专利名称：：一种蓝藻病毒蛋白n突变体、其修饰衍生物及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医药领域，具体涉及一种蓝藻病毒蛋白N(CVN)突变体、其PEG修饰衍生物和它们在制药中的应用。
背景技术：
：蓝藻抗病毒蛋白N(Cyanovirin-N，CVN)是美国科学家BOYD等人从蓝藻可提取的一种具有抗HIV活性的蛋白。CVN能特异地、高亲合性地结合在人免疫缺陷病毒HIV-1的衣壳蛋白gpl20上从而发挥抗病毒活性，这一特点使它可以不受病毒变异的干扰，同时它还具有抗病毒谱广，性质稳定等特点，这使得CVN蛋白成为一种很有价值的抗病毒药物[BOYDMR，GUSTAFSONKR,MCMAHONJB,etal.Discoveryofcyanovirin-N，anovelhumanimmunodeficiencyvirus-inactivatingproteinthatbindsviralsurfaceenvelopeglycoproteingpl20:Potentialapplicationstomicrobicidedevelopment[J].AntimicrobialAgentsandChemotherapy,1997,41(7):1521-30.]。但因为该蛋白分子量较小，且分子中有二个二硫键，使得该蛋白在大肠杆菌中表达困难，产量低。同时作为一种原核生物来源的小分子蛋白类药物，它存在半衰期短、细胞毒性及引起免疫应答等缺点。聚乙二醇(PEG)是一种无毒、无免疫原性的水溶性高分子物质，可以通过共价结合方式修饰蛋白质，聚乙二醇修饰是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的稳定性差，半衰期短等问题的有效途径(IANGZY,XUSW,WANGYQ.Chemistryforpegylationofproteinandpeptidemolecules[J].ChineseJournalofOrganicChemistry,2003,23(12):1340-7.)利用PEG-马来酰亚胺在酸性条件下修饰CVN已有文献报道，Zappe等人选择了62位谷氨酰胺被半光氨酸替代的突变体(CVN(Q62C))用mPEG-马来酰亚胺(mPEG-MAL)在中性PH条件下对其进行修饰，在有效改善了其成药性(ZAPPEH,SNELLME,BOSSARDMJ.PEGylationofcyanovirin-N,anentryinhibitorofHIV[J].AdvancedDrugDeliveryReviews,2008,60(1):79-87.)。Zappe等人具体的修饰策略是选择62和14位谷氨酰胺被半光氨酸替代的突变体分子量分别为20KD和30KD的mPEG-马来酰亚胺(mPEG-MAL)在中性PH和偏碱性PH条件下对其进行修饰，结果14位谷氨酰胺被半光氨酸替代的突变体(CVN(Q14C))的修饰效率非常底，而62位谷氨酰胺被半光氨酸替代的突变体(CVN(Q62C))在中性PH、CVN突变体与mPEG-MAL摩尔比为1:3的条件下修饰率较高。但是CVN(Q62C)抗HIV的活性较未突变的CVN要低，并且由于选择的修饰位点是在CVN的内部，所以经过mPEG-马来酰亚胺30KDa(mPEG-MAL-30KDa)修饰的体变体抗HIV的活性几乎丧失。
发明内容针对现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的首先是提供一种CVN突变体，其更容易在宿主中表达，更易于纯化，并且有利于进一步的修饰。本发明的另一目的是提供上述CVN突变体的修饰衍生物，以降低蛋白本身的细胞毒性和免疫原性，使其更适于应用。本发明的再一目的则是将上述突变体和修饰衍生物用于制备预防和/或治疗艾滋病的药物。为实现上述目的，本发明提供以下技术方案一种蓝藻病毒蛋白N突变体，其氨基酸序列由序列A和序列B组成，序列A位于序列B的N端，序列A如下述之一a.序列表中的SEQIDNO:1;b.将序列表中的SEQIDNO:1的氨基酸残基序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，其具有亲水柔性的特点；序列B如下述之一c.序列表中的SEQIDNO:2;d.将序列表中的SEQIDNO:2的氨基酸残基序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但不改变其N端的前三个残基，且其具有特异性地抗HIV病毒活性；本发明还提供了蓝藻病毒蛋白N突变体的编码核苷酸序列。