为JaL1157和1158。实施例14曲霉属菌株TaLl157、TaLl158和TaLl182中α-淀粉酶CBM融合蛋白的稳定件将菌株JaL1157、JaL1158和JaL1182接种入100mlMLC培养基中并在30°C温育2天。将十毫升MLC培养基接种入100mlMU-1培养基中并在30°C温育7天。通过在3，OOOxg离心10分钟而获得上清。通过加入几滴0.05MNaOH使上清的pH升高至pH6.5-7.0，并在40°C温育7天。对温育样品进行SDS-PAGE分析。使用商业化的e-PAGEL凝胶E-T7.5L(ATT0Corporation)进行SDS聚丙烯酰胺电泳。将10μ1温育的样品悬浮于2Χ浓度的样品缓冲液中(1%SDS，1%β-巯基乙醇，Img/ml溴酚蓝，10%甘油，50mMTris-HCl{pH6.8})并煮沸5分钟。将所有样品载入到聚丙烯酰胺凝胶上，并在IXTrix/甘氨酸/SDS电泳缓冲液(25mMTris_HCl，0.1%SDS，192mM甘氨酸)中以20mA进行90分钟电泳。用染料溶液(lg/L考马斯亮蓝，10%乙酸，30%甲醇)将得到的凝胶染色30分钟，然后用脱色溶液(10%乙酸，30%甲醇)脱色，直至条带清晰可见。对凝胶的观察显示，在不产生额外的ρ印C抑制剂的菌株JaL1182中，分别对应于α-淀粉酶和CBM的降解产物清晰可见，而在菌株JaL1157和JaL1158中，观察到的降解非常少。权利要求具有PepC抑制活性的分离的多肽，其选自下组(a)多肽，其包含与SEQIDNO6的成熟多肽具有至少85％，优选至少90％，并且最优选至少95％同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由在优选至少高严紧条件下与以下序列杂交的多核苷酸编码(i)SEQIDNO17的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQIDNO17中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由下述多核苷酸编码所述多核苷酸包含与SEQIDNO17的成熟多肽编码序列具有优选至少至少85％，更优选至少90％，并且最优选至少95％同一性的核苷酸序列；(d)变体，包含取代、缺失和/或插入一个或几个氨基酸的SEQIDNO6的成熟多肽。2.权利要求1的多肽，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或其具有P印C抑制活性的片段，或由SEQIDNO:6的氨基酸序列或其具有P印C抑制活性的片段组成。3.权利要求2的多肽，其包含SEQIDNO6的成熟多肽或由SEQIDNO6的成熟多肽组成。4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:6的氨基酸18至89。5.用于在曲霉属(Aspergillus)宿主细胞中产生目的异源多肽的方法，其包括(a)在有益于表达由第一和第二核酸序列编码的多肽的条件下培养曲霉属宿主细胞，所述细胞包含所述第一和第二核酸序列，并且其中第一核酸序列编码目的异源多肽，而第二核酸编码权利要求1-4的抑制剂多肽，并且其中抑制剂多肽由重组核酸构建体表达，导致与不包含所述重组核酸构建体的曲霉属宿主细胞相比，抑制剂多肽的水平增加；和(b)回收所述异源多肽。6.根据权利要求5的方法，其中所述曲霉属宿主包括泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、棘抱(Aspergillusaculeatus)>HftI^JHftβ(Aspergillusnidulans)(Aspergillusoryzae)。7.根据权利要求5-6中任一项的方法，其中由所述重组核酸构建体表达所述抑制剂受到组成型启动子的控制。8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其中所述异源多肽是抗体，优选IgG。9.权利要求1-4中任一项的多肽用于枯草杆菌蛋白酶类型的丝氨酸蛋白酶的体外或体内抑制的用途。10.根据权利要求9的用途，其中所述丝氨酸蛋白酶选自下组P印C和P印D，或它们的同源物。全文摘要本发明涉及具有PepC抑制活性的分离的多肽以及用于在曲霉属宿主细胞中产生目的异源多肽的方法，包括(a)在有益于表达由第一和第二核酸序列编码的多肽的条件下培养包含所述第一和第二核酸序列的曲霉属宿主细胞，并且其中第一核酸序列编码目的异源多肽，而第二核酸编码本发明的抑制剂多肽，并且其中抑制剂多肽由重组核酸构建体表达，所述核酸构建体可使与不包含重组核酸构建体的曲霉属宿主细胞相比，抑制剂多肽的水平增加；和(b)回收所述异源多肽。文档编号C07K14/38GK101889020SQ200880119501公开日2010年11月17日申请日期2008年12月2日优先权日2007年12月6日发明者宇田川裕晃,简·莱姆贝克申请人:诺维信公司