专利名称：乙基丙二酰基取代水飞蓟宾及其制备方法和药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一个23位乙基丙二酰 基取代的水飞蓟宾衍生物即化合物丙二酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二 氢-3,5,7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氢-l,4-苯并二氧六环-2]-甲基乙酯的 制备方法和医药用途。该化合物被发现具有抑制II型单纯疱疹病毒HSV-2复 制的功能，因此该化合物或其可药用盐可以预期用于制备治疗由II型单纯疱疹 病毒HSV-2引发的生殖器疱疹和/或生殖器炎症的药物。
背景技术：
单纯疱疹病毒直径约为120-150微米，含有DNA的核位于中间，向外依 次由包膜、体被、衣壳三种同心结构组成，衣壳表面为162个壳微粒组成的3:3:2 轴对称的20面体，在低温下可生存数月，湿热5(TC及干燥90°C 30分钟处理 可灭活。单纯疱疹病毒可分为I型和II型二种，I型疱疹病毒(HSV-1)主要 感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官，HSV-1主要通过呼吸道、皮肤和粘膜密切 接触传播，99%的口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，口和口 周围发生的疱疹都是由I型疱疹病毒感染引起的。II型疱疹病毒(HSV-2)主 要存在于女性宫颈、阴道、外阴皮肤及男性的阴茎、尿道等处，是引起生殖器 发炎和疱疹的罪魁祸首。
HSV-2病毒经性器官接触后，潜伏约2-20天(平均6天)，HSV-2感染引 起的生殖器疱疹临床表现中可分为原发和复发两种，患病部位先有烧灼感，很 快在红斑基础上发生3-10个成群的红色丘疹，伴有瘙痒，丘疹很快变成小水 疱，3-5天后变为脓疱，破溃后形成大片的糜烂和溃疡，自觉疼痛，最后结痂 愈合。整个病程可持续20天左右。男性好发于龟头、冠状沟、尿道口、阴茎、 阴囊、大腿和臂部等处。女性好发于阴唇、阴阜、阴蒂、肛周或阴道。约90% 的病人，病毒可同时侵犯子宫颈，出现阴道分泌物增多或下腹痛，并可并发宫 颈炎和子宫炎。大多数男女病人双侧腹股沟淋巴结肿大。后期炎症波及尿道、 膀胱时，可出现排尿困难、尿痛、尿频、严重者可发生尿潴留等现象。此外， 被感染者还可能有其它症状同时出现，如发热、全身不适、头痛、颈项强直、脑膜炎和骶部神经系统功能不全。
生殖器疱疹病毒与生殖器恶性肿瘤关系密切，引起生殖器疱疹的II型疱疹 病毒可能是宫颈癌的潜在致癌因子。研究发现，患过生殖器疱疹的妇女比未患
过者得宫颈癌的危险性大5~10倍，并且，在宫颈癌组织、剥脱细胞或癌前期 细胞中发现了 II型疱疹病毒特异抗原，从而表明II型疱疹病毒在宫颈癌的发 生过程中起了重要作用。另外，从阴茎癌病人的活检材料中也观察到单纯疱疹 病毒样颗粒。此外，近年来人们也注意到孕妇与II型疱疹感染的严重性。对妊 娠的患者或无症状携带者来说，最严重的是传染给新生儿，孕妇患生殖器疱疹 可导致胎儿畸形、流产、死产。
对HSV-2感染引起的病毒性疾病目前尚无特效治疗方法，临床上主要的 治疗措施为采用阿昔洛韦等抗病毒药物。此外，人白细胞干扰素也可抑制病毒 繁殖，减少生殖器疱疹的复发率。然而，使用此类激素类药品、抗菌素类药品 存在较大的毒副作用和易使病人产生耐药性以及菌群失调等不足之处。
中医将II型单纯性疱疹病毒感染疾病称为"阴疮"，其病性早期属热证、 实证，为湿热、毒火阻滞肝脉；后期则伴有肝肾不足。中药外用药可用包括外 用1%氯锌油，紫草油等方法，但治疗效果不十分理想；常用方药为清毒神圣 汤加减、牛黄解毒丸、六味地黄丸加减和龙胆泻肝汤等，但对本病症无显著的 针对性。
因此，应用现代病毒药理学技术、利用现代药物化学之设计、合成、分离、 纯化手段，寻找创新性的先导化合物骨架，开发出新的能够避开核苷类抗病毒 药物的副作用并能有效治疗II型单纯疱疹病毒感染暨防治生殖器疱疹的药物 是十分必要的。
