专利名称：不可水解的二磷酸核苷或三磷酸核苷衍生物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及不可水解的多磷酸核苷(non-hydrolyzable nucleoside polyphosphate)衍生物及包含它们的药物组合物。所述化合物有用于预防或治疗由P2Y受 体调节的疾病或病症，以及用于疼痛控制。
背景技术：
由配体门控离子通道(P2XR)和G蛋白偶合的受体(P2YR)组成的P2受体(P2R) 超家族主要通过细胞外核苷ATP、ADP、UTP或UDP来活化(Jacobson等人，2002)。另外， 通过数种多磷酸二核苷(dinucleoside polyphosphate) (二核苷酸)活化P2受体(TO 2003/0207825 ；Shaver 等人，2005)。P2YR是有吸引力的药物靶标，因为它们牵涉正常和病理生理条件下的许多组织和 器官中的各种功能的调节(Williams 和 Jarvis, 2000 ；Guile 等人，2001 ；Fischer, 1999)， 因此使得P2YR激动剂成为有潜力的药物。目前，作为药物提出的P2YR激动剂由酶促不稳 定和化学不稳定的核苷酸支架组成(Williams和Jarvis，2000 ；Fischer, 1999 ；Abbracchio 等人，2006 Jacobson 等人，2002 ；Laxman 和 Beavo, 2007)。克服基于核苷酸的药物候选物固有的不稳定性的方法包括使用(i)比相应的核 苷酸在代谢上更稳定的二核苷酸；( )非核苷酸P2R配体；(iii)核苷酸前药；以及(iv)基 于电子等排体(isoster)的不可水解的核苷酸。第一种方法是相当有前景的，事实上，已经在人临床前试验中给予数种二核苷酸。 例如，已经证明Ap4A、Up4U和Up4dC在麻醉期间有效降低血压，并且分别有效作为干眼病、囊 性纤维化和视网膜脱离的治疗剂(Kikuta等人，1999 ；Maminishkis等人，2002 ；Mundasad 等人，2001 ；Yerxa 等人，2002)。第二种方法在氯吡格雷(Plavix ，Sanof i-Synthelabo/BMS)(—种用于预防继发 性血管事件的抗血小板凝集剂)的情况下已经获得成功(Chow和ZiegelStein，2007)，这是 目前可获得的唯一的P2YR靶向药物。发挥P2Y12受体拮抗剂作用的氯吡格雷(Angiolillo 等人，2006a和2006b)不是核苷酸。第三种方法涉及掩蔽三酯核苷酸前药的制剂。这些前药(例如抗HIV核苷类似 物d4T)证明为膜溶性并在细胞内释放活性核苷酸(McGuigan等人，1993，1996a和1996b ； W0/2002/055521)。只报道了少数通过生物电子等排体(bioisoster)方法来改进基于核苷酸的药 物候选物(酶抑制剂或受体配体)的稳定性的尝试(Blackburn等人，1987 ；Cusack等人， 1987 ；He 等人，1997 ；Kowalska 等人，2007 ；Lin 等人，2001 ；Misiura 等人，2005 ；Romaniuk 和 Eckstein, 1981 ；Stingelin 等人，1980)。糖尿病是西方世界最普遍的慢性疾病之一，其影响高达5 %的人口。它是以由胰岛 素分泌、胰岛素作用或二者的组合的缺陷所引起的慢性高血糖伴随脂质和蛋白质代谢中的 其它异常为特征的一组异质性病症。除了其慢性代谢异常之外，糖尿病与牵涉各种器官，尤 其眼睛、神经、血管、心脏和肾的长期并发症有关，这可以导致失明、截肢、心血管疾病和终末期肾病。糖尿病并发症的发生似乎与血糖的慢性升高有关。糖尿病目前没有治愈方法； 然而，有效的血糖控制可以降低糖尿病并发症的发生率并减低它们的严重性。2型糖尿病也称作非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)，其影响大约95%的糖尿病患 者，似乎是胰岛素抵抗和相关胰岛素缺陷共存于其中的一种复杂的多基因疾病。因此，改进 胰岛素分泌是主要的治疗目标。胰岛素释放的缺陷本身不仅通过缺乏葡萄糖的第一期胰岛 素反应来表示，而且通过胰岛素释放量总体减少至正常分泌容量的10-20%来表示。具有2 型糖尿病的患者用各种口服抗糖尿病药物、胰岛素注射液或两者的组合来治疗。目前可得 的口服抗糖尿病药的目标是增加胰岛素从胰腺β “细胞分泌，降低外周胰岛素抵抗，或者 减慢从肠道吸收碳水化合物。大约一半的2型糖尿病病人用口服药治疗，其中有相当大的比例是用刺激胰岛素 分泌的药剂治疗。胰岛素促分泌剂的选择局限于磺酰脲类和相关化合物(格列奈类)，它 们通过与膜ATP敏感性钾通道的调节亚基结合，诱发其封闭来引起胰岛素分泌。然而，磺酰 脲类除了可能的对于它们的特异性靶标胰腺β“细胞的长期不利影响以外还具有一些不 希望有的效应。这些副作用包括由于在低葡萄糖浓度下刺激胰岛素分泌而导致的低血糖风 险、在大量病人中难以实现正常血糖、每年5-10%的充分血糖控制的继发性失效率以及对 心血管系统的可能的负面效应。P2YR在胰腺β细胞中的存在得到充分的文献描述，它们的活化导致了在刺激性 葡萄糖浓度下刺激胰岛素分泌。P2YR激动剂增强葡萄糖诱导的胰岛素释放的机制可能牵涉 环状AMP/蛋白激酶A信号转导途径，据报道，其增加与不依赖于Κ+ΑΤΡ通道的葡萄糖作用的 效力。已经表明各种P2R选择性配体在体内增加胰岛素分泌并降低血糖。配体的名单包 括2-甲硫基-ΑΤΡ，它快速地分解成2-MeS-腺苷，因此直接注入到胰-十二指肠动脉，腺苷 5’ -0-(2-硫基)二磷酸对于酶促水解是稳定的，因此静脉内或口服给药。几乎所有的现有合成P2-受体激动剂是对ATP或UTP药效团的修饰。将嘌呤(嘧 啶)环系统、核糖结构部分(moiety)或三磷酸链在一个或多个位置修饰(Fischer，1999)。 以前，我们已经报道了在C-2位置处携带长的硫醚取代(基)的ATP衍生物的合成，例如 2-硫醚-5，-0-(l-硫代三磷酸)腺苷衍生物的合成(Fischer等人，1999)。WO 2003/034978 (对应于US 7，319，093)公开了以ATP类似物的硼烷磷酸酯 (盐)(boranophosphate)电子等排体为基础的一系列有效的P2YJ选择性激动剂(腺 苷 _5 ‘ - α -硼烷三磷酸盐(adenosine-5 ‘ - α -borano-triphosphate)类似物)(Nahum 等人，2002 ；Major 等人，2004 ；TuIapurkar 等人，2004 ；Farret 等人，2006)。这些类似物被 证明在生理pH下是高度稳定的，并且在pHl. 4和37°C下是相对稳定的。此外，这些激动剂 对胞外三磷酸核苷二磷酸水解酶(e-NTPD酶)的水解具有相对抵抗性，并且证明在灌注大 鼠胰腺时具有高度有效的胰岛素促分泌作用。最有效的激动剂是2-MeS-ATP-a -B，1，与基 础分泌相比，其诱发了增强9倍的胰岛素分泌，具有28nM的EC5tlt5 2-MeS-ATP- α -B的胰岛 素释放作用是葡萄糖依赖性的，表明该化合物可以是治疗2型糖尿病的候选药物；然而，发 现它对于碱性磷酸酶不稳定，这使得该化合物用作药物是不合格的。发明概述在一个方面，本发明涉及通式I的化合物及其非对映异构体
7
其中X是通过9位连接的式Ia的腺嘌呤残基 其中R1是H ；卤素；0-烃基；S-烃基；NR4R5 ；杂芳基；未取代的烃基或被卤素、CN、SCN、 NO2、OR4、SR4、NR4R5或杂芳基取代的烃基，其中R4和R5各自独立地是H或烃基，或者R4和R5 与它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、氮或硫的其他杂原子的5元或6 元饱和或不饱和杂环，所述其他的氮是未取代的或者被烷基取代，所述烷基被商素、羟基或 苯基取代；且R2和R3各自独立地是H或烃基；或者X是通过1-位连接的式Ib的尿嘧啶残基 其中&是!1 ；卤素；0-烃基；S-烃基；NR8R9 ；杂芳基；未取代的烃基或者被卤素、CN、SCN、 NO2、OR8、SR8、NR8R9或杂芳基取代的烃基，其中R8和R9各自独立地是H或烃基，或者R8和R9 与它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、氮或硫的其他杂原子的5元或6 元饱和或不饱和杂环，所述其他的氮是未取代的或者被烷基取代，所述烷基被商素、羟基或 苯基取代；且R7 是 0 或 S ；Y 是 H、OH 或 NH2;Z1、Z2和Z3各自独立地是(Γ或BH3-；11和12各自独立地是0、012、00^1)2或朋，其中他1是卤素，优选为F或Cl ；η是O或1，条件是当η为O且评2为0时，Z1是ΒΗ3_ ；且当η是1时，WjP W2中的
8至少一个不是0 ；m 是 3 或 4;且B+表示药学上可接受的阳离子；但排除其中η是0，Z1和Z3各自为0_且W2是CH2或NH的化合物以及其中η是1， 且Z1-Z3各自为0_的化合物。在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含排除了其中η是0、Z1和Z3各自为 0_且W2是CH2或NH的化合物以及其中η是1和Z1-Z3各自为0_的化合物的通式I的化合 物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。本发明进一步提供包含通式I的化合物的药物组合物，其用于治疗由Ρ2Υ受体调 节的疾病、病症或状态(condition)，如2型糖尿病或疼痛。因此，在又一个方面，本发明涉及通式I的化合物或其药学上可接受的盐在制备 治疗由P2Y受体调节的疾病、病症或状态的药物组合物中的用途。因此，在又一个方面，本发明涉及通式I的化合物或其药学上可接受的盐，其用于 治疗由P2Y受体调节的疾病、病症或状态。在再一个方面，本发明提供在有需要的个体中治疗由P2Y受体调节的疾病、病症 或状态(例如2型糖尿病或疼痛)的方法，其包括对所述个体给予有效量的通式I的化合 物或其药学上可接受的盐。附图简述
图1A-1B示出了如通过81MHz下的31P匪R所监测的，在胃液样(gastric juice-like)条件下(在pHl. 4的KC1/HC1缓冲液中，37°C )本文中表示为2的化合物的 水解。化合物2的31P NMR谱为时间的函数，在图IA中示出；图IB示出了以上水解反应的 t1/2的测定，显示t1/2为65小时。图2A-2C示出了如通过HPLC所监测的，在胃液样条件下(在pHl. 4的KC1/HC1缓 冲液中，37°C )本文中表示为3B和4B的化合物的水解。图2A和2B分别示出了在t = 19 小时和t = 71小时时3B的HPLC色谱图，图2C示出了以上水解反应的t1/2的测定，显示3B 和4B的t1/2分别为19小时和14. 5小时。图3示出了如通过HPLC所监测的，在37°C下，人血清中的ATP、ADP和AMP的酶促 水解，显示ATP的tU2为3. 6小时。图4A-4C示出了如通过HPLC所监测的，在37 °C下，人血清中β， Y -CH2-2MeS-ATP (2)的酶促水解。图4A和4B分别示出了在t = 8小时和t = 15小时时， 人血清中的水解混合物的HPLC色谱图；图4C示出了以上水解反应的k(t1/2)的测定，显示 t1X2为12. 7小时。图 5 示出了 2-MeS-腺苷-5' -0-(1_ 硼烧基二磷酸盐)(2-MeS-adenosine_5 ‘ -0 -(1-boranodiphosphate)) (19)降低大鼠在葡萄糖攻击之后的血糖。如实施例12中所述， 在葡萄糖攻击之后10分钟用2. 5mg/kg或盐水静脉内(IV)治疗饥饿的Wistar大鼠(η = 5)。作为阳性对照，在-30分钟时口服给予格列本脲(0.25mg/kg)。发明详述在一个方面，本发明涉及如上文定义的通式I的不可水解的二 _或三磷酸核苷衍 生物，其是P2Y受体亚型选择性激动剂。
9
本文所使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘，优选是氟或氯。不同基团R1-R9的任何定义中，术语“烃基”指仅仅含有碳和氢原子的基团，该基团 可以是饱和或不饱和的、直链或支链的、环状或无环的，或芳族的，包括C1-C8烷基、C2-C8烯 基、C2-C8 炔基、C3-Clt^烧基、C3-Clt^烯基、C6-C14 芳基、(C1-C8)烧基(C6-C14)芳基禾口(C6-C14) 方基(C1-C8)烧基。术语"C1-C8烷基”通常指具有1-8个碳原子的直链或支链烃基，包括例如甲基、乙 基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2，2-二甲基丙基、正己基、正 庚基、正辛基等。优选C1-C6烷基，最优选甲基。术语"C2-C8烯基”和"C2-C8炔基”通常分别 是指具有2-8个碳原子和一个双键或三键的直链和支链烃基，包括乙烯基、3- 丁烯-1-基、 2-乙烯基丁基、3-辛烯-1-基等以及丙炔基、2- 丁炔-1-基、3-戊炔-1-基等。优选C2-C6 烯基。术语"C3-Cltl环烷基”指环烃基或双环烃基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、金 刚烷基、双环[3.2. 1]辛基、双环[2.2. 1]庚基等。术语"C6-C14芳基”表示碳环芳族基团， 例如苯基和萘基，术语“芳(C1-C8)烷基”表示芳基烷基，例如苄基和苯乙基。当基团R1是0-烃基或S-烃基或是被OR4或SR4基团取代的烃基，其中R4是烃基 时，所述烃基中的每一个优选是C1-C6烷基，最优选甲基；或芳基，最优选苯基；或芳烷基，最 优选苄基。当基团R2和R3中的一个或两个是烃基时，这些烃基中的每一个优选是C1-C6烷基， 最优选甲基；或芳基，最优选苯基；或芳烷基，最优选苄基。当基团R6是0-烃基或S-烃基或是被OR8或SR8基团取代的烃基，其中R8是烃基 时，所述烃基中的每一个优选是C1-C6烷基，最优选甲基；或芳基，最优选苯基；或芳烷基，最 优选苄基。在基团NR4R5中，R4和R5各自独立地是H或如以上定义的烃基，或者与它们所连 接的N原子一起形成饱和或不饱和的(优选5元或6元的)杂环，所述杂环任选含有1或 2个选自氮、氧和硫的其他杂原子。此类环可以被例如一个或两个C1-C6烷基取代，或者 在所述环(例如哌嗪环)的第二个氮原子处被一个烷基或羟烷基取代。基团NR4R5的实 例包括但不限于氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基、苯基甲基氨基、吡咯烷基 (pyrrolidino)、哌唆子基、四S批唆基(tetrahydropyridino)、哌嗪基(piperazino)、乙 基哌嗪基、羟乙基哌嗪基、吗啉代、硫代吗啉代、噻唑啉基(thiazolino)等。在基团NR8R9中，R8和R9各自独立地是H或以上定义的烃基，或者与它们所连接的 N原子一起形成饱和或不饱和的(优选5元或6元的)杂环，所述杂环任选含有1或2个选 自氮、氧和硫中的其他杂原子。此类环可以被例如一个或两AC1-C6烷基取代，或者在所述 环(例如哌嗪环)的第二个氮原子处被一个烷基或羟烷基取代。基团NR8R9的实例包括但 不限于氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基、苯基甲基氨基、吡咯烷基、哌啶子基、 四氢吡啶基、哌嗪基、乙基哌嗪基、羟乙基哌嗪基、吗啉代、硫代吗啉代、噻唑啉基等。术语“杂芳基”指衍生自含有1-3个选自N、0和S的杂原子的单环或多环的基团， 具有芳族特性的不饱和键(unsaturation)。杂芳基的非限制性例子包括吡咯基、呋喃基、噻 吩基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡啶基、1，3-苯并二噁英基、吡 嗪基、嘧啶基、1，3，4-三嗪基、1，2，-三嗪基、1，3，5-三嗪基、噻嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯 并呋喃基、异苯并呋喃基、吲哚基、咪唑并[l，2_a]吡啶基、吡啶并[l，2_a]嘧啶基、苯并咪
10唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基。杂芳基环可被取代。应理解，当多环杂芳族环被取代时，可 以在杂环上或在碳环上进行取代。说明书中所描述的化合物，式I化合物、起始化合物和中间体以及已知的化合 物，在本文均通过粗体阿拉伯数字1-22来标识。在本文的附录A、方案1-5中描述了完全 化学结构。化合物2也通过名称β，Y -CH2-2MeS-腺苷-5 ‘-三磷酸盐来标识，化合物 3也通过名称腺苷-β，y-CH2-5' -0-(l-硼烷三磷酸盐)来标识，化合物4也通过名称 2MeS-腺苷-β，y -CH2-5' _0-(1_硼烷三磷酸盐)来标识，化合物17也通过名称2_MeS_腺 苷-5' -二氯亚甲基-二磷酸盐来标识，化合物18也通过名称2-MeS-腺苷-5' - 二氟亚 甲基_ 二磷酸盐来标识，化合物19也通过名称2MeS_腺苷-5 ‘ -0- (Pa-硼烷基)二磷酸 盐来标识，化合物20也通过名称腺苷-β，Y -CCl2-5 ‘ -0- (1-硼烷三磷酸盐)来标识，化 合物21也通过名称2MeS-腺苷-β，Y -CCl2-5 ‘ -0- (1-硼烷三磷酸盐)来标识，且化合物 22也通过名称2MeS-腺苷-β，Y _CF2_5 ‘ -0- (1-硼烷三磷酸盐)来标识。在一个实施方案中，本发明的化合物是含有0-2个^13_基团的二磷酸盐衍生物 (diphosphate derivative)，其中η是0。在优选实施方案中，该化合物不含硼烷基；或者它 在α位处含有仅仅一个硼烷基，其中21是^13_且22是0_，或者在β位处含有仅仅一个硼 烷基，其中Z3是BH3-且Z1是0_ ；或者在α和β位处含有两个硼烷基，即，Z1和Z3是ΒΗ3_。在另一个实施方案中，本发明的化合物是含有1-3个BH3-基团的三磷酸盐衍生物 (triphosphate derivative)，S卩，η是1。在优选实施方案中，该化合物在α位处包含仅 仅一个硼烷基，其中Z1是ΒΗ3_，且Z2和Z3是0_ ；在β位处包含仅仅一个硼烷基，其中Z2是 BH”且Z1和Z3是0_，或者在γ位处包含仅仅一个硼烷基，其中Z3是BH”且Z1和Z2是0_ ； 在α和β位处包含两个硼烷基，其中Z1和Z2是BH3-,且Z3是0_;在α和Υ位处包含两 个硼烷基，其中Z1和Z3是ΒΗ3_，且Z2是0_，或者在β和γ位处包含两个硼烷基，其中Z2和 Z3是BH3-,且Z1是0_ ；或者在α、β和Υ位处包含三个硼烷基，其中Z1-Z3是ΒΗ3_。在一个实施方案中，X是腺嘌呤残基，即，本发明的化合物是ATP或ADP衍生物。优 选地，所述化合物是其中X是腺嘌呤残基，R1是H或S-烷基(优选S-甲基)，R2和R3各自 独立地是H ;Υ是OH ;η是1 -,I1是BH3- ;Ζ2和Z3是0_ J1是0 ；以及W2是CH2XF2或CCl2的那 些化合物；其中X是腺嘌呤残基，R1是H或S-烷基(优选S-甲基)，R2和R3各自独立地是 H ;Υ是OH ;η是0 J1和Z3是0_，且W2是CF2或CCl2的那些化合物；以及其中X是腺嘌呤残 基，R1是H或S-烷基(优选S-甲基)，R2和R3各自独立地是H ;Y是OH ;n是0 (L1是BH3_ ； 且W2是0的那些化合物。在一个优选实施方案中，本发明的化合物是通式I的化合物，其中X是腺嘌呤残 基，R1是H，R2和R3是H，Y是0H，η是1，Z1是BH3_，Z2和Z3是0_，W1是0且W2是CH2 (化合 物3)。由于在P α的手性中心，该化合物具有一对非对映异构体(化合物3Α和3Β)。在另一个优选的实施方案中，本发明的化合物是通式I的化合物，其中X是腺嘌呤 残基，R1是SMe5R2和R3是H，Y是0Η，η是LZ1是BHpZ2和Z3是OM1是0且W2是CH2 (化 合物4)。更优选地，本发明的化合物是化合物4的非对映异构体B，其特征在于，当使用半制 备反相Gemini 5u柱(C-18110A，250 X 10mm，5微米)和流速为5ml/min的等度洗脱[IOOmM 三乙基乙酸铵(TEAA)，pH 7(A) MeOH (B), 85 15]，从非对映异构体的混合物中分离时 具有5. 57分钟的保留时间(Rt)(化合物4B)。
在进一步优选的实施方案中，本发明的化合物是通式I化合物，其中X是腺嘌呤残 基，R1是SMe, R2和R3是H，Y是0H，η是0，Z1和Z3是0_，且W2是CCl2 (化合物17)。在另一个优选实施方案中，本发明的化合物是通式I化合物，其中X是腺嘌呤残 基，R1是SMe, R2和R3是H，Y是0Η，η是0，Z1和Z3是0_，且W2是CF2 (化合物18)。在又一个实施方案中，本发明的化合物是通式I化合物，其中X是腺嘌呤残基，R1 是SMe，R2和R3是H，Y是0Η，η是0，Z1是BH3_，Z3是0_，且W2是0 (化合物19)。更优选地， 本发明的化合物是化合物19的非对映异构体Α，其特征在于当使用半制备反相Gemini 5u 柱(01811(^，250父10_，5微米)和流速为 lml/min 的等度洗脱[IOOmM ΤΕΑΑ,ρΗ 7(A) 乙腈(Β)，88 12]，从非对映异构体的混合物中分离时具有8. 073分钟的保留时间(Rt) (化合物19Α)。在又一个优选实施方案中，本发明的化合物是通式I化合物，其中X是腺嘌呤残 基，R1, R2和R3是H，Y是0Η，η是1，Z1是BH3_，Z2和Z3是0_，W1是0 ；且W2是CCl2 (化合物 20)。该化合物具有两种非对映异构体(化合物20Α和20Β)。在又一个进一步优选的实施方案中，本发明的化合物是通式I化合物，其中X是腺 嘌呤残基，R1是SMe，R2和R3和H，Y是0Η，η是1，Z1是BH3_，Z2和Z3是0_，W1是0 ；且W2是 CCl2 (化合物21)。该化合物具有两种非对映异构体(化合物2IA和21Β)。在又一个进一步优选的实施方案中，本发明的化合物是通式I化合物，其中X是腺 嘌呤残基，R1是SMe，R2和R3是H，Y是0Η，η是1，Z1是BH3_，Z2和Z3是0_，W1是0 ；且W2是 CF2 (化合物22)。该化合物具有两种非对映异构体(化合物22Α和22Β)。在另一个实施方案中，X是尿嘧啶残基，即，本发明的化合物是UTP或UDP衍生物。 优选地，所述化合物是其中X是尿嘧啶残基，R6是H或S-烷基(优选S-甲基)，R7是0或 S ;Υ是OH ;η是1 -,I1是BH3- ;Ζ2和Z3是0_ 是0 ；且W2是CH2, CF2或CCl2的那些化合物； 以及其中X是尿嘧啶残基，R6是H或S-烷基(优选S-甲基)，R7是0或S ;Υ是OH ;η是0 ； Z1和Z3是0_ ；且W2是CF2或CCl2的那些化合物。本发明包括如以上所定义的式I化合物、其非对映异构体和其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，阳离子B是碱金属无机阳离子，例如但不限于Na+、K+和Li+。在另一个实施方案中，阳离子B是铵(NH4+)或者它是从式R4N+的胺衍生的有机阳 离子，其中每一个R独立地选自H K1-C22烷基，优选C1-C6烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙 基、丁基等；苯基；或杂芳基，例如吡啶基、咪唑基、嘧啶基等；或者两个R与它们所连接的氮 原子一起形成任选含有选自N、S和0的其他杂原子的3-7元环，例如吡咯烷、哌啶和吗啉。在进一步的实施方案中，阳离子B是阳离子脂质或阳离子脂质的混合物。阳离子 脂质常常在作为传递剂使用之前与中性脂质混合。中性脂质包括但不限于卵磷脂；磷脂酰 基-乙醇胺；二酰基磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇 胺、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺；磷脂酰基-胆碱；二酰基磷 脂酰胆碱，例如二油酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱 和二硬脂酰基磷脂酰胆碱；脂肪酸酯；甘油酯；鞘脂；心磷脂；脑苷脂；神经酰胺；和它们的 混合物。中性脂质还包括胆固醇和其它3β羟基-固醇。本文考虑的其它中性脂质包括磷脂酰甘油；二酰基磷脂酰甘油，例如二油酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油和二硬脂酰基磷脂酰甘油；磷脂酰丝氨酸；二酰基磷脂 酰丝氨酸，例如二油酰基磷脂酰丝氨酸或二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸；和二磷脂酰基甘油。阳离子脂质化合物的实例包括但不限于Lipofectin (Life Technologies, Burlingtor^Ontario)(阳离子脂质N-[l-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵 和二油酰基磷脂酰基-乙醇胺的 1 l(w/w)制剂)；Lipofectamine (Life Technologies, Burlington, Ontario)(聚阳离子脂质三氟乙酸2，3- 二油基氧基_N_[2(精胺-羧酰胺 基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵和二油酰基磷脂酰基-乙醇胺的3 l(w/w)制剂)； Lipofectamine Plus (Life Technologies, Burlington, Ontario)(Lipofectamine 禾口 附力口 试剂(Plus reagent)) ；Lipofectamine 2000(Life Technologies, Burlington, Ontario)(阳离子脂质)；Effectene (Qiagen, Mississauga，Ontario)(非脂质体脂质制 齐[J ) ；Metafectene (Biontex, Munich, Germany)(聚阳离子月旨质)；Eu-fectins (Promega Biosciences, San Luis Obispo, Calif.)(乙酉享阳离子月旨质(ethanolic cationic lipid)编号 1-12 C52H106N6O4 · 4CF3C02H、C88H178N8O4S2 · 4CF3C02H、C40H84NO3P · CF3CO2H, C50H103N7O3 · 4CF3C02H、C55H116N8O2 · BCF3CO2H, C49H102N6O3 · 4CF3C02H、C44H89N5O3 · 2CF3C02H、 CiooH2OeNi2O4S2 · 8CF3C02H、C162H330N22O9 · 13CF3C02H、C43H88N4O2 · 2CF3C02H、C43H88N4O3 · 2CF3C02H、 C41H78NO8P) ；Cytofectene (Bio-Rad, Hercules, Calif.)(阳离子脂质和中性脂质的混合 物)；GenePORTER(Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.)(中性脂质(Dope)和阳 离子脂质的制剂)和 FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，Ind.)(基 于非脂质体试剂的多组分脂质)。不可水解的多磷酸核苷类似物已广泛用作核苷酸水解酶的探针和抑制剂 (Labataille 等人，1995 ；Yanachkov 等人，1997 ；Spelta 等人，2003)。用亚甲基替代 ATP 中的β，Y-桥接氧(即，β，Y-CH2-ATP)赋予了对核苷酸磷酸水解酶的水解的显著抵抗 性。例如，β , Y-CH2-ATP被鉴定为甘油激酶的抑制剂(Bystrom等人，1997)，3'-叠氮 基-3‘-脱氧-胸苷-5' -β , y -CF2-TP(ΑΖΤ-5‘ -β , y -CF2-TP)中的 5‘ -β , y -CF2-TP 结构部分使得AZT (人免疫缺陷逆转录酶(HIV-RT)的有效抑制剂)在血清和细胞提取物 中稳定(Wang等人，2004)。类似地，β , Y-CH2-ATP抑制洗涤剂溶解的e_NTPD酶(Picher 等人，1996)。另外，β，y -CH2-ATP选择性抑制由e-NPP以及e-NTPD酶催化的ATP水解 (Jos印h 等人，2004)。已将β，γ -CH2-ATP和类似物评价为某些Ρ2受体亚型的代谢稳定性配体(Spelta 等人，2003 ；El-Tayeb 等人，2005 ；Chen 和 Lin，1997 ；Yegutkin 和 Burnstock，2000 ； Zi謹ermann，2000 Joseph等人，2003)。例如，发现β，Y -CH2-ATP是有效的P2XJ激动剂 (Burnstock 等人，1994 Janssens 等人，1996)，但对于 P2X2/3R 是弱激动剂(Spelta 等人， 2003)。β，γ -CH2-ATP 不活化 PZY1R(BurnstC)Ck 等人，1994 Janssens 等人，1996)，但却是 P2YJ的弱竞争性拮抗剂，抑制由2-MeS-ADP引起的应答(Sak等人，2000)。虽然在酶促试验中水解稳定，但β，Y -CH2-ATP在132ml星形细胞瘤和C6神经 胶质瘤细胞中通过牵涉通过e-NPP (β , y -CH2-ATP- > AMP)和CD73 (AMP- >腺苷)的系列 催化的紧密偶联反应而快速代谢为腺苷(Jowph等人，2004)。虽然我们意识到β，Y -亚甲基作为稳定化电子等排体在β，Y -CH2-ATP抗NTPD 酶-介导的水解中的优点，但我们认识到，它不会保护不稳定的α，β-磷酸二酯键。此外，
