一种高特异性的抗肿瘤单克隆抗体的制作方法

专利名称：：一种高特异性的抗肿瘤单克隆抗体的制作方法一种高特异性的抗肿瘤单克隆抗体
技术领域：
：本发明涉及肿瘤学和医学领域。本发明尤其涉及抗人肿瘤的特异性单克隆抗体及其应用。
背景技术：
：肿瘤是仅次于心血管病的人类第二大杀手，肿瘤的早期诊断和治疗是生命科学领域面临的一个重要课题。HAAH是细胞内的一种酶，仅见于胚胎和肿瘤，在正常人体内，HAAH基因的表达处于关闭状态，所以不产生HAAH。肿瘤细胞中HAAH的表达明显上调。由于HAAH与肿瘤的发生和发展都有密切的联系，因此HAAH是肿瘤早期诊断的一个重要标志，也是肿瘤治疗的一个重要靶标。对肿瘤的免疫诊断和免疫治疗一直是人们关注的重点，但突破性的进展并不多。人们在不断寻找肿瘤特异性抗原的同时，越来越重视对肿瘤相关抗原的研究和应用。HAAH是一种特殊的癌胚抗原，其特殊性是(1)与几乎所有的肿瘤相关，已知与十二种以上的肿瘤相关，是一种广谱的癌胚抗原。(2)HAAH与肿瘤有着密切的相关性，检测HAAH对肿瘤的诊断具有很高的特异性，所以具有确诊的意义。(3)针对HAAH抗原的特异性抗体具有介导NK细胞的ADCC作用，发挥特异性杀伤肿瘤细胞作用。抗体依赖的细胞介导的细胞毒(antibody-d印endentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)作用是体内免疫系统特异性清除肿瘤和病毒感染细胞的重要途径之一。NK细胞、巨噬细胞等膜表面表达有IgGFc受体，通过与结合在病毒感染细胞或肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，发挥杀伤靶细胞的作用。NK细胞是发挥ADCC作用的主要细胞。在抗体介导的ADCC作用的发生过程中，抗体首先与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，NK细胞继而杀伤已与抗体结合的靶细胞，具有特异的导向杀伤作用。肿瘤清除的效果与ADCC作用的强弱密切相关，而ADCC作用的强弱则与抗体-抗原作用的特点密切相关。并非所有的抗体都具有介导ADCC作用，针4对同一个抗原不同表位的抗体也有各自不同的亲和力和不同的介导ADCC活性。因此，筛选具有强介导ADCC作用的特异性单克隆抗体，对于肿瘤的治疗具有重要意义，在肿瘤的特异性诊断上自然也具有重要的应用价值。基于肿瘤诊断与治疗的这一应用需要，本发明从大量的融合的淋巴细胞杂交瘤中筛选出了一株具有很强介导NK细胞ADCC作用的单克隆抗体，在体内与体外的实验中，能使NK细胞对肿瘤的杀伤活性提高50。/f80%。抗体应用于肿瘤的诊断上也有很高的特异性，病理切片的免疫组化结果显示，与常规病理切片的诊断结果比较，其阳性符合率为100%。
发明内容本发明的目的提供一种特异性抗肿瘤标志性抗原的单克隆抗体。一种高特异性的抗肿瘤单克隆抗体，该抗体的轻链可变区由105个氨基酸组成，其序列如下GlnPheValLeuThrGluSerGlyAlalieMetSerThrAlaMetGlyGlyArgValThrlieAlaCysAlaThrSerGlyGlySerAspThrArgAsnLeuHisTrpTyrAlaThrValThrArgLeuProGlyArgValThrSerLysArgProSerPheAlaCysLeuGluSerArgThrAsnGlyAspAlaL>ysValLeuProGlyPhePheAsnGlyGinThrPheAlaSerProPheValAlaThrProAsnAlaHisValProAlaAspGlyLeuLeuGlyHisAlaGlySerLysAlaPheGlySer重链可变区由lll个氨基酸组成，其序列如下AlaValSerProAsnGlyLysTyrLysGlyAsnSerArgProThrCysProAspCysPheProAlaThrSerLeuGluGlyLeuPheLeuGluLeuSerArgArgAlaLysCysPheProThrValValArgGlyPheGluHisThrCysAsnThrArgGluLeuProAspLeuGlyArglieHisSerlieLysAlaGlylieHisArgAsnGlyGlylieGinPhelieThrPheGlyLeuCysGlyAspArgliePheProGluValAspAsnArgValLysPheThrCysSerAsnAspSerValAsnGlySerAlaPhelieArgCys在本发明的一个实施例中，上述抗体与抗原HAAH(Humanasparaginylbeta-hydroxylase，人天冬酰胺羟化酶)发生特异性结合。