具有动物型糖链加成功能的植物细胞的制作方法

专利名称：具有动物型糖链加成功能的植物细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞。这种植物细胞含有一个编码动物来源的酶的导入基因，这种酶可以将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白中糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。 优选的，这种来源于动物的酶是a 1，6-岩藻糖基转移酶。
—方面，本发明涉及一种从该植物细胞再生的植物。 另一方面，本发明涉及一种生产具有动物型糖链加成功能的植物细胞的方法。该方法包括在植物细胞中导入一种来源于动物的编码酶的基因的步骤，其中这种酶可以将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白糖链中的还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。 在另一方面，本发明涉及一种生产具动物型糖链的糖蛋白的方法。该方法包括以下步骤通过在植物细胞中导入一种编码来源于动物的酶的基因，以及一种编码外源性糖蛋白的基因来转化植物细胞，其中的酶可将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白的还原末端的乙酰氨基葡糖残基上，并且培养获得的转化的植物细胞。 本发明也涉及用上述方法所生产的一种糖蛋白。这种糖蛋白具有一个动物型糖链。


图1显示用于生产本发明中植物细胞的载体pBI221-FT的构建图。pBI221-FT载
体特有的Sacl位点被更换为Sail位点。在该位点中插入一个a 1，6-FT基因。 图2显示用于生产本发明中植物细胞的载体pGPTV-HPT-FT的构建图。 图3是一张电泳后显色的胶的照片，染色体DNA是从转化株BY2-FT 2_13制备并
通过PCR进行扩增的。 图4A、 B是一张电泳后显色的胶的照片，染色体DNA是从转化株BY2-FT 2， 3， 4和
6制备的RNA中通过RT-PCR扩增所获得的。 图5是显示高效液相色谱(HPLC)分析一个结果的图。 图6是显示高效液相色谱(HPLC)分析一个结果的图。 图7是显示高效液相色谱(HPLC)分析一个结果的图。 图8是电泳胶印迹PVDF膜显色后的照片，显示本发明中应用植物凝血素的植物细胞产生的糖蛋白的分析结果。 图9是显示一种植物和一种动物的复合型糖链结构的示意图。在复合型糖链结构的核心部分，植物型糖链包含一个木糖残基，而动物型糖链也包含一个木糖残基。另外，一个岩藻糖残基以a 1，6方式与动物型糖链最内部的N-乙酰氨基葡糖残基连接，一个岩藻糖残基以a 1，3方式与植物型糖链最内部的N-乙酰氨基葡糖残基连接。 图IO是一个显示用于测量a 1，6-FT以及一种活性测量体系中底物糖链结构的示意图。 图11是转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白HPLC分析的色谱图。 图12显示从转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白的一种糖链结构(高甘露
糖型糖链)的分析结果图。 图13显示从转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白的一种糖链结构(复合型糖链)的分析结果图。 图14显示从转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白的一种糖链结构(a 1，6-岩藻糖连接糖链)的分析结果图。 图15是一张电泳后显色的胶的照片，染色体DNA是通过PCR扩增从转化的植物FT(l) 、FT(2) 、FT1、FT2和FG3中制备的。 图16是电泳胶印迹PVDF膜显色后的照片，显示本发明中应用植物凝血素的植物细胞产生的糖蛋白的分析结果。
具体实施例方式
以下将详细描述本发明。 本行业中已知的分离和分析蛋白质的方法，以及免疫分析法，除特别提到的以外，可用于本发明中。这些技术可通过市场提供的试剂盒、抗体、标记物以及其它实施。本发明中所使用的技术将在以下的材料与方法部分中进行描述。 根据本发明的方法是针对一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞，这里所用的术语"动物型糖链"是指这样一种糖链，即其中岩藻糖残基与糖蛋白的核心糖链中的还原末端部分存在的N-乙酰氨基葡糖残基以al，6方式连接。优选的，岩藻糖残基是与存在于核心糖链的最核心部分的N-乙酰氨基葡糖残基连接的，而这种核心糖链是与蛋白质的天冬酰胺残基连接的。 植物细胞可以是任何植物细胞。植物细胞可以是培养的细胞、培养的组织、培养的
器官或一种植物。优选的，植物细胞应是培养的细胞、培养的组织、或培养的器官，最优选的
是培养的细胞。应用于本发明生产方法中的植物类型可以是可用于基因导入的任何类型的
植物。可用于本发明中生产方法的植物类型的例子包括，茄科、poaeae、芸苔科、蔷薇科、豆
科、瓜科(curcurbitaceae)、唇形科、百合科、藜科、伞形科家族的植物。 茄科家族植物的例子包括烟草属、茄属、曼陀罗属、番茄属、牵牛花属的植物。特别
的例子包括烟草、茄子、土豆、西红柿、红辣椒和牵牛花。 POAEAE家族植物的例子包括稻属、大麦属、黑麦属、甘蔗属、稻田稗属和玉蜀黍属。特别的例子包括大麦、黑麦、稗、高粱和玉米。 芸苔科家族植物的例子包括萝卜属、芸苔属、ARABIDOPSIS、WASABIA和荠属。特别的例子包括日本白萝卜、油菜籽、拟南芥、日本辣根和荠菜。 蔷薇科家族植物的例子包括oru皿s、苹果属(malus)、梨属(py皿s)、草莓属和玫瑰属。特别的例子包括李子、桃、苹果、梨、荷兰草莓和玫瑰。 豆科家族植物的例子包括大豆属、豇豆属、菜豆属、碗豆、蚕豆属、花生属、红花草属、紫花苜蓿和苜蓿属。特别的例子包括大豆、小豆、菜豆、豌豆、蚕豆、花生、苜蓿和紫花苜蓿。
8
瓜科家族植物的例子包括丝瓜，黄瓜属和香瓜属。特别的例子包括南瓜、倭瓜、黄瓜和甜瓜。 唇形科家族植物的例子包括薰衣草属、薄荷属和紫苏属。特别的例子包括熏衣草，薄荷和白苏植物。 百合科家族植物的例子包括葱属、百合属、郁金香属。特别的例子包括洋葱、大蒜、百合和郁金香。 藜科家族植物的例子包括菠菜属，特别的例子是菠菜。 伞形科家族植物的例子包括当归属、胡萝卜属、鸭儿芹属和芹属。特别的例子包括日本土当归、胡萝卜、北柴胡和芹菜。 优选的，本发明的生产方法中所使用的植物应该是烟草、西红柿、土豆、稻、玉米、萝卜、大豆、豌豆、紫花苜蓿或菠菜。更优选的，本发明的生产方法中所使用的植物应该是烟草、西红柿、土豆、玉米或大豆。"能将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基的酶"是指植物细胞中糖蛋白的蛋白质部分合成以后，在糖链添加过程中可以将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基的酶。这种酶的例子之一是al，6-岩藻糖基转移酶。这个酶可使岩藻糖以
a 1，6的方式连接到糖蛋白离肽链最近处的N-端连接的糖链的N-乙酰氨基葡糖残基上，GDP-岩藻糖用作糖的供体。该酶可从任何动物细胞中获得，优选的是哺乳动物，更优选的是人。 优选的，这个酶定位于细胞的细胞器中。发明人相信，该酶存在于细胞的细胞器中(例如内质网和高尔基体)，并导致岩藻糖以a 1，6的方式连接到植物细胞外源蛋白质的还原末端部分所存在的N-乙酰氨基葡糖残基上。尽管发明人并不拘泥于一种特定的理论。
"能将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基的酶的基因"可以是利用编码该酶的核苷酸序列从任何动物细胞中分离到的基因，或是一种市售商品。这类酶可经修饰后适应于在植物中表达。对这种分离和修饰，有本行业熟练人员已知的方法。
例如对于哺乳动物，己从人和猪中克隆到a 1，6-岩藻糖基转移酶的cDNA(JBiochem(Tokyo) 1997三月；121 (3) :626-32 YanagidaniS， Uozx咖i N， Ihara Y， MiyoshiE，Yamaguchi N，Taniguchi N Japanese Laid—Open Publication No. 10—84975，JapaneseLaid-OpenPublication No. 10-4959 ;J Biol Chem 1996十 一 月1 ;271(44) :27810-7Uozumi N， Yanagidani S， Miyoshi E， Ihara Y， Sakuma T， Gao CX， Teshima T， FujiiS， Shiba T， Taniguchi N Japanese Laid—Open Publication No. 10—4969， JapaneseLaid-OpenPublication No. 9-201191)。已显示了 cDNA的结构。 这里所用的术语"基因"是指结构基因部分。可将操纵序列如启动子、操纵子和终止子连接到这段基因上，以便在植物中正确表达该基因。 术语"外源性糖蛋白"是指在植物中以基因工程方法表达所得到的糖蛋白。这类外源性糖蛋白的例子包括酶、激素、细胞因子、抗体、疫苗、受体和血清蛋白。酶的例子包括辣根过氧化物酶、激酶、葡糖脑苷脂酶、a-半乳糖苷酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(TPa)和HMG-CoA还原酶。激素和细胞因子的例子包括内啡肽、a-干扰素、GM-CSF、G-CSF、绒毛膜剌激激素、白介素-2、 P-干扰素、Y-干扰素、红细胞生成素、血管内皮细胞生长因子、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体(生成)激素(LH)、甲状腺剌激激素(TSH)、催乳素和
9卵巢剌激激素。抗体的例子包括免疫球蛋白G(IgG)和单链抗体可变区基因片段(ScFv)。疫苗的例子包括乙型肝炎表面抗原、轮状病毒抗原、大肠杆菌肠毒素、疟疾抗原、狂犬病毒G蛋白和艾滋病毒糖蛋白(如gpl20)。受体和基质蛋白的例子包括EGF受体、纤维结合素、a l-抗胰蛋白酶和凝集因子III。血清蛋白质的例子包括白蛋白、补体蛋白、纤溶酶原、类皮质酮结合球蛋白、甲状腺素_结合球蛋白和蛋白质C。 术语"外源性糖蛋白基因"是指从任何动物细胞中分离的基因，可应用核苷酸序列
编码该基因，或市场提供的基因。这类基因可通过修饰以适应在植物细胞中表达。 能将岩藻糖残基转移到还原末端的N-乙酰氨基葡糖残基的酶的基因，以及外源
性糖蛋白的基因均可通过本行业中已知的方法导入到植物细胞中。这些基因可分别或同时
导入到植物细胞。将基因导入到植物细胞的方法的例子包括土壤杆菌属法、电穿孔法和粒
