专利名称：：花生叶片dna微量快速提取方法
技术领域：
：本发明涉及农业
技术领域：
，尤其涉及一种花生叶片DNA微量快速提取方法。
背景技术：
：花生是世界最重要的油料作物之一，在我国花生生产发展迅速，总产量已经位居世界首位。花生种质基础有限，抗病资源缺乏，同时花生生产也一直受多种病虫害的危害，导致产量和品质下降。进行花生遗传改良，培育新的抗虫抗病品种具有重要意义。系统育种，杂交育种，诱变育种都不能有目的创新，而基因工程技术育种可以任意选择生产上的当家品种进行外源基因的导入，达到目的性状基因的转移，可目标明确的达到种质改良的目的。建立高效植抹再生体系技术是植物基因工程的关键环节之一。花生组织培养，国外从40年代开始研究，我国从70年代开始，已在花生营养和生殖器官建立了多种成熟的再生体系，为花生分子育种和品种改良提供了可靠的技术基础。遗传转化技术通过将特定的外源基因引入到受体细胞，并使其定向稳定地转化从而超越物种的限制，实现基因的交流，产生具有特定性状的转基因植物，是对传统的植物育种方法的补充，也是进一步实现作物产量提高、抗性增强和品质改善的最大希望所在。花生基因转化的基本技术环节是分离目的基因，构建重组载体，导入外植体受体，筛选获得目的基因的抗性后代。目前，花生遗传转化的常用方法有农杆菌介导的遗传转化法和基因枪法。无论采用何种转化方式，提取组织培养外植提基因组DNA,对转化体进行分子鉴定，从而筛选转化体都是必需的途径。而目前常用的分子鉴定方式是将获得的卡那霉素抗性植物先移栽，然后采用大量提取方法提取植物基因组DNA。该提取方法存在鉴定效率低、周期长、成本高等缺点，而本技术则可以弥补上述缺点，提早转化体鉴定时间，加快转化体鉴定速度，从而显著提高转化体鉴定效率，尤其适合大批量组培苗转化植物的筛选鉴定。植物基因组DNA的提取和鉴定是进行植物生物技术试验所必需的试验内容，高质量的植物基因组DNA对于后续试验操作非常有利。花生是我国重要的油料作物和经济作物，花生基因组DNA的提取是花生生物技术试验中一项常规技术，由于花生体内含有较多的次生代谢物质，所以其基因组提取相对比较困难。目前广泛应用的技术方法多是利用CTAB、酚类法大量提取，不仅对操作人员有害，而且由于样品需要量较多，对所检测植抹也有不利影响，尤其对较小的植抹。本技术中的一种小量快速提取花生基因组DNA的方法，利于开展普通的花生生物技术试验，可直接用于PCR、限制性酶切以及组培苗初期分子鉴定等分子生物学试验操作。花生基因组DNA的提取是花生生物技术试验中一项常规技术，由于花生体内含有较多的次生代谢物质，所以其基因组提耳M目对比较困难。目前广泛应用的技术方法多是利用CTAB、酚类法大量提取，不仅对操作人员有害，而且由于样品需要量较多，对所检测植抹也有不利影响。
发明内容为解决常规植物基因组DNA提取周期长、成本高等缺点，针对花生外源基因遗传研究中转化体的筛选鉴定，本专利提供一种快速、高效、简便的花生叶片基因组DNA提取方法，该方法包括如下步骤(1)将无菌花生叶片置于离心管中，滴入0.2~0.4mL液氮后将所述叶片捣碎，加入0.2~0.3mL提取液并混合均匀；(2)加入适量浓度为15%25%的SDS(W/V)后轻緩摇动离心管，此步骤的目的是使DNA发生断裂。将所得产物进行温育；(3)加入适量的经预冷处理的醋酸钾(KAc)H冲液，混合均匀后进行第一次离心分离；(4)将所得上清液加入适量预冷的异丙醇，混合均匀后在冰冻条件下放置1525分钟；(5)将上一步骤所得上清液进行第二次离心分离以沉淀核酸，其中所述第二次离心分离的条件与第一次相同；离心后用预冷5小时以上的乙醇漂洗沉淀，漂洗后干燥沉淀，随后用适量Tris-EDTA(TE)溶液干燥沉淀。在本发明的一个实施方式中，步骤(l)中的所述无菌花生叶片的取用量为0.1~0.2g。在本发明的一个实施方式中，步骤(l)中所述液氮的用量为0.4~0.6mL。在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中所述提取液的加入量为0.2~0.3mL。在本发明的一个实施方式中，所述20。/。的SDS的量为0.020.06mL。优选0.030.05mL，更Y尤选0.04mL。在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中所述KAc的用量为0.20.4mL,加入后轻緩摇匀进行冰浴，时间为15~25分钟。