一种修饰体外合成rna的试剂盒和方法

专利名称：：一种修饰体外合成rna的试剂盒和方法
技术领域：
：本发明涉及了一种修饰体外合成核糖核酸(RNA)的试剂盒和方法，属于核酸研究
技术领域：
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背景技术：
：近年来，随着对核糖核酸(RNA)结构和功能认识的深入，RNA领域的研究迅速发展、日新月异。RNA干扰现象(RNAi)、siRNA、microRNA以及piRNA等RNA相继发现。深入研究这些RNA的结构，分析RNA功能，对RNA合成和修饰提出了更高的要求。天然的非修饰RNA由于其酶不稳定性、转运非靶向性、低细胞穿透性限制了RNA的研究。化学修饰RNA可以有效的提高RNA的稳定性、靶向性以及细胞穿透性，已经成为研究RNA领域的最重要方法之一。分子连接法是一种重要的RNA修饰方法，这种方法用化学修饰手段将RNA和各种活性分子通过共价键稳定连接。这些活性分子包括抗体或抗体的活性部分、脂质体等疏水分子、糖类分子、激素类分子、蛋白类分子、多肽类分子、以及放射性探针分子、荧光探针分子、光感探针分子、抗生素分子、酶抑制分子、半抗原分子或药物分子等。己有研究表明，脂质体等疏水分子同siRNA连接不影响RNA的活性，同时可以提高siRNA的酶稳定性，并可以提高siRNA在活体内的细胞穿透性；多肽以及糖类分子同siRNA连接，在不影响RNA的活性的同时提高RNA的细胞穿透性、以及细胞靶向性；放射性探针分子、荧光探针分子、光感探针分子同RNA连接，可达到修饰RNA目的，从而研究RNA功能。抗生素分子、酶抑制分子、药物分子等也正在被开发同RNA连接，提高RNA的靶向性、稳定性。己报道分子连接方法修饰RNA可归为两类，一类通过固相进行分子连接，另一类在液相中进行分子连接。其中固相进行分子连接可分为两种连接方法，插入修饰亚磷酰胺核糖苷单体法和分步固相合成法。插入修饰亚磷酰胺核糖苷单体法，首先将待连接的活性分子修饰成核苷类似结构分子或类核苷分子，经过磷酰化保护后，直接通过核酸自动合成仪插入到RNA链中。这种方法优点在于连接反应在固相上完成简单、方便，很多活性分子的亚磷酰胺单体己经商品化，可以直接使用，如图l。这种方法的缺点在于连接分子在RNA的合成和脱保护处理过程中的酸、碱以及氧化条件下必须稳定，否则会被分解。而大多数活性分子在酸、碱或氧化条件下都不稳定。这就限制了这种方法的应用。分步固相合成法是将RNA和待连接活性分子在同一固相上合成，一般先合成RNA然后合成活性分子，一般会引入一段链结构将RNA同活性分子连接。分步固相合成法主要用于将多肽、以及糖类等复杂分子同RNA连接。这种方法的优点在于合成产物易于纯化分离，已被应用于核酸活性分子连接化合物库的合成。但是这种方法需要很特殊的合成设备，而且连接分子在整个合成过程中和脱保护基过程中要稳定不能分解，在很多不稳定分子(如多肽)连接时该法是十分麻烦的。至今为止，仍没有一套用该法稳定、高效连接RNA和活性分子体系被开发出来。液相中进行分子连接首先分别合成RNA分子和活性分子，在合成过程中将活性反应基团引入RNA分子和活性分子。在合成后RNA分子同活性分子在液相中通过活性反应基团共价连接。应用这种方法RNA分子和活性分子是分开合成的，避免了在合成RNA过程中活性分子的分解，也可以用常规的分析方法对活性分子和RNA分子表征分析。这种方法可应用连接活性分子的范围最广、成本低、操作简单、易于控制等优点，被认为是最具前景的分子连接修饰RNA方法。液相分子连接法修饰RNA现在面临的最大难题是连接反应选择。RNA分子不稳定，去保护后的在酸性或碱性条件下进行反应都会分解，所以反应条件一定要十分温和，另外，连接产率要高(大于95%)保证RNA同活性分子充分结合。开发一种温和条件下高产率的连接反应，是改进该法的关键！"点击"化学的概念是2001年诺贝尔化学奖得主Sharpless提出的，"点击"反应是在传统的Huisgen三唑反应基础上，发展出一类在温和条件下，高选择性和高产率的化学反应。传统的Huisgen三唑反应(如下表)是有机叠氮和炔基化合物在加热条件下发生1，3-二偶极[3+2]环加成反应，得到五元杂环[l,2，3]-三氮唑。Huisgen三唑反应为链接两个化合物提供了一种很好的手段，但该反应条件通常都是通过加热活化等条件完成。"点击"反应是亚铜离子催化下的Huisgen三唑反应，由于亚铜离子的催化Huisgen三唑反应活化能降低，使该反应可以在常温下水和多种有机溶剂中高产率完成。另外，"点击"反应仅得到1'4'位三氮唑产物，不同于加热条件下得到1'5'位同1'4'位混和产物。现"点击"反应已经广泛应用于组合化学合成，，并被认为是"搭建起化学和生物学桥梁的杰出反应"。
发明内容本发明的目的是提供一种以"点击"反应作为连接反应的修饰体外合成RNA方法和试剂盒。技术方案如下一种修饰体外合成RNA的试剂盒，主要包括有(A)带有l，3—二偶极基团或亲偶极基团的亚磷酰胺单体底物，或带有l,3—二偶极基团或亲偶极基团三磷酸苷底物；(B)带有与l，3—二偶极基团或亲偶极基团对应的亲偶极基团或1，3—二偶极基团的生物分子探针，所述亚磷酰胺单体底物或三磷酸苷底物与生物分子探针能通过l，3—二偶极基团与对应的亲偶极基团逬行"点击"反应。一种修饰体外合成RNA的方法，主要包括以下步骤-(1)在化学合成核糖核酸时，以带有l，3—二偶极基团或亲偶极基团的亚磷酰胺单体或三磷酸核苷为底物，合成带有l，3—二偶极基团或亲偶极基团的核糖核酸；(2)然后在化学合成过程中或合成完毕后，步骤(l)中合成的核糖核酸与带有与1,3—二偶极基团或亲偶极基团对应的亲偶极基团或1，3—二偶极基团的生物分子探针在亚铜离子化合物的催化剂催化下进行"点击"反应，核酸被修饰。具体方法为1，3—二偶极基团或亲偶极基团底物在合成RNA的过程中插入RNA骨架中，在处理和纯化RNA的过程中或纯化后，在催化作用下插入了1，3—二偶极基团或亲偶极基团的核糖核酸和功能分子进行"点击"反应，纯化后得到修饰RNA。所述l，3—二偶极基团优选为氧化腈基、叠氮基、重氮甲基、硝酮基、腈胺基等等；亲偶极基团优选为烯基、炔基。更优选地，所述烯基为乙烯基、丁烯基等；所述炔基为乙炔基、丙炔基，环状炔基等；所述生物分子探针可为任何已知的小分子或大分子，该已知的小分子或大分子包括抗体或抗体的活性部分、脂类和类脂分子、糖类分子、激素类分子、蛋白类分子、多肽类分子、以及放射性探针分子、荧光探针分子、光感探针分子、抗生素分子、酶抑制分子、半抗原分子或药物分子。所述活性生物分子探针优选为带有叠氮基或炔基的吲哚类菁生物荧光探针或苯并吲哚类菁生物荧光探针。更优选为，生物分子探针为u,r,r-四甲基-3-乙基-3'-叠氮基丙基-吲哚三甲川花菁或分子探针为l-乙基-l，-叠氮正己基-3，3，3，，3，-四甲基-6-磺酸基-口引哚五甲川花菁。所述溶剂优选为乙醇、水、四氢呋喃、DMSO、乙腈、氨水、或四氢呋喃与水的混合物、或DMSO与水的混合物、或其中多种溶剂混合物。