专利名称：去除多杀菌素发酵液中色素的方法
技术领域：
本发明属于生物农药生产技术领域，具体涉及一种去除多杀菌素发酵液 中色素的方法。
背景技术：
多杀菌素(Spinosad)是1982年美国礼莱公司科研人员从维尔京群岛土 壤中分离的刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵液中提取得到的一 种新颖的大环内酯类超高效生物源杀虫剂。该类化合物不仅有很高的生物 活性，而且对非靶标生物的毒性很低，对人和其他哺乳动物非常安全。在 天然多杀菌素分离提取物中，两个最高活性组份A和D的混和物被称为 spinosad，中文通用名为多杀菌素，它是商业化产品的主要成分。多杀菌 素主要应用于对棉铃虫、烟青虫、小菜蛾、果蝇、甜菜夜蛾、蓟马等的防 治，适用于棉花、茶、蔬菜和苹果、梨、桃等落叶果树。到1999年多杀 菌素已经在24个国家、100多种作物上进行了注册登记。多杀菌素具有高 杀虫活性的同时，对捕食性昆虫还表现出较低毒性，对鳞翅目害虫而言， 多杀菌素是已发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一。多杀菌素的另一 个优点是对哺乳动物和鸟类相对低毒，对水生动物也只是轻微的中等毒 性，此外，哺乳动物的慢性毒性试验表明，多杀菌素无致癌、致畸、致突 变性或神经毒性。目前，多杀菌素商业化的品种有用于棉花的Tmcer，用 于蔬菜类的菜喜(Success)，以及Conerve和SpinTor。我国目前使用的有用 于蔬菜的菜喜。在美国，多杀菌素产品标签上标明可应用于100多种作物， 同时它还在其他24个国家进行了注册登记，并在全世界范围内为广大种 植者所接受。
对于多杀菌素的分离纯化工艺，国内外的研究并不多，其主要方法是 利用溶媒萃取法，此法虽然也能取得一定的效果，但有机溶媒使用量大， 环境污染严重，利用树脂吸附法则能克服这一缺点，但目前树脂吸附的工
3艺并不成熟，尤其是发酵液必须经过一定的预处理后树脂才能发挥其作 用。
发表于2005年5月的华中农业大学的硕士学位论文"多杀菌素分离 纯化工艺的研究"披露了一种多杀菌素的树脂吸附法提取多杀菌素的工 艺，文献中先对发酵液进行预处理，然后采用XAD-4大孔吸附树脂对多 杀菌素进行粗提。此树脂在PH5-11对多杀菌素进行吸附时均有泄露，不 能达到完全吸附的效果，并且对吸附速率也有较高的要求，不利于工艺的 放大生产。
多杀菌素的发酵液由于杂质较多，滤液混浊，目前现有技术中还没有 一种简单的方法能够将发酵液的色素有效去除，并将多杀菌素的纯度提到 较高的水平。
发明内容
为解决该技术问题，本发明通过动态实验，筛选了各种吸附剂，选取 了一种效果较好的吸附剂，并对吸附条件进行了探索，使得能够基本除去 多杀菌素发酵液中的色素，且减少了很多杂质，使多杀菌素的纯度得到提 高，减轻了后面的树脂分离的压力，整个工艺简单，操作十分方便。
因此，本发明提供一种去除多杀菌素发酵液中色素的方法，该方法包 括将预处理后的多杀菌素发酵液上氧化铝柱吸附并用溶剂系统洗脱的步 骤。
所述预处理后的多杀菌素发酵液按照下列步骤得到取多杀菌素发酵 液，离心得菌丝体，用丙酮浸泡过夜，再次离心，所得上清液即为预处理 后的发酵液。
具体处理方法取多杀菌素发酵液3L， 4000r/min， 30min离心得菌丝 体，用3L的丙酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预
处理后的多杀菌素发酵液。
本发明所述氧化铝柱选自酸性氧化铝柱、中性氧化铝柱或碱性氧化铝 柱，考虑到多杀菌素在碱性氧化铝和中性氧化铝中的稳定性问题，优选酸 性氧化铝柱。
本发明所述溶剂系统可以选自丙酮、甲醇或乙醇等，但比较下来，丙酮能够更好的溶解多杀菌素，且所含的杂质最少。因此所述溶剂系统优选
为丙酮水溶液，且优选丙酮浓度为80%-100%的丙酮水溶液。
本发明方法中，多杀菌素的发酵液pH—般比较稳定，基本上在2 11， 优选3 10之间。
