专利名称：：一种新型prrs病毒受体及该受体的阻断抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及发现一个新型PRRS病毒细胞受体以及利用受体蛋白和多肽及其衍生物进行对PRRS病毒感染的防治，属于生物学领域。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)又名蓝耳病，是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种猪的急性传染病。PRRSV侵入宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合。利用细胞内吞作用而感染易感细胞(Na冊ynck，HJ,DuanX,FavoreelHW，etc.J.Gen.Virol.1999,80:297-305)，如MA-104和PAM。到目前为止已报道的四个独立但功能相关的PRRSV细胞受体,它们是唾液酸粘附素(Sialoadhesin)(VanderheijdenN,DelputtePL,FavoreelHW，etc.J.Virol.2003,77:8207-8215)，似肝磷脂蛋白(Heparinlike)(DelputtePL,VanderheijdenN,Nauwynck，HJ，etc.J.Virol.2002,76:4312-4321)，波形蛋白(Vimentin)(KimJK，FahadAM,ShanmukhappaK，etc.J,Virol.2006,80:689-696)，清道夫受体(CD163)蛋白(CalvertJG，SladeDE，ShieldsSL，etc.J.Virol.20D7.81:7371-7379)。但是还存在有其他的PRRSV细胞受体，这些受体均可结合或参与结合PRRSV感染易感细胞，从而引起蓝耳病。因此，通过对PRRSV的研究，依然会不断的有新的病毒受体出现，从而扩大研究的范围。
发明内容本发明涉及一个新型PRRSV的细胞受体，同时提供了一种利用纯化的NMHCn-A蛋白和人工合成的多肽及其blebbistatin作为受体阻断剂，抑制PRRSV感染细胞的方法，同时可以作为受体阻断剂的还有利用丽HCII-A蛋白和多肽免疫小鼠所得的抗体。上述的各种阻断剂都对PRRSV感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRSV感染的药物。申请人利用模拟PRRSV的GP5膜抗原的单克隆抗独特型抗体首先从非洲绿猴肾细胞系(MA-104)和猪肺巨噬细胞(PAM)上分离和提纯出一个可溶性蛋白(ZhouEM,XiaoYH，ShiYF，etc.J.Virol.Methods.2008，149:300—308)。利用这个模拟PRRSVGP5抗原的单克隆抗独特性抗体，申请人发现了一个新的PRRSV细胞受体，经过分析其氨基酸序列所得该受体为即非肌肉肌球蛋白II型重连A(nonmusclemyosinheavychainII-A,酬CII-A)蛋白，其蛋白的羧基端的氨基酸序列为SeqIDNo:1所示。同时发现了该受体阻断和抑制剂，它们是NMHCII-A蛋白、NMHCII-A多肽、抗NMHCII-A蛋白和多肽抗体，以及非肌肉肌球蛋白II型(nonmusclemyosinn，NMM-n)抑制剂，即(+)-blebbistatin:是N廳-II的选择性抑制剂[(土)-或(-)-blebbistatin]的无活性的对映异构体。其中(a)画HCII-A蛋白，蛋白的羧基端的氨基酸序列为SeqIDNo:1所示；(b)麵CII-A人工多肽，其氨基酸序列为SeqIDNo:2所示;(c)匿II-A人工多肽，其氨基酸序列为SeqIDNo:3所示;(d)NMHCII-A人工多肽，其氨基酸序列为SeqIDNo:4所示;上述病毒受体及受体阻断和抑制剂，所针对的PRRSV主要包括经典美洲株(代表毒株为VR-2332),中国分离株(代表毒株为Ch-la)，以及高致病性毒株(代表毒株为JXA-1)。而上述的非肌肉肌球蛋白II型(nonmusclemyosinII,N画-II)抑制剂(+)-blebbistatin与N固-II反应而阻断PRRSV经典美洲株、中国分离株，以及高致病性毒株感染细胞。