黄酮木脂素化合物属于杂木质素类，是由一分子苯丙素和一分子黄酮结合 而成的一类含有C6-C3-C6-C3-C6结构单元的天然产物。其代表性化合物当属 存在于菊科植物水飞蓟的种子中的木质素二氢黄酮醇水飞蓟宾。水飞蓟已在临 床上广泛应用，在市场上其商品名为Legalon11^ (利肝隆)或Flavobion^。三 十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅FloraK.等人，Am. J. Gastroenterol, 1998， 93， 139-143; Sailer R.等人，Drugs, 2001， 61(14)， 2035-2063)。因此，以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素类化合物引起了越来越 多的关注，如本发明人制备出的一系列水飞蓟宾类衍生物也具有强效的抗氧化 活性(杨雷香，赵昱等，"Synthesis and Antioxidant Properties Evaluation of Novel Silybin Analogue", Jow/7 a/ o/五"2^附e MWc/"a/ C7 e附z's^y, 2006，21(4), 399-404.)。
水飞蓟宾类化合物具有以上所述的多种确切疗效，然而其于抗病毒方面包括抑制单纯疱疹病毒的新用途尚未得到有效开发，故此我们设计并制备出了 23位以乙二酸酯取代的水飞蓟宾类新的酯类衍生物，并测试了其抑制II型单纯疱疹病毒HSV-2复制的药理活性，以期最终获取能够有效抑制该病毒感染之自主知识产权的新药。试验结果发现合成得到的木质素二氢黄酮醇类化合物丙二酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3- 二氢-3,5,7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氢-1,4-苯并二氧六环-2]-甲基乙酯对118￥-2病毒株具有确切的抑制活性，可以作为防治II型单纯性疱疹病毒感染疾病之药物先导化合物继续开发，从而完成本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抑制II型单纯疱疹病毒HSV-2复制、防
治生殖器疱疹病毒感染疾病的活性化合物。具体而言，本发明提供了一种具有
式(1)所示结构的水飞蓟宾23-酯类衍生物及其可药用盐。
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中OEt是指乙氧基(OCH2CH3)
<formula>formula see original document page 6</formula> 式(1)
B环上所联之二氧六环上10， ll位之取
代基互为反式构型，也即C-10和C-l 1位构型同时是R构型或同时是S构型。
本发明的又一个目的是提供了式(i)化合物用于制备防治由n型单纯疱
疹病毒HSV-2引发的生殖器疱疹和/或生殖器炎症药物的用途。
本发明的另一个目的是提供了一种用于防治由II型单纯疱疹病毒HSV-2引发的生殖器疱疹和/或生殖器炎症的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的式(1)化合物或其可药用盐和可药用辅料。根据本发明，该药物组合物中可加入各种药学上可接受的药用赋形剂，添加剂及载体。
本发明的再一个目的是提供一种合成该水飞蓟宾23-酯类衍生物的制备方法，该化合物的制备是通过如下反应式实现<formula>formula see original document page 7</formula>水飞蓟宾
偶氮二甲酸二 酯，三苯基膦
溶剂
HO
乙基丙二酸
OEt
HO
OEt
OCH
OH O
式(1)
其中，偶氮二甲酸二酯选自二甲酯，二乙酯，二丙酯，二异丙酯或二丁酯中的 一种或多种，溶剂选自四氢呋喃，二甲亚砜，二甲基甲酰胺中的一种或多种， 反应温度为室温至回流，水飞蓟宾:乙基丙二酸:偶氮二甲酸二酯:三苯基膦的摩 尔比=1:1~3:1~3:1~3，反应时间0.5~20小时。