子轰击法。 转移植物细胞的合适的方法包括显微注射(Crossway等人，BioTechniques 4:320-334(1986))、电穿孔(Riggs等人，Proc NatlAcad Sci USA 83:5602-5606(1986))、土壤杆菌属介导的转化(Hinchee等人，Biotechnology 6 :915-921(1988);也见Ishida等人，Nature Biotechnology14 :745-750 (六月1996)的玉米转化)、直接基因转移(Paszkowski等人，EMB0 J 3:2717-2722(1984) ;Hayashimoto等人，Plant Physiol93 :857-863(1990)(水稻))，以及利用以下公司出售的仪器进行弹道粒子加速法Agracetus公司，Madison, Wis以及Dupont公司，Wilmington, Del (见，例如，Sanford等人，美国专利号4945050 ;以及McCabe等人，Biotechnology6 :923-926 (1998))，也见于Weissinger等人，Annual Rev Genet22 :421-477(1988) ;Sanford等人，ParticulateScience andTechnology 5:27-37 91987 (洋葱)；Svab等人，Proc Natl Acad SciUSA87 :8526-8530(1990)(烟草叶绿粒);Christou等人，PlantPhysiol 87 :671-674(1988)(大豆);McCabe等人，Bio/Technology6. 923-926(1988)(大豆);Klein等人，Proc NatlSci USA85 :4305-4309(1988)(玉米);Klein等人，Bio/Technology 6.559-563(1988)(玉米);Klein等人，Plant Physiol 91 :440-444(1988)(玉米);Fromm等人，Bio/Technology 8:833-839(1990);和Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2 :603-618 (1990)(玉米);Koziel等人，Biotechnologyll :194-200(1993)(玉米);Shimamoto等人，Nature338 :274-277(1989)(水稻);Christou等人，Biotechnology 9 :957-962(1991)(水稻);Datta等人，Bio/Technology 3 :736-740 (1980)(水稻);欧洲专利申请EP 033258"果园草和其它P00IDEAE) ;Vasil等人，Biotechnology 11 :1553-1558(1993)(小麦)；Weeks等人，PlantPhysiol 102 :1077-1084(1983)(小麦);Wan等人，Plant Physio1104 :37-48(1984)(大麦);Jahne等人，Theor A卯l Genet 89 :525-533(1994)(大麦);Umbeck等人，Bio/Technology 5 :263-266 (1987)(棉花);Casas等人，Proc Natl Sci USA 90:11212-11216(1983年12月)(高粱);Somers等人，Bio/Technology 10 :1589-1594(1982年12月)(橡胶)；Torbert等人，Plant Cell R印orts 14 :635-640 (1995)(橡胶)；Weeks等人，Plant Physiol 102 :1077-1084(1983)(小麦)；Chang等人，W0 94/13822 (小麦)和Nehra等人，The Plant Journal 5 :285-297 (1994)(小麦)。 一套特别优选的通过显微注射轰击将重组DNA分子导入玉米的实施方案可见于Koziel等人，Tiotechnology 11 :194-200(1993)， Hill等人，Euphytica 85 :119-123(1995)和Koziel等人，纽约科学院年
10鉴792 :164-171 (1996)。另一种优选的实施方案是在欧洲专利0292435中披露的玉米的原生质体转化法。植物转化可以用单一种类的DNA或多种类DNA进行(例如联合转移)，这些技术均适用于过氧化物酶编码的序列。 导入植物细胞中基因的表达可用本行业中任何已知的方法观察。这类方法的例子包括银染或加强法、免疫印迹法、RNA印迹杂交和酶活性检测法。表达导入基因的细胞即转化细胞。 可以表达能将岩藻糖残基转移到还原末端的N-乙酰氨基葡糖残基的酶以及外源性的糖蛋白的转化细胞表达具有动物型糖链的外源性糖蛋白。也就是说，转化的细胞具有动物型糖链加成功能。通过培养这类转化细胞，可大量生产具有动物型糖链的糖蛋白。动物型糖蛋白包含核心糖链和外部糖链。核心糖链由一个甘露糖和一个或一个以上的乙酰氨基葡糖所组成。这类糖蛋白的外部糖链包含非还原末端糖链部分。外源糖链可具有一个直链结构或一个支链结构。优选的，外部糖链可具有一个支链结构。支链糖链部分有一、二、三或四级结构。用这类转化细胞生产的糖蛋白优选的包含以a 1，6-方式连接到离糖蛋白肽链最近的N端糖链的N-乙酰氨基葡糖上的任何岩藻糖残基。 这些转化的植物细胞可以是培养的细胞或分化成特异组织或器官的形式。替代
地，这些细胞也可以再生为植物。在这种情况下，转化的植物细胞可以分布于整个植物中或
存在于植物特定的部位，例如种子、果实、果核、叶子、根、干或植物的花。 对于培养来讲，转化的植物细胞的分化和再生均使用本行业已知的方法和培养
基。培养基的例子包括MURASHIGE-SKOOG(MS)培养基、GAMB0RG B5 (B)培养基、WHITE培养
基和NITSCH&NITSCH(NITSCH)培养基，然而，本发明并不仅限于此。这类培养基一般在添加
合适量的植物生长调节物(例如植物激素)及同类物以后使用。 这些体系在不同植物株的应用取决于该植物株从原生质体再生的能力。已有描述谷类由原生质体再生的示范性方法(Fujimura等人，Plant Tissue Culture Letters, 2:74， 1985 ;Toriyama等人，TheorAppl Genet， 73 :16， 1986 ;Yamada等人，Plant Cell R印，4:85， 1986 ;Abdullah等人，Biotechnology,4 :1087， 1986)。 对于不能由原生质体成功转化的植物株，可利用其它将DNA导入完整细胞或组织的方法。例如，谷类可按描述的方法由不成熟的胚胎或外植体有效再生(Vasil，Biotechnology,6 :397，1988)。 土壤杆菌介导的转化也是在植物细胞中导入基因所广泛应用的体系，这是由于DNA可导入到整个植物组织中，从而越过了从原生质体到完整植物的再生的需要。应用土壤杆菌介导的植物整个载体向植物细胞中导入DNA是本行业中熟知的方法。例如，本方法在以上已进行了描述。 由转化植物细胞生产的具动物型糖链的糖蛋白可从植物细胞中分离或萃取。分离糖蛋白的方法可以是本行业已知的任何方法。本发明中的糖蛋白可应用于食品中，而糖蛋白仍存留于转化的细胞中。本发明中植物细胞生产的糖蛋白由于添加了动物型糖链，可以在动物、特别是人身上注射而没有抗原性。
(实施例) 实施例中使用的材料、试剂以及操作步骤将在以下的材料与方法部分进行描述。
(实施例1 :在培养的烟草细胞中导入a 1 ， 6_岩藻糖基转移酶基因(此后指a 1，6-FT)) 应用可以感染植物细胞的土壤杆菌在培养的烟草细胞中导入a 1，6-岩藻糖基转移酶基因。土壤杆菌农杆根瘤菌经常用于转化双子叶植物。最近的研究显示，Ti质粒上的vir区编码的一组基因参与了肿瘤的形成。当感染植物时，土壤杆菌接受由双子叶植物分泌的作为感染信号的酚，然后激活vir基因组的转录。结果，vir基因编码的几个蛋白通过切割、转移，掺入T-DNA基因。单个的T-DNA和vir基因不具备肿瘤形成的能力。即使当T-DNA和vir基因存在于同一土壤杆菌细胞但在不同复制子时，T-DNA和vir基因可以共同致癌。利用一个双载体导入外源性基因的方法利用了这种特性。 在这个实施例中，来源于人a 1，6-FT(序列鉴定号2)的cDNA(序列鉴定号1)，例如糖转移酶(a 1，6-FT亚克隆所得到的pBluescript-FT由大阪大学医学系的NaoyukiTaniguchi惠赠)插入到T-DNA区域以构建双载体pGPTV-HPT-FT、 pGPTV-DHFR-FT和pGPTV-BAR-FT。这种双载体的构建方案以图1和图2表示。 最初，利用pBluescript-FT为模板，通过PCR扩增所获得的a 1，6-FT基因片段用限制性内切酶进行消化。同样，将该基因片段插入到PBI221载体(CL0NTECH LABORATRIESINC)，通过PCR对其限制性酶切位点进行修饰以获得一个pBI221-FT载体(图1)。引物参照Yanagidani等人的报告而产生(J Biochem (Tokyo) 1997三月；121 (3) :626-32 YanagidaniS， Uozumi N， Ihara Y， Miyoshi E， Yamaguchi N， Taniguchi N J Biol Chem 1996十一月1 ;271(44))。 另夕卜，Xba I-EcoR I片段含有一个CALIFL0WER花叶病毒35S启动子基因，a 1，6-FT，并从pBI221-FT载体中切掉一个胭脂碱合成酶终止子基因。Xba I-EcoR I片段掺入到三个植物转化双载体pGPTV-HPT(例如从美国典型培养物保藏中心(ATCC， 12301 ParklawnDrive,Rockbill，Maryland USA 20852)获得的ATCC77390) 、pGPTV-DHFR(例如，ATCC77390从ATCC获得)pGPTV-BAR(例如，ATCC77391从ATCC获得)(图2)。这三种双载体在其T-DNA区域具有不同的抗药性基因，因此可以使用不同的药物筛选转化的植物细胞。