在本发明的另一个实施例中，该抗体的恒定区为鼠IgG2a亚类。在本发明的第二方面，提供了上述单克隆抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。在本发明的另一个实施例中，上述单克隆抗体在制备治疗肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、前列前癌、肾癌、食道癌、膀胱癌药物中的应用。本发明的单克隆抗体能显著提高NK细胞的ADCC活性，使NK细胞对肿瘤的杀伤率提高至少50%。更为重要的是其可变区的氨基酸序列具有其自身的唯一性，它的可变区氨基酸序列与其它已报道的抗HAAH单克隆抗体完全不同，这是区分不同抗体特性的根本。具体实施方式一、HAAH基因的重组表达来源于临床切除的人乳腺癌组织，采用RNA提取液从研磨的肿瘤组织中提取总RNA，oligo(dt)引物逆转录获得HAAH基因的cDNA。随后采用PCR方法扩增出用于克隆的HAAHcDNA。扩增的HAAHcDNA测序确认后克隆在pPIC9k酵母表达载体上，转化GS115酵母菌后，筛选3mg/mlG418抗性的转化酵母菌。利用甲醇对酵母进行发酵和表达诱导，从发酵液上清中纯化表达产物，最终获得纯度为95%的HMH重组表达蛋白。实施过程如下1.HAAHcDNA的克隆首先合成下列引物上游弓l物5，atgaattcatggtgattgcattgctgggc3，下游弓I物5，atgcggccgcctaaattgctggaaggetgcgtc3，上游引物引入了EcoRI酶切位点gaattc,下游引物引入NotI限制性内切酶位点；克隆的具体过程如下抽提肿瘤组织中的总RNA:取临床上经病理确诊的乳腺癌组织约0.1克，冻融-匀浆后加入lml的TrizolRNA提取液(Invitrogen公司产品)、氯仿200ul抽提，12000rpm离心5分钟，吸取水相500ul，加入异丙醇500ul，12000rpm离心15分钟，获得RNA沉淀，75%乙醇洗沉淀一遍。沉淀的总RNA在超净台中吹干，溶解在50u1DEPC处理过的水中。取5u1总RNA，以OligodT16作为逆转录引物，AMV为逆转录酶获得HAAH的第一链cDNA。以8pl逆转录产物为模板，以上述的上下游引物为扩增引物，用PCR方法中扩增HAAH基因。扩增条件为94。C2min，94°C50s-55°C50s_72°Clmin30s共30个循环。扩增产物经1%琼脂糖电泳后，在约2.3kb大小处有一清晰的扩增条带。从琼脂糖凝胶中回收该DNA条带，随后与T载体连接。连接产物转化DH5a大肠杆菌(感受态)，在含IPTG与X-gal的青霉素平板上挑选8个白色菌落，分别提取质粒，用EcoRI和NotI进行双酶切鉴定，结果5个克隆的质粒都能切出2.3kb大小的片段。取其中的一个克隆送交测序公司测序，结果表明所克隆的基因与公布的HAAHcDNA序列完全一致。'2.构建表达HAAH的表达载体用EcoRI和NotI双酶切T载体后，回收2.3kb的HAAH基因，与同样双酶切的pPIC9K载体连接，转化DH5a感受态菌，取4个克隆用EcoRI和NotI双酶切鉴定，结果都能切出两个片段(一个片段为9.3kb的载体，另一个为2.3kb的HAAH基因)，取其中一个克隆进行序列测定，证实为HAAH基因克隆在pPIC9K载体中。确认的克隆提取质粒，Sall酶切成线性后，纯化回收。线性化的克隆质粒约0.1iig(在0.2y1纯水中)与50p1的感受态GS115毕赤酵母菌混合，在25uF，2.5kV条件下电穿孔，将克隆质粒转入毕赤酵母菌中。电穿后的GS115毕赤酵母菌涂布在MD平板上。3(TC培养5d后，收集所有毕赤酵母菌落，混合均匀后再涂布在含3mg/mlG418的YNB平板上，30。C培养5d后，获得2个抗4mg/mlG418的酵母工程菌克隆。取其中一个克隆进行小规模的诱导表达实验在BMGY培养基中扩菌后，在含甲醇的B醒Y培养基中进行诱导表达，表达上清，经SDS-PAGE电泳确定在90kd处可看到有明显表达的蛋白。采用兔抗HAAH多克隆抗体(来源见下述)对其进行western-blot染色，证明90kd处的蛋白为HAAH。