本发明的有益之处在于半合成制备了 23位乙基丙二酰基取代的水飞蓟 宾化合物，并通过药理实验证明其在开发防治HSV-2病毒感染药物领域中的 潜力，对于开发抗生殖器疱疹创新型药物提供了新的物质基础，具有潜在的社 会效益和经济效益。本发明再一特点为该化合物来源于天然药物的半合成改 造，原料来源方便易得，制备步骤简便，成本低，污染小，利于节能减排条件 下的大规模开发。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步说明本发明。实施例给出了丙二酸[3-(4-羟基-3-甲 氧基苯基)-6-(2,3-二氢-3,5,7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氢-l,4-苯并二氧 六环-2]-甲基乙酯的制备方法及其相关结构鉴定的数据，其中OEt是指乙氧基 (OCH2CH3)。必须说明，实施例中所述的制备方法是用于对本发明的说明而 不是对本发明的限制。
实施例l:式(1)化合物丙二酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氢-3， 羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氢-l，4-苯并二氧六环-2]-甲基乙酯的制备
7<formula>formula see original document page 8</formula> 式(1)
在干燥的反应瓶中加入1克水飞蓟宾，0.56克乙基丙二酸和1.6克三苯基 膦，用20毫升无水四氢呋喃溶解，加入1克偶氮二甲酸二乙酯，加完后于室 温搅拌10小时，减压蒸馏除去溶剂，加入5毫升氯仿，过滤除去白色固体， 母液经柱层析，得浅黄色粉末0.46克，收率37%。 Rf (氯仿醋酸乙酯乙 酸=50:1:0.25): 0.11;核磁共振氢谱'H NMR (400 MHz,氖代氯仿)&1.28 (三重峰，J = 7.2 Hz， 3H, C//3), 3.41 (单峰，2H, COC/f2CO), 3.76 (单峰，3H， OC//3), 4.08 (多重峰，1H， H-23a), 4.22 (多重峰，2H， H-3， 10), 4.36 (多重峰，1H， H隱23b), 4.90 (双峰,J =7.6 Hz, 1H, H-ll)， 4.98 (双峰,J =10.8 Hz， 1H， H-2)， 5.99 (单峰，1H， H-6), 6.07 (单峰，1H， H-8)， 6.82-8.25 (多重峰，9H,芳香环Ar-H), 11.19 (单峰，1H, 5-OH);电喷雾质谱ESI-MS: 595 (M—1)+。
实施例2:式(1)化合物的制备
在干燥的反应瓶中加入1克水飞蓟宾，0.56克乙基丙二酸和1.8克三苯基 膦，用20毫升无水二甲基甲酰胺溶解，加入1.2克偶氮二甲酸二甲酯，加完 后回流4小时，减压蒸馏除去溶剂，加入5毫升氯仿，过滤除去白色固体，母 液经柱层析，得浅黄色粉末0.42克，收率34%。
其Rf值、核磁共振氢谱及电喷雾质谱数据与实施例1中产物所测得值相同。
本发明的又一特点是，经药理实验证明半合成得到的式(1)化合物对 II型单纯疱疹病毒HSV-2复制有确切的抑制作用，其半数抑制浓度IC5o值为 55.74微克/毫升。说明该化合物有望发展为防治由II型单纯疱疹病毒HSV-2 引发的生殖器疱疹病毒感染之先导化合物及药物。
本发明中制备得到的式(1)化合物或其可药用盐用制药领域中的常规方 法，结合中、西药制药中常规的可药用辅料，可以制成各种药物组合物，如注 射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂型或纳米制剂。这些药物组合物可以用于防治由II型单纯疱疹病毒HSV-2 引发的生殖器疱疹和/或生殖器炎症。
本发明的式(1)化合物或其可药用盐还可以与现已上市的治疗单纯疱疹 病毒HSV-2感染常用药物联合或交叉使用，制备得到具有治疗单纯疱疹病毒 HSV-2感染和生殖器疱疹或炎症的药物组合物或复方制剂。可组合的药剂例子 包括阿昔络韦ACV、人白细胞干扰素等。此外，其还可以与神经痛镇痛药物 以及解热镇痛药物合并用药。上述各类药物组合物或者复方制剂同样可以采用 片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂等剂型，包括采用现已 公认的药剂学常识经由常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。