所述催化剂优选为硫酸铜和抗坏血酸钠、溴化亚铜、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Cu、Cu丝的一种或多种。所述催化剂稳定剂优选为TBTA(Tris[(l-benzyl-l/M,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine)，TCEP(Tri-(2-carboxyethyl)phosphine)中的一种或多种。由于"点击"反应条件温和，产率高，本发明通过"点击"反应作为液相分子连接法修饰RNA的连接反应，连接效率高，可应用的活性分子广，抗体或抗体的活性部分、脂质体等疏水分子、糖类分子、激素类分子、蛋白类分子、多肽类分子、以及放射性探针分子、荧光探针分子、光感探针分子、抗生素分子、酶抑制分子、半抗原分子或药物分子等都可以通过本发明方法同RNA连接。本发明方法修饰RNA避免了传统分子连接方法在RNA合成或脱保护基过程中活性分子分解失活的缺点。另外，本发明方法成本低(是传统亚磷酰胺连接法的七十分之一)、操作简便(在RNA正常的合成过程中完成)，条件温和(避免了传统亚磷酰胺连接法无水操作)，修饰效果好(同传统亚磷酰胺连接法修饰效果相同)，可连接的活性分子范围广(已知连接方法中可应用活性分子最广的方法)，而且不影响任何RNA的生物活性。图1是已商品化的活性分子亚临酰胺单体；图2是Huisgen三唑反应；图3是含亲偶极基团嘧啶核苷类似物；图4是含亲偶极基团嘌呤核苷类似物；图5是1,3—二偶极基团修饰嘧啶核苷；图6是1，3—二偶极基团修饰嘌呤核苷；图7是修饰后RNA活性检测结果。具体实施例方式本发明首先开发了一类携带亲偶极和1,3-二偶极基团的核苷类似物，并合成这些类似物对应的亚磷酰胺单体和三磷酸苷底物，用这些底物合成了携带亲偶极或1,3-二偶极基团的RNA;随后，本发明合成了一系列亲偶极或l，3-二偶极基团的活性分子；最后，在合成RNA的过程中，以及RNA合成完毕后，把携带亲偶极或l,3-二偶极基团的RNA和对应的携带l,3-二偶极或亲偶极基团的活性分子通过"点击"反应连接，纯化后得到修饰RNA，并验证修饰RNA的生物活性。携带亲偶极基团核苷的合成本发明合成了如图(3)(4)中结构的亲偶极基团核苷类似物，5-乙炔基-2，-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2，-脱氧-5-(1,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-乙炔基-2，-脱氧胞嘧啶核苷(YTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2，-脱氧-5-(1,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2，-脱氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2'-脱氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8-(l,7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基-7-氮杂-2，脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-乙炔基-7-氮杂-2，脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1,7辛二炔)-7-氮杂-2'脱氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1,7辛二炔)-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QXA)、2，-脱氧-8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YG)、2，-脱氧-8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XTG)、8-(1,7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮杂-2，脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮杂-2'脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-(l,7辛二炔)-7-氮杂-2，脱氧-鸟嘌呤核苷(QXTG)、7-(l，7辛二炔)-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QXG)。合成方法是通过引入碘原子后引入各种炔基，合成路线类似，仅以2'-脱氧-5-(l,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、2'-脱氧-5-(1,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-(1,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、8-(1,7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)、5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)和5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)合成为例。2'-脱氧-5-(l,7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)合成5-碘-2'-脱氧尿嘧啶核苷(1.50g,4.26mmo1)PdC12(PPh3)2(0.299g，0.426mmol)碘化亚铜(0.161g,0.852mmol)溶于3mlDMF,加入(3.9ml，21.3mmo1)N,N-二异丙基乙胺室温搅拌10分钟。l陽三甲硅基-l,6二辛炔(0.908g,5.54mmol)溶于lmlDMF，缓慢滴入反应体系，滴加完后常温搅拌过夜。蒸干反应溶剂后，混合物用100ml乙酸乙酯溶解，分别用100ml水、饱和NaCl溶液洗，硫酸镁干燥有机层后旋干，直接用于下一步反应。将得到的固体溶于2ml水，加入2当量的碳酸钾，搅拌1小时。旋干反应液，直接柱层析分离，梯度洗脱(甲醇乙酸乙酯0—10%),得到产物0.89g(63%)。