这个结果表明已成功构建出表达HAAH的酵母工程菌。3.制备兔抗HAAH的多克隆抗体为了对重组表达的HAAH蛋白进行鉴定，我们在此之前依据HAAH中第86位至110位的氨基酸序列，化学合成了一条25个氨基酸的短肽，合成的短肽与完全佐剂混合后免疫家兔，获得了兔抗HAAH的多克隆抗体。4.HAAH在酵母中发酵、表达与纯化(1)酵母工程菌的发酵与诱导表达HAAH的酵母工程菌10ml，在500mlBMGY培养基中培养48小时，转到含15L基础培养液的30L发酵罐中。温度、溶氧度和pH值分别设定在30。C、60%、5.0。用甘油进行分批补料培养72小时。停止甘油流加后，开始流加甲醇进行诱导表达，诱导时间为72h。(2)发酵液的分离收集发酵罐中的发酵液共30L，离心收集上清液20L。取少量上清用SDS-PAGE电泳法对表达产物进行鉴定。结果表明，在约90kd处有一明显的蛋白表达，与0.5mg/ml的标准含量人白蛋白比较，初步确定本工程菌的HAAH蛋白表达量可达0.5mg/ml。(3)HAAH蛋白的纯化发酵诱导表达的上清液用50K的超滤板进行超滤浓縮，获得超滤浓縮液1L。超滤浓縮液首先通过s印hadexG50去除其中的盐离子，随后采用离子交换层析的方法纯化其中的目的蛋白。HAAH的等电点为4.8，所以采用DEAE-s印harose-FF阴离子交换层析柱，在0.1-2M浓度剃度NaCl的PBS(pH7.0)洗脱下，纯化HAAH蛋白。纯化后的HAAH蛋白经SDS-PAGE电泳及灰度扫描，证实纯化后蛋白的纯度可达到99%。纯化后最终获得HAAH蛋白3g。二、抗HAAH单克隆抗体制备纯化的重组HAAH与不完全佐剂混合研磨后免疫BALB/c小鼠，小鼠免疫的剂量为每只小鼠每次皮下免疫0.5mg的HAAH,共免疫4次，每次间隔10天。取免疫小鼠的脾脏，筛网研磨后与sp2/0骨髓瘤细胞融合，制备淋巴细胞杂交瘤。从融合生长的杂交瘤细胞中筛选具有分泌结合HAAH抗体的单克隆杂交瘤，制备含单克隆抗体的小鼠腹水。共获得3株能与HAAH结合的单克隆抗体，分别命名为2C6、2D5、2H8。具体实施过程如下1.免疫Balb/c小鼠重组表达的HAAH蛋白0.5ml(含1.5mgHAAH蛋白)与lml的完全佐剂(sigma公司产品)混匀，每只小鼠脊背皮下3点、腹股沟2点进行免疫注射，每点注射0.lml，共免疫3只BALB/c小鼠(BALB/c小鼠购自第四军医大学实验动物中心)。IO天后进行第二次免疫，腹腔注射0.5mg的重组HAAH蛋白。第20天进行第三次免疫，免疫剂量与免疫途径同第二次。第三次免疫后一周从尾静脉采少量的血进行效价测定。ELISA间接法结果证实，小鼠血清的抗HAAH抗体效价达到了1:10000。第30天小鼠腹腔加强免疫注射lmgHAAH蛋白，第35天取小鼠脾脏，用于制备淋巴细胞杂交瘤。2、淋巴细胞杂交瘤的融合(1)主要试剂淋巴细胞杂交瘤技术中使用的细胞培养基是RPMI-1640(GibcoBRL)。以RPMI-1640为基础培养液，在杂交瘤融合制备过程中根据添加的成分不同，用于不同的目的。不完全RPMI-1640培养基每100ml含RPMI-1640培养基原液96ml、100X谷氨酰胺溶液lml(0.2mol/L)、双抗溶液lml(含青霉素1万单位/ml、链霉素10mg/ml)、7.5。/oNaHC03溶液2ml、HEPES溶液lml(lmol/L)。上述液体均已通过过滤除菌。完全RPMI-1640培养基每100ml含不完全RPMI-1640培养基80ml、胎牛血清20ml。完全1640用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞的培养。HT培养基完全RPMI-1640培养基99ml、lml次黄嘌呤和胸腺嘧喊核苷(HT)。HAT培养基:完全RPMI-1640培养基98ml、lmlHT、lml氨基喋呤(A)。(2)骨髓瘤细胞与脾细胞的融合骨髓瘤细胞融合前收集对数生长的骨髓瘤细胞(SP2/0)，悬浮于不完全培养基中。脾淋巴细胞取上述已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球放血并处死后在75%酒精中浸泡1分钟，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于平9皿中，分别用20ml不完全培养基洗涤2次。剥去脾脏周围结缔组织后，将脾脏移入200目铜网上(置于平皿中)，用lml玻璃注射器针芯轻轻挤压研磨脾脏，用10ml不完全培养基冲洗筛网。