专利名称：一种重组人促红素分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及基因工程重组蛋白纯化领域，尤其涉及一种采用阴离子交换层析技术对重组人促红素进行分离纯化的方法。
背景技术：
促红素(Erythropoietin，ΕΡ0)最早发现于1906年，是一种糖蛋白，属唾液糖蛋 白激素，蛋白质部分由166个氨基酸组成，分子量为34KD。其编码基因是单拷贝基因，定位 于人的7号染色体长臂21区。依据其糖型结构的差异可分为α、β两种，α型含34%的 碳水化合物，β型含26%的碳水化合物，两种类型在生物学特性、抗原性等效果上均相同。 促红素的生理作用是刺激骨髓中血红蛋白或红细胞的形成，主要由肾脏生成并通过循环血 进入骨髓而发挥作用。当人的肾功能发生严重损害时，如在急、慢性肾衰竭或肾切除的情况 下，EPO的产生减少，出现贫血。因此，EPO对绝大多数肾性贫血患者均有很好的疗效。1985年，人EPO基因克隆和表达的成功使重组人促红素的制备成为现实，重组人 促红素(rhEPO)采用反转录PCR技术克隆人EPO-cDNA，将其插入到真核细胞表达载体中，构 建重组表达质粒，并转化到CHO细胞中，筛选出高效稳定表达人EPO的工程细胞株。培养该 工程细胞，收获上清，进行rhEPO蛋白分离纯化。rhEPO具有与天然的人促红素相同的结构 及生理作用，是治疗肾性贫血的首选药物，还可用于外科围手术期的红细胞动员，治疗癌症 及癌症放疗化疗引起的贫血，治疗艾滋病伴发贫血症等，rhEPO是目前为止人类开发最成功 的基因工程药物。随着对rhEPO临床应用的深入研究，发现rhEPO在治疗妇科贫血、孕产妇 贫血、类风湿性关节炎所致的贫血等方面都有较好的效果。目前已有重组人促红素分离纯化方法具有以下缺点操作繁琐，每次处理量不高， 工艺放大难度大，不适合大规模生产，且最终rhEPO纯度仅能达到95%以上，唾液酸含量为 9. Omol/molEPO以上，体内生物学比活性为1. 2X105IU/mg。亟需建立一种适合大规模生产且生产成本低的重组人促红素(rhEPO)分离纯化 方法，以满足大量患者的需求。
发明内容
为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种工艺稳定、容易放大、适合大规 模生产且生产成本低的重组人促红素分离纯化方法。为达到上述目的，本发明的技术方案为一种重组人促红素分离纯化方法，包括以下步骤1)样品进行蓝胶层析；2)所述蓝胶层析产物进行超滤浓缩；3)所述超滤浓缩产物进行离子交换层析I，用pH6. 5 7. 5的10mmol/L Tris-HCl 缓冲液平衡柱床，上样后先用PH6. 5 7. 5，含0. 03 0. 07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱至基线，再用 pH6. 5 7. 5，含 0. 08 0. 15mol/L NaCl 的 10mmol/LTris-HCl缓冲液洗脱；4)所述离子交换层析I产物进行C4反相层析；5)所述C4反向层析产物进行离子交换层析II，用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，上样后先用pH3. 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L甘氨 酸的缓冲液洗脱柱床，洗脱至基线后再用PH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液淋洗 10 15 个柱体积，最后用 pH6. 5 7. 5、含 0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱；6)所述离子交换层析II产物进行S-200分子筛层析，得到重组人促红素蛋白。所述步骤1)中样品为灌流培养细胞收集液；所述步骤1)具体为用 ρΗ6· 5 7. 5、含 0. 1 0. 3mo 1/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱，上样后，先用所述缓冲液平衡 液淋洗至基线，再用ρΗ6· 5 7. 5、含1. 0 1. 4mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液 洗脱，收集rhEPO峰。优选地，步骤1)具体为用 ρΗ7· 0、含 0. 2mol/L NaCl 的 20mmol/LTris-HCl 缓冲 液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱，上样后，先用所述缓冲液平衡液淋洗至基线， 再用 pH7. 0、含 1. 3mol/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱，收集 rhEPO 峰。所述步骤2)具体为用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液进行超滤浓 缩，浓缩至电导率和缓冲液电导率相差100 200μ S/cm。优选地，步骤2)具体为用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液进行超滤浓缩，浓 缩至电导率和缓冲液电导率相差180 μ S/cm。所述步骤3)具体为用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上 样后先用PH6. 5 7. 5、含0. 03 0. 07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱至基 线，再用 ρΗ6· 5 7. 