优选地，上述编码核苷酸序列包括下述序列之一e.序列表中的SEQIDNO:3;f.在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNO:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。这里的高严谨条件是指，低盐高温的杂交条件，如0.1XSSC，0.1。/。SDS和65。C温度。上述核苷酸序列主要可用于在宿主中表达目标蛋白，含有上述核苷酸序列的表达载体，细胞系，宿主菌等均可以通过常规的技术手段得到。蛋白质从宿主中纯化过程也可采用常规的方法。在得到纯化蛋白的基础上，本发明还提供了CVN突变体修饰衍生物，是将上述CVN突变体的N末端进行PEG修饰，修饰位点一般是针对N末端甘氨酸残基的a-氨基。优选地，所述PEG修饰的修饰剂使用mPEG-ALD(单甲氧基醚PEG-丙醛)，所述mPEG-ALD的分子量优选为10KD-20KD。上述突变体和修饰衍生物均可用于在制备预防和/或治疗艾滋病的药物中的应用，基于相同的抗病毒机理，本发明的突变体和修饰衍生物可以应用于制备预防和/或治疗其他病毒微生物所致疾病的药物。相对于现有技术，本发明具有如下有益效果本发明提供的CVN突变体及其修饰衍生物是为了更好的实现体外重组CVN的抗病毒功能，改造后的L-CVN抗HIV活性增强(WST法和细胞融合法)。由于本发明制备的LCVN末端引入了亲水柔性的多肽序列，因此可以进行N端的定点氨基修饰。我们的实验结果证明，LCVN经N端定点氨基修饰后，不仅可以获得有活性的修饰产物，并且修饰产物的抗病毒活性进一步增强。图1是pET3c-6His-SUMO-LCVN重组质粒图。图2是重组pET3C-6His-SUMO-LCVN质粒限制酶和PCR分析，其中M:DL2000DNAmarker;泳道l:pET3C-6His-SUMO-LCVN/MfeI+^w7i/I;泳道2:PCR。图3是SDS-PAGE电泳分析BL21/pET3c-6His-SUMO-LCVN蛋白表达特性，其中由左至右，各泳道依次为未加IPTG诱导、IPTG诱导20h、诱导表达破碎离心上清、诱导表达破碎离心沉淀。图4是纯化目的蛋白LCVN，其中由左至右，各泳道依次为Sumo-LCVN融合蛋白、Sumo-LCVN融合蛋白经Sumo蛋白酶酶切的混合物、LCVN蛋白。(*)表示Sumo-LCVN融合蛋白(**)表示LCVN蛋白。图5是RP-HPL分析重组LCVN的纯度。图6是不同pH及投料比条件下10KmPEG-ALD修饰LCVN的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中从左至右，泳道1是蛋白Maker,泳道2、3、4分别是PH3.5，LCVN与10KmPEG-ALD摩尔比分别为1:1、i:3、1:5时的修饰产物电泳条带；泳道5、6、7分别是PH4.0,LCVN与10KmPEG-ALD摩尔比分别为1:1、1:3、1:5时的修饰产物电泳条带；泳道8、9、10分别是PH5.0，LCVN与10KmPEG-ALD摩尔比分别为1:1、1:3、1:5时的修饰产物电泳条带；泳道ll、12、13分别是PH6.0，LCVN与10KmPEG-ALD摩尔比分别为1:1、1:3、1:5时的修饰产物电泳条带；泳道14、15、16分别是PH7.0，LCVN与10KmPEG-ALD摩尔比分别为l:l、1:3、1:5时的修饰产物电泳条带。图7是不同PH及投料比条件下10KmPEG-ALD修饰LCVN的修饰率比较图。图8是不同PH及投料比条件下20KmPEG-ALD修饰LCVN的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中从左至右，泳道l是蛋白Maker,泳道2、3、4分别是PH3.5，LCVN与20KmPEG-ALD摩尔比分别为1:1、1:3、1:5时的修饰产物电泳条带；泳道5、6、7分别是PH4.0,LCVN与20KmPEG-ALD摩尔比分别为1:1、1:3、1:5时的修饰产物电泳条带；泳道8、9、10分别是PH5.0，LCVN与20KmPEG-ALD摩尔比分别为1:1、1:3、1:5时的修饰产物电泳条带；泳道ll、12、13分别是PH6.0，LCVN与20KmPEG-ALD摩尔比分别为1:1、1:3、1:5时的修饰产物电泳条带；泳道14、15、16分别是PH7.0，LCVN与20KmPEG-ALD摩尔比分别为l:l、1:3、1:5时的修饰产物电泳条带。图9是不同PH及投料比条件下20KmPEG-ALD修饰LCVN的修饰率比较图。