猪DC-SIGN、ICAM-3和LSECtin及其用途的制作方法

专利名称：猪DC-SIGN、ICAM-3和LSECtin及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于各种猪单核细胞来源的树突和肝细胞的新型猪DC-SIGN和猪 LSECtin基因、cDNA、猪DC-SIGN和猪LSECtin蛋白、稳定表达所述新型蛋白的转染细胞或细 胞系、融合产物、抗体、分离和克隆所述猪基因的方法及所述猪蛋白用于繁殖病毒的用途。 本发明还提供了编码从猪单核细胞来源的树突细胞新发现的猪ICAM-3同种型的核苷酸序 列。相关技术描述本说明书中引用的所有专利和公开物的全部内容通过引用结合于本文中。树突细胞(DC)是遍布外周免疫系统的专门性抗原呈递细胞(APC)。侵入性外源抗 原引发未成熟DC从血液向组织迁移，它们在所述组织处检测并捕获所述抗原(K. Palucka 禾口 J· Banchereau，〃Dendritic cell -.a link between innate andadaptive immunity ( M 突细胞天然免疫和获得性免疫之间的连接)，“J. Clin. Immunol. 19 :12-25 (1999))。激 活的DC通过MHC分子将捕获的蛋白加工成免疫原性肽(称为MHC分子或主要组织相容性 复合体的一组膜糖蛋白)并呈递给T细胞。通过DC识别侵入性病原体受到模式识别受 体(PRR)包括 iToll 样受体(TLR)和凝集素介导(S. Thoma-Uszynski 等人，"Induction of directantimicrobial activity through mammalian toll-like receptors (通过口甫季L动 物的toll样受体诱导直接抗微生物活性)，“Science 291 :1544-1547(2001) ；W. I. Weis 等人，“The C-type lectin superfamily in the immune system(免疫系统中的 C-型 凝集素超家族)，“Immunol. Rev. 163 19-34 (1998))。在DC表面表达的凝集素是钙依赖 性C-型凝集素受体(CLR)家族中的成员并在抗原捕获和DC内在化中起关键作用(Weis等 人，1998，出处同上)。CLR也在其它APC，包括巨噬细胞上表达。CLR家族包括通过以钙依赖性方式结合到糖蛋白配体上的多糖链上进行蛋白-糖 相互作用的大量蛋白。许多CLR属于在APC表面表达的PRR，它们能识别外源病原体，在宿 主免疫应答中起关键作用。II型CLR根据它们位于细胞胞质内的NH2末端结构域-胞质尾 区(CT)分类。其它II型CLR结构域包括在CT后的跨膜结构域(TMD)、在暴露于细胞外的 羧基末端处单糖识别结构域(CRD)和在TMD和CRD之间的颈结构域。II型CLR的人凝集素基因簇，位于人染色体19pl3. 3处的⑶23/LSECtin/DC-SIGN/L-SIGN,越来越引起了 人们的关注。人 DC-SIGN、hL-SIGN 和 hLSECtin,它 们具有类似的基因组结构(W.Liu等人，“Characterization of a novel C-type lectin-like gene, LSECtin :demonstrationof carbohydrate binding and expression in sinusoidal endothelial cells of liverand lymph node ( 一禾中新型 C 型 基因LSECtin的表征糖结合的展示及在肝和淋巴结的窦状内皮细胞内的表达)，“J. Biol. Chem. 279 18748-58 (2004))，是能介导病原体识别的重要C-型凝集素。人 CD23(FCER2)是低亲和力的IgE受体，其在细胞-细胞粘附、B细胞存活和抗原呈递中起 重要作用。树突细胞特异性细胞间粘附分子-3(" ICAM-3")结合非整合素(人⑶209， 也称为‘‘DC-SIGN”，一种44kDa的II型跨膜蛋白)，一种CLR,被确定为介导DC和T细胞 相互作用的 ICAM-3 结合蛋白(T. B. Geijtenbeek 等人，“Identificationof DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3receptor that supportsprimary immune responses (DC-SIGN- 一种支持初次免疫应答的新型树突细胞特异性ICAM-3受体的鉴 定)，“Cell 100 :575-5850000))和介导HIV-I传播到反式易感细胞的HIV-lgpl20 受体(Τ· B. Geijtenbeek 等人，“DC-SIGN，a dendriticcell-specific HlV-l-binding protein that enhances trans-infection of Tcells (DC-SIGN, 一 种增强 T 细胞转 染的树突细胞特异性HIV-I结合蛋白)，“CelllOO :587-597(2000)).此外，发现 DC-SIGN与ICAM-2结合蛋白相互作用，调节趋化因子诱导的跨越休止和激活内皮的DC 运输 T. B. Geijtenbeek 等人，“DC-SIGN-ICAM_2interaction mediates dendritic celltrafficking(DC-SIGN-ICAM-2 相互作用介导树突细胞运输)，“Nat. Immunol. 1 353-357(2000)) ο 第 二种人 DC-SIGN (hDC-SIGN)同源体 hL_SIGN(CD209L)或 DC-SIGNR 随后得以确认并显示出具有与hDC-SIGN类似的作用，但病原体识别性能稍微不同 (A. A. Bashirova等人，“A dendritic eel 1-specificintercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin(DC-SIGN)-relatedprotein is highly expressed on human liver sinusoidal endothelial cells andpromotes HIV-Iinfection(树突细胞特异性细 胞间粘附分子-3结合非整合素(DC-SIGN)相关蛋白在人肝窦状内皮细胞上高度表达且促 进 HIV-I 感染)，“J. Exp. Med. 193 :671-678 (2001)) 人DC-SIGN在体外主要在单核细胞来源的人DC上表达，在体内主要在正常人淋巴 结、真皮、粘膜和脾内的未成熟和成熟DC和肺泡内巨噬细胞上表达(T. B. Geijtenbeek等 人’ “Identification of DC-SIGN,a novel dendriticcell-specific ICAM_3receptor that supports primary immune responses (DC-SIGN- —iSiS^ WflMW 突细胞特异性 ICAM-3 受体的鉴定)，“Cell 100 :575-585 (2000) ；Τ. B. Geijtenbeek 等 人’ “DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-l-binding protein that enhances trahs-infection of !"cells (DC-SIGN : —种增强T细胞转染的树突细胞特异性HIV-1结 合蛋白)，“CelllOO :587-597^000) ;L. Tailleux 等人，“DC-SIGN induction in alveolarmacrophages defines privileged target host cells for mycobacteria in patientswith tuberculosis (肺泡巨噬细胞中的DC-SIGN诱导为肺结核患者内 的分支杆菌定义了特定靶宿主细胞)，“PLoS Med. 2 :e381 (2005) ;E.J. Soilleux等 人’ “Constitutive and induced expression of DC-SIGN on dendritic cell andmacrophage subpopulations in situ and in vitro (DC—SIGN 在丰对突细胞禾口巨 1 细胞亚群的原位和体外组成性和诱导表达)，“J. Leukoc. Biol. 71 :445-457 (2002))，而L-SIGN 在肝和淋巴结的窦状内皮细胞内高度表达(Bashirova等人，2001，出处同上)。已观察到 L-SIGN同源物仅存在于人和非人灵长类内，而在其它非灵长类哺乳动物内不存在。最近，确认了第三种人DC-SIGN相关的C-型凝集素(确定为“CLEC4G”并命名 为"LSECtin")具有类似的病原体识别和抗原捕获特性，它与hL-SIGN在肝和淋巴结 的窦状内皮细胞(LSEC)内共表达(A. Dominguez-Soto 等人，“TheDC-SIGN-related lectin LSECtin mediates antigen capture and pathogenbinding by human myeloid cells (DC-SIGN相关的凝集素LSECtin通过人骨髓细胞介导抗原捕获和病原体结合)〃， Blood 109 :5337-45(2007))。除了 hLSECtin外，其它哺乳动物内的LSECtin同源物还未通 过实验确认，尽管从基因组数据库可检索到有限的基因信息。由于与人在器官大小和生理学上具有相似性，猪被视为异种移植 (Xenotransplantation)的优选源云力物(Y. G. Yang 禾口 M. Sykes, ‘’ Xenotransplantation current status and a perspective on the future (异禾中移植与展望)，“Nat. Rev. Immunol. 7 :519-31 (2007))。理解跨越分子相互作用的人-猪物种屏障的相容性对 于猪-人异种移植的临床应用是非常关键的。猪造血细胞上受体与人内皮细胞上配体 的相互作用在猪造血细胞用于诱导人接受体内的耐受性中起关键作用(A. N. Warrens等 人， “Human-porcinereceptor-ligand compatibility within the immune system relevance forxenotransplantation (免疫系统内人-猪受体-配体相容性异体移植 的相关性)，“Xenotransplantation 6:75-8(1999))。T-细胞介导的异种移植排异反 应，一种可能由人T细胞对猪抗原比对同种抗原的更强应答诱导引起的现象，也涉及猪 APC如DC与人T细胞之间粘附分子的潜在相互作用(A. Dorling等人，‘‘Detection of primary direct and indirect human anti-porcine T cell responsesusing a porcine dendritic cell population(采用猪树突细胞群检测初次直接和间接人抗猪T细胞应 答)，〃 Eur. J. Immunol. 26 1378-87 (1996) )。DC-SIGN还已经表现为 ICAM-2 和 ICAM-3 的内 在粘着受体(T. B. Geijtenbeek 等人，"Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM_3receptorthat supports primary immune responses(DC-SIGN-一 种支持初次免疫应答的新型树突细胞特异性ICAM-3受体的确认)，“Cell 100 575-5850000)) ;Τ· B. Geijtenbeek 等人， “DC-SIGN-ICAM_2interaction mediates dendritic celltrafficking(DC-SIGN-ICAM_2 相互作用介导树突细胞运输)，“Nat. Immunol. 1 :353-357(2000) ；D. A. Bleijs 等人， “DC-SIGN and LFA-I :a battle foriigand (DC-SIGN 和 LFA-I 为 了配体而争斗)，“Trends Immunol. 22 :457-63 (2001))。猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)，一种在全世界存在的经济学上重要的猪病原体， 是动脉炎病毒科家族套式病毒目下的成员。在全世界范围确认的PRRSV分离株被分成两 个不同的基因型欧洲基因型(第1类)和北美基因型(第2类)，它们导致相同的疾病 症状但是抗原有差异的。就像其它包膜病毒如HIV和HCV—样，PRRSV进入宿主细胞即猪 肺泡巨噬细胞是一个复杂的多步骤过程，涉及几个进入因子的存在，包括唾液酸粘附素、 CD163 禾口石！酸乙酷月干素(P. L. Delputte 等人，“Analysis of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus attachment and internalization -distinctive roles for heparansulphate and sialoadhesin(猪繁殖呼吸综合征病毒附着和内在化分析硫酸乙酰肝素和唾液酸粘附素的不同作用)，〃 J. Gen. Virol. 86 1441-5 (2005))。然而，PRRSV 和猪PRR在APC上的潜在相互作用还未有报道。由于人L-SIGN表现出与SARS-冠状病毒 进入肺有关，猪DC-SIGN/L-SIGN同源物在猪肺PRRSV感染过程中可能起着类似作用，这是 由于PRRSV和冠状病毒都属于套式病毒目，但在做出结论之前需要大量实验。尽管猴肾细胞系(如美国专利6，146，873和其它地方所述)和原始猪肺泡巨噬 细胞(PAM)已成为已知支持繁殖性PRRSV复制的仅两种细胞，其它细胞如BHK-21细胞系 已表现为复制型，即具有支持PRRSV复制的必要能力(H. Nielsen等人，‘‘Generationof an infectious clone of VR-2332,a highly virulentNorth American-type isolate of porcine reproductive and respiratory syndromevirus (VR-2332 感染性克隆体-猪繁 殖呼吸综合征病毒的一种高毒力北美型分离株的产生)"，J.Virol. 77 :3702-11 (2003)； J. J. Meulenberg 等人，“Infectioustranscripts from cloned genome-length cDNA of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus (来自猪繁殖呼吸综合征病毒 的克隆基因组长度cDNA的感染性转录体)，“J. Virol. 72 :380-7 (1998))。例如，当用病 毒RNA或用欧洲株LV或北美株VR-2332的全长基因组cDNA在体外合成的RNA转录体转 染BHK细胞时，在BHK细胞中检测到PRRSV复制迹象。PRRSV病毒体产生并被排泄到介质 中，当转染BHK-21细胞的上清液转移到PRRSV容纳细胞时，观察到致细胞病变效应(CPE)。 遗憾的是，转染的BHK-21细胞中的复制性病毒不会在细胞之间传播，表明BHK-21细胞上 缺乏受体。经报道推定的PRRSV结合受体与肺泡巨噬细胞区别开来，为210-kDa的膜蛋白 (E. H. Wissink等人，"Identification of porcine alveolar macrophage glycoproteins involved ininfection of porcine respiratory and reproductive syndrome virus (与 猪繁殖呼吸综合征病毒感染有关的猪肺泡巨噬细胞糖蛋白的鉴定)，“Arch. Virol. 