5、含 0. 08 0. 15mol/L NaCl 的 IOmmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱，收集 DEAE I洗脱峰。优选地，步骤3)具体为用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后 先用ρΗ7· 0、含0. 04mol/L NaCl的IOmmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱至基线，再用ρΗ7· 0、含 0. 13mol/L NaCl 的 10mmol/LTris-HCl 缓冲液洗脱，收集 DEAE I 洗脱峰。所述步骤4)具体为用pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的lOmmol/LTris-HCl缓 冲液平衡C4柱，上样后，先用pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的10mmol/L Tris-HCl缓冲 液淋洗至基线，再用PH6. 5 7. 5、含40% 70%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱， 收集洗脱峰。优选地，步骤4)具体为用pH7. 0、含8%乙醇的lOmmol/LTris-HCl缓冲液平衡C4 柱，上样后，先用PH7. 0、含8%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液淋洗至基线，再用pH7. 0、 含50%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱峰。 所述步骤5)具体为用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上 样后先用PH3. 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L甘氨酸的缓冲液洗脱柱床，洗 脱至基线后再用PH6. 5 7. 5的lOmmol/LTris-HCl缓冲液淋洗10 15个柱体积，最后用 ρΗ6· 5 7. 5、含 0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 IOmmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱，收集 DEAE II 洗脱峰。
优选地，步骤5)具体为用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样 后先用PH4. 0、含5mol/L尿素、1. 5mmol/L甘氨酸的缓冲液洗脱柱床，洗脱至 基线后再用 pH7. 0的IOmmol/L Tris-HCl缓冲液淋洗15个柱体积，最后用ρΗ7· O、含0. 3mol/L NaCl的 10mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集DEAE II洗脱峰；所述步骤6)具体为用pH6. 0 8. 0、含50 150mmol/L NaCl的20mmol/L枸橼 酸_枸橼酸钠缓冲液平衡S-200柱，上样并洗脱，同时用0. 22 μ m过滤器过滤并无菌收集， 收集峰即为重组人促红素。优选地，步骤6)具体为用pH7. 0、含120mmol/L NaCl的20mmol/L枸橼酸-枸橼 酸钠缓冲液平衡S-200柱，上样并洗脱，同时用0. 22 μ m过滤器过滤并无菌收集，收集峰即 为重组人促红素。本发明中采用两次阴离子交换层析，第二次阴离子交换层析柱(DEAE-Sepharose Fast Flow层析)的使用，不但可以根据生产需要进行不同程度的放大，解决生产规模问 题，而且在去除乙醇的同时对rhEPO纯度和体内生物学比活性起到进一步提高的作用，该 步层析可以将唾液酸含量低的rhEPO去除，提高产品中唾液酸含量高的rhEPO蛋白的比例。 采用本发明重组人促红素分离纯化方法，纯化得到的rhEPO纯度可达99%以上，唾液酸含 量达9. 5mOl/mOlEP0以上，体内生物学比活性达1.4X105IU/mg以上。本发明在已有工艺 方法基础上进行改进，不但解决了生产规模问题，且提高了 rhEPO产品质量。
图1是本发明重组人促红素分离纯化方法工艺流程图。
具体实施例方式下面结合说明书附图对本发明重组人促红素分离纯化方法做进一步详细说明。材料准备通过细胞培养罐连续灌流培养含人促红素基因的重组工程细胞株获得 含重组人促红素(rhEPO)的无血清培养液。从上述培养液中分离纯化rhEPO的具体步骤1.蓝胶层析(Blue Sepharose 6 Fast Flow 层析)1. 1 平衡用 0. 2mol/L NaCl_20mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)缓冲液平衡 Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱，直至流出液pH为7· 0。1. 2上样以40ml/min流速，将过滤后的细胞收集液上样。1. 3 淋洗用 0. 2mol/L NaCl_20mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)缓冲液以 40ml/min 的