图10是不同时间下，10KmPEG-ALD修饰LCVN的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中泳道l是蛋白Maker，泳道2-8分别是反应lh、3h、5h、7h、9h、12h和24h后的样品电泳结果，泳道9是未修饰的LCVN。图11是不同时间下，20KmPEG-ALD修饰LCVN的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中泳道l是蛋白Maker,泳道2-8分别是反应lh、3h、5h、7h、9h、12h和24h后的样品电泳结果，泳道9是未修饰的LCVN。图12是10KmPEG-ALD修饰LCVN经SP-Sepharose分离纯化的洗脱曲线。图13是10KmPEG-ALD修饰LCVN经SP-Sepharose分离纯化各组分的Tricine-SDS誦PAGE电泳图，其中泳道l是蛋白Maker,泳道2-5是修饰反应的混合物、上样穿透峰、含有80mMNaCl的bufferA的洗脱峰；含有400mMNaCl的bufferA的洗脱峰。图14是20KmPEG-ALD修饰LCVN经SP-Sepharose分离纯化的洗脱曲线。图15是20KmPEG-ALD修饰LCVN经SP-Sepharose分离纯化各组分的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中泳道l是蛋白Maker,泳道2-5是修饰反应的混合物、上样穿透峰、含有70mMNaCl的bufferA的洗脱峰；含有400mMNaCl的bufferA的洗脱峰。图16是MT-4经不同浓度LCVN及其修饰产物处理后的细胞存活率(％)。图17是CVN和LCVN对HIV-l/IIIB增殖的抑制率(％)。图18是LCVN及其PEG修饰产物的抗人类免疫缺陷病毒活性，其中，图(a)相差显微镜下观察培养24h后的(l)MOLT-4细胞、(2)MOLT-4/IIIB细胞、(3)共培养后的细胞、(4)假处理的共培养后的细胞、(5-8)浓度为113nM的CVN/LCVN/10kPEG-LCVN/20kPEG-LCVN处理后的共培养细胞，黑色箭头所示处为融合的巨大细胞。图(b)CNV、LCVN、10kPEG-LCVN、20kPEG-LCVN的融合抑制活性，所有实验至少是3次独立实验后的统计学处理结果。图19是LCVN及其PEG修饰产物抗HSV-1活性的CPE观察结果。其中A、正常对照；B、病毒对照；C、阳性药物ACV对照(l昭/ml);D、L-CVN样品(1.562吗/ml);E、SUMO-L-CVN样品G.125pg/ml);F、mPEG垂ALD-10kDa-L-CVN(3.125pg/ml);G、mPEG-ALD-20kDa-L隱CVN(3.125吗/ml)。具体实施例方式以下列举一些本发明优选的实施例，以助于进一步理解本发明，但本发明的实施方式不限于此。本发明实施例涉及的主要材料如下宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)(购自Novagen公司)、质粒pET3c(购自Novagen公司)、pET3c-SUMO-CVN由本室保存(其构建方法已申请专利"重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法及应用，申请号200810198926.0"，质粒的构建亦可采用公知的基因工程方法，基本思路是首先通过PCR的方法得到SUMO-CVN融合序列，再连入pET3c载体即可得到质粒pET3c-SUMO-CVN);SUMO蛋白酶(购自海基生物有限公司)；Taq酶、T4DNA连接酶、DNA分子量标准、各种限制性内切酶购自大连宝生物公司；蛋白质分子量标准品(购自聚研生物科技有限公司)、引物购自上海生工生物公司；Ni2+SepharoseFastFlow、SPSepharoseFastFlow购自GEHealthcare公司；MTT、WST购自美国SIGMA公司；单纯疱疹病毒l型(HSV-1)F株来自武汉大学病毒研究所(CGMCCNo.0396);Vero細胞(CCL-81tm)、MOLT-4細胞(CRL-1582tm)、MT-4細胞(CRL-1942tm)、HIV-I/IIIB病毒(CRL-1973T，等来自美国典型菌种保藏中心(ATCC);mPEG-ALD(10K)和mPEG-ALD(20K)购自北京凯正生物工程发展有限公司。