与(士)-或(-)-blebbistatin不同的是，(+)-blebbistatin不抑制细胞依赖NMM-II的细胞分裂和增殖(StraightAF,CheungA,LimouzeJ,etc.Science.2003，299:1743-1747)。而(士)-blebbistatin—直是脊推动物细胞上醒-IIATP酶活性的选择性抑制剂，而由于发明人将NMHCII-A蛋白作为了PRRSV受体，同时经发明人的长期试验，发现(+)-blebbistatin是可以作为阻断PRRSV感染细胞的受体阻断剂，这在之前的研究中也一直未见应用。其病毒受体非肌肉肌球蛋白II型重连A(nonmusclemyosinheavychainII-A，NMHCII-A)蛋白的具体分离及鉴定过程为利用模拟PRRSVGP5膜抗原的单克隆抗体独特型抗体从MA-104和PAM细胞中提纯出一个可溶性蛋白(ZhouEM,XiaoYH，ShiYF，etal.J.Virol.Methods,2008,149:300-308);50jug上述可溶性蛋白用7.5%SDS-PAGE分离,分离出的蛋白用胃蛋白酶水解，水解片段经微毛细管高压液相层析分离，将分离片段用纳米电喷射离子化，经离子捕获质谱仪分析。将获得的水解片段序列与GenBank氨基酸序列库对比获得受体蛋白为非肌肉肌球蛋白II型重连A(NMHCII-A)。上述(b)或(c)或(d)人工多肽的合成，具体方法是根据NMHCII-A重连的氨基酸序列，用DMStar软件分析序列的抗原表位，设计出20个多肽序列，通过固相多肽合成方法合成多肽，合成的多肽通过MBS或戊二醛方法与载体蛋白匙孔虫戚血蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin，KLH)偶联。同时利用上述合成的人工多肽通过PRRSV阻断试验，证明了NMHCII-A羧基端内的23个氨基酸为PRRSV结合区域，因此羧基端具有与序列表中SeqIDNo:1—致的蛋白，可以作为病毒的受体并作为相应的阻断剂。NMHCII-A蛋白和多肽-KLH偶联产物与铝佐剂混合免疫小鼠产生抗NMHCII-A蛋白和多肽抗体，可采用腹腔免疫小鼠的方法制得，也可采用其他的抗体制备方法制得该血清抗体。如与其它佐剂混合，采用肌肉或皮下免疫方法制得。具体的免疫方法可采用现有生物学中的免疫方法。综上所述，由于发明人将羧基端具有与序列表中SeqIDNo:l—致的蛋白，特别是非肌肉肌球蛋白II型重连A(nonmusclemyosinheavychainII-A,NMHCII-A膝白作为了PRRSV受体，因此与之相关的上述的各种物质，均可以都对PRRSV4感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRSV感染的药物。从而为PRRS的研究和防治提供了一个全新的思路，扩大了研究的范围，对于实际生产有着极为重要的意义。具体实施例方式实施例1新型PRRSV细胞受体的发现和鉴定利用模拟PRRSVGP5膜抗原的单克隆抗体独特型抗体从MA-104和PAM细胞中提纯出一个可溶性蛋白(ZhouEM，XiaoYH,ShiYF，etal.J.Virol.Methods,2008,149:300-308):50jug可溶性蛋白用7.5%SDS-PAGE分离，分离出的蛋白用胃蛋白酶水解，水解片段经微毛细管高压液相层析分离，将分离片段用纳米电喷射离子化，经离子捕获质谱仪分析。将获得的水解片段序列与GenBank氨基酸序列库对比获得受体蛋白为非肌肉肌球蛋白II型重连A(NMHCII-A)。实施例2NMHCII-A人工多肽合成根据NMHCII-A重连羧基端序列制定的多肽序列通过固相多肽合成方法合成多肽，具体方法是将2-ChlorotritylChlorideResin树脂与DMF混合振荡30-60min进行树脂溶涨；通过沙芯抽滤掉DMF，加入3倍摩尔过量C端第一个氨基酸与树脂连接，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30-60min;去掉DMF，加20。P底嚏DMF溶液，反应5-15rain;取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105。C-11(TC加热5min对反应物进行检测。依次用DMF、甲醇和DMF洗涤两次。通过下列方法之一对连接产物进行缩合。