收获脾细胞悬液，1000rpm离心10分钟，不完全培养基离心洗涤3次，最后将细胞重悬于10ml不完全培养基。饲养细胞的制备取一只正常BALB/c小鼠(未经过免疫)，按照与制备脾淋巴细胞相同的方法制备伺养细胞。96孔细胞培养板，每孔加入0.1ml含106个饲养细胞备用。骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞的融合-将1X108个脾细胞与1X107个骨髓瘤细胞SP2/0混合后，1000rpm离心5分钟，吸净上清。手指轻轻弹击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置37。C预热。1分钟内加入37。C预热的PEG(sigma)lml，边加边轻轻搅拌。90秒内加入20ml预热的不完全培养基，静置10分钟。1000rpm离心5分钟，弃去上清。加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至50ml。上述含饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔0.lml，培养板置37。C，5%0)2培养箱内培养。5天后用HAT培养基换出1/2培养基。IO天后用HT培养基换出HAT培养基；经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清检测抗体。(3)杂交瘤筛选纯化的重组HAAH蛋白包被ELISA板，20ug/孔。取有杂交瘤生长孔的培养上清0.lml，加入已包被好的ELISA板中，阴性对照孔加入0.lml完全1640培养基，37'C1个小时。洗板后加入羊抗鼠酶标抗体O.lml，37'C1个小时后洗板，加入OPD底物显色。阳性较强孔对应的杂交瘤细胞转至24孔板中继续培养，并进行三次的克隆化。本次融合获得了三株阳性克隆。分别命名为2C6、2D5、2H8。这三株单抗经抗体亚类检测证实均为IgG2a。(4)单克隆抗体腹水制备BALB/c小鼠15只，每只腹腔注射液体石蜡0.2ml，7天后腹腔注射上述筛选出的三株杂交瘤细胞。每种杂交瘤各注射5只BALB/c小鼠，每只注射106个杂交瘤细胞。13天后抽取腹水，离心收集后-2(TC保存备用。三、抗HAAH单克隆抗体介导NK细胞的ADCC活性以A549肺癌细胞、7721肝癌细胞、MCF乳腺癌细胞为靶细胞，磁珠分离获得的人NK细胞为效应细胞，两种细胞混合后在96孔板中培养，效应细胞与靶细胞数量的比例为5:1。对照组只有肿瘤细胞与NK细胞混合培养，实验组除了肿瘤细胞和NK细胞外还加入10P1的单克隆抗体腹水。为了计算杀伤率的需要，还另设了只有单独NK细胞和只有单独肿瘤细胞的对照孔。各组细胞在同一块96孔培养板上，37。C培养4小时后，分别用CellCountingkit-8试剂盒测定活细胞的量，计算杀伤率。杀伤率(％)=〔l一(Ae+t—Ae)/At〕X100%;Ae:单纯效应细胞孔即NK细胞孔的A值(吸光值)；At:单纯靶细胞孔即K562细胞孔的A值；Ae+t:效应细胞加靶细胞孔的A值。各组的杀伤率结果如下表表l.3株单克隆抗体介导ADCC作用结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从上表的实验结果可以看出2D5这一株单克隆抗体具有明显的介导NK细胞ADCC作用，另外两株单克隆抗体2C6与2H8只有很弱或没有ADCC作用。四、2D5单克隆抗体亚类以及重、轻链可变区氨基酸序列的确定分泌2D5单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清，采用小鼠抗体类别鉴定试剂盒进行鉴定。证实2D5单克隆抗体属于小鼠IgG2a亚类。提取2D5杂交瘤细胞的总RNA，采用小鼠可变区cDNA基因扩增的5组引物，分别对重、轻链可变区基因进行扩增。结果，各有一对引物分别扩增出了重链可变区cDNA和轻链可变区cDNA。重、轻链可变区cDNA分别克隆到T载体后进行基因序列测定，在基因库中进行序列比对，未发现与本序列相同的基因。以本基因序列推导的氨基酸序列经过序列比对证实2D5单克隆抗体可变区的结构具有鼠抗体典型的骨架结构特征，可变区中高变区的氨基酸序列也具有独特的结构，现有的抗体可变区氨基酸序列没有与其有重复的序列。