为了更好地理解本发明的实质，本发明还通过下列药理相关实施例的方式 说明式(1)化合物对单纯疱疹病毒HSV-2抑制作用的药理实验结果。实验结 果说明该化合物在抗单纯疱疹病毒HSV-2的药物研究领域中的用途；本发明 人还测试了其对Vero细胞的半数细胞毒活性数据TD5()，用以说明该化合物的 毒性，从而评价其治疗指数(TI)。同样必须说明，本发明的药理相关实施例 仍是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行 的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例3:微量细胞病变抑制(CPE)法研究式(1)化合物对单纯疱疹病毒 HSV-2的抑制作用 3.1实验目的
以HSV-2病毒感染的Vero细胞为模型，筛选抗HSV药物，其中样品来 自实施例1中制得的式(1)化合物样品。 3.2材料
3.2.1病毒和细胞
3.2丄1病毒HSV-2病毒由浙江大学药学院中药与天然药物研究室提供； 3.2丄2细胞Vero细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。 3.2.2试齐IJ
3.2.2.1 RPMI 1640培养基Gibco公司产品；
3.2.2.2 L-谷胺酰氨AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司 分装；
3.2.2.3 MTT: AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司分装； 3.2.2.4胎牛血清Gibco公司产品；3.2.2.5青霉素钠江西东风药业股份有限公司产品； 3.2.2.6硫酸链霉素华北制药股份有限公司产品；
3.2.2.7阳性对照药阿昔洛韦(ACV)，湖北科益药业股份有限公司，0.25g/ 支。
3.2.3仪器
3.2.3.1 C02培养箱美国Shellab公司产品；
3.2.3.2 XD-2倒置显微镜重庆光电仪器有限公司产品； 3.2.3.3生物安全柜美国LABCONCO公司产品；
3.2.3.4 Synergy HT酶标仪美国BIO-TEK公司产品；
3.2.3.5 LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂产 3.3方法
3.3.1病毒毒力测定在长成单层的细胞中加入10倍连续倍比稀释的病毒液， 从10"到10一等共9个浓度，在37"C， 5%二氧化碳，100%相对湿度条件下培 养48小时，然后用MTT法比色，测定病毒的毒力，以TCID5Q表示。 3.3.2样品毒性测定用培养基将药物连续稀释成4个浓度(100微克/毫升， 10微克/毫升，l微克/毫升)，分别加入细胞已长成单层的96孔培养板中， 每孔200微升，置于37'C, 5%二氧化碳，100%相对湿度的培养箱中培养，培 养72小时后用MTT法测定样品对细胞的毒性，计算半数中毒浓度(TD5())。 3.3.3细胞病变抑制法测定样品对病毒生长抑制作用
细胞接种96孔培养板，37°C， 5%二氧化碳，100%相对湿度培养24小时， 加入2X100 TCID5。的病毒IOO微升，吸附2小时，倾出病毒，分别加入最大 浓度为无毒浓度的不同浓度样品，每浓度3孔，同时设正常细胞对照和病毒感 染对照，37°C， 5%二氧化碳，100%相对湿度培养72小时后在倒置显微镜下 观察细胞病变。以五级标准作为判断细胞病变的标准_:细胞无变化，分值 为8分；+: 25%以下细胞出现病变，分值为6分；+ + : 25。％ 50%细胞出 现病变，分值为4分；+ + + : 50% 75%细胞出现病变，分值为2分；+ + + + : 75%以上细胞出现病变，分值为O分。
3.4实验结果结果如表一显示，丙二酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氢 -3，5,7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基乙酯能显 著抑制HSV-2病毒的复制，其对HSV-2病毒复制的半数抑制浓度和治疗指数如表所示。
表一.式(1)化合物对HSV-2的抑制作用