148 177-87 000 )，但仍缺少病毒进入水平的这种受体候选物的功能验证。最近，已经显示猪 唾液酸粘附素(PSn)介导了 PAM内PRRSV的内化(N. Vanderheijden等人，“hvolvement of sialoadhesin in entry of porcinereproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolarmacrophages (猪唾液酸粘附素参与猪繁殖呼吸综合征病毒进入 猪肺泡巨噬细胞的相关实验)，“J.Virol. 77 (15) :8207-15 (2003))，和pSn是唾液酸结 合凝集素且PRRS病毒体上的唾液酸与pSn之间的相互作用对于PAM的PRRSV感染很重 要(P.L. Delputte 禾口 H.J. Nauwynck, “ porcine arterivirus infection ofalveolar macrophages is mediated by sialic acid on the virus (月市泡巨U·细胞白勺猪动脉炎病 毒感染由病毒上的唾沫酸介导)，“J.Virol. 78(15) :8094-101 (2004))。在人、小鼠和猪 中，唾液酸结合凝集素仅在离散的组织巨噬细胞亚组上表达。已知PRRSV感染猪体内的呼 吸和淋巴系统内的巨噬细胞。由于PRRSV还感染体内的其它单核细胞来源的淋巴细胞，如 树突细胞，且由于PRRSV病毒体的结构非常复杂，多种选择性受体和/或共受体可能存在于 这些细胞上。此外，还未确定易感猴肾细胞上的PPRSV受体。巨噬细胞和树突细胞对于病原体的识别很重要，且在抵抗侵入性病原体的免 疫中起重要作用。人DC-SIGN及相关肝内皮细胞凝集素L-SIGN已经被表征并发现在 树突样细胞表面上大量表达(A. I3Uig-Kroger等人，“Regulatedexpression of the pathogen receptor dendritic cell-specific intercellularadhesion molecule 3(ICAM-3)-grabbing nonintegrin in THP-I humanleukemic cells, monocytes, andmacrophages (病原体受体树突细胞特异性细胞间粘结分子3 (ICAM-3)结合非整合素在 THP-I人白血病细胞、单核细胞和巨噬细胞中的调节表达)，“J.Biol. Chem. 279(24) 25680-8(2004)) ο此外，C型甘露糖结合凝集素hDC-SIGN和hL-SIGN (或DC-SIGNR)已经 由于它们在体外结合和摄取病原体的能力而引起相当关注，所述病原体包括包膜病毒如 HIV、细菌(分支杆菌)、真菌和寄生虫(Y. van Kooyk 和 Τ· B. Gei jtenbeek，“ DC-SIGN escape mechanism for pathogens (DC-SIGN :病原体的逃避机制)，〃 Nat. Rev. Immunol. 3 697-709 Q003))、登革病毒(Ε· Navarro-Sanchez 等人，“Dendritic-cell-specific IC AM3-grabbing non-integrin is essential for theproductive infection of human dendritic cells by mosquito-cell-derived dengueviruses (树突细胞特异性 ICAM3 结 合非整合素对于通过蚊子细胞来源的登革病毒复制性感染人树突细胞很重要)，“EMBO R印.4 (7) :723-8 Q003))、埃博拉病毒(C.P.Alvarez 等人，“Otype lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellularentry by Ebola virus in cis and in trans (C 型凝集 素DC-SIGN和L-SIGN介导顺式和反式埃博拉病毒的细胞进入)，‘‘J. Virol. 76 (13) 6841-4 Q002))、马尔堡病毒(A. Marzi 等人，“DC-SIGN and DC-SIGNR interact with the glycoprotein ofMarburg virus and the S protein of severe acute respiratory syndromecoronavirus (DC-SIGN和DC-SIGNR与马尔堡病毒的糖蛋白和严重急性呼吸综 合征冠状病毒的S蛋白相互作用)“,J.Virol. 78 (21) 12090-5 (2004) )、SARS冠状病 毒(id.)、巨细胞病毒(F. Halary 等人，“Human cytomegalovirus binding toDC-SIGN is required for dendritic cell infection and target celltrans-infection(结 合到DC-SIGN的人巨细胞病毒是树突细胞感染和靶细胞转染所需的)“，Immunity 17(5) :653-64 0002))和丙型肝炎病毒(P. Y. Lozach 等人，“Otype lectins L-SIGN and DC-SIGN capture and transmit infectioushepatitis C virus pseudotype particles (C-型凝集素L-SIGN和DC-SIGN捕获和传送传染性丙型肝炎假病毒颗 粒)〃，J. Biol. Chem. 279(31) :32035-45(2004) ；Ε. G. Cormier 等人，“L-SIGN(CD209L) and DC-SIGN(CD209)mediatetransinfect ion of liver cells by hepatitis C virus (L-SIGN(CD209L)和DC-SIGN (CD209)介导丙型肝炎病毒对肝细胞的转染)〃，Proc. Natl. Acad. Sci. USAlOl :14067-72(2004))以促进进入细胞和感染。hDC-SIGN和hL-SIGN都 包含C型凝集素特异性糖识别结构域(CRD)，所述CRD以钙(Ca2+)依赖性方式牢固结合到广 谱包膜病毒上病毒性包膜糖蛋白内的天冬酰胺酸连接高甘露糖型聚糖(T. B. Geijtenbeek 等人，“Identification of different binding sites in the dendriticcell-specific receptor DC-SIGN for intercellular adhesion molecule 3andHIV_I (树突细胞特异性 受体DC-SIGN内不同细胞间粘附分子3和HIV-I结合位点的确定)，〃 J. Biol. Chem. 277 11314-11320(2002))。因此C-型凝集素将病毒集中在表达DC-SIGN或L-SIGN的细胞上， 促进了病毒结合并进入细胞内。 已报道DC-SIGN结合到HIV gpl20并促进HIV传送到T细胞(J. F. Arrighi 等 人， “ DC-SIGN-mediated infectious synapse formation enhances X4HIV-ltransmission from dendritic cells to T cells (DC-SIGN 介导的传染性突触形 成增强了从树突细胞到T细胞的X4HIV-1传输)〃，J Exp Med. 200(10) :1279-88(2004)； T. B. Gei jtenbeek 等人，“Rhesus macaque and chimpanzee DC-SIGNact as HIV/SIVgpl20trans-receptors, similar to human DC-SIGN(猕猴和黑猩猩 DC-SIGN 作为 HIV/ SIV gpl20 反式受体，类似于人 DC-SIGN)，“ ImmunolLett. 79 :101-7(2001) ；M. Satomi 等人，“Transmission of macrophage-tropicHIV-Iby breast-milk macrophages via DC-SIGN(母乳巨噬细胞通过DC-SIGN传播巨噬细胞热带HIV-I)，" J. Infect. Dis. 191(2) 174-81 (2005) ；Ε· J. Soilleux 等人，"Placental expression of DC-SIGN may mediate intrauterine verticaltransmission of HIV (DC-SIGN 的胎盘表达可介导 HIV 在子宫内 的垂直传播)，“J. Pathol. 195 =586-592 (2001))。DC-SIGN 和 L-SIGN 已表现为丙型肝炎 病毒糖蛋白E2的高亲和力结合载体(P. Y. Lozach等人，“DC-SIGN and L-SIGN arehigh affinity binding receptors for hepatitis C virus glycoprotein E2 (DC-SIGN 禾口 L-SIGN是丙型肝炎病毒糖蛋白E2的高亲和力结合受体)“，J.Biol. Chem. 278 02) 20358-66^)03))，并介导丙型肝炎病毒对肝细胞的转染(Lozach等人，2004，出处同 上；Cormier等人，2004，出处同上)。还发现DC-SIGN介导登革病毒对人树突细胞的感 染(Navarro-Sanchez等人，2003，出处同上)。DC-SIGN和L-SIGN都表现出介导顺式和 反式埃博拉病毒进入细胞(Alvarez等人，2002，出处同上；G. Simmons等人，‘‘DC-SIGN and DC-SIGNR bind Ebolaglycoproteins and enhance infection of macrophages and endothelialcells (DC-SIGN和DC-SIGNR结合埃博拉糖蛋白并提高巨噬细胞和内皮细胞的 感染)，“Virology 305 (1) 115-23 (2003))。其它报道中，已报道大量包膜病毒包括逆 转录病毒(人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV))、黄 病毒科(登革病毒、西尼罗河病毒和丙型肝炎病毒(HCV))、纤丝病毒(埃博拉和马尔堡病 毒)、冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV))、披膜病毒(辛德毕斯病毒) 和疱疹病毒(人巨细胞病毒(人CMV))采用DC-SIGN和/或L-SIGN作为体外加强的传 染的识别和粘附受体(P. Y. Lozach 等人，“The C type lectins DC-SIGN and L-SIGN receptors for viralglycoproteins (C 型凝集素 DC-SIGN 和 L-SIGN 病毒性糖蛋白的受 体)，“Methods MoI. Biol. 379 :51-68 (2007)) DC-SIGN和L-SIGN是同源四聚的II型膜蛋白并能通过C末端糖识别结构域识 别病毒性包膜糖蛋白上的相当大量的N联糖，如含甘露糖的糖结合物和含海藻糖的Lewis 血型抗原(D. A. Mitchell 等人，“A novel mechanism ofcarbohydrate recognition by the C-type lectins DC-SIGN and DC-SIGNR. Subunit organization and bindingto multivalent ligands (通过C型凝集素DC-SIGN和DC-SIGNR识别糖的新机理，亚基 组织并结合到多价配体)，“J. Biol. Chem. 276 :28939-28945 (2001) ；H. Feinberg 等 人， “ Structural basis forselective recognition of oligosaccharides by DC-SIGN and DC-SIGNR(通过DC-SIGN和DC-SIGNR选择性地识别低聚糖的结构基础)“， Science294 :2163-2166 (2001))。根据计算机预测，PRRSV病毒体膜上的四种糖蛋白中， GP2a.GP3.GP4和GP5分别包含2_7个N-糖基化位点。葡萄糖内酯酶处理表明所有推定位 点都被复合型氮聚糖占据(Meulenberg等人，1998，出处同上)。这些观察表明DC-SIGN/ L-SIGN可与PRRSV病毒体上的一个或多个糖蛋白相互作用，从而介导PRRSV进入和内吞作 用。DC-SIGN在DC和一些类型的巨噬细胞上表达，它们都是PRRSV复制的重要目标。发现 L-SIGN在窦状内皮细胞和胎盘巨噬细胞上表达。发现DC-SIGN的胎盘表达介导HIV的子宫 内垂直传播(Soilleux等人，2001，出处同上)。巧合的是，已知PRRSV在妊娠母猪内导致严重的繁殖系统疾病。SARS冠状病毒(和动脉炎病毒家族一起属于冠状病毒家族的尼多病毒目，其中 PRRSV是动脉炎病毒家族中的一员)也在病毒感染和发病过程中表现出利用S糖蛋白来 结合 DC-SIGN 和 L-SIGN (Marzi 等人，2004，出处同上；Z.Y.Yang 等人，“ρΗ-d 印 endent entry of severe acute respiratory syndromecoronavirus is mediated by the spike glycoprotein and enhanced by dendriticcell transfer through DC-SIGN(严重急性呼 吸综合征冠状病毒的PH依赖性进入由刺突糖蛋白介导并被树突细胞传送通过DC-SIGN增 强)，"J.Virol. 78(11) :5642-50 (2004))。尽管PRRSV和冠状病毒属于同一超家族，需要 进一步的测试来确定PRRSV是否同样地采用DC-SIGN或L-SIGN来感染和发病。最新研究报道了尼帕病毒表面糖蛋白(NiV-G)能结合hLSECtin，而hLSECtin是 尼帕病毒表面糖蛋白(NiV-G)的推定受体(T. A. Bowden等人，“Crystal Structure and Carbohydrate Analysis of Nipah Virus AttachmentGlycoprotein :A Template for Antiviral and Vaccine Design(尼帕病毒附着糖蛋白的晶体结构和糖分析抗病毒和疫 苗设计的模板)，"J.Virol, in press 2008)。所述相互作用由NiV-G中的GlcNAc β l_2Man 末端结构介导。埃博拉病毒的膜表面糖蛋白(截短聚糖)及严重急性呼吸综合征冠状病 毒的刺突蛋白(SARS-CoV)携带这些糖基序且被hLSECtin独特地识别(T. Gramberg等 人， “LSECtininteracts with filovirus glycoproteins and the spike protein of SARScoronavirus(LSECtin与丝状病毒糖蛋白和SARS冠状病毒的刺突蛋白相互作 用)，“Virology 340(2) :224-36 (2005)) 与 hDC-SIGN 和 hL-SIGN 不同，hLSECtin 选择 性地结合到终止于二糖GlcNAcii l-2Man中的糖蛋白。此外，DC-SIGN和L-SIGN被认为是人内基因组水平的两种独立基因。由于保守序 列，它们可能具有类似但不同的作用，如已有的DC-SIGN/L-SIGN人体研究中所示。然而， L-SIGN的生物或生理功能局限于肝(L-SIGN的mRNA仅在肝内表达)而DC-SIGN在全身内 树突细胞中起作用。已经公开了关于人C-型凝集素和人DC-SIGN的其它相关技术。例如，美国专利 6，190，886 (Hoppe等人)描述了包括人SP-D的胶原凝集素(collectin) C-型凝集素结构域 和从被诱导表达重组蛋白的细菌培养基的分解产物提纯的颈区凝集素结构域的一种多肽， 其中所述多肽能在胶原凝集素颈区三聚。