i普图数据:1HNMR(d6-DMS0，400MHz)S1.57(m，4H),2.11(m,2H),2.19(m，2H),2.38(m,2H),2.75(m,1H),3.55-3.65(m,2H),3.78(dd,1H)，4.23(m,1H),5.06(t,1H),5.22(b，1H),6.10(t，1H),8.10(s,1H),11.3(bs,1H)。2，-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)合成5-碘-2'-脱氧尿嘧啶核苷(0.6g,1.7mmo1)Pd(PPh3)4(196mg，0.17mmol)碘化亚铜65.5mg,0.34mmol)溶于3mlDMF，加入lmlN,N-二异丙基乙胺室温搅拌10分钟。1-三甲硅基-1,6二辛炔(1.8g，17mmol)溶于lmlDMF，缓慢滴入反应体系，滴加完后常温搅拌过夜。蒸干反应溶剂后，混合物用100ml乙酸乙酯溶解，分别用100ml水、饱和NaCl溶液洗，硫酸镁干燥有机层后旋干，直接用于下一步反应。将得到的固体溶于2ml水，加入2当量的碳酸钾，搅拌l小时。旋干反应液，直接柱层析分离，梯度洗脱(甲醇乙酸乙酯0—10%)，得到产物0.42g(75%)。谱图数据谱图数据1HNMR(d6-DMSO，400MHz):1.54—1.62(m,4H,2CH2)，2.0—2.15(m，3H,HR-C(2')，CH2),2.22-2.44(m,3H，H_-C(2')，CH2),2.76(s,1H,C三CH),3.54~3.62(m,2H墨C(5'))，3.79(m,H-C(4'))，4.20(m,H-C(3')),5.04(t,OH-C(5')),5.20(d，OH-C(3'))，6.12(t,H-C(l')),6.71(s,NH),7.67(s,丽)，8.07(s,H-C(6)).5-(l，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)将2，3，5，-氧-三乙酰基尿苷(14g,37.81mmol，leq)溶于230mlCH3CN中，向反应液中加入12(4.8g,18.91mmol,0.5eq)及Ce(NH4)2(NO3)6(10.36g,18.9mmol,0.5eq),加热至U80。C恒温搅拌lh。旋蒸除去溶剂，残余物用300mlCH2C12溶解，有机层分别用200mlH2O，200ml5%NaHS03水溶液，200ml饱和食盐水洗涤。水相用200mlCH2C12返萃，合并有机层。旋干溶剂，过柱分离，洗脱剂比例PE:EAl:l，得白色固体产物5-碘-2，3，5，-氧-三乙酰基尿苷16.9g，产率90%。将5-碘-2，3，5'-氧-三乙酰基尿苷(5g,10mmol，leq)溶于100mlCH2C12:(C2H5)3N1:1混合溶液中，N2保护下向其中加入(PPh3)2PdC12(0.53g,0.757mmol,0.075eq)，Cul(0.29g,1.5mmol,0.15eq)，1-三甲硅基-1,6二辛炔(3.12g，6.7ml,21.17mmol,2.1eq)，N2保护下常温搅拌20h，旋蒸除去溶剂，残余物用100mlCH2C12溶解，有机层用2x200ml10%EDTA二钠水溶液，200ml饱和食盐水溶液洗涤，水层用200mlCH2C12返萃，合并有机层，旋干溶剂，过柱分离，洗脱剂比例PE:EA3:11:1，得淡黄色泡沫5-(三甲基硅1,7辛二炔基)-2，3，5，-氧-三乙酰基尿苷4g，产率78.2%。将5-(三甲基硅1,7辛二炔基)-2，3，5，-氧-三乙酰基尿苷(12g,21.22mmol,leq)溶于200mlCH3OH中，向其中加入28。/。NH3'H2O(35ml,10eq)，常温搅拌2h，向反应液中加入K2C03(2.22g,16mmol，1.5eq)，常温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，残余物用少CH30H:H201:1混合液溶解后过柱分离，洗脱剂比例CH2C12:CH30H7:11:1,得白色粉末状固体产物4.5g，产率62%。1HNMR(d6-DMSO,400MHz)51.57(m,4H),2.11(m,2H),2.19(m,2H),2.38(m,2H),2.75(m，1H),3.55-3.65(m，2H)，3.78(dd，1H)，4.23(m，1H),5.06(t,1H),5.22(b,1H)，5.26(b,lH)，6.10(t，1H),8.10(s,1H)，11.3(bs,1H)。5-(l,7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)5-碘-胞嘧啶核苷(3.1g,8.5mmo1),Pd(PPh3)4(980mg,0.85mmo1),碘化亚铜(327.5mg,0.34mmol)溶于30mlDMF，加入8mlN，N-二异丙基乙胺室温搅拌10分钟。1-三甲硅基-1，6二辛炔(9g,85mmol)溶于lmlDMF,缓慢滴入反应体系，滴加完后常温搅拌过夜。蒸干反应溶剂后，混合物用100ml乙酸乙酯溶解，分别用100ml水、饱和NaCl溶液洗，硫酸镁干燥有机层后旋千，直接用于下一步反应。将得到的固体溶于2ml水，加入2当量的碳酸钾，搅拌1小时。旋干反应液，直接柱层析分离，梯度洗脱(甲醇乙酸乙酯0—10%)，得到产物4.1g(70X)。谱图数据谱图数据1HNMR(d6-DMSO,400MHz):1.54—1.62(m，4H,2CH2),2.0—2.15(m,3H，HR-C(2')，CH2)，2.22—2.44(m,2H,CH2)，2.76(s,1H，C三CH),3.54—3.62(m,2H-C(5'))，3.79(m,H-C(4'))，4.20(m,H-C(3')),5.04(t,OH隱C(5')),5.20(d，OH-C(3'))，5.26(d,OH-C(2'))，6.12(t,H-C(l')),6.71(s,NH),7.67(s,NH),8.07(s,H-C(6)).8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)8-碘-鸟嘌呤核苷4.08g,(lOmmol),Pd(PPh3)4(l.lg，lmmol),碘化亚铜(0,28g,1.5腿ol)溶于100mlDMF，加入10mlN,N-二异丙基乙胺室温搅拌10分钟。1-三甲硅基-1，6二辛炔17.8g，100mmol)溶于15mlDMF，缓慢滴入反应体系，滴加完后常温搅拌过夜。蒸干反应溶剂后，混合物用500ml乙酸乙酯溶解，分别用200ml水、饱和NaCl溶液洗，硫酸镁干燥有机层后旋干，直接用于下一步反应。将得到的固体溶于20ml水，加入2当量的碳酸钾，搅拌1小时。旋干反应液，直接柱层析分离，梯度洗脱(甲醇乙酸乙酯0—10%)，得到产物2.1g(56X)。