13我们推测，该亚甲基电子等排体将如以上对于β，Y-CH2-ATP所述降低核苷酸对于P2YJ的 活性。因此，除了选择为保护ATP中的该水解不稳定的键的β，Y-CH2-基团以外，α磷酸 被硼烷磷酸结构部分取代，以稳定ATP的α，β -磷酸二酯键抗NTPD酶(Nahum等人，2002) 和NPP (Nahum等人，2006)水解。为了对抗β，Y亚甲基的效应和提高对Ρ2Υ^的效力，我 们用SMe基团取代ATP的C2-位(Fischer等人，1993)。已开发了几种化学方法，用于在核苷酸中形成焦磷酸酯键。其中β，Y-桥接 氧被亚甲基取代的核苷酸类似物可便利地通过以下方式制备活化单磷酸核苷(NMP)的 5’ _磷酸根(5’ -phosphate)，形成磷酰基供体，随后与亚甲基双膦酸盐(磷酰基受体)反 应。核苷_5’ -单磷酸和亚甲基双膦酸盐的酸酐通过以下方式制备用羰基二咪唑(CDI) (Padyukova等人，1999)、三氟乙酸酐和N-甲基咪唑(Mohamady和Jakeman，2005)或者二环 己基碳化二亚胺(DCC) (Myers等人，1963)活化NMP，随后与亚甲基双膦酸或其盐缩合。2-MeS- β，y -CH2-ATP⑵先前以三步合成来获得首先制备2_MeS_AMP，然后用羰 基-二咪唑活化AMP类似物，最后与亚甲基-二膦酸反应(Cusack等人，1987)。没有报道 这些反应的条件和产物收率。因此，我们尝试改进该化合物的合成并提出短的单罐合成，如 下文实施例1中详细描述和方案1中所描述的。为了确保在5，-OH处的2-MeS-腺苷的选择性反应(Macfarlane, 1992)，我们 使用2' ,3'-甲氧基亚甲基-2-MeS-腺苷5a作为起始原料。因此，首先在Proton Sponge (Aldrich) (1，8_双(二甲基氨基)萘)的存在下，用POCl3在磷酸三甲酯(TMP)中 于0°C处理5a 3小时，随后在0°C下加入双(三丁基铵)亚甲基-二膦酸盐和三丁胺。最 后，在0. 5M TEAB中水解，将甲氧基亚甲基去保护，以9%总收率获得2。2的低总收率鼓励我们使用未经保护的核苷5b作为起始原料。事实上，用POCl3 在TMP中(在Proton Sponge 的存在下)于0°C处理5b 2小时，随后在0°C下加入双(三 丁基铵)亚甲基-二膦酸盐和三丁胺，持续25分钟，并在0.5M TEAB中水解，以20%总收 率获得产物2。主要的副产物是2-MeS-AMP，没有获得2' ,3'-环状-磷酸-2_MeS-( β， Y -CH2-ATP) (2 ‘，3' -cyclic-phosphate-2-MeS-(3，γ-CH2-ATP))(即，在+20ppm 下没 有观察到信号)，这表明不需要保护2’，3’ -羟基。以前，我们已经开发了类似物1的一种有效的四步单罐合成(Nahum等人，2002)。 本文中，如在实施例2-3中详细描述和方案2中所示出的，我们已经改良了用于制备3和4 的合成法。该合成方法中亚磷酸化(phosphitylation)和硼化试剂的使用需要使用受保护 的核苷起始原料。为此目的，我们已经用甲氧基亚甲基保护核苷2’，3’ -羟基，所述甲氧基 亚甲基在贯穿整个合成中保持稳定并且在最后步骤中被有效除去。第一合成步骤包括化合物9的5’ -OH的亚磷酸化。为此目的，我们已经尝试了几 种亚磷酸化试剂。因此，用[(iPr)2N]2PCl在0°C下处理9几小时；然而，大多数起始原料在 RT下即使在14小时之后也没有消耗。使用氯苯并二氧杂膦(dioxaphosphorine)，大多数起 始原料9在RT下在15分钟之后消耗。然而，在RT下经10分钟加入1. 5当量亚甲基-双 膦酸盐和在RT下经30分钟加入10当量BH3 · SMe2时，仅仅获得痕量的产物3。最后，发现 PCl3是最好的亚磷酸化试剂。起始原料9在少于30分钟内被消耗。此外，由于PCl3的高 反应性，与亚甲基双膦酸盐的偶联相当快速(11分钟)。最后，在0°C下加入BH^SMe2，然 后将该反应混合物在RT下搅拌30分钟。基于粗反应混合物的81MHz 31P NMR，这些条件以
1439%的收率提供产物3。除了 3以外，AMP-α-BH3和腺苷-5，-H-膦酸分别以1 0. 46 约1的比率作为副产物获得。通过31P NMR和MS(电喷雾电离)两者来鉴定这些副产物。以相同方式在LC分离之后以28%的总收率从5a获得产物4。通过1H和31P NMR,高分辨快原子轰击(FAB) MS和在双溶剂系统中的HPLC来确定 产物的身份和纯度。产物3和4的31P NMR谱显示了在大约83ppm处作为多重峰的典型P α 信号。3和4的1H NMR谱显示了作为在大约0.4ppm处的非常宽的信号的硼烷氢(borane hydrogen)原子。由于Pa处的手性中心，类似物3和4各自作为一对非对映异构体而获得。在1H 和31P NMR谱二者中，在3和4的两种非对映异构体的化学位移之间存在轻微差别。例如， 对于3非对映异构体，在8. 59ppm和8. 56ppm处，观察到H8的两组信号。通过反相HPLC充 分分离这些异构体，在它们的保留时间上具有大约2分钟差别。首先洗脱的异构体称为A 异构体，另一种异构体称为B异构体。为了探究P2AR激动剂2-4作为药物候选物的适宜性，我们评价了它们的水解稳 定性。尤其，β，Y -CH2-ATP类似物2-4的水解稳定性通过31P NMR谱或HPLC-MS在模拟胃 液酸度的条件下(即PH 1. 4/370C )来监测。如下文实施例4-5所示，基于31P NMR谱，在这些条件下，化合物2表现出相对高 的稳定性和相对于其浓度的准一级指数衰减速率方程(pseudo first-order exponential decay rate equation)，其中在pH 1. 4/37°C下测定的其半衰期为65小时。类似地，基于 HPLC，化合物3 (异构体B)显示出准一级指数衰变速率方程化合物3的水解描述在方案3 中)。化合物3B在pH 1.4/37 下测定的半衰期为19小时。同样地，以同样方式测定的化 合物4的半衰期为14. 5小时。2和3的水解率常数在相同条件下与2-MeS-ATP- α -BH3的 水解率常数相比代表其化学稳定性的约3-11倍的改进(5. 9小时的t1/2)。先前，我们已经发现，化合物1容易被碱性磷酸酶水解，大多数降解为 2-MeS-AMP- α -BH3,但也能检测到少量的2_MeS_ADP- α -ΒΗ3。具体地说，在碱性磷酸酶中于 37°C将1孵育12分钟之后，仅仅保留40%的1，而在100分钟之后，通过HPLC-MS仅能检测 到痕量的1。因此，为了比较化合物2-4与化合物1对碱性磷酸酶的水解抵抗性，我们用该酶将 各种类似物在37°C下孵育30分钟，如实施例6中所示，酶促反应混合物的HPLC分析指示， 化合物2-4在这些条件下保持完整无缺。用于治疗目的核苷-5’ -三磷酸的使用由于其在细胞外介质中快速脱磷酸而受到 限制。合成核苷酸的细胞外浓度通过胞外ATP酶(ecto-ATPases)水解(以及胞外核苷酸 二磷酸激酶合成；参见细胞外ATP的调节)来调节(Zimmermann，2000 ；Yegutkin等人，2001 和2002 ；Lazarowski等人，1997和2000)。如在Zimmermann (2000)中所描述的，已经鉴定 了四个主要的胞外核苷酸酶家族(i)胞外核苷5'-三磷酸二磷酸水解酶(e-NTPD酶)； ( )胞外核苷酸焦磷酸酶(e-NPPs) ； (iii)糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚固(anchored)的胞 外-5'-核苷酸酶；以及(iv)GPI-锚固的碱性磷酸酶(APs)。属于细胞表面酶的e-NTPD 酶1-3将细胞外ATP降解为ADP，并将ADP降解为AMP，释放无机磷酸，而e_NPPl_3将ATP 直接水解为AMP和焦磷酸。细胞外AMP进而可通过胞外碱性磷酸酶被降解为腺苷。血清含 有脱磷酸酶，因此提供体内细胞外环境的良好模型系统。
膦酸修饰的dNTP类似物在人血清中(Arzumanov等人，1996 ;Dyatkina等人， 1996 ；Shirokova 禾口 Dyatkina，1996)禾口月JL 肉 I ffjiJ 齐Ll (muscle strips preparations) (Cusack等人，1987)中显示出增强的针对脱磷酸酶的稳定性。因此，在后一种制剂中，在60 分钟孵育之后没有检测到β，Y -CH2-ATP和2-MeS- β，y -CH2-ATP被外核苷酸酶降解，在 此期间，ATP被完全脱磷酸(Cusack等人，1987)。为了确定化合物2-4在人血清中的半衰期，将这些化合物在人血清和RPMI-1640 中在37°C下孵育1直至144小时，并且将它们的水解与ATP的水解在相同条件下进行比较。 如实施例7中所示，将ATP水解为ADP和AMP，具有3. 6小时的半衰期，而在相同条件下，化 合物2、3A和3B大部分被水解为相应的核苷-单磷酸(硼烷磷酸)，分别具有12. 7、14. 1和 47. 1小时的半衰期。使用不同的评价方法，ATP以7. 7小时的半衰期被水解，而在相同条件 下，化合物4B以71. 9小时的半衰期被水解。这些值表示ATP的代谢稳定性具有3. 5-20倍 的取决于取代的增强。在实施例11中所述的实验中，检查式I的各种化合物对人星形细胞瘤细胞中表达 的G蛋白偶联的P2YRs P2Yp P2Y2、P2Y4和P2Y6的活性。首先检查的化合物是化合物2_4， 如所示那样，化合物2和4Β是P2YJ的激动剂，分别具有0. 08 μ M和17. 2 μ M的EC50 (相比 之下2-MeS-ADP具有0. 004 μ M的EC5tl)，并且在100 μ M下对P2Y6R具有轻微的激动效应。 化合物3A、3B和4A对于所测试的P2YRs具有不明显的活性。尽管发现化合物2相比于化合物4B是更有效且更有选择性的P2YJ激动剂，但它 的效力在相关系统中比2-MeS-ADP (EC5tl 4nM)或2_MeS_ATP低大约一个数量级(EC5tl InM, 在表达γΡ2Υ^的HEK293细胞中。通过Ca2+动员来测定EC5tl) (Major等人，2004)。2的相对降 低的效力可能与膦酸比磷酸具有更高的PKa值(8. 4比6. 5)有关(Blackburn等人，1981)。 尤其，尽管在分析条件下，PH 7.4(和可能在受体结合袋内)，91%的2-MeS-ADP(ATP)被 电离，仅仅9%的化合物2(膦酸结构部分)被电离。2的这种低电离度的结果是如下所 述的与受体的相互作用较弱。为了评价该假设是否正确，我们然后检查了 2-MeS-ADP-a， β -CCl2 (或 CF2)(分另Ij 为 17 禾口 18)、2-MeS-ADP α B (异构体 19Α)禾口 2_MeS_ATP α B— β， ￥-012(异构体2认和218)对于P2YJ的激动效应。化合物17、18和21 (尤其CF2类似 物)中的末端膦酸根(terminal phosphoanate)的pKa值是大约6. 7，表明这些类似物应 该与P2Yi受体具有改进的相互作用，因此显著改进对P2A受体的活性。不过，如在实施例 11中进一步所示，虽然发现这些化合物中的每一种相比于化合物2是效力和选择性更低的 P2YJ激动剂，但发现化合物19A对于P2YJ是最有效和最有选择性的(化合物17、18、19A、 21A 和 21B 的 EC50 分别为 3. 1,0. 98,0. 038,0. 57 和 1. 2 μ M)。以前，我们计算了 Z-BUS-ATP = PZY1R络合物的模型，且发现该核苷酸类似物的P β， Y与Ρ2Υ^结合部位内的带正电荷的Lys240和Argl28相互作用(Major和Fischer，2004)。 因此我们假设，化合物2的膦酸结构部分的较高的pKa可能导致与P2AR结合袋的重要离子 相互作用的损失，结果降低EC5tl值。虽然由于PCP对POP角和C-P对O-P键长的差别带来的几何考虑因素也可能在 2对2-MeS-ADP(ATP)的分子识别中起重要作用，然而，这些差别仍然相当小(PCP和POP 角_分别为117. 0和128. 7 ；以及C-P和0-P键长-分别为1.79人和1.63A)，这表明决定2 的亲和性和活性的主要参数是膦酸基团的PKa值。