三聚多肽的建议用途是接种胶原形成，作为受体 特别是低亲和力结合受体(例如神经肽、白细胞介素)、抗原、激活后具有反应性的化合物 如光活化化学交联剂、有机化合物如咖啡因和吗啡、低亲和力结合结构域的肽配体，特别用 于在药学研究中筛选潜在抑制剂等。美国专利6，455，683 (Yang等人)描述了编码人C-型凝集素和称为“CLAX”(C_型 凝集素，激活表达)蛋白的三种同源物的独立cDNA序列。该专利公开了使用核酸序列、多 肽、具有人CLAX蛋白全部或部分(如胞外区)的融合蛋白、CLAX特异性的抗体、人CLAX的 配体和抑制剂的方法。提出包含所述蛋白的药物组合物可用于预防和治疗感染、炎症和过 敏疾病。美国专利6，280, 953 (Messier等人)提供了鉴定人和/或非人灵长类动物内多核 苷酸和多肽序列的方法，所述多核苷酸和多肽序列可能与生理条件如疾病包括对AIDS发 展的易感性(人)或耐受性(黑猩猩)有关。生理特性包括对AIDS发展的耐受性；多核苷酸可为人DC-SIGN基因；而调节作用是随后提高的对AIDS发展的耐受性。提出该序列可用 作宿主治疗靶点和/或用于筛选分析。美国专利6，365，156 (Lee)涉及延长待给药的病毒特异性配体在粘膜上的半衰期 的方法，其中所述膜用细菌如乳酸菌(Lactobacillus)、链球菌(Str印tococcus)、葡萄状 球菌(Staphylococcus)、乳酸乳球菌(Lactococcus)、球菌类杆菌(Bactericides)、芽孢杆 菌(Bacillus)和奈瑟菌(Neisseria)形成菌落，所述方法通过修饰所述细胞特异性配体以 结合粘膜上形成菌落的细菌来进行。该专利还公开了包含病毒特异性配体如CD4、DC-SIGN、 ICAM-l、HveA、HveC、脊髓灰质炎病毒受体、玻连蛋白受体、⑶21或IgA受体序列和细菌特异 性配体如抗体、肽、多肽、蛋白或糖的嵌合分子。美国专利6，391，567 (Littman等人)涉及作为受体的人DC-SIGN，其在树突细胞 上特异性表达并促进人免疫缺陷病毒(HIV)对T淋巴细胞的感染。该专利提供了鉴定调节 DC-SIGN和HIV和/或T细胞和巨噬细胞之间相互作用的化合物的分析，其中所述化合物抑 制HIV进入细胞的反式增强。美国专利7，148，329 (Figdor等人)涉及甘露糖、海藻糖、植物凝集素、抗生素、蛋 白或抵抗C-型凝集素的抗体(所述抗体结合到树突细胞表面上的C-型凝集素上)在制备 用于通过调节树突细胞表面上的C-型凝集素受体对T细胞表面上的ICAM受体的粘合力来 调节免疫应答的组合物中的用途。该专利公开了抑制树突细胞和T细胞之间即树突细胞表 面上的DC-SIGN和T细胞表面上的ICAM-3受体之间的结合的抗体。提出将所述组合物用 于预防/抑制对特异性抗原的免疫应答、用于诱导耐受性、用于免疫疗法、用于免疫抑制、 用于治疗自身免疫疾病、用于治疗过敏和/或用于抑制HIV感染。 如上所述，作为免疫超家族的一部分的DC-SIGN与ICAM-3之间存在生物学 关系。细胞间粘附分子(ICAM)是属于免疫球蛋白(Ig)超家族中一个亚科的I型 跨膜糖蛋白。迄今为止，已经在哺乳动物中确定了五个ICAM家族成员(ICAM 1-5) (C. G. Gahmberg 等 人’ “Leukocyte adhesion-structure andfunction of human leukocyte beta2-integrins and their cellular ligands (白细 f占附—人白细 β 2整合素及其细胞配体的结构与功能)“,Eur. J. Biochem. 245 =215-232 (1997)) 0它 们共享功能性及结构性Ig样结构域并介导与免疫系统功能有关的细胞与细胞间粘附作 用(T. A. Springer, “ Traffic signals forlymphocyte recirculation and leukocyte emigration :the multistep paradigm(淋巴细胞再循环和白细胞迁移中的路径信号一多 步骤范例)“，Cell 76 :301-314(1994))。除了 ICAM-5以外，所有其它ICAM成员结合到整 合素LFA-I (⑶Ila/⑶18)但在组织分布上显示出大的差异(Gahmberg等人，1997，出处同 上)。这些粘附作用在通过发炎和未发炎组织介导白细胞运输中起着重要作用并有利于抗 原特异性T细胞应答。ICAM成员中，ICAM-3被认为是免疫应答启动过程中LFA-I的主要 配体，因为ICAM-I和ICAM-2没有在休止白细胞和抗原呈递细胞(APC)上表达或以非常低 的水平表达(A. R. de Fougerolles 等人，“Cloning and expression of intercellular adhesion molecule 3reveals stronghomology to other immunoglobulin family counter-receptors for lymphocytefunction-associated antigen 1(细胞|、司丰占附分子 3的克隆和表达揭示出与淋巴细胞功能相关的抗原1的其它免疫球蛋白家族反受体的强同 一性)，〃 J. Exp. Med. 177 1187-1192 (1993))。已报道了 ICAM-2 和 ICAM-3 与 C-型凝集素、人DC-SIGN的结合，在于在抗原呈递过程中ICAM-3与DC-SIGN的相互作用在树突细胞 和休止T细胞之间建立了初步接触而ICAM-2与人DC-SIGN的结合调节树突细胞迁移和通 过内皮的移行(T. B. Geijtenbeek等人，"Identification ofDC_SIGN，a novel dendritic cell-specific ICAM_3receptor that supportsprimary immune responses(DC-SIGN-一 种支持初次免疫应答的新型树突细胞特异性ICAM-3受体的鉴定)，“Cell 100 575-585(2000) ；Τ. B. Geijtenbeek 等人， “DC-SIGN-ICAM_2interaction mediates dendritic celltrafficking(DC-SIGN-ICAM_2 相互作用介导树突细胞运输)，“Nat. Immunol. 1 :353-357(2000))。全长ICAM分子包含信号肽序列、两个(ICAM2和ICAM4)、五个(ICAM1和ICAM3) 或九个(ICAM-5)胞外Ig样结构域、疏水跨膜结构域TMD)和胞质尾区(CT)。各Ig样 结构域由不同外显子编码(G. Voraberger等人，“Cloning of thehuman gene for intercellular adhesion molecule 1 and analysis of its 5' -regulatory region. Induction by cytokines and phorbol ester (细胞间粘附分子1的人基因克隆及其 5'调控区分析，细胞因子和佛波酯的诱导)，“J. Immunol. 147 :2777-2786(1991)； C. M. Ballantyne ^Α “ Characterization of the murinelcam—lgene (鼠 Icam_l ―因白勺 表征)，“Genomics 14 :1076-1080 (1992))。在ICAM-I敲除小鼠中已确认了选择性剪接产 生的鼠 ICAM-I 的同种型(P. D.King 等人，“Novel isoforms of murine intercellular adhesion molecule-1 generated by alternative RNA splicing(；^择个生尺NA 剪接产生白勺 鼠细胞间粘附分子-1 的新同种型)，〃 J. Immunol. 154 =6080-6093(1995) ；N. K. van Den Engel ^Α “ Circulating forms of intercellular adhesion molecule (ICAM) -I in micelacking membranous ICAM-I (缺少膜状ICAM-I的小鼠中的细胞间粘附分子(ICAM)-I 循环体)，“Blood 95 :1350-1355(2000)) ο各鼠ICAM-1同种型通过完全跳跃编码Ig样 结构域2、3和/或4的外显子而产生。此外，外显子6中选择性5'剪接位点的存在也产 生从外显子6的3 ‘-末端删除69-nt的鼠ICAM-I同种型(J. P. Mizgerd等人，‘‘Exon truncation by alternative splicing of murineICAM—1 (通过鼠 ICAM—1 的选择个生剪接 截短外显子)，“Physiol. Genomicsl2 :47-51 (2002))。鼠 ICAM-4 中，还确定了内含子保 留引起的跨膜结构域缺失同种型(G.Lee等人，“Novel secreted isoform of adhesion molecule :potentialregulator of membrane-associated ICAM-4interactions ( Ij1J 附 分子的新型分泌型同种型膜相关的ICAM-4相互作用的潜在调节剂)，“Blood 101 1790-1797(2003))。到目前为止，所有确认的ICAM同种型都是全功能的，表明选择性mRNA 剪接在不同免疫应答路径中起不同作用。基于人-猪-小鼠-大鼠或人-狗-小鼠-大鼠基因组区的两种对比序列分析研 究揭示啮齿动物基因组中缺失ICAM3基因(H. Sugino，“ ICAM_3，a ligand forDC-SIGN, was duplicated from ICAM-Iin mammalian evolution, but was lostin the rodent genome (ICAM-3, DC-SIGN的配体，在哺乳动物进化中从ICAM-I复制，但啮齿动物基因组 中缺失)，“FEBS Lett. 579 :2901-2906 (2005) ；Τ. Leeb 和 M. Muller, “ Comparative human-mouse-rat sequence analysis of the ICAMgene cluster on HSA 19pl3. 2and a 185-kb porcine region from SSC 2q (HSA19pl3. 2 上 ICAM 基因簇和 SSC 2q 的 185-kb 猪 区的对比人-小鼠-大鼠序列分析)，“Gene 343239-244(2004)) 0人、非人灵长类和牛中ICAM3基因组织类似，其包含七个推定外显子，外显子3-7在该基因的近3'侧区聚集 (P. KiIgannon等人，〃 Mapping of the ICAM-5 (telencephalin) gene, a neuronal member of theICAM family, to a location between ICAM-I and ICAM_3on humanchromosome 19pl3. 2 (ICAM-5 (端脑素)基因(ICAM家族的神经元成员)定位到人染色体19pl3. 2上 ICAM-I 和 ICAM-3 之间)，“Genomics 54 :328-330(1998) ；Ε. K. Lee 等人，“Cloning and sequencing of a cDNA encoding bovineintercellular adhesion molecule 3 (ICAM-3)(编码牛细胞间粘附分子3 (ICAM-3)的cDNA的克隆和序列分析)“，Gene 174 311-313(1996))。还没有完全知道猪ICAM-3的基因序列，因为仅外显子1到部分外显子 5的区域已确定并测序(Leeb和Muller，2004，出处同上)。此外，迄今为止，还未确定猪 ICAM-3 的 cDNA。外显子内的无义突变可在pre-mRNA剪接过程(其命名为无义相关的可变剪接 (NAS))中诱导夕卜显子足兆跃(L. Cartegni 等人，〃 Listening to silence andunderstanding nonsense :exonic mutations that affect splicing(聆听沉默禾口理角军无义影响剪接 的夕卜显子突变)，“Nat. Rev. Genet. 3 :285-298 (2002) ；L. Ε. Maquat, “ The power of point matations (点突变的力量)，“Nat. Genet. 27 :5-6(2001) ；H. C. Dietz 等人，“The skipping of constitutive exons in vivo induced bynonsense mutations (无义突变 引起的体内组成型外显子跳跃)，“Science259 :680-683 (1993))。NAS通常是疾病相关 的，如几种导致疾病的基因中所示(Cartegni等人，2002，出处同上)，这是由于翻译未成熟 终止将导致不能产生功能性蛋白。认为NAS的机理是由于在切片、间接无义介导的mRNA衰 变(NMD)或外显子剪接增强子(ESE)破坏(id.)之前发生翻译样核扫描。尽管人DC-SIGN参与了各种包膜病毒如人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、登革病 毒和SARS冠状病毒传播到它们各自的靶细胞，但从其它物种获得的DC-SIGN的特征和特性 还未表现出模仿hDC-SIGN的规则。因此，需要进一步的测试来确定任何给定DC-SIGN的功 能。在本发现之前，来自猪的DC-SIGN及其它LSECtin相关同源物还未被分离、确认或表征。因此本发明的一个重要目标是获得编码到目前为止猪基因组数据库中还未描述 的新型猪DC-SIGN和猪LSECtin蛋白的全核酸分子的克隆和表征。本发明的另一重要目标是确认和表征编码来自体外培养的猪单核细胞来源的树 突细胞的新型猪ICAM-3同种型的全核酸分子。本发明的另一重要目标是将单独的pDC-SIGN、pLSECtin、ρ ICAM-3或作为与 hDC-SIGN、hL-SIGN或hLSECtin的融合蛋白在某些组合物中的pDC-SIGN、pLSECtin、 pICAM-3用于繁殖病毒，具体是包膜病毒，特别是猪包膜病毒的新方法中，利用稳定表达 pDC-SIGN、pLSECtin和/或pICAM_3的新型转染细胞或细胞系。本发明的另一目标是制备与pDC-SIGN蛋白的氨基酸序列特异性地结合并可用于 增强弱抗原物质的免疫活性的抗体。也非常希望制备与pLSECtin和pICAM-3蛋白的氨基 酸序列特异性结合的抗体。本发明的其它目的和目标将随说明书显现出来。通过制备并分离所述编码pDC-SIGN、pICAM-3和pLSECtin的新型全核酸序列、将 编码所述蛋白的核苷酸序列用于特别设计的载体以繁殖包膜病毒、制备抗体等来实现上述 目标。
发明简述本发明涉及从猪单核细胞来源的树突细胞获得的完整猪DC-SIGN基因和cDNA克 隆，以及该新型基因编码的新型猪DC-SIGN蛋白。本发明还涉及从猪的肝组织获得的全基 因和cDNA及新型编码的pLSECtin蛋白。此外，本发明包括从体外培养的猪单核细胞来源 的树突细胞分离的猪ICAM-3的两种新型cDNA同种型。具体来说，本发明涉及分离的核酸 分子，其包括编码猪DC-SIGN、猪ICAM-3、猪LSECtin中的一种或多种的核苷酸序列、所述核 苷酸序列的补体或所述核苷酸序列的功能限定部分，或连接到另一蛋白的某些蛋白融合产 物，所述蛋白可能来源于猪或人。本发明范围还包括包含本文中所述的新型核酸分子的生 物功能质粒、病毒载体等、被本发明质粒或载体暂时转染的稳定细胞或细胞系和多肽表达 产物。本发明的一个重要实施方案还包括所述猪同源物在繁殖病毒，特别是包膜病毒的方 法中的新用途。附图简述下面将参考附图对本发明背景及其与现有技术的不同进一步描述，其中