在本发明的一个实施方式中，所述KAc緩沖液的浓度为35M,其使用量是0.2~0.4mL。该KAc缓沖液在加入反应物之前在4。C预冷23hr,轻緩混匀后水浴1030分钟。在本发明的一个实施方式中，所述第一次离心分离的转速为100015000r.分钟"，优选12000~150001*.分钟-1,离心分离进行12~18分钟，优选15分钟。离心后所得上清液中加入0.10.4mL的异丙醇，该异丙醇在加入上清液之前，在冰冻条件下，优选-15-20。C的温度下，预冷10小时以上，优选15小时以上。混合均匀后在所述冰冻条件下放置15~25分钟。在本发明的一个实施方式中，所述步骤(4)中异丙醇在-20。C温度下预冷15小时以上。在本发明的一个实施方式中，在所述乙醇用于漂洗沉淀之前，在冰冻条件下，优选-15-20。C的温度下，预冷5小时以上，优选8小时以上；该乙醇的浓度为7075%(W/V);溶解所述沉淀用的TE溶液的量为0.2~0.4mL。植物基因组DNA提取方法较多，不同的作物间细胞内含物差异较大，花生基因组DNA提取主要的限制因素是消除其中的酚类物质比较困难，常规方法操作比较复杂，需要试剂多比较昂贵。应用本方法提取花生基因组DNA整个试验流程仅需5070hr,可节省较多时间，较适合大量待检测花生6基因组DNA提取；由于省却了DNA纯化步骤，使得试-验步骤少，流程简单；本方法提取的花生基因组DNA不必使用酚、氯仿等强污染性和腐蚀性化合物进行纯化足以进行常规的分子生物学试验操作，从而降低了成本，减少了试验操作本身对试验人员的伤害；另外，常规方法大量提取至少需取1520片花生叶片，而应用本方法则仅需12片，对植抹生长基本无较大影响，这也是应用本方法最大的优点之一。附图简要说明图1:花生基因组DNA电泳图象(1，XDNA/HindIII+EcoRImarker;2~6,花生基因组DNA)。图2:PCR电泳检测结果(l，PCRmarker;2、3,非转基因植抹扩增图象；4、6、8,转基因植抹C/2/基因扩增产物；5、7、9，转基因植抹G7w基因扩增产物；其中4、5为转基因植抹1，6、7为转基因植林2，8、9为转基因植抹3)。具体实施例方式本发明提供一种快速、高效、简便的花生叶片基因组DNA提取方法，该方法包括如下步骤取0.10.2g新鲜花生金花1012(爿rac/^/2_ypogaeaL.)叶片》文入1.5mL离心管中，滴入0.4~0.6mL(2~3滴)液氮冷冻后用玻才奉研成细末，加入0.5mL提耳又緩冲液，瞬间涡旋混合均匀；加入0"4mL20%SDS(W/V)并轻緩摇动离心管5次(该阶段涡旋会使DNA断裂)，并在65。C温育1215分钟；加入0.2mL4。C预冷的5MKAc緩冲液，轻緩混匀5次后冰浴20分钟；12000r.分钟"离心15分钟，上清加入0.2mL-20°(:预冷10hr以上的异丙醇，混合均匀后-20。C放置20分钟；12000r.分钟"离心15分钟沉淀核酸，用70%、-20。C预，5hr以上的乙醇漂洗沉淀，并将沉淀转入1.5mL离心管中，吹干或抽干沉淀后用0.2~0.4mLTE'溶液'溶解沉淀，形成DNA提取液备用；随后用本领域中常规方法去除RNA。1、所提取花生基因组DNA纯度测定及电泳才企测应用UV-754型紫外分光光度计测定所提取花生基因组DNA在D，和D28o的吸光值，并计算二者的比值，发现均在1.8-2.0之间。对上述方法所得到的花生基因组DNA进行电泳观察分析，由图1可看出，所提取花生基因组DNA条带清晰，各样品基因组DNA条带整齐度较好，在每一条带中千扰物质较少，得率亦较高(样品孔中加入5uL基因组DNATE溶液)，分光光度计测定在0.8~1.4ug/uL之间，说明应用该方法提取花生基因组DNA是可行的。2、PCR产物;险测结果从图2看出，直接应用所提取基因组DNA进行PCR扩增经电泳^^企测具有相当好的效果，所扩增条带与PCR分子量标准相比亦非常清晰，并具有相当少的干扰信号，说明所提取花生基因组DNA在未经纯化处理的条件下即可直接用于常规的生物技术操作。实施例从表1可看出，使用本方法极大缩短了提取花生基因组DNA所用的时间，同时减少了所用叶片的用量，非常适合转基因苗大批量筛选研究，同时可以降低成本和环境污染。