化合物2、4B、17、18、19A、2IA和2IB对P2Y^具有活性，而化合物3Α和3Β实际上无 活性的事实可能归因于2-MeS-腺嘌呤结构部分/腺嘌呤与P2YJ结合袋的改进的相互作用 (Major等人，2004,Major和Fischer，2004)。尤其，除了对于ATP类似物的三磷酸结构部分 所观察到的针对P2YJ的强识别网络之外，还观察到腺嘌呤环的虽然较弱的另一重要的相 互作用网络(Major和Fischer，2004)。这些相互作用是重要的，因为它们改进对受体的亲 和力并确定受体亚型的选择性。对N\N6和N7的特异性氢键相互作用由Arg310、Ser314和 可能的Tyr58提供。这些相互作用在C2处的SMe基团的存在下由于电子效应而增强。艮口， 硫代甲基增加在腺嘌呤Nl-位置处的电子密度，因此提高其作为氢键受体的效力。另外，腺 嘌呤环与Phel31的π -堆叠相互作用在用SMe基团取代C2时进一步增强，因为在该衍生物 中，腺嘌呤环在η-堆叠电荷转移络合物中起着电荷供体分子的作用。此外，该取代基获得 在腺嘌呤结构部分与受体之间的更刚性配合。具体地，化合物2、4Β、17、18、19Α、21Α和21Β 的C2-硫代甲基形成与包括Leul04、Prol05、Ilel30和Leul35的P2YJ疏水袋的疏水性相 互作用。我们已经报道了 C2-取代的ATP- α -B类似物不被P2Y2R所充分耐受(Tulapurkar 等人，2004)。发现2-C1-和2-MeS-ATP- α -B是非常弱的P2Y2R激动剂。鉴于此，我们在这 里关于膦酸盐2和4A对于P2Y2R没有活性的发现与这些较早的报道一致。预期化合物2-4 对于P2Y4/6-Rs没有活性，因为这些受体对于尿苷核苷酸激动剂具有选择性。总之，因为ATP或ADP类似物的相对效力通常与它们对水解的抵抗性相关(Adams， 1994 ；Burnstock 和 Kennedy，1985 ；Evans 和 Kennedy，1994)，所以我们已经开发了 新颖的 不可水解的P2YJ激动剂。化合物2、4B、17、18、19A、21A和21B的EC5tl值比相应的磷酸类 似物2-MeS-ATP和IA的EC50值高1-3个数量级(Nahum等人，2002 ；Major等人，2004)。然 而，先前的类似物的巨大优点在于它们在人血清中以及在苛刻的胃液条件下具有明显较高 的存留率。这些特征使得这些类似物成为牵涉P2YJ的健康病症的有吸引力和选择性的治 疗候选物。在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含排除了其中η是0、Z1和Z3各自为 0_且W2是CH2或NH的化合物以及其中η是1且Z1-Z3各自为0_的化合物的通式I的化合 物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。在进一步方面，本发明提供药物组合物，其包含用于治疗由Ρ2Υ受体调节的疾病、 病症或状态的通式I的化合物。用于此类用途的优选化合物包括化合物2、4，更优选4Β、17、 18、19，更优选19Α、21Α和21Β，或其药学上可接受的盐。由Ρ2Υ受体调节的疾病或病症可以是癌症、与血小板凝集有关的病症、心血管疾 病或病症、与粘液的水化、分泌和清除障碍有关的疾病或2型糖尿病。可用通式I的化合物治疗的癌症类型可以非限制性地为白血病、淋巴瘤、多发性 骨髓瘤、黑色素瘤、前列腺癌、脑癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、食道癌和膀胱癌。心血管疾病或病症可以非限制性地为缺血/再灌注损伤、心肌梗塞和长期存在的 心力衰竭。与粘液的水化、分泌和清除障碍有关的疾病包括但不限于慢性阻塞性肺病、肺炎、 支气管炎、囊性纤维化、原发性睫毛运动障碍、鼻窦炎、中耳炎、干眼病、青光眼、鼻泪管阻塞、水肿型视网膜疾病、视网膜变性、阴道干燥、口腔干燥、胃食管返流以及便秘。如在上述WO 03/034978中所公开的，发现基于ATP类似物的硼烷磷酸盐电子等 排体的选择性P2YJ激动剂在灌注大鼠胰腺时是高度有效的胰岛素促分泌剂，其中最有效 的激动剂是2-MeS-ATP-a -B(I)，与基础分泌相比，其诱发了提高9倍的胰岛素分泌，具有 28nM的EC5tlt5因此，包含属于高选择性P2AR激动剂的通式I的化合物(优选化合物2、4B、 17、18、19A、21A和21B)的药物组合物可用作治疗2型糖尿病的胰岛素促分泌剂。因此，在一个优选实施方案中，由P2Y受体调节的疾病或病症是2型糖尿病。因为疼痛也至少部分由P2A受体所调节，因此包含通式I的化合物的药物组合物 可以进一步用于疼痛控制。可以通过常规技术来制备含有通式I的化合物的药物组合物，例如，“雷明顿药 物技术和实践(Remington :The Science and Practice of Pharmacy)”，第 19 版，1995 中 所述技术。所述组合物可以常规形式出现，例如胶囊、片剂、溶液或混悬剂、乳剂、乳膏剂、喷
雾剂等。给药途径可以是有效将活性化合物输送到适当或所需的作用部位的任何途径，优 选口服途径。如果固体载体用于口服给药，则该制剂可被压片；以粉末或粒料形式置于硬明 胶胶囊中；或者它可以是锭剂的形式。如果使用液体载体，该制剂可以是糖浆、乳剂或软明 胶胶囊形式。具有滑石和/或碳水化合物载体或粘合剂等的片剂、糖衣丸或胶囊特别适合 口服应用。优选用于片剂、糖衣丸或胶囊的载体包括乳糖、玉米淀粉和/或马铃薯淀粉。在进一步的方面，本发明提供在有需要的个体中治疗由P2Y受体调节的疾病、病 症或状态(例如2型糖尿病或疼痛)的方法，其包括对所述个体给予有效量的通式I的化 合物或其药学上可接受的盐。现在通过下列非限制性实施例来说明本发明。 实施例实验通则(general)所有空气和湿度敏感的反应在用橡胶隔片密封的火焰干燥、氩气吹洗的双颈烧瓶 内进行，用注射器引入试剂。通过TLC，在预涂覆的Merck硅胶板(60F-254)上监测反应的进 程。通过紫外光来显现。使用Bruker DPX-300、DMX_600或AC-200分光计，通过核磁共振来 表征化合物。在200、300或600MHz处测定1H NMRif0还可在Bruker AC-200和DMX-600分 光计上使用85% H3PO4作为外部参考、通过用D2O中的31P NMR来表征核苷酸。在AutoSpec-E FISION VG质谱仪上通过化学电离来记录高分辨率质谱。在Q-TOF微型仪器(Waters，UK) 上，在ESI (电喷雾电离)下分析核苷酸。在使用S印hadex DEAE-A25柱(在IM NaHCO3中于 4°C溶胀1天)的LC(IsC0 UA-6)系统上实现核苷酸的初步纯化。该树脂在使用之前用去离 子水洗涤。通过280nm处的UV检测来监测LC分离。应用0-0. 8M NH4HCO3 (500ml水500ml 缓冲液)的缓冲液梯度。在使用半制备反相柱(Gemini 5u C-18110A，250X 10. 00mm，5微 米，Phenomenex,Torrance，USA)的HPLC(Merck-Hitachi)系统上实现核苷酸的最终纯化和 非对映异构体对的分离。在分析反相柱系统(Gemini 5u，C-18，110A，150X4. 60mm，5微米， Phenomenex, Torrance, CA, USA)上，在如下所述的双溶剂系统中评价核苷酸的纯度。
18
除非另有说明，所有商品试剂未经进一步纯化而使用。湿度敏感性反应中的所有 反应剂在真空烘箱中干燥过夜。RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640缓冲液从 Sigma-Aldrich获得。2’，3’ -0-甲氧基亚甲基腺苷衍生物如Nahum等人(2002)所述来制 备。在使用硅胶柱(25+M柱)和以下梯度程序的MPLC系统(Biotage，Kungsgatan，Uppsala， Sweden)上分离2，，3，-O-甲氧基亚甲基_2_MeS-腺苷3柱体积(CV)的100 O(A) CHCl3(A) (B)Et0H，5CV 的 100 0 至Ij 90 10 的 A B 梯度和 4CV 的 90 10 A B, 流速为12. 5ml/min。化学稳定性的评价和pH测量用Orion微型组合pH电极和Harma Instruments PH 计来进行。细胞内钙测量使稳定表达火鸡P2Yi、人P2Y2、人P2Y4或大鼠P2Y6的人132ml星形细胞瘤细胞在 含有5 % (ν/ν)胎牛血清、100单位/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素和500 μ g/ml遗传霉素 (G-418，Life Technologies, Inc)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco，s modified Eagle's medium)中生长。细胞内游离钙浓度[Ca2+]i的变化通过载有fura_2的细胞悬浮液 的如前所述的双激发荧光光谱分析来检测(Garrad等人，1998 ；Grynkiewicz等人，1985)。 在含有ImM CaCl2和ImM MgCl2的IOmM H印es_缓冲盐水(pH 7. 4)中分析细胞。使细胞在 微型离心机中沉淀，再悬浮于2ml缓冲液中。用Prism曲线拟合程序(GraphPAD Software, San Diego, CA)分析浓度响应数据。对每一个P2Y受体亚型在单独日子中进行三次实验。实施例1. β，γ -CH2-2MeS-腺苷-三磷酸盐(2)合成通过如方案1中所示和下文所述的两种方法来制备β，Y-CH2_2MeS-腺 苷-5'-三磷酸盐(2):方法A.如上所述制备双(三丁基铵)亚甲基二膦酸盐。在火焰干燥的双颈烧瓶 内，在氮气下，于0°c将1，8_双(二甲基氨基)萘(117mg，0. 57mmol, 1. 5eq)加到磷酸三甲 酯(2ml)中的2' ,3' -0-甲氧基亚甲基-2-MeS-腺苷(5a) (130mg,0. 37mmol)中，并将反 应物搅拌20分钟，直到获得澄清溶液为止。在0°C下加入P0Cl3(67y l，1.09mmOl，3eq)。将 该溶液在0°C下搅拌3小时。在0°C下加入0. 5M双(三丁基铵)亚甲基二膦酸盐(386mg， 2. 19mmol,6eq)的无水 DMF(4. 3ml)溶液和三丁胺(360 μ 1，1. 46mmol，4eq)，并将反应混合 物搅拌1. 6分钟。在室温下加入0. 25M乙酸铵(IOml)溶液，将反应混合物搅拌30分钟，然 后冷冻干燥。将所得残留物施加至活化S印hadex DEAE-A25柱(0_0. 8MNH4HC03，总体积1L) 中。收集相关级分，进行冷冻干燥，通过用去离子水反复冷冻干燥而除去过量的NH4HCO3，获 得白色固体状的产物8a。用18% HCl溶液处理产物5，直到达到pH 2. 3为止，然后在室温 下搅拌3小时。最后，用24% NH4OH溶液处理混合物，并将pH调节至9。将溶液搅拌45分 钟，然后冷冻干燥。在HPLC柱上分离残留物，获得纯的2。使用半制备反相Gemini 5u C_18 IlOA柱(250X10. 00mm，5微米)和等度洗脱来实现分离，所述等度洗脱使用溶剂系统I，应 用85 15的(A) IOOmM三乙基乙酸铵(TEAA)，pH 7与(B)MeOH,流速为5ml/min。将相关 级分(Rt = 12. 09min)冷冻干燥。通过反复冷冻干燥循环除去过量的缓冲液，且每次将固 体残留物溶于去离子水中。最后，使纯产物1通过Si^phadex-CM C-25Na+-形式柱，将核苷酸 三乙铵抗衡离子与Na+离子交换。在LC分离之后，以10% (23mg)的收率获得产物2。半 制备柱上的保留时间12. 09分钟。2的光谱数据与由Mohamady和Jakeman (2005)所述的 数据一致。
19
方法B.如上所述制备双(三丁基铵)亚甲基二膦酸盐。在火焰干燥的双颈烧瓶 内，在氮气下，于0°c将1，8_双(二甲基氨基)萘(41mg，0. 19mmol,2eq)加到磷酸三甲酯 (Iml)中的2-MeS-腺苷(5b) (30mg，0. 09mmol)中，并将反应物搅拌20分钟，直到获得澄清 溶液为止。在0°C下加入P0Cl3(26y 1，0. 28mmol，3eq)。将该溶液在0°C下搅拌2小时。在 0°C下加入IM双(三丁基铵)亚甲基二膦酸盐(101mg，0. 57mmol,6eq)的无水DMF(480 μ 1) 溶液和三丁胺(91 μ 1,0. 38mmol,4eq)，并将反应混合物搅拌1. 6分钟。然后，在室温下加 入0. 5M碳酸氢三乙铵(TEAB)溶液(IOml)，并将反应混合物搅拌30分钟，然后冷冻干燥。 将所得残留物施加于活化S印hadex DEAE-A25柱(0_0. 8MNH4HC03,总体积1L)。收集相关 级分，冷冻干燥，通过用去离子水反复冷冻干燥来除去过量的NH4HCO3，获得白色固体状的 产物2。在HPLC柱上分离残留物，获得纯的2。使用半制备反相Gemini 5u C_18 IlOA柱 (250X10. 00mm，5微米)和溶剂系统1(参见上文)来实现分离，其中梯度为(92 8到 70 30 A B)，经20分钟，流速为5ml/min。将相关级分(Rt = 11. 94min)冷冻干燥。 通过反复冷冻干燥循环来除去过量的缓冲液，且每次将固体残留物溶于去离子水中。最 后，使纯产物1通过S印hadex-CM C_25Na+-形式柱，将核苷酸三乙铵抗衡离子与Na+离子 交换。在LC分离之后，以10% (Ilmg)的收率获得产物2。2的光谱数据与由Mohamady和 Jakeman(2005)所述的数据一致。实施例2.腺苷-β，Y-CH2-5' -0-(1-硼烷三磷酸盐)(3)的合成、分离和表征腺苷-β，γ -CH2-5 ‘ -0- (1-硼烷三磷酸盐)(3)合成通过以下方式制备双(三丁基铵)亚甲基二膦酸盐在室温下将Bu3N(2eq)加到 EtOH中的亚甲基二膦酸游离酸中并搅拌2小时，随后减压脱除溶剂，获得白色固体。如在 方案2中所描述，在火焰干燥的双颈烧瓶内，在氮气下，将2' ,3' -0-甲氧基亚甲基腺苷 9(100mg,0. 32mmol)溶于磷酸三甲酯(2. 5ml)中。在0°C下，加入1，8-双(二甲基氨基)萘 (138mg，0. 65mm0l，2eq)，并将反应物搅拌20分钟，直到获得澄清溶液为止。在0°C下加入 PCl3(56 μ 1,0. 65mmol,2eq)，沉淀出白色固体。将悬浮液在0°C下搅拌30分钟。然后，在0°C 下加入IM双(三丁基铵)亚甲基二膦酸盐(642mg，1.94mmol，6eq)的无水DMF(1.8m)溶液 和三丁胺(308 μ 1，1. 29mmol，4eq)，将该反应混合物搅拌11分钟。在0°C下加入BH3 · SMe2 配合物在THF(2. 2ml, 3. 9mmol, IOeq)中的2M溶液，该反应混合物变得澄清。将溶液在0°C 下搅拌5分钟，然后在室温下搅拌30分钟。最后，在室温下加入0. 5M TEAB溶液(IOml)，并 将混合物搅拌60分钟，然后冷冻干燥。将所得残留物施加于活化的Si^phadex DEAE-A25柱 (0-0. 8M NH4HCO3,总体积1L)。收集相关级分，冷冻干燥，通过用去离子水反复冷冻干燥循 环来除去过量的NH4HC03。获得产物13a，为白色固体。用18% HCl处理产物13a，直到达到 PH 2. 3为止，然后在室温下搅拌3小时。最后，用24% NH4OH溶液处理混合物，并将pH调 节至9。将溶液在室温下搅拌45分钟，然后冷冻干燥。