图1显示了通过RT-PCR或RACE-PCR进行的来自体外培养的猪单核细胞来源的 树突细胞(MDDC)的pDC-SIGN cDNA扩增和通过基因组PCR进行的来自猪基因组DNA的 pDC-SIGN基因扩增。图1 (a)显示了放大倍数=400x下在rpGM-CSF和rpIL_4存在下CD 14单核细胞7天体外培养后猪MDDC的形态发育。图1(b)显示了采用简并引物通过RT-PCR 检测具有预期大小的 210-bp产物。图1 (c)显示了 5' -RACE和3' -RACE PCR的结果。图2显示了 pDC-SIGN cDNA的全长核苷酸序列(其对应于SEQ ID NO 1)及其推 测的氨基酸序列(其对应于SEQ ID NO :2)。该1，069-核苷酸序列包含编码MO-aa蛋白 的、从立置的nt开始的开放阅读框。预测的跨膜结构域(TMD)用虚线框显示而糖识别 结构域(CRD)用下划线表示。多聚腺苷酸化信号划上框。箭头显示外显子边界。图3展示了 pDC_SIGN(构建物pCI-PDCQ在转染BHK-21细胞中的表达。图3 (a) 用pDC-SIGN特异性抗肽多克隆抗体进行转染后48小时的免疫荧光测定(IFA)结果(放大 倍数= 200x)。大多数细胞具有漫延的胞质和膜染色。图3(b)显示仅少数细胞具有细胞 膜染色。内侧板(Inner panel)显示了已染色细胞的放大倍数GOOx)。图3 (c)显示了用载 体pCI-neo作为阴性对照的细胞转染QOOx)。图3 (d)显示了用质粒pCI-PDCS或pCI-neo 转染的BHK-21细胞的裂解物的蛋白质印迹分析。图4显示了猪DC-SIGN基因的克隆，其中图4 (a)通过一步基因组PCR进行的猪 DC-SIGN基因猪基因组DNA的扩增结果而图4(b)显示采用各自的测序引物M13F、2F、3F、4F 和M13R的五个独立序列的猪DC-SIGN基因的三种克隆之一(⑶CS-6)的组合体。图5-1到5-2显示了位于染色体DNA上的猪DC-SIGN基因的全长核苷酸序列(包 括外显子和内含子)(其对应于SEQ ID NO :3)。指出了外显子1-8、基因组PCR引物IF和 4R和测序引物2F、3F和4F的位置。图6-1到6-4显示了分别通过RT-PCR及流式细胞术检测选定的猪组织和细胞群 中pDC-SIGN表达。图6-1 (a)展示了 RT-PCR表达图谱，其显示了 pDC-SIGN的mRNA表达。 猪组织cDNA用作PCR与引物PDCS-E56F/PDCS-E78R或猪GAPDH特异性引物反应中的模板。 图6-2(b)到6-4显示了确定的猪细胞群和细胞系上pDC-SIGN表达的检测。在Ficoll上 离心分离猪PBMC并对其前向角散射和侧向角散射性能进行评估。通过免疫磁珠标记MACS系统，采用抗⑶14单克隆抗体将外周血淋巴细胞(PBL，⑶14—细胞)和单核细胞(⑶14+ 细胞)分离。其它测试板中，通过用抗PDC-SIGN抗体(灰色柱)染色对pDC-SIGN在PBL、 单核细胞、单核细胞来源的树突细胞(MDDC)、单核细胞来源的巨噬细胞(Μ ΜΦ)、猪肺泡巨 噬细胞(PAM)、猪单核细胞系3D4/31和猪肾上皮细胞系5上的表达进行评价。虚线开 放柱显示了背景对照。数据代表3个独立实验。图7显示了通过免疫组织化学技术(IHC)检测猪淋巴结组织而不是猪肝组织中 pDC-SIGN蛋白的表达。在猪淋巴结(a，c，d)和猪肝(b)的石蜡切片上通过IHC采用ABC方 法检测PDC-SIGN蛋白表达的定位。图7(a)表明pDC_SIGN蛋白优选在淋巴结窦(被膜下 窦)中表达。图7(b)表明pDC-SIGN蛋白不在猪肝中表达。图7 (c)表明窦中用pDC-SIGN 特异性抗肽抗体免疫染色的大多数细胞为形态上巨噬细胞样(箭状物)和树突样细胞(箭 头)。图7(d)显示了软组织中的淋巴管内皮细胞也被pDC-SIGN特异性抗体免疫染色。图8-1到8-5显示了人ICAM-3和ICAM-2免疫黏附素结合到稳定表达pDC-SIGN 的BHK细胞。图8-1 (a)提供了 pDC-SIGN蛋白在稳定BHK细胞系上的表面表达检测。分别 用抗pDC-SIGN抗体和FITC标记的山羊抗兔IgG染色BHK-21及未分选或已分选BHK-PDCS 细胞系并通过流式细胞术进行分析。虚线开放柱形图表示背景染色。用实心灰色柱形图表 示pDC-SIGN的表达。通过用hDC-SIGN单克隆抗体染色验证hDC_SIGN在3T3-HDCS细胞系 表面上的表达(最低测试板)。图8-2 (b)到8-5展示了人ICAM-3和ICAM-2免疫黏附素 钙依赖性结合到BHK-PDCS和3T3-HDCS细胞。虚线开放柱形图代表仅用FITC标记的抗人 IgG Fc抗体进行的细胞染色。结果代表三个独立实验。数据表示成10，000个细胞的柱形 图分析。图9-1到9-2提供了猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)在BHK-PDCS细胞中的感染结 果。图9-1 (a)表明通过修饰的PRRSV传染性cDNA克隆表达GFP转染，PRRSV在BHK-PDCS 细胞中是能复制的(左测试板)，而释放的病毒能感染靶MARC-145细胞(右测试板)。直 接监测在BHK-PDCS细胞中48小时后转染或在MARC-145细胞中72小时后转染的GFP信 号(放大倍数=IOOx)。图9-1 (b)显示了 PRRSV在BHK-PDCS和BHK-21细胞系上结合的 比较。空心点柱形图表示不用PRRSV接种进行培养但用抗PRRSV mAb SD0W17-A和FITC标 记的山羊抗小鼠IgG染色的对照细胞。用病毒接种和用两种抗体培养的细胞用实心灰色柱 形图表示。图9-2 (c)显示了 PRRSV PGXG株和VR2385株都阻碍hICAM-3结合到BHK-PDCS 细胞系。在加入hICAM-3-Fc之前，在4°C下用PGXG或VR2385 (M. 0. I. = 10FFU/细胞)培 养BHK-PDCS细胞60min。如本文中所述采用FACS分析染色细胞。提供的数据为标准化到 未处理对照物的(仅加入hICAM-3-Fc和FITC标记的抗人IgG Fc抗体)的平均荧光强度 士SD。星号表示与未处理对照物对比的统计差异(ρ < 0. 05)。图9-2 (d)表明BHK细胞介 导的PRRSV传输被pDC-SIGN提高。按照实施例中所述采用BHK-PDCS、BHK_21和MARC-145 细胞作为供体细胞、MARC-145细胞作为靶细胞传输PRRSV PGXG或PRRSV VR2385，并滴定 PRRSV。未接触PRRSV的MARC-145靶细胞共培养的供体细胞用作模拟传输对照物，结果未 显示于图中(没有检测到病毒)。星号表示BHK-PDCS和BHK-21细胞之间PRRSV VR2385株 的统计学差异(P < 0. 05)。图10显示了通过RACE-PCR对来自体外培养的猪单核细胞来源的树突细胞(MDDC) 的猪ICAM-3cDNA进行的扩增。图10(a)展示了通过5' -RACE PCR确认两种同种型(各 800bp)。图10 (b)通过3' -RACE PCR确认 700bp产物的检测。图11-1到11-2提供了猪ICAM-3cDNA(其对应于SEQ ID NO 4)的全长核苷酸序 列和预测蛋白序列(其对应于SEQ ID NO :5)。在右侧标记出核苷酸位置，在各残基下标记 出氨基酸(aa)位置。预计编码63-aa肽(其对应于SEQ ID NO 38)的小开放阅读框在括 号中显示，所述63-aa肽在大的5' -RACE PCR中推定ICAM-3编码区的上游。小5‘ -RACE PCR产物中发现的缺失核苷酸区的序列(其对应SEQ ID NO 39)显示于虚线框内。推定信 号肽用双虚线标出，潜在多聚腺苷酸化信号用虚线标出。粗下划线序列表示预测的跨膜区。 潜在的N-糖基化部位用一Ν—显示。Ig-样结构域1-3和跨膜结构域(TMD)及胞质尾区 (CT)的建议起始位点用相应核苷酸序列上方的箭状物标记。图12-1到12-2给出了猪ICAM-3基因的建议无义相关可变剪接(NAS)的示意图。 图12-1 (a)显示了猪ICAM-3与灵长类/牛ICAM-3之间的pre-mRNA剪接和蛋白表达比较。 所有ICAM-3都具有类似的基因组结构，所述基因组结构包含7个推定外显子(E1-E7)，且外 显子3-7在基因组的近3'区聚集。在灵长类和牛中，发生常规pre-mRNA剪接，从而包含所 有7外显子(用粗线和箭头表示)。外显子1编码信号肽，外显子2-6分别编码D1-D5，而 外显子7编码跨膜结构域和胞质尾区。在本研究的猪种中，提出预测的ICAM-3蛋白中缺少 D4和D5导致在pre-mRNA剪接过程中(用细线和箭头表示)外显子5和6 (e5和e6)连续 跳过。猪ICAM-3的部分已知基因组DNA序列参见AJ632303(克隆RP44-379M9)而本发明实 验确定了猪ICAM-3的剩余未知序列。图12-2(b)给出了通过采用引物PIC53和PIC58进行 基因组DNA片段(从左框至右框的序列分别对应SEQ ID NO :40、SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 42)的基因组PCR扩增来确定猪ICAM-3基因e5和E7之间的未知区域之间序列的示意 图。与灵长类/牛ICAM-3相比，由于上游4-nt缺失(AAAG)，猪ICAM-3外显子5包含3_nt 框内无义突变(CTT突变为TGA，下划线示出的)而外显子6包含4个框内无义突变(下划 线示出的)。内含子6(16)内推定剪切供体位点的第一核苷酸处的点突变(g突变为a)用 星号表不。图13描述了从猪肝剪接过程中通过RT-PCR扩增pLSECtin pre-mRNA中间和最终 产物(同种型)和通过基因组PCR扩增来自猪基因组DNA的pLSECtin基因。虚线箭头显 示了剪接的中间产物；实线箭头显示了同种型和pLSECtin基因。14-1到14-2显示了 pLSECtin的cDNA的基因结构和核苷酸序列。图14-1 (a)提 供了 pLSECtin基因的基因结构。顶行显示了各结构域的外显子分配。下行显示了推定 pLSECtin编码区的结构域结构。CT 胞质尾区；TMD 跨膜结构域；CRD 糖识别结构域。外显 子1和9中的未翻译区显示成空心框(openbox)。图14-2 (b)提供了 pLSECtin cDNA的全 长核苷酸序列(其对应SEQ IDNO 36)及其推导的氨基酸序列(其对应SEQ ID NO 37)。本 研究中未确定的pLSECtin cDNA非编码区两末端处的其它核苷酸序列用虚的下划线表示。 两个框内起始密码子和终止密码子用方框表示。CT中的两个潜在内化基序YSKW和EE用 虚线框表示。推定TMD用双线框表示，而糖识别结构域(CRD)用下划线示出。颈区中的两 个预测糖基化位点用点下划线标记。多聚腺苷酸化信号(AATAAA)用大写字母显示。箭头 显示外显子的边界。图15显示了 pLSECtin基因与其它LSECtin同源物及通过mVISTA程序产生的 pDC-SIGN基因的基因序列和外显子数比较。序列对之间的保守区显示为相似度(Y轴)对pLSECtin基因序列位置(X轴)的峰。图上方的深灰色框表示pLSECtin基因的9个 外显子。相同灰色阴影中的峰显示外显子内保守区，而浅灰色阴影中的峰(同样其中框 上缺少阴影)显示了内含子内的保守区。百分一致性的截留值设定为70%。人和黑猩猩 LSECtin假基因由于在建议的起始密码子处的点突变尔-A)而丧失蛋白编码能力。两种猕 猴LSECtin假基因由于Ι-nt插入或l_nt缺失导致移码突变而不能编码功能性LSECtin蛋 白。目前为止没有获得黑猩猩LSECtin基因的外显子4序列。缩写猪LSECtin(pLSECtin)、 牛 LSECtin(bLSECtin),犬 LSECtin(caLSECtin),马 LSECtin (eLSECtin),人 LSECtin QiLSECtin)、人 LSECtin 假基因(hpLSECtin)、黑猩猩 LSECtin (chLSECtin)、 黑猩猩 LSECtin 假基因(chpLSECtin)、猕猴 LSECtin 假基因(rhpLSECtin)、小鼠 LSECtin(mLSECtin)、大鼠 LSECtin(rLSECtin)、负鼠 LSECtin(opLSECtin)、鸭嘴兽 LSECtin (plLSECtin)和猪 DC-SIGN(pDC-SIGN)。图16显示了从猪LSECtin pre-mRNA去除的内含子的建议次序。编号1_9的框代 表9个pLSECtin外显子序列。8个内含子序列(用A-H表示)，在外显子之间用黑线表示。 箭头显示了剪接路径。显示了通过RT-PCR检测到的基因、剪接中间产物和同种型以它们各 自的大小显示于左边。图17显示了通过RT-PCR检测pLSECtin mRNA在选定的猪组织中的表达。猪组织 cDNA用作PCR与引物PLST-E67F/PLST-E89R或猪GAPDH特异性引物反应中的模板。发明详述本发明提供了迄今未知的分离的核酸分子，所述核酸分子包括编码选自猪 DC-SIGN (pDC-SIGN)、猪 ICAM-3 (pICAM-3)、猪 LSECtin (pLSECtin)的一个或多个蛋白的核 苷酸序列，以及所述核苷酸序列中至少一个的补体和包含至少一个所述核苷酸序列的功能 性限定部分的功能性片段。采用基因组PCR技术，本发明显示了编码从野猪(野猪，猪家族的一员)的体外培 养的猪单核细胞来源的树突细胞分离的独特PDC-SIGN的全基因和cDNA序列的分子克隆和 表征。与文献中已经描述的小鼠和其它物种的基因组数据库中的DC-SIGN同源物的计算机 筛选不同，猪基因组数据库中还未获得DC-SIGN相关的猪基因序列，因此，向克隆全长核酸 序列提出了挑战。本发明的范围还包括编码从猪肝组织分离的新pLSECtin蛋白的全长基因和cDNA 序列。本发明公开内容描述了相关猪蛋白的组织和细胞分布，说明了 pDC-SIGN和hICAM-3 的交叉相互作用，显示了 pDC-SIGN和hICAM-2的交叉相互作用，且特别重要的是，展示了通 过pDC-SIGN对PRRSV反式输送到靶细胞的提高。本发明的基础在于hDC-SIGN和hL-SIGN可为许多包膜病毒，特别是在巨噬细胞和 树突细胞如PRRSV中复制的那些病毒的结合受体的报道。人DC-SIGN可能也介导生殖系统 中的PRRSV发病并与生殖衰竭有关。既然本文中确定了猪特异性DC-SIGN和pLSECtin基因 并与hDC-SIGN和hL-SIGN对比，并观察到蛋白结构出乎意料的类似，本文中还确定PRRSV 可利用pDC-SIGN来促进进入巨噬细胞和树突细胞，pDC-SIGN在能复制的细胞如BHK-21中 的表达可导致生殖PRRSV复制。同样，本发明还涉及有效支持生殖PRRSV复制的基因工程 稳定的转染细胞或细胞系。本发明中还出乎意料地观察到猪LSECtin与人LSECtin在氨基酸水平方面高度一致，这表明pLSECtin具有与hLSECtin相同的糖_蛋白相互作用模式。现有研究报道了尼帕 病毒表面糖蛋白(NiV-G)与人LSECtin结合的能力和hLSECtin作为NiV-G的推定受体的 可能功能(T. A. Bowden等人，即将发表，2008，出处同上)。其它研究报道了埃博拉病毒的包 膜蛋白以及SARS-CoV的刺突蛋白具有相同的糖基序且也可被hLSECtin识别(T. Gramberg 等人，2005，出处同上)。由于现在看到的本发明新发现的pLSECtin和hLSECtin之间的相 似性，新pLSECtin可作为病原体识别受体(PRR)以在猪感染过程中触发宿主先天免疫应答 并促进尼帕病毒或其它致病猪包膜病毒的输送和传播。同样pLSECtin的应用包括设计特 定的抗病毒药物(如糖配体、siRNA等)来阻止病毒-pLSECtin相互作用、病毒疫苗的开发 等，所述病毒疫苗包含刺激pLSECtin依赖性抗原识别和提高宿主先天性免疫应答以提高 疫苗功效的因素。本发明还包括融合蛋白。融合蛋白可包括连接到pDC-SIGN的pLSECtin，所述融 合蛋白还可包括连接到其它蛋白的功能性限定部分的pLSECtin或pDC-SIGN。单独或融 合的pLSECtin、pDC-SIGN或其功能性限定部分可进一步融合到至少一个选自如下的蛋白 hDC-SIGN、hL-SIGN、hLSECtin及其组合，或其功能性限定部分。所述蛋白的功能性限定部 分涉及确定为在猪或人同源物中具有免疫原功能、受体活性或结合能力的结构域或区域， 例如pDC-SIGN或pLSECtin的糖识别结构域、hDC-SIGN、hL-SIGN、hLSECtin或其组合的胞 质尾区、跨膜结构域或重复颈区。