NTA陽0buffer(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，0.15mol/LNaCl，)，NTA-20buffer(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，0.15mol/LNaCl，20腿ol/L咪唑)，NTA-250buffer(20匪ol/LTris-HCl，pH8.0，0.15moi/LNaCl，250mmol/L咪唑)，酶切缓冲液(20mmol/LTris-HCi，pH8.0，0.15mol/LNaCl)，bufferA(20mmol/LNaAc-Ac，pH4.0)。实施例1、构建重组质粒pET3c-6ffis-SUMO-LCVNSUMO-L-CVN基因的构建合成分两步进行，首先通过两次PCR合成L-CVN基因，第一次PCR以pET3c-SUMO-CVN质粒为模板，以F1-CVN、R-CVN为上下游引物。反应体系为模板lng，上下游引物各lpM，20nlTaqPCRMasterMix，加水至40nl，反应混合物94。C变性lmin，退火至55'C，保持lmin，72'C延伸lmin，进行29个循环。反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段，作为下一轮PCR的模板。第二次PCR以上一轮PCR产物为模板，F2-CVN、R-CVN为上下游引物对(其中F2-CVN引物中含有编码15个氨基酸残基的柔性多肽)，合成L-CVN全长序列。SUMO全长序列通过PCR方法从pET3c-SUMO-CVN中合成。利用SUMO序列末端与L-CVN序列前端的26bp重叠互补序列进行PCR:以SUMO序列和L-CVN序列为延伸模板，F-SUMO，R-CVN为上下游引物，在常规的PCR条件下进行反应，反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并做胶回收，得到SUMO-L-CVN全长序列。将质粒pET3C禾B6His-SUMO-LCVN全长序列分别用MfeI和与5aw/H双酶切，酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物，T4DNA连接酶，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37'C培养过夜，提取质粒，PCR扩增及AWeI与万"m/ZI双酶切鉴定，阳性质粒送往英骏公司测序。表l用于合成SUMO-LCVN全长序列的引物引物名称序列F2-CVN5，-CAGATTGGTGGTGGTGGCGGAGGGAGCGGTGGAGGGGGCAGTGGCGGAG-3'F1-CVN5'-GGAGGGGGCAGTGGCGGAGGAGGTAGCCTTGGTAAATTCTCCCAG-3'R-CVN5'-AGAG04rCCTCATCATTCGTATTTCAGGGTAC-3，F-SUMO5'-CAGC4Z4rGCATCATCATCATC-3，R-SUMO5'-CTCCCTCCGCCACCACCACCAATCTGTTCTCTG-3'2、LCVN工程菌的摇瓶培养、蛋白纯化和纯度测定测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得工程菌BL21[pET3c-6His-SUMO-LCVN]，挑选单克隆进行培养并诱导表达，收集菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明BL21[pET3c-6His-SUMO-LCVN]阳性克隆菌株经诱导后会表达大小约为28kDa的融合蛋白，未诱导对照组在相应位置无肉眼可见表达，经超声破碎菌体后，发现融合蛋白位于上清中，为可溶性表达，经凝胶光密度扫描，可溶性目的蛋白占上清总蛋白的28.3±3.4%(图3)。选取高表达菌株接种到1L含氨苄青霉素(100mg/)的LB培养基中，37°C，180rpm培养至OD600:0.61.0时，降温至2(TC加IPTG至终浓度0.5mM诱导表达24h。4°C、6000xg、10min离心收集菌体，冻融一次，然后将菌体沉淀以l:IO比例重新悬浮于NTA-IObuffer,超声破碎(工作时间5s、间歇时间5s，99次，重复3遍)，4°C、25000xg、30min离心收集上清。上清液上样柱床体积为20ml的Ni-NTA亲和层析柱，流速0.6ml/min,NTA-0buffer洗回基线，流速为lml/min,NTA-20buffer洗杂蛋白，NTA-250buffer洗脱目的蛋白。