在下述条件下，在HPLC柱上分离产 物3的非对映异构体对。最后，使纯化异构体3A和3B通过S印hadex-CMC-25Na+-形式柱， 以将三乙铵抗衡离子与Na+离子交换。腺苷-β，y-CH2_5' -0-(1-硼烷三磷酸盐)(3)的分离3的非对映异构体对的分离如下进行使用半制备反相Gemini 5u柱(C-18110A， 250 X 10. 00mm，5微米)和等度洗脱，所述等度洗脱使用89 11 A B的溶剂系统I (参 见实施例1)，流速为5ml/min，然后使用分析Gemini 5u柱(C-18110A，150X4. 60mm)进行两种非对映异构体的最终分离(应用梯度90 10到70 30 A B的溶剂系统I (参见 实施例1)，历时20分钟，流速为lml/min)。收集含有相同异构体的级分[Rt = 6. 33分钟 (异构体A)，7. 73min (异构体B)]，并冷冻干燥。过量的缓冲液通过反复冷冻干燥循环来除 去，每次将固体残留物溶于去离子水中。在LC分离之后，以36% (66mg)的总收率获得非对 映异构体3A和3B。腺苷-β，γ -CH2-5 ‘ -0- (1-硼烷三磷酸盐)(3A)的表征半制备柱上的保留时间7.64min。1H NMR(D20,600MHz) δ 8. 59 (s，H_8，1H)， 8. 25(s，H-2，1H)，6. 14(d，J = 4. 8Hz，Η-Γ，1H)，(4. 78ppm 处的 H2 ‘信号被水信号所 遮掩)，4. 60 (m, H-3 ‘，1H)，4. 39 (m, H-4 ‘，1H)，4. 27 (m, H-5 ‘，1H)，4. 14 (m, H-5 “，1H)， 2. 25 (t, J = 20. 4Hz, CH2, 2H) ,0. 37 (m, BH3，3H)ppm。31PNMR(D2O, 600MHz) δ 82. 81 (m, Pa-BH3), 13. 92 (s, Ργ), 11. 22 (br s，P0)ppm。MS-ESI m/z 502 (Ml TLC(NH4OH H2O 异丙醇2 8 11)，Rf = 0.23。在分析柱上获得纯度数据保留时间3. 55min(100%纯 度)，使用溶剂系统I (参见实施例1)，梯度为90 10到70 30 A B，历时10分钟，流 速lml/min)。保留时间2. 53分钟(95. 5%纯度)，使用溶剂系统II，梯度为90 10到 80 20 的(A)O. OlM KH2PO4, pH = 4. 5 至(B)MeOH，历时 10 分钟，流速为 lml/min)。腺苷-β，y -CH2-5 ‘ -0- (1-硼烷三磷酸盐)(3B)的表征半制备柱上的保留时间9.67 分钟。1H NMR(D20, 300MHz) δ 8. 56 (s，H_8，1H)， 8. 24(s，Η-2，1Η)，6· 14(d，J = 5. 1Hz，Η-Γ，1Η)，(4. 78ppm 处的 H2 ‘信号被水信号所 遮掩)，4. 52 (m, H-3 ‘，1H)，4. 39 (m, H-4 ‘，1H)，4. 23 (m, H-5 ‘，1H)，4. 17 (m, H-5 “，1H)， 2. 30 (t, J = 20. 10Hz, CH2, 2H) ,0. 40 (m, BH3，3H)ppm。31P NMR(D2O，60OMHz) δ 82. 50 (m, Pa-BH3), 14. 10(s,PY), 11. 03 (br s，P0)ppm。MS-ESI m/z:502(]T)。TLC(NH40H : H2O 异 丙醇2 : 8 : ll)，Rf = 0.23。在分析柱上获得纯度数据保留时间4. 09分钟(92. 6%纯 度)，使用溶剂系统I (参见实施例1)，梯度90 10到70 30 A B，历时10分钟，流速 为lml/min)。保留时间3. 66分钟(95. 5%纯度)，使用溶剂系统II (参见上文)，梯度为 95 10 到 80 20 A B，历时 10 分钟，流速为 lml/min)。实施例3. 2MeS-腺苷-β，Y _CH2_5' _0-(1_硼烷三磷酸盐)(4)的合成、分离和 表征2MeS-腺苷-β，Y _CH2_5 ‘ _0_ (1_ 硼烷三磷酸盐)(4)合成按照与实施例2中对于产物3所述的相同方式，如下文方案2所示，在LC分离之 后以28%总收率从5a获得产物4。2MeS-腺苷- β，Y ~CH2~5' ~0-(1~硼烷三磷酸盐)⑷的分离使用半制备反相Gemini 5u柱(C-18110A，250X 10. 00mm，5微米)和等度洗脱来 实现4非对映异构体的分离应用75 25 A B的溶剂系统I (参见实施例1)，流速为 5ml/min。使用分析Gemini 5u柱(C-18110A, 150X4. 6mm)和溶剂系统I (参见实施例1) 实现两种非对映异构体的最终分离梯度为82 18到74 26 A B，历时20分钟，流速 为lml/min。收集含有相同异构体的级分[Rt = 9. 79分钟(异构体A)，11. 53分钟(异构 体B)]，并冷冻干燥。通过反复冷冻干燥循环来除去过量的缓冲液，每次将固体残留物溶于 去离子水中。在LC分离之后以28% (38mg)的总收率获得非对映异构体4A和4B。2MeS-腺苷-β，Y _CH2_5 ‘ _0_ (1_硼烷三磷酸盐)(4A)的表征
半制备柱上的保留时间5.29min. 1H NMR(D20,600MHz) δ 8. 30 (s, H_8，1H)， 6. 12 (d，J = 4.98Hz，H-I'，1H)，(4. 78ppm 处的 H2 ‘信号被水信号所遮掩)，4. 50 (m，H_3 ‘， 1H)，4. 25(m，H-4'，1H)，4. 14 (m，H—5 ‘，1H)，4. 05 (m，H—5 〃，1H)，2. 95 (s，CH3, 3H)，2. 17 (t， J = 20. IOHz，CH2, 2H) ,0. 42 (m, BH3，3H)ppm。31P NMR (D20,60OMHz) δ 83. 60 (m, Pa-BH3), 14. 61(s, Ργ), 10. 26 (br s，P0)ppm。MS-ES m/z 548 (Ml TLC (NH4OH : H2O 异丙醇 2:8: ll)，Rf = 0.44。在分析柱上获得纯度数据保留时间4. 24分钟(94. 3%纯度)， 使用溶剂系统I (参见实施例1)，梯度为80 20到60 40 A B，历时10分钟，流速为 lml/min)。保留时间2. 99分钟(99. 5%纯度)，使用溶剂系统II (参见实施例2)，梯度为 75 25 到 65 35 A B，历时 10 分钟，流速为 lml/min)。2MeS-腺苷-β，Y _CH2_5 ‘ _0_ (1_硼烷三磷酸盐)(4B)的表征半制备柱上的保留时间5.57 分钟。1H NMR(D20,600MHz) δ 8. 29 (s, H_8，1H)， 6. 99 (m, H-I ‘，1H)，(4. 78ppm 处的 H2 ‘信号被水信号所遮掩)，4. 47 (m，H-3 ‘，1H)， 4. 27 (m, H-4 ‘，1H)，4. 15 (m, H-5 ‘，1H)，4. 08 (m, H-5 “，1H)，2. 49 (s, CH3, 3H) 2. 18 (t, J =19.20Hz, CH2,2H),0. 32 (m, BH3,3H)ppm0 31P NMR(D20，600MHz) δ 84. 13 (m，Pa-BH3)， 14. 85(s, Ργ), 10. 04(br s，P0)ppm。MS-ESI m/z 548 (Ml TLC (NH4OH H2O 异丙醇 2:8: ll)，Rf = 0. 44。保留时间2. 12 分钟(94%纯度)，使用 70 30 到 40 60 A B 的(A) IOOmM ΤΕΑΑ,ρΗ 7与(B)CH3CN的梯度，历时10分钟，流速为lml/min)。保留时间1. 38 分钟(100%纯度)，使用溶剂系统II (参见实施例2)，梯度为50 50到40 60A B，历 时10分钟，流速为lml/min)。实施例4.通过31P NMR评价的化合物2的化学稳定性通过31P NMR监测可能的脱磷酸产物来评价2在pH 1.4和37°C下的稳定 性。将化合物 2(1. 5mg)溶于 0. 2M HC1/KC1 (0. 35ml)和 D2O(40 μ 1)中。通过加入 0. 2Μ HCl (20 μ 1)，将最终pH调节至1.4。将该溶液保持在37 °C的油浴中。以12小时的时 间间隔记录波谱，持续11天。每一实验中的扫描数为500。磷酸酯的水解百分率以β， Y-CH2-2MeS-ATP (-10. 5ppm)的 Pa 信号和水解产物 2MeS_AMP(9) (0. 7ppm)的 Pa 信号的积 分为基础。通过测定各自NMR信号积分随时间的变化来确定水解率。如图IA中所示，在这些条件下，化合物2表现出相对高的稳定性。尤其，除了起 始原料2以外，观测到2-MeS-AMP的量随时间而增加。因此，逐步出现了 Oppm处的信号 (2-MeS-AMP的P a )，而在-Ilppm处的信号(2的P a )随时间而减少。2-MeS-AMP的P α的 31P NMR信号随时间的强度变化(作为β，Y -CH2-2-MeS-ATP和2-MeS-AMP的总P α积分的 百分率)相对于2的浓度拟合为准一级指数衰变速率方程。在pH 1. 4/37°C下测定的2的 半衰期为65小时，如图IB中所示。实施例5.通过HPLC评价的化合物3和4的化学稳定性3(异构体B)在37°C的适当缓冲溶液(0. 2M HCl/KCl，pH = 1. 4)中的稳定性通过 按7-17小时间隔持续5天的HPLC-电喷雾电离(ESI)MS来评价，基于3B峰随时间的HPLC 积分变化，将其水解率拟合准一级指数衰变速率方程，如图2A-2B中所示。除了 3B以外，在 水解混合物中鉴定降解产物6、7和8，如方案3中所描述。例如，19小时之后，50%的3B降 解，获得37%的AMP- a -B和AMP- a -H(分别为6和7，二者在相同保留时间下出现；然而， MS能够鉴定这些化合物)和13%腺苷(图2A)。图2C中描述了随时间的水解混合物的组成变化。3B的半衰期为19小时。化合物4 (异构体B)在37°C的适当缓冲溶液(pH = 1. 4)中的稳定性通过HPLC监 测可能的脱磷酸产物来评价。将化合物4(1. 6mg)溶于0. 2MHC1/KC1缓冲液(0. 4ml)中，且 通过加入0.2M HCl (15 μ 1)将最终pH调节至1.4。将该溶液保持在37°C的油浴中，其组成 通过HPLC-MS来分析使用Gemini分析柱(5u C-18 110A, 150X4. 60mm)和梯度洗脱，使用 溶剂系统I (参见实施例1) 89 11 A B持续15分钟，然后82 18到74 26 A B 持续20分钟，流速为lml/min。以12小时间隔采集样品，持续5天。通过测量降解产物6、 7和8的HPLC峰的积分随时间的变化来测定4的水解率。如图2C中所示，化合物4B的半 衰期为14. 5小时。实施例6.化合物2-4对碱性磷酸酶的酶促稳定性通过从核苷酸衍生物释放对硝基苯酚，使用紫外-可见分光光度计 (spectrophotometer)在405nm下测定酶活性。在37°C下测定核苷酸对于酶促水解的相 对活性和抵抗性。简要地说，32. 5μ 1核苷酸衍生物(77μ g/ml，在0. IM Tris-HCl和0. IM MgCl2 中，pH 7. 5)和 6 μ 1 去离子水用牛肠碱性磷酸酶(Fermentas Inc.，Glen Burnie,MD, 1 单位/μ 1，6. 25μ 1，37°C。最终pH = 9. 8)孵育。30分钟之后，通过在80°C下孵育30分钟 来停止反应。通过HPLC监测可能的脱磷酸产物来评价核苷酸衍生物的稳定性。在Gemini分 析柱(5u C-18 110A, 150X4. 60mm)上混合物使用梯度洗脱(溶剂系统I (参见实施例1) 对于 3A 和 3B 为 90 10 至Ij 70 30 A B，对于 4A、4B 和 2 为 82 18 至Ij 50 50A B, 历时20分钟，流速为lml/min。通过测定各自HPLC峰的积分随时间的变化来确定水解率， 如所观察到的，类似物2-4在这些条件下保持完整无缺。实施例7. ATP和化合物2-4在人血清中的稳定性人血清的制备从血库(Tel-Hashomer医院，以色列)中获得取自健康志愿者的血 液，在4°C下储存12小时，室温下在塑料管中以1500g离心15分钟。分离血清，在_80°C下 储存。2-3在人血清中的稳定性评价，方法A将含有40mM核苷酸衍生物的去离子水(4. 5 μ 1)溶液、人血清(180 μ 1)和 RPMI-1640(540y 1)的分析混合物在37°C下孵育1、4、8、16、24、48、72和96小时。然后用 0. 6M的盐酸(430 μ 1)处理样品，离心2分钟(13，000g，4°C )，通过加入4M的KOH来中和， 离心2分钟(13，000g，4°C )，并冻干。通过HPLC监测可能的脱磷酸产物来评价核苷酸的 稳定性。在Gemini分析柱(5uC_18 110A, 150X4. 60mm)上分离混合物梯度洗脱