在一个优选实施方案中，所述融合蛋白可包含pDC-SIGN或pLSECtin的糖识别结 构域(CRD)，所述糖识别结构域负责捕获抗原，和hDC-SIGN、hLSECtin或hL-SIGN的胞质尾 区(CT)、跨膜结构域(TMD)和重复颈区负责通过内吞作用将捕获的抗原吸入或吞入细胞。某些包膜病毒如PRRSV仅能在有限的细胞系如MARC-145细胞系中生长到有限程 度且难以在足够滴度中培养。其它细胞系如BHK-21细胞的培养基允许PRRSV在细胞内 复制但不允许PRRSV在细胞间传播，这意味着所述病毒不能进入其它未感染的BHK-21细 胞，使得抗原生产和存活免疫产物的制备成为挑战。有利的是，PRRSV受体，即pDC-SIGN、 pICAM-3、pLSECtin等，但优选pLSECtin、pDC-SIGN或其融合蛋白构建体可在BHK-21表面 (即生物工程设计的BHK-21细胞系)表面稳定表达，允许病毒进入其它未感染细胞并繁殖 到足够滴度。因此，本发明一个重要方面包括繁殖病毒的非常有利的新方法，所述病毒优选包 膜病毒(其主要为RNA病毒)且特别是根本不能在细胞培养基中繁殖或不能在合适细胞 系中繁殖到有限程度的那些病毒。所述方法的特别优势是稳定表达本发明蛋白或融合 蛋白构建体的质粒或载体以用于培养如下病毒包膜猪病毒如猪繁殖和呼吸综合征病毒 (PRRSV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪内源性逆转录病毒、猪 巨细胞病毒、猪流感病毒(SIV)、非洲猪瘟病毒、典型猪瘟病毒、猪痘病毒、猪血凝性脑脊髓 炎病毒(PHEV)等，及传染性胃肠炎病毒(TGEV)、日本乙脑病毒(JEV)、人类免疫缺陷病毒 (HIV)、登革病毒、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)、猫冠状病毒、人巨细胞病毒(人CMV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒、A型 流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、辛 德毕斯病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、牛病毒性腹泻病毒、假狂犬病毒、水泡口炎病毒、狂犬 病毒、东方型马脑脊髓炎病毒、马动脉炎病毒(EAV)等。优选地，采用所述新方法来显著提高PRRSV的繁殖以制备猪疫苗。无包膜病毒如戊型肝炎病毒(HEV)、猪圆环病毒2型及其它 也可用于所述新方法。根据本发明的新方法，采用稳定表达pDC-SIGN、pICAM-3、pLSECtin、至少一种所述 核苷酸序列的补体、其功能性限定部分或相关融合蛋白产物的新生物工程设计的细胞或细 胞系来繁殖所述病毒。所表达的蛋白作为病毒载体来捕获并将病毒体摄入细胞内。该方法 中猪蛋白的存在通过帮助病毒在细胞间传播提供惊人的益处，从而显著地提高了病毒的繁殖。在一个方面，所述改进的方法采用如下步骤(a)提供包含编码选自pDC-SIGN、 pICAM-3和pLSECtin的一种或多种蛋白的核苷酸序列、至少一种所述核苷酸序列的补体和 至少一种所述核苷酸序列的功能性限定部分的转染细胞或细胞系；(b)在细胞生长培养基 中使转染宿主细胞或细胞系生长以形成培养；(c)用所述病毒接种所述培养；和(d)在合适 病毒培养基中，在有效繁殖所述病毒的条件下孵育已接种的培养。所述方法可任选还包括 孵育所述已接种的培养直到观察到致细胞病变效应或达到更高的滴度；或溶解所述细胞以 释放细胞内病毒体；和(g)收获病毒抗原。繁殖病毒以进行工艺开发的独特方法也可包含以下基本步骤(a)用包含编码 选自以下的的载体以允许所述多肽产物表达的方式转染合适细胞pDC-SIGN、pICAM-3和 pLSECtin的一种或多种蛋白的核苷酸序列、至少一种所述核苷酸序列的补体和至少一种所 述核苷酸序列的功能性限定部分，或本文中描述的融合蛋白；(b)使稳定表达所述蛋白或 融合多肽产物的细胞在合适的细胞生长培养基中生长以形成单层；(c)去除生长培养基， 将病毒原液接种到细胞中，然后在37°C经过通常一小时的起始短孵育期；(d)加入病毒培 养基并将所述病毒孵育2-3天，直到病毒量达到如CPE (致细胞病变效应)或高的滴度所示 的足够水平；和(e)溶解所述细胞以释放细胞内病毒体，进行病毒滴定并冷冻病毒原液。发现独特的猪DC-SIGN基因与人DC-SIGN和小鼠SIGNR家族同源，但具有本文中 所述的某些变化。发现新型猪DC-SIGN蛋白具有240个氨基酸并为II型跨膜蛋白。其 C-末端细胞外区包含糖识别结构域(CRD)。令人惊奇的是，猪DC-SIGN的推断氨基酸序列 从系统发育上讲相对于人DC-SIGN、非人灵长类DC-SIGN或其它小鼠SIGNR同源物而言，与 小鼠SIGNR7和SIGNR8更密切相关，表明了猪DC-SIGN的独特进化路径。通过用特殊抗肽 猪DC-SIGN抗体进行免疫荧光测定证实了猪DC-SIGN蛋白在用含有所述基因的真核表达质 粒转染的BHK-21细胞表面的瞬时表达。通过采用根据人、非人灵长类和小鼠DC-SIGN基因的简并RT-PCR引物，从体外培 养的猪单核细胞来源的树突细胞扩增序列与人DC-SIGN(hDC-SIGN)同源的短片段。根据最 初得到的序列，猪DC-SIGN同源物的全长cDNA和基因相继通过cDNA末端(RACE) -PCR快速 扩增确定。此外，发现猪DC-SIGN基因的表达定位于细胞表面，证实了该蛋白的跨膜性能。 随后，产生PDC-SIGN特异性抗体且开发了表达pDC-SIG N的稳定细胞系。pDC-SIGN的基因 结构、组织和细胞分布及与人ICAM-3和ICAM-2免疫黏附素的体外结合性能及pDC-SIGN与 PRRSV之间的潜在相互作用得到表征。因此，本发明的一个重要实施方案涉及编码pDC-SIGN的分离的或纯化的核酸 分子及其cDNA克隆或从单独或与hDC-SIGN、hL_SIGN、hLSECtin或其任一组合连接的 pDC-SIGN构建的蛋白融合产物。优选地，编码pDC-SIGN的核苷酸序列包括SEQ ID NO :1或其互补链。本领域中众所周知的常规方法可用于制备互补链或与SEQ ID NO :1高度同源的 核苷酸序列，例如通过本领域公认标准或高严格度杂交技术。本发明另一个重要方案涉及编码pLSECtin的cDNA和全长基因的确认和表征。全 长pLSECtin cDNA编码290个氨基酸的II型跨膜蛋白。现在发现猪LSECtin基因的基 因结构与具有9个外显子的人LSECtin基因及预测的牛、犬、小鼠和大鼠LSECtin基因相 同。LSECtin mRNA的末端3'未翻译区处的多种属保守部位预计分别是家畜内microRNA miR-350和灵长类miR-145的目标。类似于人LSECtin，pLSECtin mRNA表达分布于肝、淋 巴结和脾内。在从猪肝剪接过程中，还确认了 pLSECtin pre-mRNA的一系列连续中间产物。本发明的范围还包括含有本文中描述的新核酸分子或融合产物的生物学功能质 粒、病毒载体等、被本发明质粒或载体短暂转染的合适细胞和多肽表达产物。就本发明目 的而言，所述载体，从广义上讲，可为任何可购买到的标准病毒载体或本领域中技术人员已 知的生物学功能相当的质粒，但优选pTriEx-1. INeo以从本发明示例的重组双顺反子载体 PTriEx-PDCS获得最佳和有益结果。为了说明和比较，构建重组双顺反子载体pTriEx-PDCS和产生本文中所述的稳定 表达猪DC-SIGN的BHK-21细胞系的pTriEx_l. INeo明显优于其它载体。pTriEx-PDCS和 PCI-PDCS构建物都被设计来产生稳定表达pDC-SIGN的BHK-21细胞系，然后通过流式细胞 分析进行测试来估计瞬时转染细胞的百分率。pCI-PDCS构建物的结果显示pCI-PDCS质粒 的瞬时转染有约10%-30% (图3)的pDC-SIGN表达。大不相同的是，与载体转染对照物 相比，图8-1 (a)上部第二测试组中显示的流式细胞分选展示了采用pTriEx-PDCS，新构建 的细胞系中的95%以上细胞表达了 pDC-SIGN。两个实验的细节都在下文中描述。该方法高度期望采用本领域技术人员已知的G418抗性筛选或类似筛选技术以 获得最佳转染结果和构建稳定表达本发明蛋白的细胞或细胞系。可被转染以稳定表达 pDC-SIGN、pICAM-3和/或pLSECtin、特别可用于病毒繁殖、提高病毒产量并诱导免疫应答， 特别是提高对猪抗原的免疫应答的合适细胞或细胞系包括但不局限于BHK-21、MARC-145、 PK-15、C0S-7、VERO, CV-U LLC—MK2、MDCK, MDBK, Raji B、CH0_K1、3D4/31、SJPL, IPEC-J2、 THP-URAff 264. 7、ST细胞、MA_104、293T等的培养物，尽管优选宿主细胞包含BHK-21细胞、 MARC-145细胞或其它树突细胞系、巨噬细胞系、单核细胞系、滋养细胞系、淋巴细胞系等，优 选单核细胞来源的树突细胞、间质树突细胞等的培养物。本文中描述的新型表达、繁殖及相 关方法采用这种稳定表达pDC-SIGN或其作为允许病毒进入宿主细胞的病毒受体而衍生的 融合构建物的合适的细胞或细胞系。尽管为了本发明目的，这些术语在本文中可交换使用， 但术语“宿主细胞”是指直接从动物或人或其外培养的原代细胞，也就是说，本发明宿主细 胞意图在微观或微生物水平而不是以整个人或动物的感染为基础。术语“细胞”是指不属 于宿主(例如猪)细胞系的最初类型的分离细胞。术语“细胞系”是指代表具体细胞类型 的已建立细胞系。特别优选的蛋白或多肽，作为可交换使用的常用术语，包括具有SEQ IDNO 2和图 2中列出的氨基酸序列的分离的pDC-SIGN多肽、具有SEQ ID NO 5和图11_1到11_2中列 出的氨基酸序列的分离的pICAM-3多肽及具有SEQ IDNO 37和图14_2 (b)中所列的氨基酸 序列的分离的pLSECtin多肽。所述猪蛋白的生物学活性变体也属于本发明。本领域普通 技术人员将知道如何修饰、替代、删除所述多肽序列中的氨基酸等以及无需过度努力制备保留与母序列相同或实质上相同活性的生物学活性变体。为了制备或表达本发明多肽产物，特别是pDC-SIGN、pLSECtin或其融合蛋白构建 物，所述方法可包括以下步骤在合适的营养条件下以允许所述多肽产物或多肽融合产物 表达的方式，使用选定的核酸分子转染的原核或真核宿主细胞生长，和通过本领域中已知 的方法分离所述核酸分子表达的所需多肽产物。用于转染的核酸分子包括，例如编码选自 pDC-SIGN, pICAM-3和pLSECtin的一种或多种蛋白的核苷酸序列、至少一种所述核苷酸序 列的补体和至少一种所述核苷酸序列的功能限定部分或本文中所述的融合蛋白。预期本发 明猪蛋白、融合蛋白等可通过其它技术例如生物化学合成等制备。本发明的另一重要实施方案涉及制备抵抗并特异性结合到pICAM-3特别是SEQ ID NO 2的氨基酸序列的分离的单克隆或多克隆抗体，和制备抗pICAM-3和pLSECtin的抗体， 其分别与SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :37的氨基酸序列特异性结合。优选地，所述抗体为多 克隆的且所述多克隆抗体与包含SEQ ID NO 13,SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 13与SEQ ID NO :14的组合的肽区特异性结合。本发明的范围还包括与pDC-SIGN，特别是SEQ ID NO 2 的氨基酸序列或pICAM-3或pLSECtin及产生识别pDC-SIGN、pICAM-3和pLSECtin但优选 pLSECtin或pDC-SIGN的抗体的杂交瘤细胞系特异性结合的天然或人工合成的寡糖配体， 例如含甘露糖、海藻糖或半乳糖的寡糖等。所述抗体、寡糖配体和杂交瘤细胞系可通过本文 中描述的方法及本领域技术人员已知的标准方法制备。寡糖配体结合到一种或多种猪蛋白如pDC-SIGN可由，例如通过生物素-链霉亲和 素系统产生多肽抗原-寡糖复合体来介导。首先，所述多肽抗原化学偶联到链霉亲和素。随 后，链霉亲和素-抗原缀合物通过链霉亲和素-生物素结合连接到寡糖-PAA-生物素。就 体外研究而言，将稳定表达猪蛋白例如pDC-SIGN的细胞系与抗原-寡糖缀合物孵育，以研 究配体内化，证实其活性并将抗原特异性效应物T-细胞的活化作用与仅通过多肽诱导的 活性作用比较。除了寡糖配体外，抗pDC-SIGN抗体、抗pICAM-3抗体或抗pLSECTin抗体可 用于与多肽抗原交联以分别靶向pDC-SIGN、pICAM-3或pLSECtin受体。加入pDC-SIGN特 异性寡糖或抗PDC-SIGN抗体将抗原集中到引发免疫应答的未成熟树突细胞。基本上，本发明杂交瘤细胞系可通过如下制备用本发明猪蛋白抗原使小鼠免疫 并选择产生杂交瘤细胞的小鼠供体；筛选进行抗体制备的小鼠；制备骨髓瘤细胞；将骨髓 瘤细胞与免疫脾细胞融合；通过有限稀释克隆杂交瘤细胞系；和通过腹水生成使克隆膨胀 和稳定。预期技术人员将理解如何通过文献中公开的其它常规步骤或方法制备杂交瘤细胞 系。本发明还包括新的免疫原性组合物和使用所述猪蛋白抗体的方法，其中所述抗原 特异性免疫应答可通过靶向pDC-SIGN、pICAM-3和/或pLSECtin得到加强。如本发明上下 文中所用的“靶向”PDC-SIGN或pICAM-3意味着体内的未成熟树突细胞会通过配体(如寡糖 或抗DC-SIGN抗体)与树突细胞上受体(如DC-SIGN)之间的相互作用识别免疫的抗原-寡 糖缀合物或抗原-抗蛋白抗体复合体，其比用裸抗原免疫更有效。用于靶向pLSECtin受体 的合适抗体复合体的比较用途将涉及肝细胞。本发明还包括新型兽用组合物，所述组合物包含无毒的生理学上可接受的载体和 免疫量的本文中描述的单克隆或多克隆抗体，所述抗体与抗原或，替代性地，带有本文中描 述的猪蛋白的载体混合或共价连接。优选地，可采用缀合疫苗且其可通过标准方法，将弱抗原共价连接到作为载体蛋白的抗体上来制备，从而赋予附着抗原上的载体免疫性能。当给药给猪时，本发明兽用组合物可包含一种或多种猪抗原，如猪环病毒2型 (PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆 菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血性博代氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌、红斑丹毒丝 菌、钩端螺旋体菌、猪流感病毒(SIV)、猪细小病毒、大肠杆菌、猪呼吸道冠状病毒、轮状病 毒、导致Adjezky' s病的病原体、猪传染性胃肠炎等。本发明组合物任选包含多种通常的 无毒、药物学上可接受的载体、添加剂、稀释剂和助剂。为了进行说明，兽用组合物可制备 成，例如包含pDC-SIGN、pICAM-3或pLSECtin的特异性抗肽多克隆抗体以及合适载体、防腐 剂和助剂体系，其中所述抗肽多克隆抗体与一种或多种抗原如PCV-2和PRRSV混合或缀合。本发明中所需的基因工程疫苗通过本领域中已知的技术制备。这种技术包括但不 局限于进一步操纵重组DNA、修饰或替代DC-SIGN蛋白的氨基酸序列等。本发明融合蛋白产物可通过，例如将人DC-SIGN/L-SIGN的胞质尾区(CT)、跨膜 结构域(TMD)和重复颈区与猪DC-SIGN的糖识别结构域(CRD)融合制备。为了进行说 明，可进行包括两轮PCR的融合PCR技术来产生所需的融合片段。第一轮PCR中，采用人 DC-SIGN/L-SIGN cDNA克隆与引物Pl和P2将从全长人DC-SIGN/L-SIGN cDNA获得的包含人 DC-SIGN/L-SIGN的CT、TMD和颈区的上游片段扩增，同时采用引物P3和P4将包含衍生自全 长猪DC-SIGN cDNA的猪DC-SIGN的CRD的下游片段扩增。引物P2和P3相互反向互补。在其 3'-或5'-末端共享一短链( 25bp)的两个片段经过纯化并用作第二轮PCR的模板，并 用引物Pl和P4扩增所述融合片段。第二轮PCR产物用所需的限制性酶进行双酶切并克隆 至用相同限制性酶酶切的表达载体。