本发明方法中，所述处理后的多杀菌素发酵液可以配成丙酮水溶液后 上柱，也可以直接上柱。但由于多杀菌素在水溶液中的溶解性不好，含水 量超过一定比例后多杀菌素会沉淀析出，不利于过氧化铝柱，所以丙酮水 溶液的含水比例不能超过30%。同样，洗脱用的丙酮水溶液中的含水量也 不能超过30%。
本发明去除多杀菌素发酵液中色素的方法的具体步骤如下
取预处理后的多杀菌素发酵液500ml，将pH调为3 10，选用一根高 为20cm，直径3cm的玻璃层析柱，均匀填入氧化铝约10cm，往预处理后 的多杀菌素发酵液加入一定量的去离子水，配成丙酮水溶液后上柱，或将 预处理后的多杀菌素发酵液直接上柱，控制其流速为15ml/min，将500ml 浸取液过完柱后，继续用一定浓度的丙酮500ml将柱上的多杀菌素洗下来， 收集所有的洗脱液。
结果发现洗脱液已经变得澄清，几乎没有颜色，除去了绝大部分的色 素，且纯度大大提高，除去了很多极性的杂质，收率为77%以上。
多杀菌素是刺糖多孢菌在培养介质中经有氧发酵而得的次级代谢产 物，其生产菌种单一，但由于发酵培养基的配方不同，其最终发酵液的成 分也会不同，本实验室通过对比不同培养基配方的发酵液，发现其中的色 素成分比较固定，因此都可以用本发明方法除去。
本发明通过实验得到吸附力强，吸附速度快的氧化铝柱，并通过洗脱 条件的摸索，使得其用于去除多杀菌素发酵液中色素时优点突出。此方法 比文献报道的方法有以下优点
1. 色素去除较为彻底，与文献中报道的方法相比，可省去脱色步骤。
2. 所得产物纯度可达66%以上。
3. 可节省有机溶剂，且在泄露率相同的条件下，洗脱体积较小，从而 提高了回收率。
图1为本发明实施例1的处理后的多杀菌素发酵液过氧化铝柱前的 HPLC图谱；
图2为本发明实施例2的处理后的多杀菌素发酵液过氧化铝柱后的 HPLC图谱；
其中多杀菌素A和D的保留时间都在5 6分钟。
具体实施例方式
本发明多杀菌素发酵条件如下
菌种NRRL18395
斜面培养
培养基全脂奶粉2.0%、葡萄糖0.5%、进口酵母粉0.3%、硫酸镁 0.2%、自来水
条件28°C， 6天
种子培养
培养基葡萄糖3.0%、可溶性淀粉1.0%、棉籽粉2.0%、鱼粉1.0%、 热黄豆粉0.2%、玉米浆0.2。/。、碳酸l丐0.5%、自来水
条件25°C， 3天，摇床转速250rpm 发酵培养
培养基葡萄糖8.0%、葵花油2.0%、棉籽粉3.0%、鱼粉1.0%、赖 氨酸0.2%、 KH2PO4 0.1%、柠檬酸三钠0.1%、自来水
12rC灭菌20min，接种量10%，摇瓶装量100ml/750ml，置于25T恒温 室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵9天后，得到多杀菌素发酵液。
实施例1
培养基配方碳源-葡萄糖氮源-棉籽粉
取多杀菌素发酵液3L， 4000r/min， 30min离心得菌丝体，用3L的丙 酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理后的多杀 菌素发酵液。
取预处理后的多杀菌素发酵液500ml，单位为823ug/ml， pH为6.0，选用一根高为20cm，直径3cm的玻璃层析柱，均匀填入酸性氧化铝约 10cm，将丙酮浸取液加入一定量的去离子水，配成9: 1的丙酮水溶液后 上柱，控制其流速为15ml/min，将500ml浸取液过完柱后，继续用9: 1 的丙酮水500ml将柱上的多杀菌素洗下来，收集所有的洗脱液。
结果发现洗脱液己经变得澄清，几乎没有颜色，除去了绝大部分的色 素，且纯度由19.8%提高到68%，除去了很多极性的杂质，收率为95%。
实施例2
培养基配方碳源-葡萄糖氮源-棉籽粉
取多杀菌素发酵液3L， 4000r/min， 30min离心得菌丝体，用3L的丙 酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理后的多杀 菌素发酵液。
取预处理后的多杀菌素发酵液500ml，单位为823ug/ml， pH为6.4， 选用一根高为20cm，直径3cm的玻璃层析柱，均匀填入酸性氧化铝约 10cm，将丙酮浸取液直接上柱，流速控制为15ml/min，过柱后继续用丙酮 将柱上的多杀菌素洗下来，收集所有的洗脱液。