，流速为lml/min。通过测定各自HPLC峰 的积分随时间的变化来确定水解率。4在人血清中的稳定性评价，方法B将含有40mM核苷酸衍生物的去离子水(4. 5 μ 1)溶液、人血清(180 μ 1)和 RPMI-1640(540y 1)的分析混合物在 37 °C 下孵育 1、4、8、16、24、48、72、96、120 和 144 小 时。然后将样品加热到80°C，保持30分钟，用CMS印hadex (l_2mg)处理2小时，离心6分钟 (12，OOOrpm)，并用氯仿(2Χ500μ1)萃取。将水层冷冻干燥。通过用于监测可能的脱磷酸 产物的HPLC来评价核苷酸的稳定性。在Gemini分析柱(5u C-18 110A, 150X4. 60mm)上分离混合物梯度洗脱[IOOmM TEAA, pH 7 (A)/MeOH(B)，79 21, A B，15 分钟(用于 4A 和 4B) ； IOOmM TEAA，pH 7(A)/乙腈(B)，A B，10 分钟，100 0 — 90 10 A B 10 分钟， 90 10 — 80 20 A B 4 分钟，80 20 A B 1 分钟(用于 ATP)]，流速为 lml/min。 通过测定各HPLC峰的积分随时间的变化来确定水解率。如图3所示，ATP水解为ADP和AMP，具有3. 6小时的半衰期(方法A)，而在相同条 件下，化合物2、3A和3B大部分被水解为相应的核苷-单磷酸(硼烷磷酸)，分别具有12. 7、 14. 1和47. 1小时的半衰期(图4A-4C示出了关于化合物2的水解率的数据)。化合物4B 以71. 9小时的半衰期水解(方法B)，而在相同条件下，ATP以7. 7小时的半衰期水解。这 些值表示ATP的代谢稳定性的3. 5-20倍取决于取代的提高。实施例8. 2-MeS-腺苷- 二卤代亚甲基-二磷酸盐(17_18)的合成为了分别制备2-MeS-腺苷-5' -二氯亚甲基-二磷酸和2-MeS-腺苷_5 ‘ -二 氟亚甲基-二磷酸盐(17和18)，首先如方案4所示以及下文所述制备5' -0-甲苯磺酰 基-2‘ ,3' -0-丙酮化合物-2MeS-腺苷(16)在火焰干燥的双颈烧瓶内，在氮气下将2' ,3'丙酮化合物-2-MeS-腺苷(15) (Nahum 等人，2002) (97mg, 0. 27mmol)溶于无水二氯甲烷(Iml)中。加入 DMAP (134mg, 1. 09mmol,4eq)的无水二氯甲烷(2ml)溶液和 TsCl (156mg，0. 82mmol，3eq)的无水二氯 甲烷(0.5ml)溶液，并在氮气下，将所得溶液在室温下搅拌12小时。反应物用二氯甲 烷(50ml)稀释，并用NaHCO3(3X30ml)的饱和溶液萃取。除去有机层，用Na2SO4干燥，过 滤，减压蒸发，获得白色固体，在MPLC系统上使用硅胶柱[25+M柱，使用以下梯度方案 CHCl3(A) EtOH(B) ,0 0，3CV，A B，CHCl3 (A) EtOH(B) ,0 0 —0 10，5CV，A B, CHCl3(A) EtOH (B), 10 0，4CV，流速为25ml/min]将其分离。以52%收率获得化合物 16。1H 匪R (CHCl3, 300MHz) δ 7. 68 (s，H_8，1H)，7. 72 (d，J = 8. 4Hz，2H) 7. 27 (d，信号被 d_ 氯仿所遮掩)6. 05 (d，J = 7. 2Hz，H-I'，1Η)，6· 35 (t，J = 5. 4Hz，H2' )，5. 00 (q，J = 5. 70, H-3'，1H)，4. 40(m，H-4' , 1H) ,4. 25 (m, H-5'，H_5〃 2H)，2. 59 (s，3H)，2. 43 (s，3H)， 1.61(s，3H)，1.38(s，3H)。MS-ES+m/z :508 (M+)。TLC (EtOH CHCl3 5 95)，Rf = 0.79。然后在火焰干燥的双颈烧瓶内，在氮气下，将化合物16(42mg，0.08mmol)溶于无 水DMF(0.2ml)中。加入三(四丁基铵)二卤化亚甲基二膦酸盐(0. 16mmol,2eq)的无水 DMF (0. 3ml)溶液，并将该溶液在室温下搅拌72小时。加入纯净TFA (2ml)，并在鼓入氮气的 条件下将反应物在室温下搅拌10分钟。减压脱除溶剂，获得黄色固体，在活化的Si^phadex DEAE-A25柱(0-0. 3M NH4HCO3,总体积1. 41)上将其分离。收集含有化合物17或18的相关 级分，并冷冻干燥，通过使用去离子水的反复冷冻干燥循环来除去过量的NH4HC03。实施例9. 2-SMe-腺苷-5' -0_(Ρα -硼烷基)二磷酸盐(19)的合成、分离和表征如方案5中所描述，在火焰干燥的隔膜密封烧瓶内，在氩气下将2' ,3'-甲氧基 亚甲基核苷(490. 4mg, 1. 38mmol)溶于DMF (3ml) /吡啶(0. 6ml, 5eq)中。然后，通过注射 器将新鲜制备的氯磷酸水杨酯(307mg，l. Ieq)的二噁烷(Iml)溶液转移到烧瓶内。在室 温下搅拌10分钟后，将新鲜制备的IM双(三正丁基铵)焦磷酸盐(2. lml,1.5eq)的DMF 溶液和三正丁胺(1.3ml，4eq)同时注射通过隔膜。将BH3 SMe2络合物在THF(7ml，IOeq) 中的2M溶液加入到烧瓶内，并将该混合物在室温下搅拌15分钟。然后通过注射器将乙二 胺(0.5ml，5eq)注射到烧瓶内。在搅拌60分钟之后，将去离子水(4ml)加入到该烧瓶内。在10分钟之后，将反应混合物蒸发。残留物通过去离子水稀释，并用乙醚萃取。然后将水 层冷冻干燥，将所得残留物施加于活化的S印hadex DEAE-A25柱(0-0. 4M NH4HCO3,总体积 900ml)上。收集相关级分，冷冻干燥；通过用去离子水反复冷冻干燥来除去过量的NH4HCO3, 获得作为铵盐的化合物19。通过酸性水解除去甲氧基亚甲基保护基(加入10% HCl溶液， 直到达到PH2. 3为止)。在室温下3小时之后，通过加入NH4OH溶液(pH 11)将pH快速升 高至9，并将该溶液在室温下保持40分钟。在LC分离后，以46%收率获得化合物19。通过 用TEAA 乙腈88 12的等度洗脱的HPLC实现非对映异构体的最终纯化和分离。2MeS_腺苷-5' _0_(P α -硼烷基)二磷酸盐(19A)的表征保留时间8·073min。31P NMR(D20，81MHz，pH 7) δ 82. 5 (m, P α -BH3, IP) ,-9. 5(d, P β , lP)ppm0 1H WR(D20，200MHz) : δ 8. 55(s，H-8，1H)，6· 25(d，H-l'，1Η)，4· 6 (dd，Η_3 ‘， 1H)，4. 35(q，H_4 ‘，1H)，2. 7(s，CH3-S, 3H)，0. 3 (m，BH3，3H)ppm。在分析柱上获得纯度数 据保留时间4. 1131^11(98%纯度)，使用溶剂系统111(1001111 TEAA，pH 7(A)/乙腈(B)， 88 12 A B，流速为lml/min)。保留时间3. 158分钟(98. 5 %纯度)，使用溶剂系统 IV (0. OlMKH2PO4, pH 4. 5(A)/乙腈(B), 90 10 A B，流速为 lml/min)。2MeS-腺苷_5 ‘ _0_ (Pa-硼烷基)二磷酸盐(19B)的表征保留时间9·127 分钟。31P NMR(D20,81MHz, pH 7) δ 82. 5 (m, P a -BH3, IP)，-9. 0(d, Ρβ，IP)，-22. 5(dd, P β，lP)ppm。1H 匪 R(D20，200MHz) δ 8. 50 (s, Η_8，1Η)， 6. 20 (d, H-I'，1Η)，4· 5(dd，Η-3'，1Η)，4· 30 (q，Η_4'，1H)，2· 6 (s，CH3-S, 3H)，0· 3 (m，BH3, 3H)ppm。在分析柱上获得纯度数据保留时间4. 720分钟(95 %纯度)，使用溶剂系统 III(参见上文)。保留时间3.764分钟(94%纯度)，使用溶剂系统IV(参见上文)。实施例10. 2MeS-腺苷_5 ‘ _0_ (Pa-硼烷基)二磷酸盐(19)对碱性磷酸酶的稳 定性以及在人血清中的稳定性如实施例6中所述测定化合物19(异构体A)对碱性磷酸酶的稳定性，发现其t1/2 为大约6小时，而ADP为大约4小时。另外，测定该化合物在人血清中的稳定性，发现，该化合物以> 24小时的半衰期 水解，而ADP为大约2小时。尤其，该化合物在24小时后水解百分率为仅仅大约25-40%。实施例11.作为？2￥1/6受体的潜在激动剂的化合物2、48、17、18、194、2认和218如在以上实验中所述，基于细胞内钙的测量，检查化合物2、48、17、18、19六、21(异 构体A和B)对于在人132ml星形细胞瘤细胞中表达的G蛋白偶联的P2YR&P2YPP2YPP2Y4 和P2Y6的活性。尤其，检查化合物2、4B和19对于P2Y^、P2Y2R、P2Y4R和P2Y6R的活性，且 仅仅检查化合物17、18和21对于P2YJ的活性。由来自Columbia-Missouri University, Columbia, MO, USA 的 Gary A. Weisman 教授实施这些实验。如下表1中所示，发现化合物19A是最有效和选择性最高的P2YJ激动剂，具有 0. 038 μ M的EC50,相比之下2-MeS-ADP的EC50为0. 004 μ Μ。化合物2和4Β是P2YJ的激动 齐U，分别具有0. 08和17. 2 μ M的EC5tl，并在100 μ M时对P2Y6R具有轻微的激动效应。化合 物 17、18、2IA 和 2IB 是 P2YJ 的激动剂，分别具有 3. 1、0. 98、0. 57 和 1. 2 μ M 的 EC50。表1 化合物 2、4Β、17、18、20Α 和 20Β 对于 P2Y1/2/4/6R 的活性
25
*sr =在100 μ M下轻微反应；nr =无反应实施例12.本发明化合物作为胰岛素促分泌剂的效力的体内研究范例(paradigm)本实验的目的是在对插管的Wister大鼠单次经口管饲(口服)给予葡萄糖之后， 通过测定通过套管对插管的大鼠静脉内给予测试化合物之后的血糖和胰岛素水平，来研究 本发明的化合物作为胰岛素分泌增强分子的体内效应。使用总共大约40只健康的10-13周龄Wister大鼠。在开始治疗之前，使动物适 应新环境至少4天，并随意地喂饲未加入药品的商品无菌啮齿动物食品。饮用自来水可随 意获得。在治疗之前约48小时，将大鼠称重，取体重一致的群体(大约90%的动物)进行 套管插入术。尤其，通过2. 5%异氟烷97. 5%干空气吸入来麻醉动物，手术插入P52套管， 并固定在颈静脉内，在套管插入术之后用0.3-0.5mL 5%肝素化盐水冲洗(且此后，在每次 采集血液之后立即用所述肝素化盐水冲洗)。万一大鼠留置套管出现技术问题如固定或凝 固，则将另一只大鼠插套管，代替研究中先前分派的大鼠。在治疗当天，检查每只大鼠的套管，将大鼠称重，并且经由尾静脉检查每只大鼠的 葡萄糖水平。将葡萄糖水平和体重一致的群体分为三组，其中第一组用测试化合物处理；第 二组是用盐水处理的阴性对照组；第三组是用格列本脲(glibenclamide)(亦称格列本脲 (glyburide))处理的阳性对照组。后者是归类为磺酰脲的一种抗糖尿病药物，用于治疗类 II型糖尿病，它目前是世界卫生组织基本药物示范目录(WHO Model List of Essential Medicines)中的仅有的两种口服抗糖尿病药物之一。格列本脲通过抑制胰腺的β细胞中 ATP-敏感性钾通道来发挥作用，引起细胞膜去极化并打开电压依赖性钙通道，因此触发进 入β细胞的细胞内钙增加，刺激胰岛素释放。参与实验的所有大鼠通过用2g/kg体重的葡萄糖攻击来给药(口服)，其中给予 每只大鼠的葡萄糖总量是3ml/kg体重(来自0. 67g/ml溶液)。在给予葡萄糖之后10分 钟，给予第一组大鼠测试化合物；给予阴性对照组的大鼠盐水。在两种情况下，通过套管静 脉注射来进行给药。测试化合物的给药剂量水平是2. 5mg/kg体重，给药体积是lml/kg体
26重；盐水的给药体积是lml/kg体重。在给予葡萄糖之前30分钟，(口服)给予阳性对照组 的大鼠格列本脲。格列本脲的给药剂量水平是lmg/kg体重，给药体积是5ml/kg体重(来 自0.2mg/ml溶液)。在给药之后，将大鼠放回笼中，等待采集血样。在下列时间点测定葡萄糖和胰岛素水平在给予葡萄糖之前(在阳性对照组的情 况下，以及在给予格列本脲之前)30分钟；在紧邻给予葡萄糖之前和在给予葡萄糖之后5分 钟；在给予葡萄糖之后15分钟，S卩，在给予测试化合物或盐水(分别是在第一组的情况下和 阴性对照组的情况下)之后5分钟；然后在给予葡萄糖之后30、45、60、120和150分钟。对于葡萄糖水平测量，经由尾静脉从每只大鼠抽取血样，立即用血糖测定仪 (glucometer)测试。对于测量胰岛素水平，经由颈静脉套管从每只大鼠抽取血样。从每只 经处理的大鼠采集的血液体积为150μ 1。将用于测定胰岛素水平而抽取的血样采集到具有 Z血清/凝胶的0. SmL试管内。使血液在室温下凝固至少30分钟，在凝固之后，将它在大约 4°C下离心(3000Xg，15min)。收获血清，在两个0. 2ml平帽PCR管之间同等地分割(每一 等分试样至少25 μ 1)，然后在-20°C下冷冻储存，直到分析为止。在每一个体动物给药之后 和在放血期内进行临床观察。在放血期间使用血糖监测系统在适合于该系统的测试条上就 地进行全血中葡萄糖水平的血液分析。使用大鼠/小鼠胰岛素试剂盒进行血清中胰岛素水 平的血液分析。该实验的体内研究期在给予葡萄糖之后150分钟，在最终血样采集和血清采集之 后完成。预期用测试化合物处理的大鼠将在从给予葡萄糖之后15分钟(即，在给予测试化 合物之后5分钟)开始采集的血样中具有明显更低的葡萄糖水平。预期的葡萄糖水平事实 上非常类似于在饥饿之后测定的葡萄糖水平。进一步预期在给予葡萄糖之后大约15分钟(即，在给予葡萄糖之后在健康个体中 正常测得的胰岛素水平增加之前约15分钟)，见到用测试化合物处理的大鼠的胰岛素水平 显著增加。增加的胰岛素水平预期在30-45分钟期间维持，然后以一定速率下降，该速率取 决于测试化合物在血液中的稳定性。结果在初步研究中，如上所述，将2MeS_腺苷-5' _0_(Ρ α -硼烷基)二磷酸(19) (2. 5mg/kg)静脉内给予饥饿的Wistar大鼠(η = 5)，同时将盐水给予阴性对照组的大鼠， 并且在给予葡萄糖之前30分钟将格列本脲(0.25mg/kg)给予阳性对照组的大鼠。如图5 所示，相对于在盐水处理的大鼠中测定的葡萄糖水平，化合物19降低了所测定的葡萄糖水 平，与格列本脲类似。附录A 方案1 通过方法A和B合成化合物2
反应条件方法A 从 5a 开始，a)磷酸三甲酯，POCL, Proton Sponge ，0°C，3h ;b) 0. 5M 双 (三丁基铵)亚甲基二膦酸盐的无水 DMF 溶液，Bu3N, 0°C，1. 6min ;c) 0. 5M ΤΕΑΒ,ρΗ = 7,rt,
280. 5h ；以及 d) 1) 18% HCl, pH 2. 3，rt,3h ；禾口 2)24% NH4OH, pH 9，rt，45min。方法B 从 5b 开始 a)磷酸三甲酯，POCl3, Proton Sponge , 0°C, 2h ；b) IM 双(三 丁基铵)亚甲基二膦酸盐的无水DMF溶液，Bu3NjO°C, 25min ；以及c)0. 5M TEAB, pH 7，rt, 0. 5h。方案2 :化合物3和4的合成 反应条件a)磷酸三甲酯，PCl3，ProtonSponge , O°C, 30min ；b) IM双(三丁基铵) 亚甲基二膦酸盐的无水 DMF 溶液，Bu3NjO0C, Ilmin ；c)2M BH3 · SMe 的 THF 溶液，0°C，5min， 然后 rt，30min ；d) IM TEAB, pH 7，rt,0. 5h ；以及 e) 1) 18% HCl, pH 2. 3，rt,3h ；和 2)24% NH4OH, pH 9，rt，45min。方案3 化合物3的水解降解(异构体B) 方案4 化合物17和 方案5:化合物19的合成