这种融合PCR技术在S. U. Emerson等人，“In vitro replication of hepatitis E virus (HEV) genomes and of an HEV replicon expressing green fluorescentprotein (表达绿色荧光蛋白的戊型肝炎病毒(HEV)基因组和HEV复制 子的体外复制)，“J.Virol. 78(9) :4838-4846 0004)中进一步描述。为了确定所述片段是活性的且可用于本发明，进行标准配体结合和内吞活性分析 来证实所述融合蛋白各部分的潜在作用。通常，从pDC-SIGN或pLSECtin cDNA分离的融合 蛋白的CRD (糖识别结构域)部分负责识别和捕获能通过配体-结合分析证实的猪病原体， 而衍生自hDC-SIGN、hLSECtin或hL_SIGN的融合蛋白的CT (胞质尾区)、TMD (跨膜结构域) 和重复颈区负责通过内吞作用将捕获的病原体摄入细胞中，这可通过内吞活性分析证实。本发明包括通过有效诱导未接触抗原和记忆性T-细胞应答赋予动物抵抗抗原的 被动免疫(即作为免疫原的病原体)的新方法，所述方法包括给药给动物免疫有效量的本 文中所述的兽用组合物。所述方法，其提供抵抗抗原或病原体的抗原特异性免疫应答，优选 设计成通过靶向pDC-SIGN、pICAM-3或pLSECtin来提高弱抗原或病原体的免疫学活性。在 这方面，共价疫苗产物特别有用。需要从抗体组合物获得提高的免疫力的弱抗原或免疫原 性物质包括病毒、细菌、真菌或寄生虫。本发明抗体提供了细胞受体部位处病原体的提高的 进入能力、帮助诱导免疫应答和最终防止疾病传播。优选地，需要所述免疫原性提高的组合 物的动物是猪，但预计其它动物如牛或犬也能受益。在所述方法中，将免疫有效量的本发明组合物给药给需要预防疾病或感染的动 物，特别是幼猪，以在动物体内诱导保护性免疫应答。靶向pDC-SIGN、pICAM-3或pLSECtin 在动物内产生提高的免疫应答。有效免疫量是达到足够免疫应答以保护动物免受病原体的有害影响的量。当兽用组合物能保护至少免疫领域标准值要求的足够量的接种动物时认为 达到了保护性免疫应答。接种动物并引起令人满意的免疫效果的免疫有效剂量或有效免疫 量可通过常规测试如标准滴定研究容易地确定或滴定测定。本发明新型免疫原性组合物用于健康动物，优选约3个月大的小猪的免疫。也可 在成熟或成年动物如大母猪(即大于3个月)繁殖前给予疫苗。疫苗可单剂量给药，或如 果抗体滴定量下降且认为加强疫苗注射必需就重复剂量给药。优选地，以单次接种将疫苗 给药给健康动物以提供长期的疾病防疫，保护动物至少一年到三年或更长时间。合适的剂 量通过标准剂量滴定研究确定。本发明还包括克隆来自非灵长类大动物种属的未知DC-SIGN cDNA同源物的独特 方法，所述方法包括以下步骤(a)从动物静脉血中分离单核细胞来源的树突细胞，并在合 适宿主细胞中在允许所述树突细胞生长的合适营养条件下体外培养所述单核细胞来源的 树突细胞；(b)提取RNA ； (c)采用根据编码人和小鼠DC-SIGN的核酸分子的多重序列比对 设计成与人和小鼠DC-SIGN核苷酸序列中保守序列互补的简并引物进行逆转录酶(RT)和 PCR,以合成cDNA第一链并通过RT-PCR扩增序列与人DC-SIGN同源的短片段；(d)采用分 别为5' -RACE或3' -RACE设计并根据简并PCR产物的序列信息的包含SEQ IDNO :9的 基因特异性引物PDR-I和包含SEQ ID NO 10基因特异性引物PDF-I在所述短片段上进行 逆转录酶和RACE-PCR ； (e)通过快速扩增cDNA末端(RACE)-PCR反应产物克隆动物体内所 述未知DC-SIGN同源物的全长cDNA的两个重叠片段；和(f)分离、纯化或测序所述动物的 DC-SIGN同源物。以上克隆方法中，合适宿主细胞包括但不局限于⑶14阳性外周血液单核细胞 (PBMC)、源自脾的淋巴细胞、源自骨髓的淋巴细胞等的培养物。优选地，所述新克隆方法中 的宿主细胞采用⑶14阳性PBMC的培养物。与以前用于小鼠SIGNR分子的策略相比，由于猪基因组测序计划(SGSP)数据库中无相关序 列，本发明采用完全不同的新策略来克隆猪DC-SIGN基因。在体外产生猪MDDC并将从MDDC 细胞中提取的总RNA用于克隆猪DC-SIGN同源物。通过采用根据人和小鼠DC-SIGN序列 的简并引物，首先通过RT-PCR扩增序列与hDC-SIGN和小鼠DC-SIGNR同源的210_bp片段。 根据该初始序列，然后分别通过5'-和3' -RACE-PCR在两个重叠片段中获得猪DC-SIGN 的全长cDNA序列。此外，通过一步基因组PCR根据cDNA序列独特地克隆全长pDC_SIGN基 因。本文中采用的克隆策略对于其它动物种属中的无序列信息的DC-SIGN同源物的鉴定非 常有用。尽管采用猪MDDC克隆了猪DC-SIGNdfi pDC_SIGN不能采用初始纯化的CD14阳性 PBMC扩增得到，表明在MDDC发展过程中pDC-SIGN的表达被激活。就小鼠SIGNR成员而言，仅SIGNR3具有与hDC-SIGN相同的与含高甘露糖多糖和 海藻糖多糖(Powlesland等人，2006，出处同上)结合的能力。SIGNR2几乎专门地结合到 GIcNAC末端多糖，而SIGNR7优先结合到6-磺基-唾液酸化的路易斯X多糖，类似于选择性 地识别唾液酸(id.)的唾液酸结合受体的siglec家族的一些成员。本文中确认的pDC-SIGN 具有结合于CRD中的钙依赖型糖涉及的所有9个保守残基。然而，尽管由于序列同源性与其它DC-SIGN相关蛋白相比较低，序列比对结果表 明pDC-SIGN可能具有与hDC-SIGN和L-SIGN不同的糖结合特性，它们确实与hDC-SIGN具 有类似的配体结合能力。这主要因为猪和牛DC-SIGN蛋白都具有促进CRD正确重叠并涉及 钙依赖型糖结合的所有结构保守性残基。另一方面，这些相互作用除了蛋白-糖相互作用 外可能涉及蛋白-蛋白相互作用，蛋白-糖相互作用已通过hDC-SIGN结合到hICAM-2和 hICAM-3 的扫描诱变分析显示(S. V. Su 等人，“DC-SIGN binds to HIV-lglycoprotein 120in adistinct but overlapping fashion compared with ICAM-2andICAM_3(DC-SIGN 以与ICAM-2和ICAM-3不同但重叠的方式结合到HIV-I糖蛋白120)，“ J. Biol. Chem. 279 19122-32(2004)) ο此外，已经显示:hDC_SIGN对gpl20和ICAM-3具有不同但重叠的结合 方式(T. B. Gei jtenbeek 等人，“Identification of different binding sites in the dendritic cell-specific receptorDC—SIGN for intercellular adhesion molecule 3and HIV-I (树突细胞特异性受体DC-SIGN中对胞间粘附分子3和HIV-I的不同结合部位 的鉴定)，〃 J. Biol. Chem. 277 :11314-11320(2002) ；Su 等人，2004，出处同上)。hDC-SIGN 中aa位置351处缬氨酸单突变到甘氨酸消除ICAM-3结合但没有消除HIV_lgpl20相互作用 (Geijtenbeek等人，2002，出处同上)。然而，当缬氨酸突变成丙氨酸时与ICAM-3或ICAM-2 的结合没有受到影响(Su等人，2004，出处同上)。pDC-SIGN蛋白在牛、犬和马DC-SIGN蛋 白唯一共享的204位置具有组氨酸残基。从缬氨酸变化到组氨酸可能对pDC-SIGN-WCAM-3/ hICAM-2相互作用具有极小的影响。已经显示通过单独的CRD识别小分子糖化合物不足以获得DC-SIGN和L-SIGN 与病原体如HIV-lgpl20之间高亲和力相互作用。颈区内重复结构域缺失的生化研究也 表明需要最少量的三个重复序列来形成四聚体，其它重复序列将使所得四聚体稳定化 (G· A· Snyder 等人，"The structure of DC-SIGNR witha portion of its repeat domain lends insights to modeling of the receptortetramer(利用具有一部分重复结构域的 DC-SIGNR结构考察受体四聚体建模)，“J. MoI. Biol. 347 :979-989 (2005)) 0本发明中新鉴定的PDC-SIGN，及已知牛、犬和马DC-SIGN蛋白，在颈区中不具有重复序列，表明包含猪 DC-SIGN的这些蛋白可能不能形成四聚体，从而支持猪DC-SIGN具有不同的糖结合特性的 论断。这与这些蛋白的结合能力不直接有关，这是由于现在已经显示pDC-SIGN能有效 地与潜在配体如hICAM-3和hICAM-2相互作用、捕获并将PRRSV传输到靶细胞。类似地， 颈区没有重复序列的牛DC-SIGN也具有结合HIV-lgpl20及分支杆菌牛BCG并使之内化 白勺能力(Y. Yamakawa 等人，“Identification andfunctional characterization of bovine orthologue to DC-SIGN(与DC-SIGN牛直系同源物的确认和功能表征)，“J. Leukoc. Biol. 83 1396-403 (2008))。另一实例是 hDC-SIGN 相关凝集素 LSECtin，其颈区 缺少重复序列，但它仍能通过人骨髓细胞介导抗原捕获和病原体结合(A. Dominguez-Soto 等 人， “TheDC-SIGN-related lectin LSECtin mediates antigen capture and pathogenbinding by human myeloid cells (DC-SIGN 相关凝集素 LSECtin 通过人骨髓细 胞介导抗原捕获和病原体结合)，“Blood 109 =5337-45 (2007))。尽管pDC-SIGN不参与 PRRSV进入，本文中已经显示pDC-SIGN能增强反式病毒从工程BHK供体细胞到靶MARC-145 细胞的传播，尽管这两种细胞系都不是来自于猪。本文中还展示了细胞表面上表达的pDC-SIGN结合到可溶hICAM配体。提高 hICAM-2与pDC-SIGN的结合或阻碍hICAM_3与pDC-SIGN的结合可能具有治疗价值。具体而 言，由于受体T细胞介导异种移植排斥反应，体内细胞-细胞粘附作用可能对猪到人异种器 官移植的临床应用具有重要指征。此外，组织和细胞位置和pDC-SIGN的特性及其与人天然 配体交叉结合强烈地暗示了这种凝集素在细胞粘附中的类似生理作用。还预测了 PLSECtin 和pICAM-3的类似作用。研究的惊人发现相对其它小鼠SIGNR成员而言，pDC-SIGN与小鼠SIGNR7和 SIGNR8最相关。在小鼠中发现8种DC-SIGN同源物表明它们具有非常不同的生化和生 理学特性(Powlesland等人，2006，出处同上)。然而，没有一种被实验证实与人DC-SIGN 是功能上直系同源的。尽管没有发现小鼠DC-SIGN蛋白具有与人蛋白相同的功能，牛 DC-SIGN最近表现出在牛MDDC上表达，结合HIV-lgpl20及分支杆菌牛卡介苗(BCG)并 使之内化，表明它与hDC-SIGN功能上相关(Y. Yamakawa等人，“Identificationand functionalcharacterization of bovine orthologue to DC-SIGN (与 DC-SIGN 牛直系同 源物的确认和功能表征)，“J. Leukoc. Biol. 83 :1396-403 Q008))，尽管它们被分成两种 不同进化路径。这个结论也得到以下实验中组织和细胞分布及pDC-SIGN与hICAM配体的 结合特征的支持。本发明详述中，显示pDC-SIGN mRNA表达主要分布在各种淋巴器官内且在⑶14+ 单核细胞或PBL表面上没有检测到这种蛋白表达。猪DC-SIGN不仅在MDDC还在Μ ΜΦ 和PAM上表达，表明猪DC和巨噬细胞发育过程中它被激活。通过采用IHC分析，进一步 证实了 pDC-SIGN在淋巴结窦状APC包括巨噬细胞样和树突样细胞上表达，但不在B或T 淋巴细胞上表达(图7)。也在淋巴结内皮细胞上检测到猪DC-SIGN表达，其与hDC-SIGN 表达具有类似形式(J. H. Martens 等人，“Differential expression of a gene signature forscavenger/lectin receptors by endothelial cells and macrophages in humanlymph node sinuses,the primary sites of regional metastasis (iEii入 林EL结窦(局部转移的主要部位)中内皮细胞和巨噬细胞差异表达清道夫/凝集素受体的基因信 号)，〃 J. Pathol. 208 :574-89 (2006))。然而，分别采用RT-PCR和IHC分析在猪肝组织中 既没有检测到pDC-SIGN mRNA也没有检测到蛋白。根据这些结果，总结出尽管PDC-SIGN的氨基酸序列没有显示与hDC-SIGN或 hL-SIGN明显的同源性，但克隆的猪基因是DC-SIGN同源物(而不是L-SIGN同源物)。 L-SIGN基因出现于类人猿的共同DC-SIGN祖先复制事件中，并可能不存在于非灵长类哺乳 动物中，如牛、犬和马基因组区上所示，其中C型凝集素在人染色体19pl3. 3上排列成三基 因簇 CD23/LSECtin/DC-SIGN 而不是四基因簇 CD23/LSECtin/DC-SIGN/L_SIGN。这些非灵 长类哺乳动物中的DC-SIGN同源物的进化路径与灵长类哺乳动物中的DC-SIGN同源物的 进化路径不同，其导致DC-SIGN作为单基因存在。基因组织的系统发育分析和比较显示 猪DC-SIGN与这些非灵长类哺乳动物高度相关，因此应具有相同特征。此外，通过IHC和 RT-PCR，猪肝中不存在pDC-SIGN表达也支持了这个结论，这是由于，如果克隆的pDC-SIGN 是猪L-SIGN同源物，分别通过RT-PCR和IHC应该已经在肝组织检测到其RNA和蛋白表达。猪DC-SIGN蛋白的跨膜特性得到本发明相关的实验证据的验证并确定为在猪DC 上起着粘附受体的作用。为了更好地表征猪DC-SIGN的表达，需要确定基因组DNA水平的基因。根据确 定的猪DC-SIGN cDNA的末端序列，GenBank和其它猪基因组序列库中目前还未发布的猪 DC-SIGN基因也通过采用基因组PCR扩增和克隆(图4)。猪DC-SIGN基因的共有序列为 3438bp长，编码跨越该基因的整个编码区的8个外显子，其中外显子1和8的大小未知(图 5-1到5- 。内含子大小为113-689bp且所述内含子上的所有接受者和供体序列符合GT-AG 规则。通过计算机程序没有预测到其它替代性剪接的mRNA同种型，表明确认的猪单核细胞 来源的树突细胞cDNA可能是猪DC-SIGN表达的唯一存在同种型，这与上述RACE-PCR结果 一致(图 1(c))。测试pDC-SIGN的组织和细胞分布，发现通过RT-PCR在初级(胸腺和骨髓)和次级 淋巴器官(淋巴结和脾)及肺和骨骼肌中检测到pDC-SIGN mRNA表达，但没有在猪的十二 指肠、肾、心脏或肝中检测到(图6-1 (a))。在淋巴结和骨髓中的表达水平最高。检测肌肉 中表达的DC-SIGN是有趣的。考虑各种淋巴器官中的pDC-SIGN表达，推测除了 MDDC外，pDC-SIGN还可能 通过特殊的造血细胞群表达。因此，进行流式细胞分析来检测pDC-SIGN蛋白在PBL、单 核细胞、MDDC、MDMΦ和PAM的表面表达(图6_2 (b)到6_4)。猪PBMC的离散图根据形 态清楚地显示了两种细胞群PBL和单核细胞。由于CD 14分子是猪单核细胞的表面标 记(H. W. Ziegler-Heitbrock 等人’ “Theantibody MY4recognizes CD14on porcine monocytes and macrophages (抗体MY4识别猪单核细胞和巨噬细胞上的CD14)，“ Scand. J. Immunol. 40 :509-14(1994))，这两种细胞群可通过免疫磁珠标记MACS系统采用抗猪 CD 14单克隆抗体进行分离。