制备三种不同抗药性表达基因(即pGPTV-HPT-FT、 pGPTV-DHFR-FT和pGPTV-BAR-FT)的原因是，用于筛选转化细胞的药物和导入的糖转移酶对细胞具有不可知的影响。尚未发现一种可以确定应用于该情况的筛选的药物。因此，提前构建了三种al，6-FT的表达载体。构建这三种载体主要是源于这样的观点，即当将来将多个外源基因导入到同一克隆中时，含具备不同作用机制的筛选标记的载体是有用的。 在制备的表达载体中，pGPTV-HPT-FT在这个实施例中用来转化一种烟草BY2的培养细胞。 土壤杆菌是用Bevan等人的三亲株交配法转化的(Bevan M， Nucleic AcidRes， 12,8711， 1984)。含有pGPTV型质粒(Plant MolBiol 1992十二月;20(6) :1195-7Becker D， K卿er E， Schell J， Masterson R)的大肠杆菌DH5 a (suE44， A lacU169，(①801azAM15)，hsdR17) (Bethesda Research Laboratories Inc :Focus8 (2) ， 9 (1986))，以及含有辅助质粒pRK2103 (Bevan M， Nucleic AcidRes， 12， 8711， 1984)的大肠杆菌HBIOI分别在含12. 5mg/l四环素、50mg/1卡那霉素的2XYT培养基中37。C过夜培养。土壤杆菌农杆根瘤菌EHA101(Elizanbeth EH， J Biacteriol， 168， 1291， 1986)在含50mg/l卡那霉素、25mg/l氯霉素的2XYT培养基中28"C培养两晚。然后，每种培养液取1. 5ml到E卯endorf管中。收集到每种菌株的细胞后，用LB培养液将细胞洗三遍。以这种方式获得的细胞接着 用lOOiU 2XYT培养液悬浮，与三种细菌混合，涂布到2XYT琼脂培养基上，在28。C培养， 然后pGPTV型质粒从大肠杆菌结合转移到土壤杆菌。两天后，将出现在2XYT琼脂培养基 上的某些菌落用白金环转移到含50mg/l卡那霉素、12. 5mg/1四环素和25mg/l氯霉素的LB 琼脂培养皿中。将内容物在2『C培养2天后，可筛选到单菌落。 培养的烟草细胞的转化是用An G. ，Plant Mol Bio Man皿al A3，l所描述的方法。 首先，将100 iil含pGPTV型质粒的土壤杆菌EHA101在含12. 5mg/1四环素的LB培养基中， 于2『C培养48小时，在培养的第四天，将4ml培养的烟草细胞烟草属烟草L. cv.亮黄2的悬 液(菌株号BY2是从Tsukuba生命科学研究中心基因库的植物细胞发展组，用分类号RPC1 获得的)在一个培养皿中充分混匀，并在暗处于25t:放置。两天后，从培养皿中取出部分 溶液，通过离心(1000rpm，5分钟)分离上清。细胞沉淀加入到新的培养基中并再次离心。 将细胞接种到含20mg/l潮霉素和250mg/l羧苄青霉素的加强LS琼脂皿中，在暗处于25°C 放置。两至三星期后，将生长到胼胝期的细胞转移到新的培养皿中，并挑选生长的菌落。再 过两到三星期后，传代后将菌落转移到30ml含潮霉素和羧苄青霉素的加强型LS琼脂皿中。 由于筛选中用了潮霉素，获得一个转化的胼胝的时间(约5星期)是平常的两倍。对于所 得到的转化的胼胝，用含潮霉素的选择性培养基再重复筛选约一个月。从这种方法所获得 的抗性菌株中随机选择12个抗性菌株(BY2-FT 2至13)，用于DNA水平的分析。
(BY2_FT细胞DNA水平的分析) 所获得的转化菌株BY2-FT 2至13的研究如下利用其胼胝，根据以下材料和方法 部分第10节所描述的方法，制备基因组DNA， al，6-FT基因的掺入用PCR检测(见材料和 方法部分12)。对于PCR，引用以下的引物FT-Xba :5' -TGGTTCCTGGCGTTGGATTA (序列鉴定 号3)，和FT-Sal :5'-GGATATGTGGGGTACTTGAC(序列鉴定号4) 。 PCR扩增产物用材料和方法 部分第8节所描述的方法进行电泳，结果表示于图3。 如图3所显示，11个菌株即BY2-FT2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和13在1700bp附近 显示条带，被认为是al，6-FT基因区的扩增片段。相对照，从培养的野生型烟草细胞中制 备的基因组DNA用于模板时，未发现条带(在图3的右边用WT指示的电泳道)。因此，确定 a 1，6-FT基因掺入到BY2-FT细胞的染色体中。 [OO91 ] (BY2_FT细胞RNA水平的分析) 在PCR分析证实导入的a 1，6-FT基因是基因组DNA的转化子中，研究了具有高生 长率的4株菌株BY2-FT2、3、4和6。其中的RNA是根据下面材料与方法第11节中所描述的 方法制备的，进行了 RT-PCR(见下面材料与方法第13节)。结果显示于图4中。RT-PCR中所 使用的引物与以上描述的一致，扩增产物用以上DNA分析中描述的相同条件进行电泳。如 图4中所显示的结果，观察到所有4株菌株在1700bp附近显示条带，被认为是a 1，6-FT基 因区的扩增片段。野生型BY2株中未发现扩增条带(图4中WT所指示的泳道)。进一步，用 根据一种CaWV 35S启动子序列所设计的引物(CaWV引物)(序列鉴定号5)和FT-Sal弓|物 进行RT-PCR，结果没有条带(图4中第A道)。CaWV引物5 '-CGTCTTCAAAGCAAGTGGAT (序 列鉴定号5)。 在这些实验中，用制备RNA标本的试剂盒所制备的RNA液有可能被基因组DNA污 染。在RT-PCR之前，所有制备的RNA标本均经过了 DNA酶的处理。在使用经DNA酶处理的RNA标本作模板进行PCR的情况中，未发现扩增条带(图4的B道)。因此，证实上述的条
带不是从DNA扩增的片段。
( a 1 ， 6-FT酶活性的观察) 在这些实验中所使用的检测a 1，6-FT活性的一种a 1，6_FT活性检测试剂盒中， 一种具有图IO上端所显示的结构的荧光素标记糖链是一种底物糖链。荧光素标记糖链是 在Toyobo Co公司制备的，参照以下Yazawa等人和Seko等人的报告(Glycoconj J 1998九 月；15(9) :863_71 Yazawa S， Kochibe N， Nishimura T， Shima C， Takail， Adachi M， Asao T， Hada T， Enoki Y， J騰ja LR ;Biochim BiophysActa 1997四月17 ;1335(1-2) :23-32 Seko A， Koketsu M， NishizonoM， Enoki Y， Ibrahim HR， Juneja LR， Kim M， Yamamoto T)。 具有一个连接的天冬酰胺残基的糖链是从卵黄中制备的(Gn和Gn-bi-Asn)。 一种荧光底 物(4-氟-7-硝基苯呋咱(NBD-F， Dojin KagakuKenkyujo))贴附于天冬酰胺残基(Gn， Gn-bi-Asn-NBD)。传统上，还原末端是由2-氨基吡啶进行荧光标记的PA糖链是用于检测 糖转移酶的活性的。然而，在这种PA糖链中，还原末端的N-乙酰氨基葡糖有一个开-环结 构。因此，PA糖链不能作为a 1，6-FT的底物糖链。因此，尝试了用于检测al，6-FT活性 的多种受体糖链和方法。 反应产物在材料和方法第18. 3节中所描述的条件下进行了 HPLC分析。未反应的 底物在约9.5分钟洗脱(在图5的上部)，而一种al，6-岩藻糖化的糖链标准品在约15分 钟洗脱(图5的底部)。mRNA的表达在RNA水平分析时观察到的BY2_FT2、3、4和6的研究 如下。根据材料和方法第14或18. l节制备了一种酶的粗提液。这种酶的粗提液与al， 6-FT活性检测试剂盒进行反应。反应液进行HPLC分析。结果在洗脱至约15分钟时，BY2-FT 3、4和6的酶粗提液的反应液显示一个峰组合(在图6的中和下部，以及图7的上部)。这 个洗脱时间与a 1，6-岩藻糖化糖链标准品的洗脱时间一致。 进一步，对含培养的烟草细胞的植物中存在的al，3-岩藻糖基转移酶(al， 3-FT) ， Studacher等人(GlycoconjJ 1995十二月;12(6) :780-6 Staudacher E， Dalik T， Wawra P，Altma皿F，Marz L ;Glycoconj J 1998 —月；15(1) :89-91 Roitinger A，Leiter H， Staudacher E，Altmann F)已报道，从Mung绿豆中所获得的a 1， 3-FT绝对需要如Mn"和 Zn2+这样的二价阳离子，并且在没有这样的阳离子时无活性。在该实施例中，在a 1，6-FT活 性检测试剂盒和al，3-FT酶粗提液中没有添加二价阳离子。有鉴于此，建议在HPLC分析 中洗脱至15分钟时所发现的峰不是al，3-岩藻糖化糖链。事实上，野生型BY2样品HPLC 图中，在洗脱15分钟的位置，未发现对应的洗脱峰(图7下部)。
(a 1，6-岩藻糖基转移酶特异活性的检测) 检测了从BY2-FT3、4和6中所获得的蛋白粗提液的a 1，6_岩藻糖基转移酶的特 异活性。这种特异活性是根掘以下的材料和方法中第18. 4节所描述的HPLC层析谱评价的。 结果，未转化的BY2菌株(图1中用WT指示)的特异活性低于检测极限，而BY2-FT6株显 示6. 03U/mg蛋白质的最高特异活性(表1)，其中1U是指每分钟转化lpmol底物所需的酶 表1 BY2-FT的酶粗提物中a 1，6_FT的特异活性
14克隆号特异活性(U/mg蛋白质)
BY2-FT32. 57
BY2-FT42. 53
BY2-FT66. 03
WT< 0. 03 1U:lpmol/min(实施例2 : a 1，6-FT对培养的烟草细胞中糖蛋白的影响) BY2-FT细胞中导入的a 1，6_FT对糖蛋白的影响是采用豌豆凝集素(PSA)进行研 究的，豌豆凝集素的天冬酰胺连接型糖链的还原末端存在的N-乙酰氨基葡糖残基以a 1，6 方式与一个岩藻糖残基紧密连接。首先，根据材料与方法第14节所描述的方法，从BY2-FT 细胞中制备蛋白粗提物，粗提蛋白的大约浓度是通过测量A，吸光度值得到的(材料与方 法第15节)。根据以下材料与方法第16和17节，对蛋白粗提物进行SDS-PAGE。然后，进 行凝集素染色。 图18中的结果显示转化细胞中的糖蛋白糖链在约23KDa处有对应的染色，通过 与未转化的BY2菌株比较，表明与凝集素有反应(图8右边用WT所指示的泳道)。该结果 提示在BY2-FT2、3和4细胞的糖蛋白中，存在一个al，6-岩藻糖残基。未转化的BY2(WT) 细胞有轻微的染色。考虑原因是PSA与所存在的植物复合型糖链上的其它岩藻糖残基有亲 和力(包括al，3-岩藻糖残基)。应该注意，图8中用A所指的泳道是电泳的胶使用甲状 球蛋白作阳性对照作印迹所获得的，显示与凝集素的反应是阳性的。
(实施例3 :转化的培养烟草细胞所产生的糖蛋白的分析) 选择了 3株具有最高生长率的BY2-FT菌株。分析了具有导入的a 1，6-FT基因的
转化细胞所产生的糖蛋白的糖链结构。 1.由菌株BY2-FT3生产的糖蛋白的制备 将BY2-FT3(培养的烟草细胞)的培养细胞(湿重约3kg)用一个玻璃匀浆器进行 研磨，从而获得细胞的裂解物。这些细胞裂解物在4°C 、 12000rpm离心20分钟，从而得到含 糖蛋白的的上清液。上清液用去离子水进行透析(1.5X10M咅稀释)，然后冷冻干燥，从而 获得干粉标本。 2.N-连接糖链的制备 然后，将这些干粉标本在IO(TC肼解IO小时，从而从糖蛋白中切掉糖链。在肼 解产物中加入过量的丙酮，再于4°C、8000rpm离心20分钟以沉淀糖链。在得到的沉淀中 加入饱和的碳酸钠溶液和N-乙酸酐以使糖链乙酰化。然后，将得到的反应产物用Dowex 50X2(MuromachiKagaku Kogyo)进行脱盐。进一步，将得到的溶液应用到0. 1N氨水平衡 过的TSK gel YOYO PERAL HW-40 (T0S0H)凝胶过滤柱(2. 5 X 30cm)，以使N-连接的糖链复 性。 3.吡啶基氨基(PA)糖链的制备 复性后的N-连接糖链用2氨基吡啶转换为PA糖链。PA糖链通过用0. IN氨水平 衡过的TSK凝胶YOYO PERAL HW-40 (T0S0H)凝胶过滤柱(2. 5 X 30cm)进行纯化。