参考文献Abbracchio M. P. , Burnstock G. , Boeynaems J. Μ. , Barnard Ε. Α. , Boyer J. L., Kennedy C. , Knight G. Ε. , Fumagalli Μ. , Gachet C. , Jacobson K. Α. , Weisman G. Α., Pharmacological Reviews,2006，58，281—341Adams D.J. , Drug Dev. Res.，1994，31，242AngioliIlo D. J. , Bernardo Ε. , Ramirez C. , Costa Μ. A. , Sabate Μ., Jimenez-Quevedo P. , Hernandez R. , Moreno R. , Escaned J. , Alfonso F. , Banuelos C., Bass Τ. A. , Macaya C. , Fernandez-Ortiz A. , Journal of the American College of
Cardiology,2006a,48，298-304Angiolillo D. J. , Fernandez-Ortiz Α. , Bernardo Ε. , Ramirez C. , Sabate Μ., Jimenez-Quevedo P. , Hernandez R. , Moreno R. , Escaned J. , Alfonso F. , Banuelos C., Costa Μ. Α.，Bass Τ. Α.，Macaya C.，Diabetes,2006b,55，780-784Arzumanov Α. Α. , Semizarov D. G. , Victorova L. S. , Dyatkina N. B. , Krayevsky Α. Α. , Journal of Biological Chemistry,1996,271,24389-24394Blackburn G. Μ. , Taylor G. Ε. , Thatcher G. R. J. , Prescott Μ. , McLennan Α. G., Nucleic Acids Research，1987，15，6991-7004Buckley Μ. F. ， Loveland K. Α. ， McKinstry W. J. ， Garson 0. Μ. ， Goding J. W. , J Biol Chem，1990,265，17506-17511Burnstock G.，Kennedy C.，Gen.Pharmacol.，1985，16，433-440Burnstock G. ,Fischer B. ,Maillard Μ. ,Ziganshin Α. ,Ralevic V. ,Knight G., Brizzolara Α. , von Isakovics Α. , Boyer J. L. , Harden Τ. K., Jacobson K. , Drug Dev. Res. ，1994，31，206-219Bystrom C. Ε. , Pettigrew D. W. , Remington S. J. , Branchaud B. P. , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1997，7，2613-2616Chen B. C. , Lin W. W. , Biochemical and Biophysical Research Communications,1997，233，442-446Chow G.，Ziegelstein R. C.，Am J Cardiovasc Drugs,2007，7，169-171Cusack N. J. ,Hourani S. M. ,Loizou G. D. ,Welford L. A. ,Br J Pharmacol, 1987, 90,791-795Dyatkina N. ,Shirokova Ε. ,Theil F. ,Roberts S. Μ. ,Krayevsky A. ,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1996,6,2639-2642El-Tayeb A. , Griessmeier K. J. , Mueller C. Ε. , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2005，15，5450-5452Evans R. J.，Kennedy C.，Drug Dev. Res.，1994，31，285Farret Α. ，Filhol R. ，Linck N. ，Manteghetti Μ. ，Vignon J. ，Gross R. ，Petit P. , Pharm Res，2006，23，2665-2671Fischer B. , Boyer J. L. , Hoyle C. H. , Ziganshin A. U. , Brizzolara A. L. ,Knight G. Ε. , Zimmet J. , Burnstock G. , Harden Τ. K. , Jacobson K. A. , J Med Chem, 1993, 36, 3937-3946Fischer B. , Exp Opin Therap Patents，1999，9，385-399Garrad R. C. , Otero Μ. A. , Erb L. , Theiss P. Μ. , Clarke L. L. , Gonzalez F. A., Turner J. T.，Weisman G. Α.，J. Biol. Chem.，1998，273，29437-29444Grynkiewicz G.，Poeinie Μ.，Tsien R. Y.，J. Biol. Chem.，1985，260，3440—3450Guile S. D. ，Ince F. ，Ingall Α. H. ,Kindon N. D. , Meghani P. ,Mortimore Μ. P.， Prog Med Chem，2001，38，115-187He K. , Hasan A. , Shaw B. R. , Nucleic Acids Symposium Series,1997,36,159Jacobson K. A. ，Jarvis Μ. F. , Williams Μ. ，J Med Chem, 2002,45,4057-4093
Janssens R. , Communi D. , Pirotton S. , Samson Μ. , Parmentier Μ. , Boeynaems J. Μ. , Biochemical and Biophysical Research Communications,1996,221,588-593Joseph S.M. , Buchakjian M. R. , Dubyak G. R. , Journal of BiologicalChemistry,2003，278，23331-23342Joseph S. M. ,Pifer M. A. ,Przybylski R. J. , Dubyak G. R. ,British Journal of Pharmacology,2004，142，1002-1014Kaczmarek Ε., Koziak K. , Sevigny J. , Siegel J. B. , Anrather J. , Beaudoin
A.R. , Bach F. H. , Robson S. C. , Journal of Biological Chemistry, 1996,271, 33116-33122Kikuta Y. , Ohiwa Ε. , Okada K. , Watanabe A. , Haruki S. , Acta Anaesthesiologica Scandinavica,1999,43,82-86Kowalska J. , Lewdorowicz Μ. , Darzynkiewicz Ε. , Jemielity L. , Tetrahedron Letters,2007，48，5475-5479Labataille P. ,Pelicano H. ,Maury G. , Imbach J. L. ,Gosselin G. ,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1995,5,2315-2320Laxman S. , Beavo J. A. , Molecular Interventions,2007,7, 203-215Lazarowski E. R. , Homolya L. , Boucher R. C. , Harden Τ. K. , Journal of Biological Chemistry,1997，272，20402-20407Lazarowski E. R. , Boucher R. C. , Harden Τ. K. , Journal of Biological Chemistry,2000，275，31061-31068Lin J. ,Porter K. W. ,Shaw B. R. ,Nucleosides,Nucleotides & Nucleic Acids, 2001，20，1019-1023Macfarlane D. E.，Methods Enzymo1.，1992，215，137-142Major D. T.，Nahum V.，Wang Y.，Reiser G.，Fischer B.，J. Med. Chem.，2004，47， 4405-4416Maminishkis A. , Jalickee S. , Blaug S. A. , Rymer J. , Yerxa B. R. , Peterson W. M.，Sheldon S.M.，Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43，3555-3566McGuigan C. , Sheeka H. Μ. , Mahmood N. , Hay A. , Bioorganic &Medicinal Chemistry Letters,1993，3，1203—1206McGuigan C. ,Cahard D. ,Sheeka H. M. ,De Clercq Ε. ,Balzarini J. , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1996a,6,1183-1186McGuigan C. , Tsang H. W. , Mahmood N. , Hay A. J. , Antiviral Chemistry & Chemotherapy,1996b,7,330-337Misiura K. ，Szymanowicz D. ，Stec W. J. ，Organic Letters,2005,7,2217-2220Mohamady S. , Jakeman D. L. , Journal of Organic Chemistry, 2005, 70, 10588-10591Mundasad Μ. V. , Novack G. D. , Allgood V. Ε. , Evans R. Μ. , Gorden J. C. , Yerxa
B.R. , Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics,2001,17,173-179Myers T. C. , Nakamura K. , Flesher J. W. , Journal of the American ChemicalSociety,1963，85，3292-3295Nahum V. , Zuendorf G. , Levesque S. A. , Beaudoin A. R. , Reiser G. , FischerB., Journal of Medicinal Chemistry,2002,45,5384-5396Nahum V. , Tulapurkar Μ. , Levesque S. Α. , Sevigny J. , Reiser G. , Fischer B., J Med Chem，2006，49，1980-1990Padyukova N. S. , Dixon H. B. F. , Efimtseva Ε. V. , Ermolinsky B. S. ,Mikhailov S. N.，Karpeisky Μ. Y.，Nucleosides & Nucleotides，1999，18，1013—1014Picher Μ. , Sevigny J. , D' Orleans-Juste P. , Beaudoin Α. R. , Biochemical Pharmacology,1996，51，1453-1460Romaniuk P.J. , Eckstein F. , Journal of Biological Chemistry,1981, 256, 7322-7328Sak K. , Raidaru G. , Webb Τ. Ε. , Jarv J. , Archives of Biochemistry and Biophysics,2000，381，171-172Shaver S. R. , Rideout J. L. , Pendergast W. , Douglass J. G. , Brown E. G., Boyer J. L. , Patel R. I. , Redick C. C. , Jones A. C. , Picher Μ. , Yerxa B. R. , Purinergic Signalling,2005，1，183-191Shirokova Ε. A. , Dyatkina N. B. , Collection of Czechoslovak Chemical Communications,1996,61, S158-S160Spelta V. , Mekhalfia A. , Rejman D. , Thompson Μ. , Blackburn G. Μ. , North R. A. ,British Journal of Pharmacology,2003,140,1027-1034Stingelin J. , Bolen D. W. , Kaiser Ε.