方法a:加入三倍过量的溶于DMF的保护氨基酸(FOMC-Asp-OH)和HBTU，再加入十倍过量的NMM，反应30-60min;方法b:加入三倍过量的溶于DMF的保护氨基酸(FOMC-Asp-OH)和HOBt，再加入三倍过量的DIC,反应30-60min。之后依次用DMF、甲醇和DMF洗涤两次。重复以上步骤，依次连接序列中的氨基酸。最后一个氨基酸连接后，依次用DMF、甲醇、DMF和DCM洗涤两次，抽干10-20min。用切割液(TFA94.5%,水2.5%,EDT2.5%,TIS1%)切割120min将多肽从树脂上切割出来，用氮气吹干，用乙醚洗六次，常温挥干。粗制的多肽用纯水或者加少量乙腈溶解,按照下列条件用HPLC纯化多肽。层析柱为VenusiMRC-ODSC18,30x250隱;A泵溶液为0.1%的Trifluoroacetic溶于100%的纯水；B泵溶液为0.1%的trifluoroacetic溶于画的acetonitrile。最后将纯化后的多肽冻干保存-20度保存。或通过其它方法也可合成多肽，如利用/^r卜butoxy-carbonyl或9-fluorenylmethoxycarbonyl的固相合成方法(MerrifieldRB.J,AM.Chem.Soc.,1963,85:2149—2154;ChangCDandMerenhoferJ.Int.J.Pept.ProteinRes.1978，11:246-249)。实施列3多肽与载体蛋白匙孔虫戚血蓝蛋白(KeyholeLimpetH函cyanin,KLH)偶联每个多肽通过下列方法之一与KLH偶联(1)MBS(M-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide)偶联剂偶联5mgKLH用lmLPBS(0.1M,pH6.0)溶解，加入50uLDMS0(含lmgMBS)反应1小时，反应产物用HPLC分离，加入5ing多肽，反应3小时，真空冷冻干燥制得。(2)戊二醛偶联5mgKLH溶于去离子水，加入一定量的戊二醛以及5mg多肽，反应5-6小时，用碳酸氢钠和碳酸钠缓冲液透析24小时，真空冷冻干燥制得。实施例4抗NMHCII-A蛋白和人工多肽抗体的制备蛋白和多肽-铝佐剂制备NMHC1I-A蛋白或多肽-KLH偶联产物溶于0.005MPBS，pH6.2(终容积10mL),缓慢加入溶于0.005MPBS(pH6.2)的硫酸钾锅(比例为50mg蛋白/0.4mg铝)，调升pH至6.8-7.3,搅拌2小时，离心800g10分钟，蛋白-铝佐剂沉淀用生理盐水洗涤一次，用0.1M的PBS溶解制得。蛋白和多肽也可与其它佐剂使用，如福氏佐剂。免疫程序每只小鼠经腹腔免疫50"gNMHCII-A齊白或人工多肽，共免疫三次，采集小鼠血清检测和鉴定抗体。抗NMHCII-A蛋白或人工多肽的抗体也可使用其它动物(如家兔，山羊等)以及釆用其它途径免疫(如肌肉或皮下)。产生抗体的小鼠也可利用其脾脏通过细胞融合制备单克隆抗体。实施例5NMHCII-A蛋白、人工合成多肽及抗体的鉴定间接ELISA法首先，NMHCII-A蛋白及各个多肽用PBS(0.01M,pH7.2)包被ELISA板，每孔200ng,4C过夜。ELISA板用PBS-T(PBS含O.5%体积的Tween-20)洗涤3次后，用封闭液(2.5%浓度的脱脂奶粉溶于PBS-T，200n1/孔)封闭1小时，洗涤3次，每孔加入稀释的小鼠血清反应l小时，洗涤3次，每孔加入辣根过氧化物酶(服P)标记的羊抗鼠IgG反应1小时，洗涤3次，每孔加入100m1肌P底物(TMB)反应15分钟，每孔加入50jal1M硫酸终止反应，用酶标仪在450nm下读取每孔的OD值。检测结果见表1和表2。小鼠免疫之前的血清作为阴性对照血清，免疫后小鼠血清的0D值大于阴性对照的3倍则为阳性。由表1结果证实NMHCII-A蛋白具有免疫原性，血清抗体具有与NMHCII-A蛋白结合特性，其抗体效价可以达到1:100000。同时，这些血清抗体可以与人工合成多肽结合，其抗体效价可以达到1:10000。由表2结果证实人工合成的3个多肽所免疫的小鼠不但可以结合免疫用的多肽，还可以结合NMHCII-A蛋白，其抗体效价可以达到l:10000。表l.