流速淋洗至基线。1. 4 洗脱用 1. 3mol/L NaCl_20mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)缓冲液以 40ml/min 的 流速洗脱并收集EPO峰。2.超滤浓缩将蓝胶洗脱液用lOmmol/L Tris-HCl，pH7. 0缓冲液进行超滤浓缩，直到浓缩液电 导率和缓冲液电导率相差180 μ S/cm左右。3.离子交换层析 I (DEAE-Sepharose Fast Flow 层析)3. 1平衡以50mi/min的流速用lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 0)缓冲液平衡柱床，直至流出液pH为7.0。
3. 2上样以40ml/min的流速将超滤得到的浓缩液上样于DEAE-S印harose Fast Flow层析柱。3. 3 淋洗用 0. 04mol/L NaCl-lOmmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)缓冲液以 40ml/min 的 流速淋洗，直至待检测峰下降至基线。3. 4 洗脱用 0. 13mol/L NaCl-IOmmo 1/LTris-HCl (ρΗ7· 0)缓冲液以 40ml/min 的 流速洗脱，洗脱收集液为DEAE I收集液，收集于血清瓶中。4. C4反相层析4. 1 平衡用 8% 乙醇 /lOmmol/LTris-HCl (pH7. 0)缓冲液平衡 VydacC4 柱，平衡流 速为40ml/min，淋洗5倍柱体积。4. 2上样以40ml/min的流速将DEAE I收集液上样于Vydac C4柱。4. 3淋洗上样完毕后，用8%乙醇/lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 0)缓冲液淋洗至基线。4. 4 洗脱用 50% 乙醇/10mmol/L Tris-HCl (pH7. 0)缓冲液以 40ml/min 的流速洗 脱，从洗脱峰出现时开始收集至洗脱峰结束为止，收集至5L血清瓶中。5. m^^^M^fr II (DEAE-Sepharose Fast Flow 层析)5. 1平衡用lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 0)缓冲液以40ml/min的流速平衡至流出 液PH为7.0。5. 2上样以40ml/min的流速将C4反相层析收集液上样于DEAE-S印harose Fast Flow层析柱。5. 3淋洗先用5mol/L尿素/1. 5mmol/L甘氨酸(pH4. 0)的缓冲液以40ml/min的 流速淋洗至紫外检测值降低至基线，再用lOmmol/LTris-HCl (pH7. 0)缓冲液以40ml/min的 流速淋洗15个柱体积。5. 4 洗脱用含 0. 3mol/L NaCl/10mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)的缓冲液以 40ml/min 的流速洗脱，从洗脱峰紫外检测值上升时开始收集，至降低至基线结束收集，收集DEAE II 洗脱液于500ml盐水瓶中。此收集液唾液酸含量应不小于9. 5mOl/mOlEP0。6. S-200分子筛层析6. 1平衡用20mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠-120mmol/L NaCl (ρΗ7· 0)缓冲液以 12ml/min的流速平衡2倍柱体积。6. 2上样上样流速为12ml/min，上样量应不超过柱体积的1/10。6. 3洗脱用20mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠-120mmol/L NaCl (ρΗ7· 0)缓冲液以 12ml/min的流速洗脱。从洗脱峰开始出现收集至检测峰下降至基线时停止收集。用一次性 过滤器，无菌过滤EPO产品至无菌盐水瓶中，即为最终纯化的重组人促红素(rhEPO)产品原 液。分离纯化后的重组人促红素(rhEPO)产品经SDS-PAGE和HPLC检测分析，纯度达 99.0%以上，体内和体外生物比活性达1.5X105IU/mg以上，唾液酸含量不低于9. 5mol/mol EPO0其它检测项目均符合中国药典现行版规定。本发明重组人促红素(rhEPO)的分离纯化方法具有以下优点1)纯化过程中介质对蛋白的载量大，流速快，操作时间短；不但可大量处理样品，还可根据生产需要进行不同程度的放大，解决生产规模问题。2)纯化过程重复性好，且反复再生利用过程简单。3)纯化过程操作简便，不需特殊的试剂。 4)由该方法获得的rhEPO纯度高，由已有工艺产品纯度的95%以上提高到99.0% 以上，提高4.0%以上。5)由该方法获得的rhEPO活性收率高由已有工艺的10%提高至15%，提高了 50%。6)由该方法获得的rhEPO中唾液酸含量由已有工艺的9.0mOl/mOlEP0左右提高至 9. 5mol/mol EPO以上，提高了 5%以上。7)由该方法获得的rhEPO体内生物学比活性由1. 2 X 105IU/mg提高至Ij 1.4X105IU/mg以上，提高约17%以上。
权利要求