4.用HPLC对PA糖链进行分级和分析
PA糖链的结构用反相(RP)HPLC和体积分级(SF)HPLC进行分析，用外源性糖蛋白 酶消化进行双向糖链描图，并进行MALDI-TOF MS分析。HPLC分析采用的是装有日立公司FL检测器L-7480的日立HPLC系统，其中荧光
的密度是在310纳米的激发波长和380纳米的荧光波长检测的。RP-HPLC分析采用的是
Cosmosil5C18-P柱(6 X 250mm ;Nacalai Tesque) ， PA糖链的洗脱是通过以1. 2ml/min的流
速，在40分钟内将0. 02% TFA水溶液中乙腈的浓度从0%增加到6% 。 SF-HPLC分析是采
用Asahipak NH2P-50柱(4. 6 X 250mm ;Showa Denko) ， PA糖链的洗脱是通过以0. 7ml/min
的流速，在25分钟内将去离子水-乙腈混合液中乙腈的浓度从26%增加到50%。PA糖链的结构是用双向糖链描图评价的，其中洗脱时间是用反相(RP) HPLC和体
积分级(SF) HPLC进行比较的。 5.用外源性糖蛋白酶消化分析PA糖链 利用N-乙酰氨基葡糖酶(肺炎双球菌；Roche)进行酶消化的研究如下每种PA 糖链在含3mU N-乙酰氨基葡糖酶的50mM醋酸盐缓冲液(pH5.45)中于37。C反应2天。 a -L-岩藻糖酶的酶反应是在含lOmMa -L-岩藻糖酶的0. 1M醋酸盐缓冲液(pH5. 45)中于 37t:反应2天。每种酶的消化反应是通过IO(TC煮沸3分钟来终止，然后在12000rpm离心 5分钟。上清进行HPLC分析。糖链标本的洗脱时间与已知糖链的洗脱时间进行比较。
6. MALDI-TOF MS分析 MALDI-TOF MS分析是采用PerS印tive生物系统Voyager DE RP工作平台进行的。
7.由菌株BY2-FT3获得的PA糖链的结构 从约3公斤BY2-FT3所制备的PA糖链用RP-HPLC和SF-HPLC进行纯化。特别的， 由RP-HPLC所得到的成分(1至10)(见图11A所示的层析谱)进行复性，再进行SF-HPLC。 由SF-HPLC所得到的1-9的峰再进一步进行SF-HPLC分析，共得到55个峰(部分数据表示 于图11B)。其中的部分峰含有多个PA糖链。在这种情况时，这些峰再做一次SF-HPLC，从 而可完全纯化糖链。 对应于55个峰的组分中，组分4D-V、 5A-111 、 5C-111 、 5D-II 、 6B、 6F-I和7E可由岩 藻糖苷酶切割，分解的产物在完整产物之前用RP-HPLC进行洗脱(未显示数据)。这种情况 提示这些糖链包含a 1，6-岩藻糖(Glycoconj J 1998 —月；15(1) :89_91用于检测Fuc与 天冬酰胺连接的GlcNAc岩藻糖基转移酶的HPLC方法。Roitinger A，Leiter H， Staudacher E， Altmann F)。 每个糖链的结构用双向糖链描图法分析，外源性糖蛋白酶消化，或MALDI-TOF MS 分析。结果，糖链结构表示于图12至14。 组分4D-V、5C-III和5D-II的PA糖链有与M3FFX(1413. 33)基本相同的m/ z(1413.59)。用岩藻糖苷酶处理的PA糖链在双向糖链描图与M3FX匹配，而且也有与 M3FFX(1267. 19)基本相同的m/z (1267. 36)。 组分6B和5A-I11的PA糖链有与M2FFX(1251. 19)基本相同的m/z (1251. 57)(图 14)。用岩藻糖苷酶处理的PA糖链有与M2FX(1105.05)基本相同的m/z (1105. 79)。
组分6F-I的PA糖链有与Gr^M3FFX(1616. 52)基本相同的m/z(1616. 14) (图14)。用岩藻糖苷酶处理的PA糖链在双向糖链描图与GnlM3FX匹配，而且也有与 Gr^M3FX(1470. 38)基本相同的m/z (1470. 35)。
16
组分7E的PA糖链有与M5F(1459. 36)基本相同的m/z(1459. 33)(图14)。用岩藻 糖苷酶处理的PA糖链在双向糖链描图与M5A匹配，而且也有与M5A(1313. 22)基本相同的 m/z(1313. 43)。 组分5C II 311和5D I 211的PA糖链与M5A在双向糖链描图匹配，与 M5A(1313. 22)有基本相同的m/z (1313. 14)。 组分4F的PA糖链与M6B在双向糖链描图匹配，与M6B(1475. 36)有基本相同的m/ z(1475. 82)。 组分3B的PA糖链与M7B在双向糖链描图匹配，与M7B(1637. 50)有基本相同的m/ z(1638. 35)。 组分2C的PA糖链与M7A在双向糖链描图匹配，与M7A(1637. 50)有基本相同的m/ z(1638. 33)。 组分2D中1E峰的PA糖链与M8A在双向糖链描图匹配，与M8A(1475. 36)有基本 相同的m/z(1800. 44)。 进一步，组分1AIII和2A中的PA糖链与M3FX在双向糖链描图匹配，组分5CIII 的PA糖链与M3X在双向糖链描图匹配。当用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割组分7C中PA糖链 时，在SF-HPLC分析中，片段的洗脱位置移动的数量对应于一个GlcNAcl。片段与M3X在双 向描图匹配，与GnM3X(1324. 24)有基本相同的m/z (1324. 83)。因此，组分7C的PA糖链被 认为是Gr^M3X(见图13中每种糖链的结构)。 当用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割组分5C II 2和5D I 1中的PA糖链时，在SF-HPLC 分析中，片段的洗脱位置移动的数量对应于一个GlcNAcl。每个片段与M3X在双向糖链描 图匹配，与GnM3X(1324. 24)有相同的m/z(1324. 61)。因此，组分5C II 2和5D I 1的PA 糖链被认为是Gr^M3X。这些PA糖链的洗脱位置与RP-HPLC分析中组分7C的PA糖链不同。 因此，认为这些PA糖链是结构变异体。 当用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割组分4E I中的PA糖链时，在SF-HPLC分析中， 片段的洗脱位置移动的数量对应于一个GlcNAcl。片段与M3FX在双向糖链描图匹配，与 GnM3FX(1470. 38)有相同的m/z (1471. 21)。因此，组分4E I的PA糖链被认为是Gn'M3FX。
当用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割组分2B II的PA糖链时，在SF-HPLC分析中，片 段的洗脱位置移动的数量对应于一个GlcNAcl。片段与M3FX在双向描图中匹配，其m/z为 1471. 29，与GnM3FX(1470. 38)基本相同。因此，组分2B II的PA糖链被认为是G&M3FX。 这个PA糖链的洗脱位置与RP-HPLC分析中组分4E I的PA糖链不同。因此，认为组分2BI1 的PA糖链是结构变异体。 组分3A的PA糖链有与Gn2M3FX(1673. 57)基本相同的m/z (11674. 56)。当用N-乙 酰氨基葡糖苷酶切割组分3A中的PA糖链时，在SF-HPLC分析中，片段的洗脱位置移动的数 量对应于GlcNAcl的2倍数量。片段与M3FX在双向糖链描图匹配，因此，组分3A的PA糖 链被认为是Gn2M3FX。 对于数据，如m/z数值和双向糖链描图结果，其它糖链与任何N-连接糖链不匹配。 可以判断其它糖链并不是N-连接糖链。 如上所述分析的结果，N-连接糖链的比例以百分比表示。高甘露糖型糖链占 10.8%，复合型糖链占28. 1%， a 1，6-岩藻糖连接糖链占61. 1%。 a 1，6_岩藻糖连接于由a 1，6-岩藻糖苷酶基因转化的BY2-FT3中61. 1%的糖链。 如上所述，al，6-岩藻糖连接于由a 1，6-岩藻糖苷酶基因转化的BY2-FT3中 61. 1%的糖链。然而，a 1，3-岩藻糖或13 1，2-木糖也连接于a 1，6-岩藻糖连接糖链。有 报道指出，al，3-岩藻糖或Pl，2-木糖有可能对动物具有抗原性。为使这种糖链的结构 不可能对动物造成抗原性，有必要灭活a 1，3-岩藻糖基转移酶或Pl，2-木糖转移酶。这 是通过筛选或生产一种植物宿主的变种来实现的，其中不含a 1，3-岩藻糖基转移酶活性 或13 1，2-木糖转移酶活性，或通过一种酶基因来抑制基因的表达。 抑制基因表达是通过反义技术实现的(Wenderoth I， von SchaewnA "植物N-乙 酰氨基葡糖转移酶I的分离和鉴定"，"拟南芥cgl突变体和反义植物中的功能分析"Plant Physiol 2000七月;(3) :1097-1108)，利用嵌合DNA-RNA寡糖产生一种位点特异性突变 (Beetham PR， Kipp PB， Sawycky XI， Arntzen CJ， May GD "—种用于功能性植物基因组的 工具嵌合DNA-RNA寡核苷酸在体内导致基因特异性突变"，Proc Natl Acad Sci USA 1999 七月；96(15) :8774-8778)，用一种植物病毒实现基因沉默(Covey SN， Al-Kaff NS."植物 DNA病毒与基因沉默"Plant Mol Biol 2000六月;43(2-3) :307-322)。这些技术在本行业 中已知。(实施例4 :从转化的烟草细胞再生而产生植物以及由该植物所产生的糖蛋白的 分析) 1.灭菌的烟草植物的产生 将1粒烟草种子(Nicotiana tabacum SRI (从日本烟草公司的烟草叶实验室所获 得，700 Higashihara， Toyoda-cho， Iwata-g皿，Shizuoka))放入1. 5ml微量离心管中，在管 中加入70%乙醇。将离心管摇动3分钟以对种子进行灭菌，然后，弃乙醇溶液。用lml灭 菌水洗种子。接着在试管中加入lml安替佛民(antiformin)溶液(市售次氯酸盐溶液的 10倍稀释液)，放置15分钟，并间隔摇晃。然后，去掉安替佛民溶液，并用灭菌水将种子洗 3遍。 另一方面，在一个培养皿中将奥古佩宁(由Meiji Seika Kaisha公司生产)稀释 至终浓度为160mg/l。将l张灭菌滤纸浸入到培养皿中，烟草种子在滤纸上发芽。将发芽 的种子转移至MS培养基，并在一个明亮的环境中培养。将长成的烟草SR1株植物在芽的顶 端4厘米处用刀切，切下来的植物种植于新的MS培养基中生根，并进一步培养于明亮的环 境中。 2.烟草植物的转化 根据An等人描述的方法(An， G， Ebert PR， Mitra A and Ha SB(1988)Binary vectors. In Plant Molecular Biology Manual A3， 1-19，Academic Dordrecht)转化烟草 植物。 简言之，从罐中的植物上切掉一片无菌的烟草叶，叶子在一个培养皿中切成 lcmXlcm、叶片)。将叶片移到另一个灭菌的培养皿中。将已在2XYT培养基中于28t:培 养了 2天的5ml 土壤杆菌培养液(含pGPTV-HPT-FT的土壤杆菌EHA101)加入培养皿中并 充分混匀，然后静置3分钟。将叶片取出，并用一个KIM毛巾吸去粘着的多余菌液。接着， 将叶片放于MS-NB培养液中(4. 0g Murashige-Skoog植物盐混合物，30g蔗糖，10ml 5% MES-K0H(Ph 5. 7) ， 3g结冷胶，0. lmg NAA， 1. 0mg BAP， 10mg盐酸硫胺，lmg烟酸，lmg盐酸吡