谱图数据1HNMR(d6-DMS0，400MHz):1.54~1.62(m,4H),2.0—2.15(m,4H)，2.79(s,1H)，3.2—3.8(m,2H)，4-4.5(m,2H),4.8(d,1H)，5.1(t,1H),6.5(d,1H),8.5-9(b,lH).将5-碘-3，5，-氧-二乙酰基-2，-脱氧尿苷(16g,36.52mmol,leq)溶于200mlCH2C12:(C2H5)3N1:1混合溶液中，N2保护下向其中加入(PPh3)2PdC12(1.59g，2.27mmol,0.075eq)，Cul(0.86g,4.52mmol，0.15eq)，三甲基硅基乙炔(6.24g，8.8ml,63.53mmol,2.1eq)，N2保护下常温搅拌20h，旋蒸除去溶剂，残余物用300mlCH2C12溶解，有机层用2x200ml10MEDTA二钠水溶液，200ml饱和食盐水溶液洗涤，水层用200mlCH2C12返萃，合并有机层，旋干溶剂，过柱分离，洗脱剂比例PE:EA3:11:1，得淡黄色泡沫11.65g，5-[(三甲基硅基)乙炔基]-3，5，-氧-二乙酰基-2，-脱氧尿苷，产率78%。将5-[(三甲基硅基)乙炔基]-3，5，-氧-二乙酰基-2，-脱氧尿苷(11g,26.93mmol,leq)溶于100mlCH3OH中，向其中加入28。/。NH3'H2O(15ml，10eq),常温搅拌2h，向反应液中加入K2C03(4.44g,32.13mmol,1.5eq)，常温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，残余物用少CH30H:H201:1混合液溶解后过柱分离，洗脱剂比例CH2C12:CH30H7:11:1,得白色粉末状固体产物4.1g，产率64%。核磁数据1HNMRS2.10-2.14(m,2H,H-2，2"),3.54-3.64(m,2H,H-5，,5"),3.78-3.80(m，1H，H-4，)，4.23-4.25(m,1H,H-3'),5.14,5.24(tandd;1Hand1H;OH，s)，6.09(t，J=6.6Hz,1H,H陽l，),8.39(s,1H,H-61，11.65(s,1H，NH);5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)将5-碘-2，3，5，-氧-三乙酰基尿苷(15g,30.23mmol,leq)溶于200mlCH2C12:(C2H5)3N1:1混合溶液中，N2保护下向其中加入(PPh3)2PdC12(1.59g,2.27mmol,0.075eq)，Cul(0.86g,4.52mmol，0.15eq)，三甲基硅基乙炔(6.24g，8.8ml,63.53mmol,2.1eq)，N2保护下常温搅拌20h，旋蒸除去溶剂，残余物用300mlCH2C12溶解，有机层用2x200ml10%EDTA二钠水溶液，200ml饱和食盐水溶液洗涤，水层用200mlCH2C12返萃，合并有机层，旋干溶剂，过柱分离，洗脱剂比例PE:EA3:ll:l，得淡黄色泡沫5-[(三甲基硅基)乙炔基]-2，3，5，-氧-三乙酰基尿苷11.4g，产率81%。将5-[(三甲基硅基)乙炔基]-2，3，5，-氧-三乙酰基尿苷(10g,21.44mmol,leq)溶于100mlCH3OH中，向其中加入28。/。NH3'H2O(15ml,10eq),常温搅拌2h，向反应液中加入K2C03(4.44g,32.13mmol,1.5eq)，常温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，残余物用少CH30H:H201:1混合液溶解后过柱分离，洗脱剂比例CH2C12:CH30H7:11:1,得白色粉末状固体产物3.65g，产率67,53%。i普图数据:1HNMR53.54-3.70(m，2H,H-5，,5"),3.85-3.87(m,1H,H-4，),3.96-3.99(m，1H,H-3，，4.01-4.05(m，lH,H-2')，5.07,5.26，5.42(d，t，andd，1H,1H,and1H,OH，s),5.72(d,J=4.6Hz，1H,H-l，)，8.48(s,1H，H-6),11.65(brs,1H,NH);携带1,3—二偶极基团核苷的合成本发明合成了图(5)(6)中含1,3—二偶极基团核苷类似物，包括5-叠氮基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(DTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(DU)、5-叠氮基-2，-脱氧胞嘧啶核苷(DTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2，脱氧-8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DTA)、8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2'脱氧-8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DTG)、8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DG)。其中1,3—二偶极基团修饰嘌呤核苷按照巳有文献合成。1,3—二偶极基团修饰嘧啶核苷合成是首先合成氨基核苷通过重氮化反应活化氨基，用叠氮基取代氨基，得到对应的1,3—二偶极基团修饰嘧啶核苷，以5-叠氮基-尿嘧啶核苷合成为例。5-叠氮基-尿嘧啶核苷合成将2.59g(10mmol)5-氨基-尿嘧啶核苷在冰浴中溶于30ml的1NHC1，加入10mmolNaNO2，搅拌2分钟后加入20gNaN3，室温搅拌3小时后用氨水中和至中性，蒸干溶剂后，直接上柱,二氯甲垸甲醇10:1得到产物L31g产率46%谱图数据1HNMR(d6-DMSO，400MHz):3.54(m,4H),4.1~4,53(m，3H),4.8-5.1(m,3H),6.12(d,lH),6.71(s,1H),7.97(s,lH).实施例1:构建修饰体外合成RNA的试剂盒(一)携带1，3—二偶极基团和亲偶极基团亚磷酰胺单体合成本发明合成了一系列携带1,3—二偶极基团和亲偶极基团亚磷酰胺单体，包括炔基甘油亚磷酰胺、炔基三甘醇亚磷酰胺以及图(3)_(6)中核苷对应的亚磷酰胺单体。这些单体合成都是通过对应底物和2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应得到，故仅以炔基甘油亚磷酰胺、炔基三甘醇亚磷酰胺、5-乙炔基尿苷亚磷酰胺合成为例。炔基甘油亚磷酰胺(2)合成0.5g(2.66mrno1)炔基三甘醇和0.75ml(5.31mrno1)二异丙胺溶于2ml无水二氯甲烷，加入0.94gG.98mmo1)2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。