CD14+单核细胞通过在不存在细胞因子的条件下分别加入 rpGM-CSF和rpIL-4或Μ ΜΦ进一步用于形成MDDC。PBL和单核细胞没有显示任何pDC-SIGN 表达，这在预期之中，因为hDC-SIGN或L-SIGN没有在淋巴细胞或单核细胞上表达。从而， 在猪单核细胞细胞系3D4/31上没有可检测到的pDC-SIGN表达(图6_2 (b)到6_4)。单核 细胞在培养基分化成MDDC后，从第3天到第7天pDC-SIGN表达上调，平均荧光强度提高约8倍。还在Μ ΜΦ上发现了猪DC-SIGN表达。与MDDC相比，大多数Μ ΜΦ产生pDC_SIGN表 型。PAM也受到pDC-SIGN表型控制，但表达水平低于Μ ΜΦ上的表达水平。根据猪肾内未 检测到pDC-SIGN mRNA表达，该蛋白没有在源自猪肾上皮细胞系H(15内表达(图6_2 (b) 到 6-4)。为了进一步确认pDC-SIGN蛋白是否确实在淋巴组织的特定细胞群内表达，在猪 淋巴结和肝组织的石蜡切片上进行IHC分析。发现pDC-SIGN蛋白在淋巴结内的表达显示 出突出的窦状小管图谱(图7(a))。然而，猪肝内没有检测到表达(图7(b))，这与RT-PCR 结果一致(图6-l(a))。淋巴结窦内用pDC-SIGN特异性抗肽抗体免疫染色的大多数细胞 是巨噬细胞样和树突样细胞(图7(c))。软组织淋巴管内的内皮细胞也用pDC-SIGN特异 性抗肽抗体免疫染色(图7(d))。猪淋巴结内pDC-SIGN蛋白的表达图谱类似于人淋巴结 内hDC-SIGN的表达图谱，其中通过IHC不仅在窦状巨噬细胞而且在内皮细胞上都鉴别到 hDC-SIGN蛋白(J. H. Martens 等人，“Differential expression of a genesignature for scavenger/lectin receptors by endothelial cells and macrophagesin human lymph node sinuses, the primary sites of regional metastasis (通过人 林(局部转 移的主要部位)中内皮细胞和巨噬细胞差异表达清道夫/凝集素受体的基因信号)，“J. Pathol. 208 :574-89(2006))。猪肝内不存在pDC-SIGN表达进一步支持克隆的pDC-SIGN 不是L-SIGN同源物，因为假定的猪L-SIGN(如果存在)应在LSEC强烈表达。本发明一个独立的实施方案中，现已在体外培养的猪单核细胞来源的树突细胞确 认了猪ICAM-3的两种新cDNA同种型(编码较大pICAM_3同种型的核苷酸序列对应于SEQ ID NO 4而编码较小pICAM-3同种型的较小核苷酸序列对应于SEQ ID NO 39)。两种同种 型中较小者在非编码区包含114-nt缺失。胞间粘附分子-3(人ICAM-3，CD50)是结合到白 细胞整合素LFA-KOTl Ia/⑶18)和树突细胞特异性胞间粘附分子_3 (ICAMI)结合非整合 素(ADC-SIGN，⑶209)的免疫球蛋白(Ig)超家族成员。ICAM-3在激活T淋巴细胞和树 突细胞中起重要作用。出乎意料地是，新发现的同种型都仅编码三个Ig样结构域(Dl-DIB)且缺少Ig样 结构域4和5(D4-D5)，这与有五个Ig样结构域(D1-D5)的人ICAM-3不同。猪ICAM-3中 没有D4和D5可能是由于在pre-mRNA剪接过程中猪ICAM-3基因的外显子5和6连续跳 过。在确定猪ICAM-3基因组DNA序列的其余未知近3'区后，发现外显子5内存在一个框 内3-nt无义突变而外显子6内存在四个框内无义突变，这在猪中是独特的。还确定了内含 子6的推定剪接供体部位处的点突变(G到A)。因此缺少D4和D5猪的ICAM-3同种型的产 生可能由无义相关的变化的剪接(NAQ引起，所述剪接与物种有关且在pre-mRNA剪接过程 中不包含外显子5和6。以下实施例展示本发明的某些方面。然而，应该理解这些实施例仅用于说明，而非 对本发明条件和范围进行限定。应该认识到当给出特定反应条件(如温度、反应时间等)， 具体范围以上和以下的条件都可使用，尽管通常不那么便利。实施例在室温(约23°C_约
和大气压下进行。本文中提到的所有份和百分比以重量计而所有温度表示成摄氏 度，除非另有说明。通过以下非限定性实施例可对本发明进一步理解。实施例1猪DC-SIGN cDNA与基因的克隆和表征
材料与方法猪从3-7周大的健康杂交常规猪采集静脉血样品和猪肺泡巨噬细胞(PAM)。将 猪饲养在实验条件下的独立室内。猪肺泡巨噬细胞、猪外周血淋巴细胞、单核细胞、单核细胞来源的树突细胞和单 核细胞来源的巨噬细胞的分离和培养通过采用冷PBS进行肺灌洗采集猪肺泡巨噬细胞 (PAM)并悬浮于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中。新鲜或3天体外培养的PAM培养物用 于染色和随后分析。室温下，猪肝素化血用1 2磷酸盐缓冲盐水(PBQ稀释并在 FicolI-PaquePREMIUM(GE Healthcare, Sweden)上以 IOOOg 力离心分离 40min。4°C下分离 包含外周血单核细胞(PBMC)的血沉棕黄色层并用250g PBS洗涤三次，每次lOmin。通过 细胞的免疫磁珠标记MACS系统采用抗CD14mAb(M-M9，VMRD Inc.，Pullman, WA，USA)和山 羊抗小鼠 IgGl 磁性微殊(Miltenyi BiotecGmbH,Bergisch Gladbach,Germany)分选 PBMC 表面上的CD14阳性单核细胞。根据通过流式细胞分析确定的细胞形态，CD14阴性细胞被 认为是猪外周血淋巴细胞(PBL)。纯化的单核细胞以IX IO5细胞/mL悬浮于含有10%热 灭活胎牛血清(FBS)、55ymol/L β -巯基乙醇和抗生素的这尔伯克氏改良伊格尔培养基 (DMEM)。然后在6孔板或60-mm细菌培养皿中37°C下在25ng/mL重组猪粒细胞-巨噬细 胞集落刺激因子(rpGM-CSF，R&D Systems, Minneapolis, MN)和25ng/mL重组猪白细胞介 素-4(rpIL-4，Endogen, Rockford, IL)存在下培养单核细胞。每三天用新鲜培养基替换一 半培养基。观察细胞以确定DC的特征形态。在第三天或第七天收集细胞并用作单核细胞 来源的树突细胞(MDDC)。单核细胞来源的巨噬细胞(Μ ΜΦ)以类似步骤发育，但在两种细 胞因子不存在下培养。在第五天收集细胞并用作Μ ΜΦ。连续细胞系的培养37°C下在培养器内在含10% FBS和抗生素的MEM中使幼仓 鼠肾成纤细胞系BHK-21、猴肾细胞系MARC-145和猪肾上皮细胞系H(I5生长，而37°C下在 培养器内在含有10% FBS和抗生素的RPMI 1640培养基中使猪单核细胞系3D4/31(ATCC CRL-2844)生长。稳定表达hDC-SIGN的小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞系通过NIH艾滋病研 究与参照试剂计划(Germantown，MD)获得并在本研究中重命名为3T3-HDCS。该细胞系在 含有10% FBS的DMEM中培养。cDNA末端(RACE)-PCR的RNA提取、反转录(RT)和简并PCR和快速扩增在第七 天和第十天之间收集在rpGM-CSF和rpIL_4存在下获自猪单核细胞的体外培养的猪单核细 胞来源的树突细胞(MDDC)。采用Rneasy小试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia, CA)从MDDC 分离总RNA，然后进行无RNA酶的DNase I处理。采用oligo-dT (寡脱氧胸苷酸)(Promega Corporation, Madison, WI)作为反向引物用Superscript〗〗阴性逆转录酶(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)从总RNA合成第一链cDNA。根据可获得的人和小鼠DC-SIGN 相关基因的多重序列比对设计几对与人和小鼠DC-SIGN基因中保守序列互补的简并引物。 用Advantage 2PCR试剂盒(Clontech，Palo Alto, CA)在50 μ L反应物中用简并引物进行 PCR，采用如下 PCR 参数-MV :2min ；然后 94°C :15sec,357. 5°C :30sec 和 72°C :lmin，30 个 循环，最后在72°C孵育:3min。仅当一组引物(NF-05和NR-05，下表1)用于扩增时，PCR片 段得到扩增。获得的PCR产物直接进行测序并与人和小鼠DC-SIGN相关基因的GenBank序 列进行比较。用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，I3aIo Alto, CA)按照生产商的用户手册进行RT和RACE-PCR。用于5' -RACE或3' -RACE的基因特异性引物分别为PDR-I 和PDF-I (表1)，它们是根据从简并PCR产物获得的序列信息设计的。通过TA克隆策略将 RACE 反应产物克隆到 pCR2. 1 载体中 Qnvitrogen Corporation, Carlsbad, CA)并测序。表lpDC-SIGN 的猪组织中简并 RT-PCR、5' -RACE禾Π 3' -RACE PCR、基因组PCR 的
寡核苷酸引物、基因测序、亚克隆和PCR检测
权利要求
1.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包括编码选自pDC-SIGN、pICAM-3和pLSECtin 的一种或多种蛋白的核苷酸序列、所述核苷酸序列中至少一个的补体和所述核苷酸序列中 至少一个的功能性限定部分。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述融合蛋白包括至少两种蛋白，其中 pLSECtin与pDC-SIGN连接，或与所述两种蛋白中至少一种的功能性限定部分连接。
4.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述融合蛋白还包括选自hDC-SIGN、 hL-SIGN、hLSECtin及其组合的至少一种蛋白或其功能限定部分。
5.根据权利要求3所述的核酸分子，其中所述融合蛋白还包括选自hDC-SIGN、 hL-SIGN、hLSECtin及其组合物的至少一种蛋白或其功能限定部分。
6.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述融合蛋白包含pDC-SIGN或pLSECtin的 糖识别结构域和hDC-SIGN、hL-SIGN、hLSECtin或其组合的胞质尾区、跨膜结构域或重复颈 区。
7.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述编码pDC-SIGN的核苷酸序列包括SEQID NO 1或其互补链。
8.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述编码pICAM-3的核苷酸序列包括SEQID NO :4、SEQ ID NO 39 或其互补链。
9.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述编码pLSECtin的核苷酸序列包括SEQID NO 36或其互补链。
10.一种生物学功能质粒或病毒载体，所述生物学功能质粒或病毒载体包含如权利要 求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一项所述的核酸分子。
11.根据权利要求10所述的生物学功能质粒或病毒载体，其中所述载体为 pTriEx-1. INeo0
12.—种分离的转染细胞或细胞系，所述细胞或细胞系表达选自pDC-SIGN、pICAM-3和 pLSECtin的至少一种或多种蛋白、至少一种所述核苷酸序列的补体和其功能限定部分。
13.根据权利要求12所述的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系表达融合蛋白。
14.根据权利要求13所述的细胞或细胞系，其中所述融合蛋白包括至少两种蛋白，其 中pLSECtin与pDC-SIGN或所述两种蛋白中至少一种的功能性限定部分连接。
15.根据权利要求13所述的细胞或细胞系，其中所述融合蛋白还包括选自hDC-SIGN、 hL-SIGN、hLSECtin及其组合的至少一种蛋白或其功能限定部分。
16.根据权利要求14所述的细胞或细胞系，其中所述融合蛋白还包括选自hDC-SIGN、 hL-SIGN、hLSECtin及其组合的至少一种蛋白或其功能限定部分。
17.根据权利要求15所述的细胞或细胞系，其中所述融合蛋白包含pDC-SIGN或 pLSECtin的糖识别结构域和hDC-SIGN、hL-SIGN、hLSECtin或其组合的胞质尾区、跨膜结构 域或重复颈区。
18.根据权利要求12、13、14或15中任一项所述的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞 系选自树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
19.根据权利要求12、13、14或15中任一项所述的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞 系选自 BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-K1、3D4/31、SJPL、IPEC-J2、THP-I、RAW 264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
20.制备蛋白产物的方法，所述方法包括在合适的营养条件下以允许所述蛋白产物 表达的方式使用权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一项所述的核酸分子转染的原核或真 核细胞生长，和分离所述核酸分子表达的所需多肽产物。
21.一种分离的蛋白，所述蛋白包括SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :5或SEQ IDNO :37。
22.—种分离的单克隆或多克隆抗体，所述抗体与SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO 37的氨基酸序列特异性结合。
23.根据权利要求22所述的抗体，其中所述抗体为多克隆抗体，且所述多克隆抗体与 包括 SEQ ID NO :13、SEQ ID NO 14 或 SEQ ID NO 13 与 SEQ ID NO 14 的组合的肽区特异 性结合。
24.一种杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系产生如权利要求22或23所述的抗体。
25.一种天然或人工合成的寡糖配体，所述寡糖配体与SEQ ID N0:2、SEQ IDNO :5或 SEQ ID NO 37的氨基酸序列特异性结合。
26.一种繁殖病毒的方法，所述方法包括(a)提供转染细胞或细胞系，所述转染细胞或细胞系包含编码选自pDC-SIGN、pICAM-3 和pLSECtin的一种或多种蛋白的核苷酸序列、至少一种所述核苷酸序列的补体和至少一 种所述核苷酸序列的功能性定义部分；(b)在细胞生长培养基中使所述转染细胞或细胞系生长以形成培养物；(c)用所述病毒接种所述培养物；和(d)在培养中在能有效繁殖所述病毒的条件下孵育已接种的培养物。
27.根据权利要求沈所述的方法，所述方法还包括孵育所述已接种的培养物直到观察 到致细胞病变效应或达到高滴度。
28.根据权利要求沈所述的方法，所述方法还包括溶解所述细胞以释放胞内病毒体和 收获病毒抗原。
29.根据权利要求沈、27或观所述的方法，其中步骤(a)提供包含编码融合蛋白的核 苷酸序列的转染细胞或细胞系。
30.根据权利要求四所述的方法，其中步骤(a)中的所述融合蛋白包括至少两种蛋白， 其中pLSECtin与pDC-SIGN或所述两种蛋白中至少一种的功能性限定部分连接。