18哆辛(pyridoxin)/ml水)，并在明亮处于25。C培养。 2天后，将叶片转移到一个装有灭菌水的50ml圆锥管中，通过充分振荡清洗。在 用KIM毛巾将叶片上的水擦干后，将叶片放入灭菌过的培养液中，于25t:培养一周。然后， 将叶片移入含潮霉素B (终浓度20mg/L)和羧苄青霉素(终浓度250mg/L)的MS-NB培养液 中(芽形成培养液)。长大的胼胝以无菌方式移入含芽形成培养液的玻璃罐中。l个月以 后，将植物上含新生蒂的芽和叶子切下，以无菌方式植入含潮霉素B(终浓度20mg/L)和羧 苄青霉素(终浓度250mg/L)的MS-NB培养液中(根形成培养液)(注意该培养液与上述的 除BAP和NAA之外的基础培养基MS-NB —样)，在明亮处于25。C培养直到芽长成根。将罐 中长大的植物移入盘中继续生长，这样就得到了含FT(l) 、FT(2) 、FT1、FT2和FT3的转化植 物。 3.从烟草植物中制备染色体DNA 将分别从转化植物FT(l) 、FT(2) 、FT1、FT2和FT3中得到的约100g植物标本冻于 液氮中。将这些冻存的标本研磨碎之后，用微型Daeasy植物试剂盒(QIAGEN)按照其中的 操作说明制备染色体DNA。 然后，按照与实施例1中描述的从BY2-FG细胞中扩增基因组DNA相似的条件，对 每种染色体DNA进行PCR。实验证实a 1， 6_FT基因已掺入到转化植物的染色体中。采用的 引物是，CaMV引物(5' -CGTCTTCAAAGCAAGTGGAT)和FT-Sal(5' -GGATATGTGGGGTACTTGAC)
类似实施例l，所得到的PCR产物进行电泳。结果显示于图14中。如图14所示， FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3在1700bp附近有扩增带，被认为是a 1，6-FT基因区域的扩 增片段。另一方面，当以野生型SRI为模板制备基因组DNA时，在1700bp附近没有发现扩 增带。因此，在转化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3的染色体中掺入了 al，6-FT基因。
4. a 1，6-FT转化植物所产生的糖蛋白的分析植物凝集素染色
与实施例2相似，a 1，6-FT-介导的转化体所产生的糖蛋白用豌豆凝集素(PSA) 进行分析，PSA与天冬酰胺连接型糖链的还原末端存在的N-乙酰氨基葡糖残基以a 1，6方 式与一个岩藻糖残基紧密连接(Yamamoto K，Tsuji T，0sawa T， (1982)Carbohydrate Res， 110,283-289，Debray H，Montreuil J， (1989)Carbohydrate Res，185，15-26)。
结果示于图15中。如图15所示，转化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3有染色， 提示与SR1植物比较，凝集素与糖蛋白的糖链有反应。因此，转化植物的糖蛋白中存在a 1， 6-岩藻糖残基。 应当指出的是，尽管SRI植物的凝集素反应水平微弱，但在培养的用a 1， 6-FT基
因转化的烟草细胞中也观察到了这种反应，阳性克隆用凝集素进行了筛选。认为可能的原
因是PSA凝集素与其它岩藻糖残基，包括植物混合型糖链中存在的a 1，3-岩藻糖残基。 以下将对在上述实施例中所采用的材料与方法进行简要描述。 材料与方法 1.植物，菌株，质粒 (1.1植物) 作为植物转化体，使用了一种烟草BY2培养细胞(烟草属烟草L.cv.亮黄2)。 (1.2菌株) 所使用的植物列于表2中。
19
表2菌株
菌株基因型和特性
大肠杆菌
JM109RecAl， endAl， gryA96， thi， hsdR17， supE44， relAl， A (lac proAB)/F[traD36， proAB+， laclq， lacZ AM15]
DH5aSupE44， A lacU169(①801acZ AM15) ， hsdR17， recAl， endAl， gyrA96， thi-l， relAl
土壤杆菌农杆根瘤菌
EHA101卡那霉素抗性 携带反向作用毒力功能，是促进双载体T-DHA区向植物 转移所必需的
LBA4404利福平抗性，链霉素抗性 (1. 3质粒)所用的质粒示于表3中 表3质粒
基因型和特性
PUC19Amp1, lacZ
PBI221Ampr CaMV 35S启动子，GUS基因，以及克隆至PUC19的胭脂碱合成酶 终止子
PGPTV-HPTKmT. HmF
PGPTV-DHFRKnf，甲氨喋呤F
PGPTV-BARKnf，双丙胺磷r 2.培养基 (2.1培养细菌的培养基) 2XYT培养基使用的是细菌-胰蛋白胨16g/l，酵母提取物10g/l，氯化钠5g/
201。对于平皿培养基，加入12g/l纯化的琼脂粉。选择性地加入氨苄青霉素(Meiji Seika Kaisha， Ltd)，卡那霉素(Meiji SeikaKaisha, Ltd)，潮霉素(Wako Chemicals)，氯霉素 (Wako Chemicals)，利福平(Wako Chemicals)，链霉素(Wako Chemicals)，使终浓度分别为 50mg/l ， 50mg/l ， 20mg/l ， 25mg/l ， 50mg/l ，和20mg/l 。(2. 2培养烟草细胞的培养基)表4加强的LS培养基(mg/l，)NH4N031650CaCl2. 2H20440■31900MgS04. 7H20370KH2P04370Na2. DETA37. 3H3B046. 2FeS04. 7H2027. 8MnS04. 4H2022. 3氢氯硫胺10ZnS04. 7H208. 6烟酸1KI0. 83氢氯吡哆辛1Na2Mo04. 2H200. 25内消旋肌醇100CuS04. 5H200. 025蔗糖30000CoCl2. 2H200. 025 用氢氧化钾调pH至5. 8 进一步，用Murashige-Skoog培养基中的混合盐制备以上的组合物。
加强型LS琼脂培养基加强型LS琼脂培养基中KH2P04的含量为170mg/l， pH用K0H调为5. 8，再在培养 基中加入3g/1 结冷胶(Wako Chemicals)。选择性地加入卡那霉素、羧苄青霉素(Wako Chemicals)、潮霉素、氨甲蝶呤(Wako Chemicals)，和双丙胺磷(Meiji Seika Kaisha公 司)，使终浓度分别为150mg/l，250mg/l，20mg/l，0. lmg/l，和10mg/l。
3.试剂和酶 除非特别指出，所使用的试剂是从Wako Chemicals和NacaliTesque得到的。限 制酶和修饰酶是从Toyobo有限公司、Takara Shuzo有限公司、Nippon Gene， Sigma和NEB 公司购得的，使用方法按照其中的说明。
4.大肠杆菌的转化
(4. 1感受态细胞的制备) 宿主大肠杆菌接种到2ml 2XYT培养基中，并过夜培养。将培养基接种到含200ml 2 X YT培养基的sakaguchi烧瓶中。烧瓶在37"C振荡直到浊度在600nm是0. 6，然后进行离 心(5000rpm， 10分钟，(TC )。去掉上清，用5ml 50mM的CaCl2和15%的甘油悬浮细菌。然 后，将悬浮液分装于E卯endorf管中，在-S(TC保存作为感受态细胞。
(4.2大肠杆菌的转化) 将感受态细胞在冰上融化，然后，将l-15微升DNA溶液加入到感受态细胞中，并在 冰上放置30分钟。接着，将溶液在42t:放90秒，然后放于冰上。将lml 2XYT培养基加入 到溶液中，将感受态细胞在37t:培养1小时，加入到含适量抗生素的琼脂培养基上，于37°C 过夜培养。
5. 土壤杆菌的转化 土壤杆菌的转化采用Bevan等人的三亲体杂交方法。简言之，将含PGPTV型质粒 的大肠杆菌和含辅助质粒PRK2013的大肠杆菌于37t:在含抗生素的培养基中分别过夜培 养。将土壤杆菌EHA101或LBA4044于2『C在含抗生素的培养基中培养两夜。
将每种培养液1. 5ml倒入到E卯endorf管中，然后离心收集细菌。收集的细菌用 2XYT培养基洗两次，然后再悬于1ml 2XYT培养基中。将三种菌株混合并加入到2XYT 培养基中，培养于2『C，以使质粒从大肠杆菌中通过结合转化到土壤杆菌中。两天后，将 2XYT培养基上出现的部分菌落用白金环转移到含抗生素的2XYT琼脂培养基上。在28°C 培养两天后，挑选一个单菌落。
6.培养的烟草细胞的转化
(6. 1培养的烟草细胞的传代) 将95ml加强型LS培养基倒入一个300ml Mayer烧瓶中，在暗处于25°C _27°C、 120rpm进行振荡培养。将2ml到达静止期的培养细胞每7天进行传代。当第7天没有得到 足够量的细胞时，将加倍(4ml)的细胞进行传代培养。 [O207] (6. 2培养的烟草细胞的转化) 将100微升在含抗生素的2XYT培养基中于2『C培养了两天的土壤杆菌培养液 (含pGPTV型质粒的土壤杆菌EHAIOI和LBA4044)，在一个培养皿中与4ml培养到第四天的 培养烟草细胞悬液混匀，然后将混合液在25t:于暗处静置。两天后，将培养皿中的悬液移到 一个离心管中，离心(1000rpm，5分钟)去除上清。在得到的沉淀中加入含250mg/l羧苄青 霉素的新培养基，再离心以清洗细胞，这种清洗共重复三次以去除土壤杆菌。将不含土壤杆 菌的培养烟草细胞加入到含20mg/l潮霉素和250mg/l羧苄青霉素的潮霉素和250mg/l羧 苄青霉素潮霉素和250mg/l羧苄青霉素琼脂培养基上，在暗处于25t:进行培养。两至三周 后，将长到胼胝阶段的细胞转移到新的加强型LS琼脂培养基上以筛选生长的菌落。再过两 到三周后，将长到直径为1厘米的菌落转移到30ml含潮霉素和羧苄青霉素的加强型LS液 体培养基中，并进行传代培养。