室温搅拌1小时，加入5ml水终止反应。5ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，饱和NaCl洗3次，硫酸钠干燥后旋干，柱层析，石油醚洗脱，得到产物0.98g(95%)。谱图数据'HNMR(CD3C1,400MHz)S1.149-1.259(m，12H),2.3-2.8(m，3H)，3.4-3.7(m，12H),3.7-3.9(m,3H),4.1-4.2(s,2H)。炔基三甘醇亚磷酰胺(6)合成lg炔基甘油(3)溶于5ml甲醇，加入0.5ml浓盐酸室温搅拌1小时。旋干反应液，反应混合物溶于10ml二氯甲烷，千燥旋干得到0.6g产物，直接下一步反应。0.6g(4.61mmo1)化合物4溶于2ml无水吡啶，加入1.875g(5.53mmo1)4,4'-二甲氧基三苯基氯甲垸，室温反应l小时，旋干反应液，溶于10ml二氯甲烷。10ml水洗二氯甲烷层3次，饱和NaCl洗三次，硫酸钠干燥后旋干。柱层析，梯度洗脱，乙酸乙酯石油醚(0-50%)得产物1,53g(77%)。1.2g(2.77mmo1)化合物5和0.78tnl(5.55mmo1)二异丙胺溶于2ml无水二氯甲烷，加入0.985g(4.16mmo1)2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。室温搅拌1小吋，加入5ml水终止反应。5ml二氯甲垸萃取3次，合并有机相，饱和NaCl洗3次，硫酸钠干燥后旋干，柱层析，石油醚洗脱，得到产物1.6g(91^)。谱图数据'HNMR(CD3C1，400MHz)Sl-1.2(m，12H)，2.4國2.5(m,2H),2.6-2.7(t,1H),3.1-3.3(m,2H)，3.5-4(m,12H),4.1-4.3(m,3H)，6.75-6.85(t,4H),7.15-7.5(m，9H)。5-乙炔基尿苷亚磷酰胺(10)合成5-乙炔基尿嘧啶核苷(2.68g，lOmmol)溶于10ml吡啶，加入5.07g(15mmol)4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷，室温反应12小时。蒸干吡啶20ml水洗三次，Na2S04干燥后硅胶柱分离，石油醚乙酸乙酯2:1洗脱，得4.4g淡黄色固体，5'-0-4,4'-二甲氧基三苯基-5-乙炔基尿嘧啶核苷(8)，产率78%。4g(8)溶于10ml四氢呋喃，加入2ml吡啶，1.7g硝酸银'1.5g叔丁基二甲基氯硅垸，室温反应5小时，加5ml水。20ml水洗三次，Na2S04干燥后硅胶柱分离，石油醚乙酸乙酯1:1洗脱得到5'-0-4,4'-二甲氧基三苯基-2，-0-叔丁基二甲基-5-乙炔基尿瞎啶核苷(9)2.98g，产率60%1.5g(9)溶于5ml二氯甲烷，加入lml二异丙基乙胺，L5ml2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，室温反应2小时。力B2ml水。10ml水洗三次，Na2S04干燥后硅胶柱分离，石油醚乙酸乙酯6:l洗脱白色固体1.5g，产率78%。31PNMRS148.72;S149.09(二)携带1，3—二偶极基团和亲偶极基团的三磷酸核苷合成本发明合成了图(3)—(6)中核苷对应的三磷酸核苷，合成方法类似都是通过三氯氧磷合成单磷酸后在和焦磷酸盐反应得到最后的三磷酸核苷，以5'-叠氮基尿嘧啶核苷三磷酸和5'-乙炔基尿嘧啶苷三磷酸合成为例。5'-叠氮基尿嘧啶核苷三磷酸四钠盐将5'-叠氮基尿嘧啶核苷(42.7mg，0.15mmo1)溶解在干燥的磷酸三甲酯溶液(5ml)中，加入质子海绵(48.21mg，0.225mmoD。在冰浴下滴加三氯氧磷15^1。当检测当到反应中间体最多时(约85%-90%)快速滴加入1.5ml0.5M双三正丁胺焦磷酸盐的无水DMF溶液和0.15ml三正丁基胺,并在0'C激烈搅拌。反应1分钟后加入0.2MEt3N.H2C03水溶液PH7.515ml。旋蒸后的剩余物经过DEAE纤维素离子交换柱纯化后(4。C下用Et3N.H2C03缓冲液梯度洗脱0—400Mm)得到5，-叠氮基尿嘧啶核苷三磷酸四钠盐。产率61%，31P-NMR(162MHz,CD3OD):ppm-8.9(d，1P),-9.8(d,1P)，-21.7(m,IP)5，-乙炔基尿嘧啶苷三磷酸四钠盐将5，-乙炔基尿苷(40.2mg,0.15mmo1)溶解在干燥的磷酸三甲酯溶液(5ml)中，加入质子海绵(48.21mg，0.225mmo1)。在冰浴下滴加三氯氧磷15pl。当检测当到反应中间体最多时约2-3小时(约85°/。-90%)，快速滴加入1.5ml0.5M双三正丁胺焦磷酸盐的无水DMF溶液和0.15ml三正丁基胺，并在0。C激烈搅拌。反应l分钟后加入0.2MEt3N.H2CO3水溶液PH7.515ml。旋蒸后的剩余物经过DEAE纤维素离子交换柱纯化后(4。C下用Et3N.H2C03缓冲液梯度洗脱0—400Mm)得到产物56°/。。31P-NMR(D20)0~6.28(d,1p),-10.48(d,1p),-21.23(t，1P);(三)携带亲偶极基团和1,3-二偶极基团的生物探针分子合成本发明按照文献方法合成了6-叠氮羧酸(11)、6-叠氮己胺(12)、6-叠氮己醇(13)炔基羧酸(14)并购买了丙炔胺。利用这些携带亲偶极基团和1，3-二偶极基团的中间体和各种功能分子反应，得到携带亲偶极基团和1,3-二偶极基团的功能分子，以叠氮基三甘醇生物素的合成和携带亲偶极基团和1,3-二偶极基团的肽合成为例。另外，本发明根据不同功能分子的结构不同进行了简单的修饰得到携带亲偶极基团和1,3-二偶极基团的功能分子，以疏水类功能分子叠氮基胆固醇、叠氮基荧光探针合成为例。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>叠氮基三甘醇生物素(16)合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>Reagents:(a)NHS,EDC，DMF,i%67%(b)TEA^N3(OCH2CH2)3NH2,93%lg(4.09rnrno1)生物素溶于10mlDMF，加入0.942g(8.19rnrno1)N-羟基琥珀酰亚胺，1.57g(8.19mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温搅拌过夜。蒸干溶剂将反应物溶于二氯甲垸，水洗，产物析出。干燥后得产物1.02g(73%)。将lg(2.93mmol)产物直接溶于5mlDMF，加入1.531g(8.79mmol)叠氮三甘醇胺，搅拌过夜。蒸干反应液，将反应物混合物溶于10ml二氯甲烷，10ml水洗三次，饱和NaCl洗三次，干燥旋干后柱层析纯化。得到产物0.93g(79%)。