Τ., Journal of Biological Chemistry, 1980，255，2022-2025Tulapurkar Μ. Ε. , Laubinger W. , Nahum V. , Fischer B. , Reiser G., Br. J. Pharmacol.，2004，142Vollmayer P. , Clair Τ. , Goding J. W. , Sano K. , Servos J. , Zimmermann H. , Eur J Biochem，2003，270，2971-2978Wang G. , Boyle N. , Chen F. , Rajappan V. , Fagan P. , Brooks J. L. , Hurd Τ., Leeds J. Μ. , Rajwanshi V. K. , Jin Y. , Prhavc Μ. , Bruice T. W. , Cook P. D. , Journal of Medicinal Chemistry,2004，47，6902—6913Williams Μ. , Jarvis M. F.，Biochem Pharmacol,2000，59，1173-1185Yanachkov I. , Pan J. Y. , Wessling-Resnick Μ. , Wright G. Ε. , Molecular Pharmacology,1997,51,47-51Yegutkin G.G. ,Burnstock G. ,Biochimica et Biophysica Acta/Biomembranes, 2000，1466,234-244Yegutkin G. G.，Henttinen Τ.，Jalkanen S.，FASEB Journal,2001,15，251—260Yegutkin G. G. , Henttinen Τ. , Samburski S. S. , Spychala J. , Jalkanen S., Biochemical Journal,2002,367,121-128Yerxa B. R. , Sabater J. R. ,Davis C. W. ，Stutts Μ. J. , Lang-Furr Μ. ,Picher Μ.， Jones Α. C. , Cowlen Μ. , Dougherty R. , Boyer J. , Abraham W. Μ. , Boucher R. C. , Journalof Pharmacology and Experimental Therapeutics,2002,302,871-880 Zimmermann H. , Naunyn-Schmiedeberg' s Archives of Pharmacology,2000,
362,299-309
权利要求
通式I的化合物及其非对映异构体其中X是通过9位连接的式Ia的腺嘌呤残基其中R1是H；卤素；O 烃基；S 烃基；NR4R5；杂芳基；未取代的烃基或被卤素、CN、SCN、NO2、OR4、SR4、NR4R5或杂芳基取代的烃基，其中R4和R5各自独立地是H或烃基，或者R4和R5与它们所连接的氮原子一起形成任选含有1 2个选自氧、氮或硫的其他杂原子的5元或6元饱和或不饱和杂环，所述其他的氮是未取代的或者被烷基取代，所述烷基被卤素、羟基或苯基取代；且R2和R3各自独立地是H或烃基；或者X是通过1 位连接的式Ib的尿嘧啶残基其中R6是H；卤素；O 烃基；S 烃基；NR8R9；杂芳基；未取代的烃基或者被卤素、CN、SCN、NO2、OR8、SR8、NR8R9或杂芳基取代的烃基，其中R8和R9各自独立地是H或烃基，或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成任选含有1 2个选自氧、氮或硫的其他杂原子的5元或6元饱和或不饱和杂环，所述其他的氮是未取代的或者被烷基取代，所述烷基被卤素、羟基或苯基取代；且R7是O或S；Y是H、OH或NH2；Z1、Z2和Z3各自独立地是O 或BH3 ；W1和W2各自独立地是O、CH2、C(Hal)2或NH，其中Hal是卤素，优选为F或Cl；n是0或1，条件是当n为0且W2为O时，Z1是BH3 ；且当n是1时，W1和W2中的至少一个不是O；m是3或4；且B+表示药学上可接受的阳离子；但排除其中n是0，Z1和Z3各自为O 且W2是CH2或NH的化合物以及其中n是1，且Z1 Z3各自为O 的化合物。FPA00001186397900011.tif,FPA00001186397900012.tif,FPA00001186397900013.tif
2.权利要求1所述的化合物，其中n是0，且Zi和Z3是0；或者n是0，且Zi和Z3中的 至少一个是BH3_ ；或者n是1，且ZrZ3中的至少一个是BH3_。
3.权利要求2所述的化合物，其中n是0，其在a位处包含仅一个硼烷基，即，是 BH3_，且Z2是0_ ；或者在3位处包含仅一个硼烷基，S卩，Z3是BH3_，且Zi是0_ ；或者在a、^ 位处包含两个硼烷基，即，和Z3是BH3_。
4.权利要求2所述的化合物，其中n是1，在a位处包含仅一个硼烷基，即，是BH3_， 且Z2和Z3是0_ ；在3位处包含仅一个硼烷基，即，Z2是BH3_，且Zi和Z3是0_，或者在、位 处包含仅一个硼烷基，即，23是^13-，且21和22是0-;在a和0位处包含两个硼烷基，即，和Z2是BH3_，且Z3是0_ ；在a和Y位处包含两个硼烷基，即，和Z3是BH3_，且Z2是0_， 或者在0和Y位处包含两个硼烷基，即，Z2和Z3是BH3_，且Zi是0_ ；或者在a、0和Y位 处包含三个硼烷基，即，ZrZ3是BH3_。
5.权利要求1所述的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中礼是H、卤素、0-烃基或S-烃 基;R2和R3各自独立地是H或烃基；Y是OH ;n是1而是BH3_ ;Z2和Z3是0_ 乂是0 ；且W2 是 012、〔 2或012。
6.权利要求1所述的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中队是H或NR4R5，且R4和R5各 自独立地是H或烃基，或者礼和&与它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、 氮或硫的其他杂原子的饱和或不饱和杂环；R2和R3各自独立地是H或烃基；Y是OH ;n是1 ；是 BHf ； Z2 和 Z3 是(T 乂 是 0 ；且 W2 是 CH2、CF2 或 CC12。
7.权利要求1所述的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中礼是H、卤素、0-烃基或S-烃 基；R2和R3各自独立地是H或烃基；Y是OH ;n是0 ；且⑴和Z3是0_ ；且W2是CF2或CC12 ； 或(土土^！是冊^；且^是⑴
8.权利要求1所述的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中队是H或NR4R5，且R4和R5各 自独立地是H或烃基，或者礼和&与它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自氧、 氮或硫的其他杂原子的饱和或不饱和杂环；R2和R3各自独立地是H或烃基；Y是0H ;11是0 ；和 Z3 是 0_ ；且 W2 是 CF2 或 CC12。
9.权利要求5所述的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中礼是H，R2和R3是H，Y是0H， n是1，Zi是BH3_，Z2和Z3是0_，A是0，且W2是CH2 (化合物3)。
10.权利要求5所述的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中札是SMe，R2和R3是H，Y是 0H，n 是 1，是 BH3_，Z2 和 Z3 是 0_，A 是 0 且 W2 是 CH2 (化合物 4)。
11.权利要求10所述的化合物，其特征在于，它是异构体，当使用半制备反相Gemini 5u柱(C-18 110A，250X10mm，5微米)以及流速为5ml/min的等度洗脱[100mM三乙基乙酸 铵，pH 7 Me0H,85 15]，从非对映异构体的混合物中分离时，具有5. 57分钟的保留时间 (Rt)(化合物4B)。
12.权利要求5所述的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中札是SMe，R2和R3和H，Y是 0H，n是1，Zi是BH3_，Z2和Z3是0_，巧是0 ；且W2是CC12或CF2 (分别为化合物21和22)。
13.权利要求7所述的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中札是SMe，R2和R3是H，Y是 0H，n是0，Zi和Z3是0_，且W2是CC12或CF2 (分别为化合物17和18)。
14.权利要求7所述的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中礼是SMe，R2和R3是H，Y是 0H，n 是 0，Zi 是 BH3_，Z3 是 0_，且 W2 是 0 (化合物 19)。
15.权利要求14所述的化合物，其特征在于，它是异构体，当使用半制备反相Gemini 5u柱(C-18 110A，250X10mm，5微米)以及流速为lml/min的等度洗脱[100mM三乙基乙酸 铵，pH 7 乙腈，88 12]，从非对映异构体的混合物中分离时，具有8. 073分钟的保留时 间(Rt)(化合物19A)。
16.权利要求1所述的化合物，其中X是尿嘧啶残基，其中&是11、卤素、0-烃基或S-烃 基；R7 是 0 或 S ;Y 是 OH ;n 是 1 是 BHf ；Z2 和 Z3 是(T 乂 是 0 ；且 W2 是 CH2、CF2 或 CC12。
17.权利要求1所述的化合物，其中X是尿嘧啶残基，其中Re是H或NR8R9，且R8和R9 各自独立地是H或烃基，或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自 氧、氮或硫的其他杂原子的饱和或不饱和杂环；R7是0或S ;Y是OH ;n是1成是BH3_ ;Z2和 Z3 是 0_ 乂 是 0 ；且 W2 是 CH2、CF2 或 CC12。
18.权利要求1所述的化合物，其中X是尿嘧啶残基，其中&是11、卤素、0-烃基或S-烃 基；R7是0或S ;Y是OH ;n是0式和Z3是0_ ；且ff2是CF2或CC12。
19.权利要求1所述的化合物，其中X是尿嘧啶残基，其中Re是H或NR8R9，且R8和R9 各自独立地是H或烃基，或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成任选含有1-2个选自 氧、氮或硫的其他杂原子的饱和或不饱和杂环；R7是0或S ;Y是OH ;n是0而和Z3是0_ ；且 12是〔 2或012。
20.权利要求1所述的化合物，其中B是碱金属阳离子；NH4+；式R4N+的有机阳离子，其 中每一个R独立地是！！或^-。烷基，优选为(「(；烷基；阳离子脂质或阳离子脂质的混合 物。
21.药物组合物，其包含权利要求1中所要求保护的通式I的化合物或其药学上可接受 的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。
22.用于治疗由P2Y受体调节的疾病、病症或状态的药物组合物，其包含权利要求1中 所要求保护的通式I的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。
23.权利要求22所述的药物组合物，其中所述由P2Y受体调节的疾病或病症是2型糖 尿病。
24.权利要求22所述的药物组合物，其用于疼痛控制。
25.权利要求22-24中任一项所述的药物组合物，其包含选自化合物4B、17、18、19A、 21A和21B的化合物；或通式I的化合物，其中X是腺嘌呤残基，其中队是SMe，R2和R3是 H，Y是0H，n是1，ZrZ3是0_，巧是0，W2是CH2 (化合物2)。
26.权利要求1所述的通式I的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗由P2Y受体 调节的疾病、病症或状态的药物组合物中的用途。
27.权利要求1所述的通式I的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗由P2Y受体 调节的疾病、病症或状态。
28.在有需要的个体中治疗由P2Y受体调节的疾病、病症或状态的方法，其包括将对所 述个体给予有效量的权利要求1所述的通式I的化合物或其药学上可接受的盐。
29.权利要求28所述的方法，其中所述由P2Y受体调节的疾病或病症是2型糖尿病。
30.权利要求28所述的方法，其用于在有需要的个体中控制疼痛。
全文摘要
本发明提供不可水解的多磷酸核苷衍生物，例如2MeS-腺苷-β，γ-CH2-5′-O-(1-硼烷三磷酸盐)、2MeS-腺苷-β，γ-CCl2-5′-O-(1-硼烷三磷酸盐)、2-MeS-腺苷-5′-二氯甲烷-二磷酸盐、2-MeS-腺苷-5′-二氟甲烷-二磷酸盐和2MeS-腺苷-5′-O-(1-硼烷二磷酸盐)，以及它们的药物组合物。这些化合物有用于预防或治疗由P2Y受体调节的疾病或病症，如2型糖尿病，以及用于疼痛控制。
文档编号C07H19/06GK101925610SQ200880125587
公开日2010年12月22日 申请日期2008年11月23日 优先权日2007年11月23日
发明者B·费希尔, S·埃亚胡 申请人:巴尔-伊兰大学