7.小量质粒DNA的制备 小量质粒是以Birnboin和Doly' s碱性提取方法从大肠杆菌和土壤杆菌中得到 的。将细菌在含抗生素的2XYT培养基中过夜培养(土壤杆菌培养两夜)。将培养基转移 到一个Eppendorf管进行离心(12000rpm， 5分钟，室温)收集细菌。所获得的细菌用100微 升溶液I悬浮(对土壤杆菌，含5mg/ml的溶菌酶(Sigma))，并在室温静置5分钟。然后，在 悬液中加入200微升溶液II并进行充分振荡。所得到的混合物在冰上放置5分钟，接着，在 混合物中加入150微升溶液III并进行充分振荡，所得到的混合物在冰上放置5分钟。离 心后(12000rpm， 5分钟，室温)，将上清转移到另一个管中。上清用RNA酶处理(37°C ， 5分 钟)，经酚_氯仿抽提、乙醇沉淀后，将获得的沉淀物用适量的TE缓冲液溶解。
[表5] TBE缓冲液12. lg/1 Tris
6. 18g/l硼酸盐 0. 7g/l EDTA 凝胶-上样缓冲液0. 25%溴酚兰<formula>formula see original document page 23</formula>
0. 25%二甲苯腈蓝 40% (w/v)蔗糖 8. DNA电泳 用TBE缓冲液配制1. 0-1. 5% (w/v)的琼脂糖。在5份样品中加入1份凝胶上样缓 冲液，将样品加入到凝胶的槽中。所使用的电泳仪是Mupid-2(Cosmobio)。电泳是在1XTBE 中用100伏的常压下进行的。电泳完后，将凝胶在0. 5 g/ml溴化乙锭水溶液中浸泡20分 钟。将染色后的凝胶置于穿透性照明灯下观察。
9.电泳凝胶中DNA片段的复原 DNA片段从琼脂糖凝胶中的复原使用的是一种基因清除II试剂盒(F皿akoshi)。 将含有目的片段的凝胶移到一个Eppendorf管中。在1份琼脂糖凝胶中加入1/2份的TBE 加强液和4. 5份的Nal，将混合物在55t:孵育以使凝胶完全溶解。将5 基质加入到混合 物中并完全混匀，然后，将混合物在冰上放置10分钟。短促离心后弃上清，用200 的清 洗缓冲液将沉淀物洗三次，再将溶液于55t:洗脱5-10分钟，进行离心，可获得含有DNA的上 清液。 10.从烟草中制备染色体DNA (10. 1从培养的烟草细胞中制备染色体DNA) 从培养的烟草细胞中制备染色体DNA使用的是ISOPLANT(NipponGene)。将300iU 溶液I加入到大约0. lg培养的烟草细胞中，并完全搅拌。再加入150 Pi溶液II并用振荡 器完全搅拌。将细胞于5(TC孵育15分钟。再在细胞中加入150ia溶液III，振荡，并放置 15分钟。离心后(12000rpm， 15分钟，4。C )，将上清用乙醇沉淀两次，将沉淀溶于20 yl TE 缓冲液中，并用1 y 1 RNA酶A处理30分钟。
(10. 2从烟草胼胝中制备染色体DNA) 用DNeasy Plant Mini Pr印Kit(QIAGEN)从胼胝中制备染色体DNA。当胼胝长到 直径大约为1厘米后，将其于液氮中冷冻，用研磨器将胼胝研磨成粉，用这种粉(100mg)作 标本按照试剂盒的说明制备DNA。
11.从烟草培养的细胞胼胝中制备总RNA 胼胝的总RNA的制备采用RNeasy Mini Pr印Kit(QIAGEN)。在这种情况下，用
0.05%二甲基焦碳酸盐处理研磨器、乳钵和灭菌水，然后高压消毒(12(TC，30分钟)。当胼
胝长到直径大约为1厘米后，将其于液氮中冷冻，用研磨器和乳钵将胼胝研磨成粉，用这种
粉(100mg)作标本按照试剂盒的说明制备RNA。 12. PCR (12. 1反应体系) 将1 ii 1染色体DNA、5ii 1 10XPCR缓冲液(由Takara Shuzo有限公司生产的 Takara Ex Taq所附带)，4iU dNTP(由Takara Shuzo有限公司生产的Takara Ex Taq所 附带2.5mM)，引物(每种20pmo1) ，0. 5ii 1 Takara Ex Taq(5U/yl， Takara Shuzo有限公 司)，以及灭菌水混合并使总体积至50 i！ 1.
(12. 2反应条件) 反应以以下的条件进行。所使用的热循环仪是PCR系统9700 (PEBiosystems)。
[表6]
23
第一阶段1个循环变性(94°C ) 5分钟
退火(60°C 2分钟) 延伸(72 °C 3分钟) 第二阶段30个循环变性(94°C ) 1分钟
退火(60°C 2分钟) 延伸(72 °C 3分钟) 第三阶段1个循环变性(94°C ) 1分钟
退火(60°C 2分钟) 延伸(72 °C 3分钟) 退火温度根据引物的Tm值而改变。 13. RT-PCR (13. 1反转录反应) 反转录反应采用的是RNA PCR试剂盒2. 1 (Takara Shuzo有限公司)。将5
MgCl2 (5mM) ， 2 ii 1 10 X RNA PCR缓冲液，8. 5 ii 1无RNA酶的水，2 ii 1 dNTP (ImM) ， 0. 5 ii 1 RNA 酶抑制剂(1U/ Pi) ， 1 Pi反转录酶(0. 25U/ ill)以及1 ill试剂盒中所附的连接Oligo dT 的引物(0. 125 M) ， 1 按上述第11节中所制备的RNA样本混合，按以下所述的程序进行 反应。所采用的热循环仪是PCR系统9700(PEBiosystems)，循环数是l，l个循环包括5(TC 30分钟，99t: 5分钟，以及5t: 5分钟。
(13. 2反转录反应后的PCR) 将6iU MgCl2 (2. 5mM) ， 8 ii 1 10XRNA PCR缓冲液，63. 5 ii 1灭菌的蒸馏水，O. 5 ii 1 TaKaRa Taq酶(2. 5U/100 iU)，以及引物混匀并加入到上述第13. 1节已制备的反转录反 应物中。用一个小离心机离心10秒后，将管子按以下条件进行反应，第1阶段1个循环； 94°C 2分钟；第2阶段45个循环；94。C 30秒，60。C 30秒，以及72°C 1. 5分钟。
14.从培养的烟草细胞中制备蛋白质粗提溶液 通过离心收集传代后第7天的烟草细胞(3000rpm， 15分钟，4。C )，然后，通过轻轻 地将管子上下颠倒，将所得到的细胞用等量的50mM磷酸盐缓冲液(pH7. 0)进行清洗，将这 一过程重复三次，然后离心(3000rpm，15分钟，4t:)。将所收集的细胞转到一个手持匀桨 器中(20ml IKEMOTO)进行研磨。接着将细胞研磨液转移到一个50ml的离心管中并离心 (12000rpm，20分钟，4。C )，所获得的上清即蛋白质粗提液。在每50ml提取液中选择性地加 入一颗蛋白酶抑制剂药片(BOEHRINGERMANNHEIM)。进一步，如果需要粗蛋白的浓縮液，在粗 蛋白中选择性加入硫酸铵(Wako Chemicals)到70%的饱和度，在冰上放置4_5小时，然后 离心(12000rpm，20分钟，4t:)。将所得到的蛋白质悬浮于500 yl灭菌水中，用于以下的分 析。 15.蛋白质定量 用DC蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad)进行蛋白质定量。该试剂盒基于Lowly-Folin 方法，根据其中的说明，将反应液混匀并于室温放置15分钟。然后，测量750nm的吸光度。 用小牛白蛋白作标准在0.05-0.4mg/ml的范围内作标准曲线。以标准曲线作参考，测定蛋 白质的量。 16.蛋白质电泳
(16. 1 Tris-甘氨酸十二烷基硫酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳)
十二烷基硫酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是根据Laemml i方法进行的。 用于电泳的凝胶，分离胶用的是12. 5%的聚丙烯酰胺凝胶，浓縮胶用的是2. 5%的聚丙烯 酰胺凝胶(丙烯酰胺双丙烯酰胺=30 : 0. 8)，电泳缓冲液采用的是Tris-甘氨酸缓冲 液。将12 样品在加样缓冲液中于IO(TC变性3分钟，电泳中使用的电压是100伏恒压。(16. 2分子量标记)[表7]分子量标记品用的是蛋白质分子量标记品"第一"(DaiichiKagaku Yakuhin)
磷酸化酶97400小牛白蛋白66270醛縮酶42200碳酸酐酶30000大豆蛋白酶抑制剂20100溶菌酶14000或者，预先染色的SDS-PAGE标准(Bio-Rad)
磷酸化酶B106000小牛白蛋白80000卵白蛋白49500碳酸酐酶32500大豆蛋白酶抑制剂27500溶菌酶18500(16.3蛋白质染色)进行了考马斯兰染色和银染。对考马斯兰染色，将凝胶浸入到染色液中30分钟(0. 1%考马斯亮兰R-250,甲醇:乙酸盐水=5 : 5 : 2(v/v)混合物)，然后浸于脱色液
(甲醇乙酸盐水=2 : i :7(v/v)混合物)并振荡过夜。银染是用银染试剂盒(Wako
chemicals)，根据其中所描述的说明进行的。
17.凝集素染色 SDS-PAGE电泳后，将凝胶在印迹缓冲液中平衡15分钟，然后将凝胶中的蛋白质转 印到PVDF膜(Bio-Rad，用于蛋白质印迹的免疫印迹PVDF膜，O. 2mm)，使用的是半干式转印 仪(半干式转移仪BE-310Biocraft)于ImA/cm2的恒流进行60-70分钟。转印后，将PVDF 膜浸于0.6% H202/甲醇(V/v)溶液，以阻断培养烟草细胞中的内源性过氧化物酶。阻断 后，用冲洗缓冲液(IO分钟，三次)洗PVDF膜，然后将膜浸于含5X脱脂奶的洗液中，在室 温温和反应两小时。同样，将PVDF膜用洗液进行清洗。然后，将PVDF膜浸于用冲洗缓冲 液1000倍稀释的氧化物酶标记的PSA凝集素(lmg/ml，EY LABORATORIES, INC)中，于室温 反应90分钟。反应后，用上述类似的方法冲洗膜。然后用POD免疫染色盒进行染色(Wako chemicals)。上述冲洗缓冲液的配方是10Mm Tris-HCl(pH 7.4)，0.15M NaCl，0.05X吐温 20。 18. a 1 ， 6_岩藻糖基转移酶活性的测定
(18. 1粗酶液的制备)
通过离心(3000rpm， 20分钟，4°C )收集培养至第7天的转化培养烟草细胞，然后 用类似于上面第14节中的抽提缓冲液冲洗并收集细胞。接着用一个手持式匀浆器研磨细 胞，并离心(12000rpm，20分钟，4t:)。上清被用作粗酶溶液。以上抽提缓冲液的配方是 20mM Tris-HCl(pH7. 5)，0. 175% CHAPS。
(18.2a 1，6-岩藻糖基转移酶的酶反应) a 1，6的活性总是在暗处测定的。使用了一种由Toyobo有限公司提供的底物溶液 (15iU)来测量a 1，6-岩藻糖基转移酶的活性。将以上第19. l节中制备的粗酶溶液5iU 加入到一个含底物溶液的管子中，于37t:反应三小时，通过煮沸1分钟来终止酶反应，然后 立即将管子移到冰上放置1分钟，再将管上的冰水去掉。在管中加入80 ii 1去离子水并离心 (12000rpm，20分钟，4。C)。将30iil获得的上清液进行HPLC分析。每15iU测量a 1，6_岩 藻糖基转移酶活性的底物溶液包括8 y 1 0. 5M MES/NaOH缓冲液(pH7. 5) ， lnmole/ y 1 Gn， 1 ii 1 Gn-bi-Asn-NBD， 2 ii 1 5nmole/ml GDP-岩藻糖(Wako chemicals)，以4 ii 1超纯水。 使用的HPLC体系(HITACHI生产)包括接口 (L-7000)，荧光检测仪(LsChrom L-7480)，泵 (LaChrom L-7100)以及柱加热炉(LaChrom L-7300)。