抗NMHCII-A血清抗体的鉴定结果不同稀释度的血清结合抗原的OD值"抗原阴性对照血清3次免疫后的血j~~10—2~~i3~~IF~~IF~"~~iF~~~~I1"蘭CII-A蛋白^~^~^~^~~^~~0.46多肽(SeqIDNo:2)0.150.140.110.100.780.530.380.16多肤(SeqIDNo:3)0.170.160.130.110.690.480.330.11多肽(SeqIDNo:4)0.160.120.100.080.750.510.390.17表2-1.抗人工多肽(SeqIDNo:2)血清抗体的鉴定结果不同稀释度血清结合抗原的OD值抗原阴性对照血清3次免疫后的血清lo—2~~TF5~~~~IFIF~~IF~~i^~~I1"多肽(SeqIDNo:2)^~~^TTI~~~171^~~^~OI~OINMHCII-A蛋白0.130.100.100.081.170.680.350.19表2-2.抗人工多肽(SeqIDNo:3)血清抗体的鉴定结果不同稀释度血清结合抗原的OD值抗原阴性对照血清3次免疫后的血清10310"l(T5l(T210310"l(T5多肽(SeqIDNo:3)0.110.130.090.081.160.750.430.22NMHCII-A蛋白0.120.110.80.071.050.650.320.177表2-3.<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例6NMM-II抑制剂(blebbistatin)对细胞的作用(±)-blebbistatin是脊推动物细胞上薩-IIATP酶活性的选择性抑制剂，它抑制细胞卵裂沟的收缩，快速和可逆阻断细胞起泡，阻断细胞迁移以及胞质分裂(StraightAF，CheungA，LimouzeJ，etc.Science.2003，299:1743-1747)。(-)-blebbistatin是(土)-blebbistatin的活性对映异构体，(+)-blebbistatin是(士)-blebbistatin的无活性对映异构体。Marc-M5细胞和PAM(l()5个细胞/ml)培养于DMEM培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素"jug/ml，庆大霉素50]11g/ml，10%小牛血清)中，37°C,5%0)2培养箱中培养成单层。将(土)一blebbistatin，(S)-(-)-blebbistatin和(R)-(+)-blebbistatin(购自美国TocrisCookson公司)溶解于DMS0中，再用PBS倍比稀释，加入单层细胞培养板，连续培养并观察细胞病变(CPE)。CPE在普通显微镜下观察所见为细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。由表4结果表明(士)-blebbistatin和(S)-(-)-blebbistatin抑制细胞增殖并造成CPE。然而，(R)-(+)-Mebbistatin不抑制细胞增殖，无CPE。因此(+)-blebbistatin可作为PRRSV受体阻断剂。表4.Blebbistatin对MA-104和PAM细胞的作用结果不同浓度(pM)blebbistatin造成细胞CPE(有或无)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例7PRRSV受体阻断试验Marc-145细胞和PAM(105个细胞/(111)培养于DMEM培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50jug/ml，庆大霉素50"g/ml，10%小牛血清)中，37°C，5%(:02培养箱中培养成单层。将采用实施例l、2、4的方法得到的NMHCII-A蛋白、人工合成的多肽、血清抗体以及(+)-blebbistatin溶于DMEM培养基中，过滤除菌后与固定浓度(103TCID5。/ml)妁不同毒株的PRRSV混合孵育1小时后，加入上述细胞中，每个稀释度做8个重复，37。C吸附l小时后，去掉混合物，加入DMEM培养基，连续培养，每天观察CPE。PRRSV感染细胞所致的CPE表现为细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。表5所示结果为NMHCII-A蛋白、人工合成的多肽、血清抗体以及(+)-blebbistatin在每孔浓度依次为jug、jug、juL和pM时抑制CPE的程度。判断细胞CPE的指标如下"-，，代表无CPE;"+"代表25%的细胞出现CPE;"++"代表50。