表1DNA孩么量快速提取方法比较(20052007年)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1.本发明提供一种快速、高效、简便的花生叶片基因组DNA提取方法，该方法包括如下步骤(1)将无菌花生叶片置于离心管中，滴入0.4～0.6mL液氮后将叶片捣碎，加入0.2～0.3mL提取液并混合均匀；(2)加入适量浓度为20％的SDS(W/V)后轻缓摇动离心管，将所得产物进行温育；(3)加入适量的经预冷处理的醋酸钾缓冲液，混合均匀后进行第一次离心分离；(4)将所得上清液加入预冷的异丙醇，混合均匀后在冰冻条件下放置15～25分钟；(5)将上一步骤所得上清液进行第二次离心分离以沉淀核酸，其中所述第二次离心分离的条件与第一次相同；离心后用-20℃预冷5小时以上的乙醇漂洗沉淀，漂洗后干燥沉淀，随后用适量Tris-EDTA溶液干燥沉淀；(6)去除DNA提取液中的RNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的所述无菌花生叶片的取用量为(U0.2g。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述液氮的用量为0.40.6mL,温育时间为1215分钟，温育温度为60~65°C。4.才艮据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取液的加入量为0.2~0.3mL。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述20。/。的SDS的量为0.020.06mL,优选0.030.05mL，更优选0.04mL。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述KAc(醋酸钾)的用量为0.20.4ml，加入后轻緩摇匀进行水浴，时间为1525分钟。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述醋酸钾緩沖液的浓度为35M,其^f吏用量是0.2~0.4mL。该醋酸钾緩冲液在加入反应物之前在4°C预冷2~3小时，轻緩混匀后冰浴1030分钟。8根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次离心分离的转速为100015000r.分钟"，优选1200015000r.分钟"，离心分离进行1218分钟，优选15分钟。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，离心后所得上清液中加入0.20.4mL的异丙醇，该异丙醇在加入上清液之前，在水冻条件下，优选-15~-20"的温度下，预冷10小时以上，优选15小时以上；混合均匀后在所述水冻条件下》文置15~25分钟。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述乙醇用于漂洗沉淀之前，在水冻条件下，优选-15-20。C的温度下，预冷5小时以上，优选8小时以上；该乙醇的浓度为7075%(W/V);溶解所述沉淀用的TE溶液的量为0.20.4mL。全文摘要本发明提供一种花生叶片基因组DNA提取方法，该方法包括如下步骤(1)在无菌花生叶片中滴入0.4～0.6mL液氮后将叶片捣碎，并加入0.2～0.3mL提取液；(2)加入适量浓度为20％的SDS(W/V)后轻缓摇动离心管，此步骤的目的是使细胞破裂释放DNA。将所得产物进行温育；(3)加入适量的经4℃预冷处理的KAc缓冲液，混合均匀后进行第一次离心分离；(4)将所得上清液加入-20℃预冷2hr-3hr的异丙醇，混合均匀后在冰冻条件下放置15～25分钟；(5)将上一步骤所得上清液进行第二次离心分离以沉淀核酸，其中所述第二次离心分离的条件与第一次相同；离心后用预冷5小时以上的乙醇漂洗沉淀，漂洗后干燥沉淀，随后用适量TE溶液干燥沉淀。文档编号C07H21/04GK101586102SQ20091015226公开日2009年11月25日申请日期2009年7月10日优先权日2009年7月10日发明者万书波,单世华,张廷婷,李春娟,闫彩霞申请人:山东省花生研究所