结果发现洗脱液已经变得澄清，几乎没有颜色，除去了绝大部分的色 素，纯度由19.4%提高到66%，收率为89%。
实施例3
培养基配方碳源-葡萄糖氮源-棉籽粉
取多杀菌素发酵液3L， 4000r/min， 30min离心得菌丝体，用3L的丙 酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理后的多杀 菌素发酵液。
取预处理后的多杀菌素发酵液500ml，单位为823ug/ml， pH为6.5， 选用一根高为20cm，直径3cm的玻璃层析柱，均匀填入酸性氧化铝约 10cm，配成4: 1的丙酮水溶液后上柱，控制其流速为15ml/min，将500ml 浸取液过完柱后，继续用4: 1的丙酮水500ml将柱上的多杀菌素洗下来，
收集所有的洗脱液。
结果发现洗脱液己经变得澄清，几乎没有颜色，除去了绝大部分的色素，纯度由19.4%提高到68%，但收率为降为77%。 实施例4
培养基配方碳源-葡萄糖，淀粉氮源-花生柏粉
取多杀菌素发酵液3L， 4000r/min， 30min离心得菌丝体，用3L的丙 酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理后的多杀 菌素发酵液。
取预处理后的多杀菌素发酵液500ml，单位为756ug/ml， pH为6.6， 选用一根高为20cm，直径3cm的玻璃层析柱，均匀填入中性氧化铝约 10cm，将丙酮浸取液直接上柱，流速控制为15ml/min,过柱后继续用丙酮 将柱上的多杀菌素洗下来，收集所有的洗脱液。
结果发现洗脱液变得澄清，颜色很淡，除去了绝大部分的色素，纯度 由18.9%提高到65.4%，收率为87。％。
实施例5
培养基配方碳源-葡萄糖，淀粉氮源-花生柏粉
取多杀菌素发酵液3L， 4000r/min， 30min离心得菌丝体，用3L的丙 酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理后的多杀 菌素发酵液。
取预处理后的多杀菌素发酵液500ml，单位为756ug/ml,pH为6.6，选 用一根高为20cm，直径3cm的玻璃层析柱，均匀填入碱性氧化铝约10cm， 将丙酮浸取液直接上柱，流速控制为15ml/min，过柱后继续用丙酮将柱上 的多杀菌素洗下来，收集所有的洗脱液。
结果发现洗脱液变得澄清，颜色不深，除去了大部分的色素，纯度由 18.9。％提高到60.2%，收率为84Q/^。
实施例6
培养基配方碳源-葡萄糖，糊精氮源-玉米浆，棉籽粉
取多杀菌素发酵液3L， 4000r/min， 30min离心得菌丝体，用3L的丙 酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理后的多杀菌素发酵液。
取预处理后的多杀菌素发酵液500ml，单位为655ug/ml， pH为4.9， 选用一根高为20cm，直径3cm的玻璃层析柱，均匀填入酸性氧化铝约 10cm，将丙酮浸取液直接上柱，流速控制为15ml/min，过柱后继续用丙酮 将柱上的多杀菌素洗下来，收集所有的洗脱液。
结果发现洗脱液变得澄清，几乎没有颜色，除去了大部分的色素，纯 度由18.9%提高到67.2%，收率为88%。
实施例7
培养基配方碳源-葡萄糖，糊精氮源-玉米浆，棉籽粉 取多杀菌素发酵液3L， 4000r/min， 30min离心得菌丝体，用3L的丙
酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理后的多杀
菌素发酵液。
取预处理后的多杀菌素发酵液500ml，单位为655ug/ml， pH为9.5， 选用一根高为20cm，直径3cm的玻璃层析柱，均匀填入酸性氧化铝约 10cm，将丙酮浸取液直接上柱，流速控制为15ml/min，过柱后继续用丙酮 将柱上的多杀菌素洗下来，收集所有的洗脱液。
结果发现洗脱液变得澄清，几乎没有颜色，除去了大部分的色素，纯 度由18.9%提高到66.9%,收率为84%。