/。的细胞出现CPE;"+++"代表75%以上的细胞出现CPE。由表5结果表明NMHCn-A蛋白和人工合成多肽(SeqlDNo:2,3,4)在2"g-100Hg/孔、抗NMHCII-A蛋白和抗人工合成多肽的血清在5yL-100"L/孔以及(+)-b1ebbistatin在2iaM-l00jaM/孔都可以完全抑制PRRSV对细胞造成的CPE;说明NMHCII-A蛋白及其衍生物能够阻断PRRSV感染细胞，可用于开发防治PRRSV的药物。表5.PRRSV受体阻断试验结果不同浓度受体阻断剂抑,对CPE的程度受体阻断剂100502010521NMHCII-A蛋白—-——-—+多肽(SeqIDNo:2)—---——++多肽(SeqIDNo:3)---—-_++多肽(SeqIDNo:4)————_—++抗NMHCII-A蛋白血清—_-——+++4抗多肽(SeqIDNo:2)血清——--—++++抗多肽(SeqIDNo:3)血清-———-++++抗多肽(SeqIDNo:2)血清—----++++(+)-blebbistatin一_一一一_+10<110〉山东农业大学<120>—种新型PRRS病毒受体及该受体的阻断抑制剂<160>4<210〉1<211>23<212>PRT<213>Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus<400>1GlyAlaGlyAspGlySerAspGluGluValAspGlyLysAlaAspGly151015AlaGluAlaLysProAlaGlu20<210>2<211>9<212〉PRT<213>人工多肽<400>2GlyAlaGlyAspGlySerAspGluGlu15<210>3<211>14<212>PRT<213>人工多肽<400>3GlyAlaGlyAspGlySerAspGluGluValAspGlyLysAla1510<210>4<211>11<212>PRT<213>人工多肽<400>4LysAlaAspGlyAlaGluAlaLysProAlaGlu15101权利要求1.一种新型PRRS病毒受体，其特征在于蛋白的羧基端的氨基酸序列为SeqIDNo1所示。2.根据权利要求1所述的病毒受体，其特征在于所述的受体为非肌肉肌球蛋白II型重连A(no謂sclemyosinheavychainII-A，NMHCII-A)蛋白。3.—种阻断PRRS病毒感染细胞的受体阻断剂，选自具有如下特征之一的阻断剂(a)NMHCII-A蛋白，蛋白的羧基端的氨基酸序列为SeqIDNo:1所示；(b)人工多肽，其氨基酸序列为SeqIDNo:2所示；(c)人工多肽，其氨基酸序列为SeqIDNo:3所示；(d)人工多肽，其氨基酸序列为SeqIDNo:4所示；(e)利用(a)或(b)或(c)或(d)制得的血清抗体；(f)非肌肉肌球蛋白II型(no隨sclemyosinII,N固-II)抑制剂，即(+)-blebbistatin。4.根据权利要求3所述的阻断PRRS病毒感染细胞的受体阻断剂，其特征在于结合PRRS病毒或结合细胞受体，阻断PRRS病毒感染MA-l(M和PAM。5.权利要求3所述的阻断PRRS病毒感染细胞的受体阻断剂，用于开发成防治PRRS疾病的药物。全文摘要本发明涉及一个新型PRRS病毒的细胞受体，即非肌肉肌球蛋白II型重连A(nonmusclemyosinheavychainII-A，NMHCII-A)蛋白以及非肌肉肌球蛋白II型(nonmusclemyosinII)的抑制剂-blebbistatin，作为抑制PRRS病毒感染细胞的药物。本发明提供了一种利用纯化的NMHCII-A蛋白和人工合成的多肽及其blebbistatin抑制PRRS病毒感染细胞的方法。本发明还提供了利用NMHCII-A蛋白和多肽产生的抗体。这种通过纯化得到的NMHCII-A蛋白或人工合成方法获得的多肽及其blebbistatin以及抗NMHCII-A蛋白和抗多肽抗体都对PRRS病毒感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRS病毒感染的药物。文档编号C07K14/705GK101481415SQ20091001368公开日2009年7月15日申请日期2009年2月4日优先权日2009年2月4日发明者周恩民申请人:山东农业大学