样品TD50 (微克/毫升)ic50 (微克/毫升)TI (治疗指数)
式(1)化合物 阳性对照药(阿昔洛韦)>400 〉40055.74 0.21>7.2 >1867
注TD5o:样品对细胞生长的半数抑制浓度(微克/毫升)；IC5Q:样品对病毒复 制的半数抑制浓度(微克/毫升)；TI:治疗指数，TI=TD50/IC5()。
3.5结论
上述试验结果说明，式(1)化合物即丙二酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯 基)-6-(2，3-二氢-3，5,7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-l,4-苯并二氧六环 -2]-甲基乙酯对II型单纯疱疹病毒HSV-2有确切的抑制作用，虽然其对HSV-2 的抑制强度低于阳性对照药阿昔洛韦，仍可以预期其进一步完善开发成为治疗 生殖器疱疹疾病的天然药物，或与已上市之治疗HSV-2病毒感染药物联合使 用。
在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例和药理实施例的目的是举 例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等 同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。
权利要求
1. 一种具有式(1)所示结构的23位乙基丙二酰基取代的水飞蓟宾衍生物或其可药用盐；式(1)化合物的名称为丙二酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基乙酯；式(1)其中OEt是指乙氧基；B环上所联之二氧六环上10，11位之取代基互为反式构型，也即C-10和C-11位构型同时是R构型或同时是S构型。
2.权利要求1中所述式(1)化合物的制备方法，其特征为式(1)所示之化 合物是由水飞蓟宾与乙基丙二酸在三苯基膦和偶氮二甲酸二酯存在下反应得 到；其中OEt是指乙氧基。<formula>formula see original document page 2</formula>偶氮二甲酸二 酯，三苯基膦 式(1)
3.根据权利要求2的制备方法，其中偶氮二甲酸二酯选自二甲酯，二乙酯， :丙酯，二异丙酯或二丁酯中的一种或多种；溶剂选自四氢呋喃，二甲亚砜，二甲基甲酰胺中的一种或多种；反应温度为室温至回流；水飞蓟宾:乙基丙二 酸:偶氮二甲酸二酯:三苯基膦的摩尔比=1:1 3:1~3:1~3;反应时间0.5~20小时。
4. 式(1)所示化合物或其可药用盐用于制备治疗由II型单纯疱疹病毒HSV—2 引发的生殖器疱疹和/或生殖器炎症药物的用途。
5. —种用于防治由II型单纯疱疹病毒HSV-2引发的生殖器疱疹和/或生殖器 炎症的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的丙二酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氢-3,5,7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-l,4-苯并二 氧六环-2]-甲基乙酯或其可药用盐和可药用辅料。
全文摘要
本发明涉及一个乙基丙二酰基取代水飞蓟宾及其制备方法和药物用途。具体而言，本发明涉及23位乙基丙二酰基取代的水飞蓟宾酯类衍生物，以及该化合物的制备方法和该化合物在制备抗病毒药物的中的应用。该化合物名称为丙二酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基乙酯；该化合物由化学方法半合成制备而得，经药理实验证明，其对II型单纯疱疹病毒HSV-2有确切的抑制作用。因此该化合物或其可药用盐可以预期用于制备治疗由HSV-2病毒引发的生殖器疱疹和/或生殖器炎症药物的用途。
文档编号C07D407/00GK101475566SQ200910096040
公开日2009年7月8日 申请日期2009年2月2日 优先权日2009年2月2日
发明者皞 姜, 巫秀美, 李校堃, 李海波, 峰 汪, 佳 瞿, 昱 赵, 邹宏斌, 郝小江, 黄可新, 龚景旭 申请人:温州医学院;李校堃