谱图数据iHNMR(CD3Cl，400MHz)S1.34-1.47(m,2H),l,54-l,78(m,4H),2.15-2.13(t,2H),2,68-2.76(d,1H),2.84-2.92(m,1H),3.06-3.16(m，1H),3.34-3.44(m,4H)，3.52隱3.7(m，10H),4.28-4.31(m,1H),4.44-4.5(m,IH)。(四)携带亲偶极基团和l，3-二偶极基团的多肽合成本发明将中间体(11)和(14)的羧基用N-羟基琥珀酰亚胺活化，用活化单体在多肽合成仪上既可完成用于"点击"反应的多肽合成，本发明用该法合成了携带亲偶极基团和1,3-二偶极基团的R6Pen肽，TaT肽等多肽。叠氮基胆固醇(17)合成2g(2.97mmoD对甲苯磺酰基活化的胆固醇溶于10mlDMF，加入0.386g(5.94mmo1)叠氮钠室温搅拌过夜。加入100ml二氯甲烷，100ml水洗二氯甲烷三次，100ml饱和氯化钠溶液洗，硫酸钠干燥后旋干，柱层析分离，乙酸乙酯石油醚(0—10%)洗脱，得产物1.2g(74.3%)。谱图数据iHNMR(CD3Cl，400MHz)S0.67(s，3H),0.84-0.925(m,9H),0.993(s,3H)，1.1國1.6(m,24H),1.76-2.04(m,5H),2.15-2.25(t,1H),2.33隱2.41(d,1H),3.12-3.23(m,1H)，3.36-3.42(t,2H),3.6國3.7(m，10H),5.35(m,1H)。叠氮基荧光探针合成本发明合成了叠氮基和炔基吲哚类菁荧光探针，购买了BODIPY类荧光探针琥珀酰亚胺酯，AlexaFluor类荧光探针琥珀酰亚胺酯，以及FAM、FITC、罗丹明琥珀酰亚胺酯。用6-叠氮己胺和丙炔胺同购买的荧光探针琥珀酰亚胺酯反应得到对应的含1，3—二偶极基团和亲偶极基团的荧光探针，并合成了生物素探针。吲哚菁类荧光探针如下，6-叠氮己胺合成和氨基同琥珀酰亚胺酯反应按照文献报道不加赘述。U，l，,r-四甲基-3-乙基-3，-叠氮基丙基』引哚三甲川花菁(Cy3)合成4.55g(lOmmol)1,1-甲基3-乙基-2-(P-苯胺)乙烯基-吲哚啉和4.20g(lO讓ol)1,1,2-三甲基-3-叠氮基丙基-吲哚啉于50mL吡啶和2mL乙酸酐中，加热回流过夜。将溶剂蒸发后反应合物溶于100ml二氯甲垸，100ml水洗二氯甲烷层三次，100ml饱和NaCl溶液洗二氯甲烷层，硫酸钠干燥后旋干，柱层析。洗脱剂甲醇二氯甲垸(0-10%)的产物2.12g(36.8%)谱图数据1HNMR(CDC13,400MHz)S0.98-1.02(t,3H),1.52-1.61(m,2H),1.89-1.96(m，2H),2,06(s,12H),2,81(s,3H),4.17-4.25(t,2H),7.25-7.53(m,4H),7.55-7.60(d,2H),7.62-7.68(d,2H),7.90-8.00(d,4H),8.08-8,15(d,2H),8.58-8.62(t,1H)。l-乙基-l'-叠氮正己基-3，3，3'，3'-四甲基-6-磺酸基-吲哚五甲川花菁(Cy5)合成3.96g(10mmol)l-乙基-2-正苯胺基丁二烯基-3,3-二甲基-6-磺酸基吲哚，3.98g(10mmol)l-叠氮正己基-2，3，3-三甲基卩引哚碘盐溶于25mL吡啶和25mL乙酸酐中，加热回流过夜。将溶剂蒸发后反应混合物溶于100ml二氯甲烷，100ml水洗二氯甲烷层三次，100ml饱和NaCl溶液洗二氯甲烷层，硫酸钠干燥后旋干，柱层析。洗脱剂甲醇二氯甲垸(0-10%)的产物2.85g(35.9%)谱图数据1HNMR(CDC13,400MHz)S1.24-1.39(m,5H)，1.53(s,12H),1.68(m,6H),3.25(t,2H)，3.36(t,2H),4.05(t，2H)，6.09(d,lH),6.29(d，1H),6.74(t,lH),6.94-7.35(m,7H),7.94(q,2H)。本发明购买了BODIPY630/650-X,SE、BODIPYFL,SE、BODIPY530/550,SE、BODIPY493/503,SE、BODIPY558/568,SE、BODIPY564/570,SE、BODIPY576/589,SE、BODIPY581/591,SE、BODIPYFL-X,SE、BODIPYTR-X,SE、BODIPYTMR-X，SE、BODIPYR6G,SE、BODIPYFLC5，SE、以及AlexaFluor350、405、430、488、500、514、532、555、546、568、594、610、633、647、660、680、700、750和FAM、FITC、罗丹明琥珀酰亚胺酯，用这些活化好的荧光探针和丙炔胺反应，得到含亲偶极基团的荧光探针，用这些活化好的荧光探针和6-叠氮己胺反应得到含1,3-二偶极基团的荧光探针。(五)"点击"反应条件建立，具体如下反应物1反应物2产物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>0.025g(0.1mmoi;)0.054g(0.1mmoi;)C54H45BrP3Cu四氢呔喃0.025g(0.1mmo1)0.054g(0.1mmo1)C54H45BrP3Cu乙腈0.025g(0.1mmoi;)0.054g(0.1mmoi;)C54H45BrP3CuDMSO以上反应条件下反应过夜，旋干反应液直接柱层析纯化。谱图数据^NMR(CDCl3,400MHz)50.75-2.5(m,44H),3.0陽3.2(s,1H),3.4-3.8(m，14H)，3.9-4.2(b,4H)，4.3-4.8(b,3H)，5.2-5.4(s,1H)，6.20-6.5(s,1H),8.1-9.5(b,3H)。(六)携带1，3—二偶极基团和亲偶极基团的RNA合成本发明用以上合成的携带1,3—二偶极基团和亲偶极基团亚磷酰胺单体和未修饰的单体，通过亚磷酰胺固相合成了3—100nt的携带1,3—二偶极基团和亲偶极基团的RNA。并用TaKaRaT7RNAPolymemse试剂盒和我们合成的携带l，3—二偶极基团和亲偶极基团的三磷酸底物合成了100nt以上的携带l,3—二偶极基团和亲偶极基团的RNA。实施例2:RNA在合成不同阶段时被修饰方法使用以下一种或多种方法都可以得到功能分子修饰的RNA。RNA合成中脱碱基保护过程中"点击"反应携带亲偶极基团RNA:化学固相合成中用炔基亚磷酰胺(如炔基甘油亚磷酰胺、炔基三甘醇亚磷酰胺)为底物对RNA进行修饰合成，引入炔基；携带1,3-二偶极基团生物分子探针1,1,1，，1'-四甲基-3-乙基-3，-叠氮基丙基-苯并吲哚三甲川花菁；催化剂Cu(CH3CN)4PF6;溶剂乙醇氨水溶液；lOOnmol未脱碱基保护的携带亲偶极基团RNA溶于乙醇氨溶液中，加入200nmol携带1,3-二偶极基生物分子探针，100nmmol催化剂加热过夜。旋干氨水后，按照标准的RNA后处理方法处理，最终得到连接功能分子的RNA67nmo1。