(18. 3酶活性的有或无) 酶活性的有或无是用HPLC分析测定的。柱子用的是反相Mightysil RP-18 GP150-4. 6(5 iim) (Kanto Kagaku 4.6X150mm)。用于测量a 1， 6-FT活性的底物糖链进行 了荧光标记以使底物糖链可以用荧光检测仪(Ex ;470nm，Em ;530nm)特异地进行检测。进一 步，用以下方法制备了 a 1，6-岩藻糖链的标准品。将5iU a 1，6_岩藻糖基转移酶(40mU/ ml， Toyobo有限公司)加入到底物混合液中，以测量a 1，6_岩藻糖基转移酶的活性，并按 上面第1. 18节中的方法与37t:反应15分钟。
(18.4活性的测定) 计算了按以下条件进行的HPLC分析中底物的峰面积与反应产物的峰面积的比 值，活性的计算是按每分钟于每毫克粗酶溶液蛋白质中转化岩藻糖的量。粗酶溶液中总蛋 白的量是以上述第15节中描述的方法定量的。
[表8] 缓冲液A:20mM 乙酸氨 pH4. 0 缓冲液B:20mM 乙酸氨 pH4. 0_80%乙腈 缓冲液比率B二5X 模式恒溶剂 流速lml/分钟 柱温度55°C Ex : 470mm Em :530mm 工业实用性 本发明提供一种具动物型糖链加成功能的植物细胞，一种从植物细胞再生的植 物，一种生产该植物细胞的方法，一种应用植物细胞生产动物型糖蛋白的方法。本发明中用 植物细胞生产的糖蛋白具动物型糖链，以使糖蛋白对动物特别是人无抗原性。因此，本发明 中的糖蛋白适应于给动物，包括人进行注射。
序列表〈110>藤山和仁关达治〈120〉具有动物型糖链加成功能的植物细胞〈130>62734A (Jl-00356138)〈140>PCT/JP02/02091〈141>2002-0E「06〈150>JP 2001-062704〈151>2001-0E「06〈160>5〈170>Microsoft Word97 SR-2〈210>1〈211>1759〈212>DNA〈213〉人〈220〉〈221>CDS〈222>17. . 1744〈400〉朋朋tctctc tega朋atg egg cca tgg act ggt tec tgg cgt tgg att atg52Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp lie Met
1510etc att ctttttgcctggggg3CCttgctgttttatateggtggtC3C100Leu lie LeuPheAlaTrpGlyThrLeuLeuPheTyrlieGlyGlyHis152025ttg gta cgagat朋tg￡lCcatcctgatC3CtctageCg￡lg朋ctgtec148Leu Val ArgAspAsnAspHisProAspHisSerSerArgGluLeuSer303540朋g att ctggCEl朋gcttg朋cgcttaCElgCElg朋tg朋g￡lCttg196Lys lie LeuAlaLysLeuGluArgLeuLysGinGinAsnGluAspLeu45505560Elgg Cg￡l Eltggccg朋tctetceggateCC3g朋ggccctattgatCElg244Arg Arg MetAlaGluSerLeuArglieProGluGlyProlieAspGin657075ggg cca getate3gagt￡lcgcgttttag朋gagCElgcttgtt朋g292Gly Pro AlalieGlyArgValArgValLeuGluGluGinLeuValLys808590gcc 333 g朋CElgattg朋朋ttac朋gaaaCElg3CC3ga朋tggtctg340Ala Lys GluGinlieGluAsnTyrLysLysGinThrArgAsnGlyLeu95100105ggg朋ggatcatg朋atectg￡lgg￡lgg￡lggattg朋朋tget388GlyLysAspHisGlulieLeuArgArgArglieGluAsnGlyAlaLys110115120gagetctggtttttcetaCElgElgtg朋ttg朋gaaatta朋g朋ctta436GluLeuTrpPhePheLeuGinSerGluLeuLysLysLeuLysAsnLeu125130135140g朋朋tg朋etcc朋3gacatgCElgatg朋tttcttttggattta484GluGlyAsnGluLeuGinArgHisAlaAspGluPheLeuLeuAspLeu145150155catcatg朋￡iggtctateEltg3CggatetatactacetcElgtCElg532GlyHisHisGluArgSerlieMetThrAspLeuTyrTyrLeuSerGin160165170gatgCElggtgattggeggg朋aaagaggccaaagatctg580ThrAspGlyAlaGlyAspTrpArgGluLysGluAlaLysAspLeuThr175180185g朋ctggttCElgegg3gaatetatcttCElg朋tccc朋gg￡lCtgc628GluLeuValGinArgArglieThrTyrLeuGinAsnProLysAspCys190195200ageaaagcc朋gctggtgtgt朋tate朋caaaggctgtggctat676SerLysAlaLysLysLeuValCysAsnlieAsnLysGlyCysGlyTyr205210215220ggctgtCElgetccatcatgtggtctactgcttcEltgattgCEltatggc724GlyCysGinLeuHisHisValValTyrCysPheMetlieAlaTyrGly2252302353CCCElgCg￡letcatettgg朋tctCElg朋ttggcgctatgetact772ThrGinArgThrLeulieLeuGluSerGinAsnTrpArgTyrAlaThr240245250ggttgggagactgt￡lttt￡lggcctgteElgtgagtgcg￡lC820GlyGlyTrpGluThrValPheArgProValSerGluThrCysThrAsp2552602653gatctggcatetecactgg￡iC3Ctggteaggtg朋gtg朋gg￡lC868ArgSerGlylieSerThrGlyHisTrpSerGlyGluValLysAspLys270275280朋tgttc朋gtggtcgagcttcccattgt￡lg￡lCElgtcttcatccccgt916AsnValGinValValGluLeuProlieValAspSerLeuHisProArg285290295300cctCC3tatttacccttggetgt￡lCC3g朋g￡lCetcgCElgatCg￡lctt964ProProTyrLeuProLeuAlaValProGluAspLeuAlaAspArgLeu
305310 315gt￡lCg￡lgtgcatggtg￡lCcctgCElgtg tgg tgg gtg tct cag ttt gtc1012ValArgValHisGlyAspProAlaVal Trp Trp Val Ser Gin Phe Val320325 330tacttgatecgcCC3CElgccttgg cte g朋朋a g朋ate g朋g朋1060LysTyrLeulieArgProGinProTrp Leu Glu Lys Glu lie Glu Glu335340345gcc3CC朋g朋gcttggcttcaaacat cca gtt att gga gtc cat gtc1108AlaThrLysLysLeuGlyPheLysHis Pro Val lie Gly Val His Val3503553603gacgcg￡lCgtggaa get gcc ttc cat ccc att gaa1156ArgArgThrAspLysValGlyThrGlu Ala Ala Phe His Pro lie Glu365370375 380gagtacEltggtgcatgttg朋g朋cat ttt cag ctt ctt gca cgc aga1204GluTyrMetValHisValGluGluHis Phe Gin Leu Leu Ala Arg Arg385390 395Eltgc朋gtgg￡lCaaaaaa3gagtgtat ttg gcc aca gat gac cct tct1252MetGinValAspLysLysArgValTyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser400405 410ttatta朋ggaggC3朋gtac ccc aat tat gaa ttt att agt1300LeuLeuLysGluAlaLysThrLysTyr Pro Asn Tyr Glu Phe lie Ser415420425gat朋ctctatttectggteagetgga ctg cac朋t cga tec sea g朋1348AspAsnSerlieSerTrpSerAlaGly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu430435440朋tteacttcgtgg￡igtgatectggat ate cat ttt etc tct cag gca1396AsnSerLeuArgGlyVallieLeuAsp lie His Phe Leu Ser Gin Ala445450455 460g￡lCttcetagtgtgtacttttteatec cag gtc tgt cga gtt get tat1444AspPheLeuValCysThrPheSerSer Gin Val Cys Arg Val Ala Tyr465470 475g朋attEltgc朋etacatcctgat gcc tct gca aac ttc cat tct1492GlulieMetGinThrLeuHisProAsp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser■485 490ttagatg￡lCatetactattttgggggc C3g朋t gcc C3C朋t c朋att1540LeuAspAsplieTyrTyrPheGlyGly Gin Asn Ala His Asn Gin lie495500505gccatttatgetC3Cc朋cccCg￡lact gca gat g朋att CCC 3tg g朋1588AlalieTyrAlaHisGinProArgThr Ala Asp Glu lie Pro Met Glucct Pro 525