1.一种重组人促红素分离纯化方法，包括以下步骤1)对样品进行蓝胶层析；2)对所述蓝胶层析产物进行超滤浓缩；3)对所述超滤浓缩产物进行离子交换层析I，用pH6.5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl缓 冲液平衡柱床，上样后先用PH6. 5 7. 5、含0. 03 0. 07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱至基线，再用 PH6. 5 7. 5，含 0. 08 0. 15mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱；4)对所述离子交换层析I产物进行C4反相层析；5)对所述C4反向层析产物进行离子交换层析II，用pH6.5 7.5的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用pH3. 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L 甘氨酸的缓冲液洗脱柱床，洗脱至基线后再用PH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液淋 洗 10 15 个柱体积，最后用 pH6. 5 7. 5、含 0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱；6)对所述离子交换层析II产物进行S-200分子筛层析，得到重组人促红素蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中的所述 样品为灌流培养细胞收集液。
3.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤1)具体为 用 ρΗ6· 5 7. 5、含0. 1 0.3mol/L NaCl 的 20mmol/LTris-HCl 缓冲液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱，上样后，先用所述缓冲液平衡液淋洗至基线，再用pH6. 5 7. 5、含 1. 0 1. 4mol/LNaCl 的 20mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱，收集 rhEPO 峰。
4.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤2)具体为 用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液进行超滤浓缩，浓缩至浓缩液电导率和缓冲 液电导率相差100 200 μ S/cm。
5.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤3)具体为，用 ρΗ6· 5 7. 5的IOmmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用ρΗ6. 5 7. 5、含0. 03 0. 07mol/L NaCl 的 10mmol/LTris-HCl 缓冲液洗脱至基线，再用 pH6. 5 7. 5，含 0. 08 0. 15mol/LNaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱，收集 DEAE I 洗脱峰。
6.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤4)具体为 用pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的lOmmol/LTris-HCl缓冲液平衡C4柱，上样后，先用 pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的10mmol/LTris-HCl缓冲液淋洗至基线，再用pH6. 5 7. 5、含40% 70%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
7.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，步骤5)具体为用ρΗ6· 5 7. 5的IOmmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用ρΗ3· 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L甘氨酸的缓冲液洗脱柱床，洗脱至基线后再用pH6. 5 7. 5的10mmol/L Tris-HCl缓冲液淋洗10 15个柱体积，最后用pH6. 5 7. 5、含0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱，收集 DEAE II 洗脱峰。
8.根据权利要求1所述的重组人促红素分离纯化方法，其特征在于，所述步骤6)具体 为用pH6. 0 8. 0、含50 150mmol/L NaCl的20mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液平衡 S-200柱，上样并洗脱，同时用0. 22 μ m过滤器过滤并无菌收集，收集峰即为重组人促红素。
全文摘要
本发明涉及基因工程重组蛋白纯化领域，尤其涉及一种采用阴离子交换层析技术对重组人促红素进行分离纯化的方法，包括以下步骤1)样品进行蓝胶层析；2)蓝胶层析产物进行超滤浓缩；3)超滤浓缩产物进行离子交换层析I；4)离子交换层析I产物进行C4反相层析；5)C4反向层析产物进行离子交换层析II；6)离子交换层析II产物进行S-200分子筛层析，得到重组人促红素蛋白。采用本发明所述方法，纯化得到的rhEPO纯度可达99％以上，唾液酸含量达9.5mol/molEPO以上，体内生物学比活性达1.4×105IU/mg以上。本发明在已有工艺方法基础上进行改进，不但解决了生产规模问题，且提高了rhEPO产品质量。
文档编号C07K1/16GK102040659SQ20091011059
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月19日 优先权日2009年10月19日
发明者于玉根, 张翼翔, 陈红霞 申请人:深圳新鹏生物工程有限公司