脱2'位保护基过程中"点击"反应携带亲偶极基团RNA:化学固相合成中用炔基亚磷酰胺对RNA进行修饰，引入炔基；携带1,3-二偶极基团生物分子探针1,1，1，,1'-四甲基-3-乙基-3，-叠氮基丙基-苯并吲哚三甲川花菁催化剂C54H45BrP3Cu;溶剂四氢呋喃；lOOnmol未脱2'位保护基的携带亲偶极基团RNA溶于100^1四氢呋喃，加入lOOnmolC54H45BrP4Cu，200nrno1携带1,3-二偶极基团生物分子探针，lOOOnmol四丁基氟化铵反应4—12小时后，蒸干反应液，按照标准的RNA后处理方法处理，最终得到连接生物荧光探针的RNA52腦o1。RNA合成后"点击"反应携带亲偶极基团RNA:化学固相合成中用炔基亚磷酰胺对RNA进行修饰，引入炔基。或用TaKaRaT7RNAPolymerase试剂盒结合本发明已合成的携带亲偶极基团三磷酸苷合成携带炔基的RNA;携带1,3-二偶极基团生物分子探针1，U',l，-四甲基-3-乙基-3，-叠氮基丙基-苯并吲哚三甲川花菁；.催化剂硫酸铜和抗坏血酸钠；催化剂稳定剂TBTA/TCEP;溶剂水；50nmo1携带亲偶极基团RNA溶于50nm水，加入lOOnmol硫酸铜、lOOnmol抗坏血酸钠、100nmolTBTA，500nmo1携带1,3-二偶极基团生物分子探针，反应1一24小时后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化连接产物，得产物24nmo1。RNA合成中脱碱基保护过程中"点击"反应携带1，3-二偶极基团RNA:化学固相合成中用叠氮亚磷酰胺为底物，对RNA进行修饰合成，引入叠氮基；携带亲偶极基团功能分子1，1，r,r-四甲基-3-乙基-3'-乙炔基丙基-苯并ll引哚二甲川花菁；催化剂Cu(CH3CN)4PF6;溶剂乙醇氨水溶液；lOOnmol未脱碱基保护的携带1，3-二偶极基团RNA溶于乙醇氨溶液中，加入200nmo1携带亲偶极基团功能分子，100nmmol催化剂加热过夜。旋干氨水后，按照标准的RNA后处理方法处理，最终得到连接功能分子的RNA42nmo1。脱2'位保护基过程中"点击"反应携带1,3-二偶极基团RNA:化学固相合成中用叠氮亚磷酰胺对RNA进行修饰，引入叠氮基。携带亲偶极基团功能分子u，r，r-四甲基-3-乙基3'-乙炔基丙基-苯并吲哚三甲川花菁催化剂C54H45BrP4Cu溶剂四氢呋喃lOOnmol未脱2'位保护基的携带13-二偶极基团RNA溶于100^1四氢呋喃，加入lOOnmolC54H45BrP4Cu，200nrno1携带亲偶极基团功能分子，lOOOnmol四丁基氟化铵反应4—12小时后，蒸干反应液，按照标准的RNA后处理方法处理，最终得到连接生物荧光探针的RNA36nmo1。RNA合成后"点击"反应携带1，3-二偶极基团RNA:化学固相合成中用叠氮亚磷酰胺对RNA进行修饰，引入叠氮基。或用TaKaRaT7RNAPolymerase试剂盒结合本发明已合成的携带1，3-二偶极基团三磷酸苷合成携带叠氮基的RNA;携带亲偶极基团功能分子1,1,1，,1，-四甲基-3-乙基-3，-乙炔基丙基-苯并吲哚三甲川花菁；.催化剂硫酸铜和抗坏血酸钠；催化剂稳定剂TBTA/TCEP;溶剂水；50nmol携带1，3-二偶极基团RNA溶于50nm水，加入lOOnmol硫酸铜、lOOnmol抗坏血酸钠、100nmolTBTA，50Onmo1携带亲偶极基团功能分子，反应1一24小时后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化连接产物，得产物29nmo1。以下实施例例举不同功能分子探针同RNA连接方法。实施例3:胆固醇同RNA连接携带亲偶极基团RNA:化学固相合成中用炔基亚磷酰胺对RNA进行修饰，引入炔基；携带1,3-二偶极基团生物分子探针叠氮基胆固醇；催化剂C54H45BrP4Cu;溶剂四氢呋喃。lOOnmol未脱2'位保护基携带亲偶极基团RNA溶于100^1四氢呋喃，加入lOOnmolC54H45BrP4Cu，500nrno1叠氮基胆固醇，lOOOnmol四丁基氟化铵反应4一12小时后，蒸干反应液，按照标准的RNA后处理方法处理，最终得到连接胆固醇分子的RNA76nmo1。其它长链烷烃以及非极性活性分子(如脂质体分子、疏水性药物等)连接方法同胆固醇连接相同。实施例4:聚乙二醇(PEG)同RNA连接携带亲偶极基团RNA:化学固相合成中用炔基亚磷酰胺对RNA进行修饰，引入炔基；携带1,3-二偶极基团生物分子探针叠氮基聚乙二醇；催化剂Cu(CH3CN)4PF6;溶剂乙醇氨水溶液；lOOnmol未脱碱基保护携带亲偶极基团RNA溶于乙醇氨溶液中，加入500nrno1携带1,3-二偶极基团生物分子探针，100nmmolCu(CH3CN)4PF6加热过夜。旋干氨水后，按照标准的RNA后处理方法处理，最终得到连接聚乙二醇的RNA83nmol。实施例5:聚醚酰亚胺(PEI)同RNA连接携带亲偶极基团RNA:化学固相合成中用炔基亚磷酰胺对RNA进行修饰，引入炔基。携带1,3-二偶极基团生物分子探针叠氮基聚醚酰亚胺(PEI)催化剂Cu(CH3CN)4PF6溶剂乙醇氨lOOnmol未脱碱基保护携带亲偶极基团RNA溶于乙醇氨溶液中，加入500nmol携带1,3-二偶极基团生物分子探针100nmmolCu(CH3CN)4PF6加热过夜。旋干氨水后，按照标准的RNA后处理方法处理，最终得到连接聚醚酰亚胺的RNA72nmo1。其它极性稳定活性分子(如糖类分子、激素类分子、放射性探针分子、荧光探针分子、光感探针分子、抗生素分子、酶抑制分子、或药物分子等)都可以通过本实验条件同RNA连接。实施例6:多肽同RNA连接携带1,3-二偶极基团RNA:化学固相合成中用叠氮亚磷酰胺对RNA进行修饰，引入叠氮基。或用TaKaRaT7RNAPolymerase试剂盒结合本发明已合成的携带1,3-二偶极基团三磷酸苷合成携带叠氮基的RNA;携带亲偶极基团功能分子炔基修饰的多肽；催化剂硫酸铜和抗坏血酸钠；催化剂稳定剂TBTA;溶剂水；50nmo1携带1,3-二偶极基团RNA溶于50ran水，加入lOOnmol硫酸铜、lOOnmol抗坏血酸钠、100nmolTBTA，500nmo1炔基修饰的多肽，反应2小时后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化连接产物，得产物32nmo1。其它极性不稳定活性分子(如抗体或抗体的活性部分、糖类分子、激素类分子、蛋白类分子、多肽类分子、以及放射性探针分子、荧光探针分子、光感探针分子、抗生素分子、酶抑制分子、半抗原分子或药物分子等)都可以通过本实验条件同RNA连接。实施例7:对被修饰RNA的生物活性检测通过对本发明实施例2所述方法合成了的l,l,r,l，-四甲基-3-乙基-3'-叠氮基丙基-苯并吲哚三甲川花菁(Cy3.5)修饰的小干扰RNA(siRNA)。