Lys Lys
510
Gly
ggt Gly
gtt Val
515 520 gat ate att ggt gtg get gga aat cat tgg gat ggc tat tct 1636 Asp lie lie Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser 530 535 540
gtc朋c agg朋a ttg gga agg acg ggc cte tet ccc tcc tec 1684 Val Asn Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr
545 550 555
cga gag朋g ate g朋acg gtc朋g tec ccc sea tet cct gag 1732 Arg Glu Lys lie Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu
get
560
gag
a a a
565 570
t33 3gtCg3CtC3
g ￡1 t g g
Ala Glu
Lys 575
〈210>2 〈211>575 〈212>PRT 〈213〉人 〈400>2
Met Arg Pro Trp
1
Ala
Asn
Lys
Glu 65 Gly
lie
Glu
Phe
Leu 145
Trp
Asp
Leu 50
Ser
Arg
Glu
lie
Leu 130 Gin
Gly
His 35 Glu
Leu
Val
Asn
Leu 115 Gin
Thr 20 Pro
Tyr 100 Arg
Thr 5
Leu
Val 85 Lys
Arg Glu Arg His Ala
Ser
Gly Ser Trp Leu Phe Tyr
Asp His Ser
Arg Leu Lys Arg Arg
lie
Pro 70 Leu
Lys
Arg
Leu
Asp 150
Gin 55 Glu
Glu
Gin
lie
Lys 135 Glu
Ser 40 Gin
Gly
Glu
Thr
Glu 120
Lys
Arg
lie 25 Arg
Asn
Pro
Gin
Arg 105 Asn
Leu
Trp 10 Gly
Leu 90 Asn
Gly
Lys
lie Met Leu lie Gly His Leu
Glu Leu Ser Glu lie
Asp
Phe Leu Leu
Asp 75 Val
Gly
Ala
Asn
Asp 155
Leu 60 Gin
Lys 45 Arg
Lys
Leu
Lys
Leu 140 Leu
Glu 125 Glu
Phe Asp Ala Arg Met Ala
Val 30 lie
Lys
Leu 15 Arg
Leu
Gly Pro Ala Ala Gly
Lys 110 Leu
Glu 95 Asp
lie 80 Gin
His
Trp
Phe Gly Asn Glu
Gly His His
Glu 160
ArgSerlieMetThrAspLeuTyrTyrLeuSerGinThrAspGlyAla165170175GlyAspTrpArgGluLysGluAlaLysAspLeuThrGluLeuValGin180185190ArgArglieThrTyrLeuGinAsnProLysAspCysSerLysAlaLys195200205LysLeuValCysAsnlieAsnLysGlyCysGlyTyrGlyCysGinLeu210215220HisHisValValTyrCysPheMetlieAlaTyrGlyThrGinArgThr225230235240LeulieLeuGluSerGinAsnTrpArgTyrAlaThrGlyGlyTrpGlu245250255ThrValPheArgProValSerGluThrCysThrAspArgSerGlylie260265270SerThrGlyHisTrpSerGlyGluValLysAspLysAshValGinVal275280285ValGluLeuProlieValAspSerLeuHisProArgProProTyrLeu290295300ProLeuAlaValProGluAspLeuAlaAspArgLeuValArgValHis305310315320GlyAspProAlaValTrpTrpValSerGinPheValLysTyrLeulie325330335ArgProGinProTrpLeuGluLysGlulieGluGluAlaThrLysLys340345350LeuGlyPheLysHisProVallieGlyValHisValArgArgThrAsp355360365LysValGlyThrGluAlaAlaPheHisProlie61uGluTyrMetVal370375380HisValGluGluHisPheGinLeuLeuAlaArgArgMetGinValAsp385390395400LysLysArgValTyrLeuAlaThrAspAspProSerLeuLeuLysGlu405410415AlaLysThrLysTyrProAsnTyrGluPhelieSerAspAsnSerlie420425430SerTrpSerAlaGlyLeuHisAsnArgTyrThrGluAsnSerLeuArg435440445GlyVallieLeuAsplieHisPheLeuSerGinAlaAspPheLeuVal450455460CysThrPheSerSerGinValCysArgValAlaTyrGlulieMetGin
31
465470475 ■Thr Leu HisPro Asp AlaSer Ala ASh Phe His Ser Leu Asp Asp lie485490 495Tyr Tyr PheGly Gly GinAsn Ala His Asn Gin lie Ala lie Tyr Ala500505 510His Gin ProArg Thr AlaAsp Glu lie Pro Met Glu Pro Gly Asp lie515520 525lie Gly ValAla Gly AsnHis Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn530535 540Arg Lys LeuGly Arg ThrGly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu545550555 560Lys lie GluThr Val LysTyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys565570 575〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉人工序列的描述引物
〈400>3tggttcctggcgttggatta20〈210>4〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物
〈400>4ggatatgtggggtacttgac20<210>5〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物
<400>5cgtcttcaaagcaagtgg3t20
3权利要求
一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞，其中的植物细胞中导入了编码动物来源的酶的基因，这种酶可以将一种岩藻糖残基转移到糖蛋白糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。
2. 根据权利要求l所述的植物细胞，其中来源于动物的酶是al，6-岩藻糖基转移酶。
3. —种从根据权利要求1或2所述的植物细胞中再生的植物。
4. 一种生产具有动物型糖链加成功能的植物细胞的方法，包括在植物细胞中导入编码 动物来源酶的基因的步骤，其中的酶可以将一种岩藻糖残基转移到糖蛋白糖链还原末端的 乙酰氨基葡糖残基上。
5. —种生产具有动物型糖链的糖蛋白的方法，包括以下步骤通过在植物细胞中导入一种编码动物来源的酶的基因和编码外源性糖蛋白的基因转 化植物细胞，其中的酶可以将岩藻糖残基转移到糖蛋白的还原末端的乙酰氨基葡糖残基 上，并且培养所获得的转化的植物细胞。
6. —种生产具有动物型糖链的糖蛋白的方法，包括以下步骤通过在植物细胞中导入一种编码能将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残 基上的酶的基因和编码外源性糖蛋白的酶的基因来转化植物细胞，并且 在细胞器中表达该酶。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述糖蛋白从植物中表达后被分离。
8. —种用权利要求6所述的方法生产的具有动物型糖链的糖蛋白。
9. 根据权利要求l所述的植物细胞，其中所述动物来源的酶是哺乳动物a 1，6-岩藻糖 基转移酶。
10. 根据权利要求4-6任一项所述的方法，其中所述动物来源的酶是哺乳动物al， 6-岩藻糖基转移酶。
11. 根据权利要求1所述的植物细胞，其还包含外源性糖蛋白。
12. 根据权利要求11所述的植物细胞，其中所述外源性糖蛋白是酶、激素、细胞因子、 抗体、疫苗、受体或血清蛋白。
13. 根据权利要求5或6所述的方法，其中所述外源性糖蛋白是酶、激素、细胞因子、抗 体、疫苗、受体或血清蛋白。
14. 根据权利要求12所述的植物细胞，其中所述抗体是IgG或scFv。
15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述抗体是IgG或scFv。
16. 根据权利要求1所述的植物细胞，其中的内源性植物a 1，3-岩藻糖基转移酶和/ 或P 1，2木糖转移酶被灭活。
17. 根据权利要求4-6任一项所述的方法，其中还包括将内源性植物al，3-岩藻糖基 转移酶和/或Pl，2木糖转移酶灭活的步骤。
全文摘要
本发明提供一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞。这种植物细胞含有一个编码动物来源的酶的外源基因，这种酶可以将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白中糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。
文档编号C07K14/435GK101781635SQ20091014667
公开日2010年7月21日 申请日期2002年3月6日 优先权日2001年3月6日
发明者关达治, 藤山和仁 申请人:陶氏化学公司