根据2D2单克隆抗体轻链可变区cDNA序列推导出的相应氨基酸序列如下GlnPheValLeuThrGluSerGlyAlalieMetSerThrAlaMetGlyGlyArgValThrlieAlaCysAlaThrSerGlyGlySerAspThrArgAsnLeuHisTrpTyrAlaThrValThrArgLeuProGlyArgValThrSerLysArgProSerPheAlaCysLeuGluSerArgThrAsnGlyAspAlaLysValLeuProGlyPhePheAsnGlyGinThrPheAlaSerProPheValAlaThrProAsnAlaHisValProAlaAspGlyLeuLeuGlyHisAlaGlySerLysAlaPheGlySer根据2D2单克隆抗体重链可变区cDNA序列推导出的相应氨基酸序列如下AlaValSerProAsnGlyLysTyrLysGlyAsnSerArgProThrCysProAspCysPheProAlaThrSerLeuGluGlyLeuPheLeuGluLeuSerArgArgAlaLysCysPheProThrValValArgGlyPheGluHisThrCysAsnThrArgGluLeuProAspLeuGlyArglieHisSerlieLysAlaGlylieHisArgAsnGlyGlylieGinPhelieThrPheGlyLeuCysGlyAspArgliePheProGluValAspAsnArgValLysPheThrCysSerAsnAspSerValAsnGlySerAlaPhelieArgCys五、2D5单克隆抗体在SCID-Hu小鼠肿瘤动物模型上的抗肿瘤实验以SCID小鼠(T细胞核B细胞联合免疫缺陷小鼠)为原型，引入人外周血单个核细胞后构建的具有人免疫应答特征的嵌合型小鼠作为肿瘤动物模型，分别建立A549肺癌细胞、7721肝癌细胞、MCF乳腺癌细胞的实体瘤模型。36只荷瘤小鼠，分为9组，每组4只。对照组荷瘤小鼠不注射NK细胞和2D5单克隆抗体。荷瘤小鼠+NK组，每只荷瘤小鼠注射107人NK细胞。荷瘤小鼠+NK组+2D5单克隆抗体组，每只荷瘤小鼠注射107人NK细胞和lmg纯化的2D5单克隆抗体。平行实验，比较各组之间瘤体的大小。结果见表2。表.22D5单克隆抗体对SCID-Hu荷瘤小鼠的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从上表的体内实验结果可以看出，2D5单克隆抗体对这三种肿瘤都具有很强的提高NK细胞杀伤，能够明显提高NK细胞在体内的抗肿瘤活性。六、抗HAAH单克隆抗体用于肿瘤组织切片的免疫组化染色2D5单克隆抗体腹水，1:500稀释后用于肿瘤病理切片的免疫组化染色。11张已确诊的肿瘤组织切片，11张对应器官的正常组织切片分别与2D5单克隆抗体结合，再用羊抗鼠酶标二抗及底物显色。结果表明这11张已经确诊的肿瘤组织切片均为阳性。而11张相应器官的正常组织切片均为阴性。显示了2D5单克隆抗体良好的特异性。ll张已确诊的肿瘤病理切片分别是肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、前列前癌、肾癌、食道癌、膀胱癌。阴性对照切片为ll种对应器官的正常组织切片。序列表<110>广州罗森生物科技有限公司<120>—种高特异性的抗肿瘤单克隆抗体<160>4<210>1<211>105<212>PRT<213>人工序列<400>1GinPheValLeuThrGluSerQlyAlalieMetSerThrAlaMet151015GlyGlyArgValThrlieAlaCysAlaThrSerGlyGlySerAsp202530ThrArgAsnLeuHisTipTyrAlaThrValThrArgLeuProGly354045ArgValThrSerLysArgProSerPheAlaCysLeuGluSerArg505560ThrAsnGlyAspAlaLysValLeuProGlyPhePheAsnGlyGin657075ThrPheAlaSerProPheValAlaThrProAsnAlaHisValPro808590AlaAspGlyLeuLeuGlyHisAlaGlySerLysAlaPheGlySer95100105<210>2<2">1"<212>PRT<213>人工序列<400>2AlaValSerProAsnGlyLysTyrLysGlyAsnSerArgProThr151015CysProAspCysPheProAlaThrSerLeuGluGlyLeuPheLeu202530GluLeuSerArgArgAlaLysCysPheProThrValValArgGly354045PheGluHisThrCysAsnThrArgGluLeuProAspLeuGlyArg505560lieHisSerlieLysAlaGlylieHisArgAsnGlyGlylieGin657075PhelieThrPheGlyLeuCysGlyAspArgliePheProGluVal808590AspAsnArgValLysPheThrCysSerAsnAspSerValAsnGly95100105SerAlaPhelieArgCys110<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3atgaattcatggtgattgcattgctgggc29<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>4atgcggccgcctaaattgctggaaggctgcgtc3权利要求1、一种高特异性的抗肿瘤单克隆抗体，其特征在于该抗体的轻链可变区由105个氨基酸组成，其序列如下GlnPheValLeuThrGluSerGlyAlaIleMetSerThrAlaMetGlyGlyArgValThrIleAlaCysAlaThrSerGlyGlySerAspThrArgAsnLeuHisTrpTyrAlaThrValThrArgLeuProGlyArgValThrSerLysArgProSerPheAlaCysLeuGluSerArgThrAsnGlyAspAlaLysValLeuProGlyPhePheAsnGlyGlnThrPheAlaSerProPheValAlaThrProAsnAlaHisValProAlaAspGlyLeuLeuGlyHisAlaGlySerLysAlaPheGlySer重链可变区由111个氨基酸组成，其序列如下AlaValSerProAsnGlyLysTyrLysGlyAsnSerArgProThrCysProAspCysPheProAlaThrSerLeuGluGlyLeuPheLeuGluLeuSerArgArgAlaLysCysPheProThrValValArgGlyPheGluHisThrCysAsnThrArgGluLeuProAspLeuGlyArgIleHisSerIleLysAlaGlyIleHisArgAsnGlyGlyIleGlnPheIleThrPheGlyLeuCysGlyAspArgIlePheProGluValAspAsnArgValLysPheThrCysSerAsnAspSerValAsnGlySerAlaPheIleArgCys。2、如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其与抗原HAAH发生特异性妙入^口口o3、如权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于该抗体的恒定区为鼠IgG2a亚类。4、如权利要求1所述的单克隆抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。5、如权利要求1所述的单克隆抗体在制备治疗肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、前列前癌、肾癌、食道癌、膀胱癌药物中的应用。全文摘要本发明所述的一种高特异性的抗肿瘤单克隆抗体涉及肿瘤学和医学领域。本发明尤其涉及抗人肿瘤的特异性单克隆抗体及其应用。该抗体的轻链可变区由105个氨基酸组成，重链可变区由111个氨基酸组成。本发明的单克隆抗体能显著提高NK细胞的ADCC活性，使NK细胞对肿瘤的杀伤率提高至少50％。更为重要的是其可变区的氨基酸序列具有其自身的唯一性，它的可变区氨基酸序列与其它已报道的抗HAAH单克隆抗体完全不同，这是区分不同抗体特性的根本。文档编号C07K16/40GK101654482SQ20091004141公开日2010年2月24日申请日期2009年7月27日优先权日2009年7月27日发明者张明杰申请人:广州罗森生物科技有限公司