生物活性测定首先，取lpl/孔Lipofectamine2000，用50^1Opti-MEMIReducedSerumMedium稀释。轻轻混和后在室温孵育5min;取适量CY3.5-siRNA(根据不同转染浓度取量，50nM为1.25^1/孔)，用50^1Opti-MEMIReducedSerumMedium稀释，轻轻混和均匀；稀释的Lipofectamine2000(a)经过5min的孵育后，与稀释Cy3.5-siRNA(b)轻轻混和，室温静置20min，以形成FAM-siRNA-转染试剂混和物。将Cy3.5-siRNA-转染试剂混和液(c)加入含有细胞及培养液的孔中，轻轻摇晃孔板，使混和；在37C的C02培养箱中培养8小时检测。实验结果如图(7)，结果表明，通过本发明可以将Cy3和RNA连接，而且修饰后未影响siRNA沉默效果。权利要求1、一种修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，主要包括有(A)带有1，3-二偶极基团或亲偶极基团的亚磷酰胺单体底物，或带有1，3-二偶极基团或亲偶极基团三磷酸苷底物；(B)带有与1，3-二偶极基团或亲偶极基团对应的亲偶极基团或1，3-二偶极基团的生物分子探针，所述亚磷酰胺单体底物或三磷酸苷底物与生物分子探针可通过1，3-二偶极基团与对应的亲偶极基团进行“点击”反应。2、根据权利要求1所述的修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，所述l,3_二偶极基团为氧化腈基、叠氮基、重氮甲基、硝酮基、或腈胺基；亲偶极基团为烯基、或炔基。3、根据权利要求2所述的修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，所述烯基为乙烯基、或丁烯基；所述炔基为乙炔基、丙炔基，或环状炔基。4、根据权利要求3所述的修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，所述亚磷酰胺单体底物为炔基三甘醇亚磷酰胺或炔基甘油亚磷酰胺；所述三磷酸苷底物为5'-叠氮基尿嘧啶核苷三磷酸和5，-乙炔基尿嘧啶苷三磷酸。5、根据权利要求1所述的修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，所述生物分子探针为生物荧光探针、免疫探针、生物素、抗原或半抗原、放射性探针分子、光感探针分子、或蛋白标签分子。6、根据权利要求5所述的修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，所述生物分子探针为带有叠氮基或炔基的吲哚类菁生物荧光探针或苯并吲哚类菁生物荧光探针。7、根据权利要求6所述的修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，所述生物分子探针为1,1,r,r-四甲基-3-乙基-3，-叠氮基丙基』引哚三甲川花菁或分子探针为i-乙基-r-叠氮正己基-3，3，3，，3'-四甲基-6-磺酸基』引哚五甲川花菁。8、根据权利要求1所述的修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括有催化剂、溶剂，所述催化剂包为含亚铜离子化合物；所述溶剂为水、四氢呋喃、DMSO、乙腈、或四氢呋喃与水的混合物、或DMSO与水的混合物、或其中多种溶剂混合物。9、根据权利要求1所述的修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，所述催化剂为硫酸铜和抗坏血酸钠、溴化亚铜、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Cu、Cu丝中的一种或多种。10、根据权利要求8或9所述的修饰体外合成RNA的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括有催化剂稳定剂，该催化剂稳定剂为TBTA，TCEP中的一种或多种。11、一种修饰体外合成RNA的方法，其特征是，主要包括以下步骤(l)在化学合成核糖核酸时，以带有l，3—二偶极基团或亲偶极基团的亚磷酰胺单体或三磷酸苷为底物合成核糖核酸；(2)然后在化学合成过程中或合成完毕后，待修饰核糖核酸与带有与1，3—二偶极基团或亲偶极基团对应的亲偶极基团或1，3—二偶极基团的生物分子探针在亚铜离子化合物的催化剂催化下进行"点击"反应，核糖核酸被修饰。12、根据权利要求11所述的修饰体外合成RNA的方法，其特征是，所述l，3—二偶极基团为氧化腈基、叠氮基、重氮甲基、硝酮基、或腈胺基；亲偶极基团为烯基、或炔基。13、根据权利要求12所述的修饰体外合成RNA的方法，其特征是，所述烯基为乙烯基、或丁烯基；所述炔基为乙炔基、丙炔基，或环状炔基。14、根据权利要求13所述的修饰体外合成RNA的方法，其特征是，所述亚磷酰胺单体底物为炔基三甘醇亚磷酰胺或炔基甘油亚磷酰胺。15、根据权利要求11所述的修饰体外合成RNA的方法，其特征是，所述生物分子探针为生物荧光探针、免疫探针、生物素、抗原或半抗原、放射性探针分子、光感探针分子、或蛋白标签分子。16、根据权利要求15所述的修饰体外合成RNA的方法，其特征是，所述活性生物分子探针为带有叠氮基或炔基的吲哚类菁生物荧光探针或苯并吲哚类菁生物荧光探针。17、根据权利要求11所述的修饰体外合成RNA的方法，其特征是，所述溶剂为水、四氢呋喃、DMSO、乙腈、或四氢呋喃与水的混合物、或DMSO与水的混合物、或其中多种溶剂混合物；所述催化剂为硫酸铜和抗坏血酸钠、溴化亚铜、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Cu、Cu丝中的一种或多种。18、根据权利要求11所述的修饰体外合成RNA的方法，其特征是，步骤(2)中，进行"点击"反应时还加有催化剂稳定剂，该催化剂稳定剂为TBTA，TCEP中的一种或多种。全文摘要本发明公开了一种修饰体外合成RNA的方法和试剂盒，具体为(1)在化学合成RNA时，以带有1，3-二偶极基团或亲偶极基团的亚磷酰胺单体为底物合成核糖核酸；(2)然后在化学合成过程中或合成完毕后，待修饰核糖核酸与对应的亲偶极基团或1，3-二偶极基团的生物分子探针在亚铜离子化合物的催化剂催化下进行“点击”反应，核糖核酸被修饰。本发明方法提供的修饰RNA的试剂盒和方法避免了传统分子连接方法在RNA合成或脱保护基过程中活性分子分解失活的缺点。成本低、操作简便，条件温和，修饰效果好，而且不影响任何RNA的生物活性。文档编号C07K1/107GK101550175SQ20091003936公开日2009年10月7日申请日期2009年5月11日优先权日2009年5月11日发明者张必良,渠德忠,玮王申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院