对比例l:考察不同吸附剂对色素去除的比较 考察用活性炭、氧化铝、大孔吸附树脂对色素去除的比较。
培养基配方碳源-葡萄糖氮源-全脂奶粉
取多杀菌素发酵液3L， 4000r/min， 30min离心得菌丝体，用3L的丙 酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理后的多杀 菌素发酵液。
取预处理后的多杀菌素发酵液500ml，单位为742ug/ml， pH为6.1， 选用一根高为20cm，直径3cm的玻璃层析柱，分别均匀填入氧化铝、活 性炭、大孔吸附树脂XAD-2约10cm，将丙酮浸取液加入一定量的去离子 水，配成9: 1的丙酮水溶液后分别上柱，三种吸附剂都控制其流速为
915ml/min，将500ml浸取液过完柱后，继续用9: 1的丙酮水500ml将柱 上的多杀菌素洗下来，收集所有的洗脱液。
结果发现活性炭作为吸附剂时，多杀菌素大部分被吸附在活性炭上洗 不下来，损失很大。
XAD-2作为吸附剂时，很多色素都随着多杀菌素一起洗下来，除色素 效果不好。
只有氧化铝作为吸附剂时，洗脱液中几乎没有色素，颜色澄清。 对比例2:考察用絮凝剂除色素的效果
按照华中农大硕士学位论文"多杀菌素分离纯化工艺的研究"的方法， 采用絮凝剂处理多杀菌素发酵液，结果表明该方法只能沉淀发酵液中的蛋 白等大分子物质，对于色素去除的效果不佳，絮凝后发酵液的透光度仍然 不高，除色素效果远不如氧化铝。
附吸附剂规格 100 200目酸性氧化铝 技术条件
性状白色无定形粉末 主要性能指标-
技术条件符合Q/CYDZ 1791-2005
颗粒度>75.0%
千燥失重《1.0%
水溶解物《0.5%
灼烧失重《8.0%
pH3.8 4.8
生产厂家国药集团化学试剂有限公司 XAD-2大孔吸附树脂
基质 苯乙烯 直径20-60目密度1.08 g/ml
生产厂家美国罗门哈斯公司 。
权利要求
1.去除多杀菌素发酵液中色素的方法，该方法包括将预处理后的多杀菌素发酵液上氧化铝柱吸附并用溶剂系统洗脱的步骤。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理后的多杀菌 素发酵液按照下列步骤得到取多杀菌素发酵液，离心得菌丝体，用丙酮 浸泡过夜，再次离心，所得上清液即为预处理后的发酵液。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化铝柱选自酸性 氧化铝柱、中性氧化铝柱或碱性氧化铝柱。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氧化铝柱为酸性氧 化铝柱。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂系统为丙酮水 溶液。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述丙酮水溶液中丙酮 的浓度为80%-100%。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理后的多杀菌 素发酵液配成丙酮水溶液后上柱或直接上柱。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理后的多杀菌 素发酵液的pH值为2 11。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述预处理后的多杀菌 素发酵液的pH值为3 10。
全文摘要
本发明公开一种去除多杀菌素发酵液中色素的方法，该方法包括将预处理后的多杀菌素发酵液上氧化铝柱吸附并洗脱的步骤。由该方法得到的多杀菌素洗脱液中的色素基本除去，纯度和收率均得到提高。整个工艺简单，操作方便。
文档编号C07H17/08GK101659685SQ20091013311
公开日2010年3月3日 申请日期2009年4月1日 优先权日2008年8月27日
发明者亮 卢, 李继安, 韩丽敏 申请人:上海医药工业研究院