31.根据权利要求四所述的方法，其中步骤(a)中的所述融合蛋白还包括选自 hDC-SIGN、hL-SIGN、hLSECtin及其组合的至少一种蛋白或其功能限定部分。
32.根据权利要求30所述的方法，其中步骤(a)中的所述融合蛋白还包括选自 hDC-SIGN、hL-SIGN、hLSECtin及其组合的至少一种蛋白或其功能限定部分。
33.根据权利要求31所述的方法，其中步骤(a)中的所述融合蛋白包含pDC-SIGN或 pLSECtin的糖识别结构域和hDC-SIGN、hL-SIGN、hLSECtin或其组合的胞质尾区、跨膜结构 域或重复颈区。
34.根据权利要求沈、27或观所述的方法，其中步骤(a)提供包含包括SEQIDNO :1或 其互补链的核苷酸序列的转染细胞或细胞系。
35.根据权利要求沈、27或观所述的方法，其中步骤(幻提供包含包括SEQIDNO :4、 SEQ ID NO :39或其互补链的核苷酸序列的转染细胞或细胞系。
36.根据权利要求沈、27或观所述的方法，其中步骤(&)提供包含包括SEQIDNO 36 或其互补链的核苷酸序列的转染细胞或细胞系。
37.根据权利要求沈、27或观所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或 细胞系树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
38.根据权利要求沈、27或观所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或 细胞系BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-K1、 3D4/31、SJPL、IPEC-J2、THP-U RAff264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
39.根据权利要求四所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
40.根据权利要求四所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-Kl、3D4/31、 SJPL, IPEC-J2、THP-U RAff264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
41.根据权利要求30所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
42.根据权利要求30所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-K1、3D4/31、 SJPL, IPEC-J2, THP-U RAW264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
43.根据权利要求31所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
44.根据权利要求31所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-KI、3D4/31、 SJPL, IPEC-J2、THP-U RAff264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
45.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
46.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-Kl、3D4/31、 SJPL, IPEC-J2、THP-U RAff264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
47.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
48.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-Kl、3D4/31、 SJPL, IPEC-J2, THP-U RAW264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
49.根据权利要求34所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
50.根据权利要求34所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-Kl、3D4/31、 SJPL, IPEC-J2、THP-U RAff264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
51.根据权利要求35所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
52.根据权利要求35所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-Kl、3D4/31、 SJPL、IPEC-J2、THP-I、RAW264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
53.根据权利要求36所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和滋养细胞。
54.根据权利要求36所述的方法，其中步骤(a)提供选自如下的转染细胞或细胞系 BHK-21、MARC-145、PK-15、C0S-7、VERO、CV-1、LLC-MK2、MDCK、MDBK,Raji B、CHO-Kl、3D4/31、 SJPL, IPEC-J2, THP-U RAW264. 7、MA_104、293T 和 ST 细胞。
55.根据权利要求沈、27或28所述的方法，其中所述病毒为包膜或无包膜病毒。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述病毒为选自如下的包膜病毒猪繁殖和呼 吸综合征病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪内源性逆转录病毒、猪血凝性脑 脊髓炎病毒、传染性胃肠炎病毒、日本乙脑病毒、人类免疫缺陷病毒、登革病毒、西尼罗河病 毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、猫冠状病毒、人巨细胞病毒、 猪巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒、单纯疱疹 病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、猪流感病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、非洲 猪瘟病毒、典型猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、假狂犬病毒、猪痘病毒、水泡口炎病毒、狂犬 病毒、东方型马脑脊髓炎病毒、马动脉炎病毒。
57.根据权利要求四所述的方法，其中所述病毒为包膜或无包膜病毒。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述病毒为选自如下的包膜病毒猪繁殖和呼 吸综合征病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪内源性逆转录病毒、猪血凝性脑 脊髓炎病毒、传染性胃肠炎病毒、日本乙脑病毒、人类免疫缺陷病毒、登革病毒、西尼罗河病 毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、猫冠状病毒、人巨细胞病毒、 猪巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒、单纯疱疹 病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、猪流感病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、非洲 猪瘟病毒、典型猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、假狂犬病毒、猪痘病毒、水泡口炎病毒、狂犬 病毒、东方型马脑脊髓炎病毒、马动脉炎病毒。
59.根据权利要求37所述的方法，其中所述病毒为选自如下的包膜病毒猪繁殖和呼 吸综合征病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪内源性逆转录病毒、猪血凝性脑 脊髓炎病毒、传染性胃肠炎病毒、日本乙脑病毒、人类免疫缺陷病毒、登革病毒、西尼罗河病 毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、猫冠状病毒、人巨细胞病毒、 猪巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒、单纯疱疹 病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、猪流感病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、非洲 猪瘟病毒、典型猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、假狂犬病毒、猪痘病毒、水泡口炎病毒、狂犬 病毒、东方型马脑脊髓炎病毒、马动脉炎病毒。
60.根据权利要求38所述的方法，其中所述病毒为选自如下的包膜病毒猪繁殖和呼 吸综合征病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪内源性逆转录病毒、猪血凝性脑 脊髓炎病毒、传染性胃肠炎病毒、日本乙脑病毒、人类免疫缺陷病毒、登革病毒、西尼罗河病 毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、猫冠状病毒、人巨细胞病毒、 猪巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒、单纯疱疹病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、猪流感病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、非洲 猪瘟病毒、典型猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、假狂犬病毒、猪痘病毒、水泡口炎病毒、狂犬 病毒、东方型马脑脊髓炎病毒、马动脉炎病毒。
61.根据权利要求39所述的方法，其中所述病毒为选自如下的包膜病毒猪繁殖和呼 吸综合征病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪内源性逆转录病毒、猪血凝性脑 脊髓炎病毒、传染性胃肠炎病毒、日本乙脑病毒、人类免疫缺陷病毒、登革病毒、西尼罗河病 毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、猫冠状病毒、人巨细胞病毒、 猪巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒、单纯疱疹 病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、猪流感病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、非洲 猪瘟病毒、典型猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、假狂犬病毒、猪痘病毒、水泡口炎病毒、狂犬 病毒、东方型马脑脊髓炎病毒、马动脉炎病毒。
62.根据权利要求40所述的方法，其中所述病毒为选自如下的包膜病毒猪繁殖和呼 吸综合征病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪内源性逆转录病毒、猪血凝性脑 脊髓炎病毒、传染性胃肠炎病毒、日本乙脑病毒、人类免疫缺陷病毒、登革病毒、西尼罗河病 毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、猫冠状病毒、人巨细胞病毒、 猪巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒、单纯疱疹 病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、猪流感病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、非洲 猪瘟病毒、典型猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、假狂犬病毒、猪痘病毒、水泡口炎病毒、狂犬 病毒、东方型马脑脊髓炎病毒、马动脉炎病毒。
63.根据权利要求55所述的方法，其中所述病毒为无包膜病毒。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述无包膜病毒为戊型肝炎病毒或猪圆环病毒 2型。
65.根据权利要求57所述的方法，其中所述病毒为无包膜病毒。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述无包膜病毒为戊型肝炎病毒或猪圆环病毒 2型。
67.克隆来自非灵长类大动物种属的未知DC-SIGNcDNA同源物的方法，所述方法包括 如下步骤(a)从动物静脉血中分离单核细胞来源的树突细胞并在合适宿主细胞中在允许所述树 突细胞的生长的合适营养条件下体外培养所述单核细胞来源的树突细胞；(b)提取RNA ；(c)采用根据编码人和小鼠DC-SIGN的核酸分子的多重序列比对设计成与人和小鼠 DC-SIGN核苷酸序列中保守序列互补的简并引物进行进行逆转录酶(RT)和PCR以合成第一 链cDNA，并通过RT-PCR扩增序列与人DC-SIGN同源的短片段；(d)采用分别为5'-RACE或3' -RACE设计的包含SEQ ID NO :9的基因特异性引物 PDR-I和包含SEQ ID NO 10的基因特异性引物PDF-I并根据简并PCR产物的序列信息在 所述短片段上进行逆转录和RACE-PCR ；(e)通过快速扩增cDNA末端(RACE)-PCR反应产物克隆动物体内所述未知DC-SIGN同 源物的全长cDNA的两个重叠片段；和(f)分离、纯化或测序所述动物的DC-SIGN同源物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述宿主细胞为CD 14阳性外周血液单核细胞、 源于脾的淋巴细胞或源于骨髓淋巴细胞的培养物。
全文摘要
本发明涉及编码新型猪DC-SIGN和LSECtin蛋白的独特、完整基因组序列(包括pDC-SIGN基因和pLSECtin的全长cDNA和基因的新型核苷酸序列)的克隆、鉴定和表征。本发明还提供了编码从猪的单核细胞来源的树突细胞新发现的猪ICAM-3同种型的核酸分子及其用途。具体来说，本发明涉及分离的核酸分子，所述核酸分子包括编码猪DC-SIGN、猪ICAM-3、猪LSECtin中的一种或多种的核苷酸序列、所述核苷酸序列的补体或所述核苷酸序列的功能限定部分或连接到蛋白的蛋白融合产物，所述蛋白可能来源于猪或人。本申请中还描述了分离和克隆所述新型猪基因的方法及将所述新核苷酸序列用于繁殖病毒特别是包膜病毒的改进方法的方法。本发明还包括可稳定地表达所述猪蛋白的新转染细胞或细胞系、新抗体等。
文档编号C07K14/705GK102066415SQ200880124056
公开日2011年5月18日 申请日期2008年10月29日 优先权日2007年10月29日
发明者孟祥金, 黄耀伟 申请人:弗吉尼亚科技知识产权有限公司