纯化后的目的蛋白6His-SUMO-LCVN经SephadexG-25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。6His-SUMO-LCVN调整浓度至lmg/ml，加入lUSUMO蛋白酶/mg融合蛋白，30°C酶切lh。因6His-SUMO标签、SUMO蛋白酶均含有6xHis标签，酶切后的样品再次上样Ni-NTA亲和层柱进行纯化，除去带6His标签的SUMO、未酶切的6His-SUMO-LCVN和SUMO蛋白酶，得到非融合的目的蛋白LCVN，经G-25分子筛柱脱盐后冷冻干燥，得LCVN制品，供后续理化性质测定、活性测定或PEG修饰用。图3是工程菌BL21[pET3c-6His-SUMO-LCVN]经IPTG诱导后的蛋白表达图谱，可见经诱导后，在分子量28kD处出现明显增粗的蛋白带(泳道3)，与6His-SUMO-LCVN的理论分子量相符，超声破碎后，目的蛋白位于菌体破碎后的上清中，含量占菌体可溶性蛋白的40%(泳道2)。图4是SDS-PAGE分析LCVN纯化过程，其中+所示处为6His-SUMO-LCVN融合蛋白，**所示处为LCVN蛋白。图5是LCVN制品的反向高效液相色谱(RP-HPLC)纯度分析结果，株型是C-18反向柱，检测器波长为280nm，流动相A:含0.1%三氟乙酸(TFA)的超纯水，流动相B:乙氰，经40X-60X的B进行梯度洗脱，保留时间在4-6min之间出现LCVN的洗脱峰。3、LCVN工程菌的中试发酵和蛋白制备工程菌BL21[pET3c-6His-SUMO-LCVN]，挑选单克隆进行培养并在试管中诱导表达，选取高表达菌株进行中试发酵。分别在锥形瓶中培养一级和二级种子，培养二级种子至合适浓度，以10X接种量接种到15L的发酵培养基中。自动控制温度为37'C，适时调整转速和通气量以保持合适的溶氧水平，NaOH和HCl调节PH为7.07.2。当菌体密度(OD600)为12左右时，温度降至20'C，力nIPTG至终浓度0.5mM诱导表达20h。100ml/min，9000g，连续流离心收集菌体，15L的发酵培养基可以收获约550g的湿菌体，收集的菌体于-2(TC冰箱保存。菌体沉淀以l:IO比例悬浮于NTA-Obuffer,超声破碎(工作时间5s、间歇时间5s，99次，重复3遍)，4'C、25000xg、30min离心收集上清。柱床体积为20ml的Ni-NTA填料上样量为250ml上清，流速lml/min,NTA-0buffer洗回基线；流速为lml/min,NTA-20buffer洗杂蛋白，NTA-250buffer洗脱目的蛋白。纯化后的目的蛋白6His-SUMO-LCVN经SephadexG-25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。6His-SUMO-LCVN调整浓度至lmg/ml，加入lUSUMO蛋白酶/mg融合蛋白，3CTC酶切lh。因6His-SUMO标签、SUMO蛋白酶均含有6xffis标签，酶切后的样品再次上样Ni-NTA亲和层柱进行纯化，除去带6His标签的SUMO、未酶切的6His-SUMO-LCVN和SUMO蛋白酶，得到非融合的目的蛋白LCVN，经G-25分子筛柱更换缓冲液，再用截留量3KD的超滤管浓縮LCVN蛋白，供后续理化性质测定、活性测定或PEG修饰用。4、LCVN蛋白的PEG修饰对药用蛋白进行PEG修饰是改善其药代特性、稳定性和免疫原性等多种成药性质的有效方法。蛋白质可供PEG修饰的位点包括侧链氨基、N端氨基、侧链羧基、C端羧基、侧链巯基等多种。现有的羧基修饰技术容易产生非特异性交联反应，因此氨基修饰更为常用，技术发展也更为成熟。Zappe等的研究结果表明，对野生型CVN的侧链氨基或N端氨基的修饰都会破坏该蛋白的活性，因此，作者首先对CVN进行定点突变，获得Q62C突变体，然后对62位引入的Cys进行侧链巯基修饰，获得了有活性的蛋白。由于天然CVN中已有的4个Cys残基之间形成2对二硫键，并且在溶液中，蛋白质的二硫键处在动态异构和平衡状态，因此引入Q62C突变后，很难避免引入的Cys不干扰二硫键的正确搭配，或者非62位的Cys修饰，作者最后的实验结果也证明，CVNQ62C突变体及其修饰产物的活性均低于野生型CVN。由于本发明制备的LCVN末端引入了亲水柔性的15肽序列，因此可以尝试进行N端的定点氨基修饰。我们的实验结果证明，LCVN经N端定点氨基修饰后，不仅可以获得有活性的修饰产物，并且修饰产物的抗病毒活性进一步增强。对氨基的PEG修饰方法很多，可供选择的修饰剂也很多，本发明选择mPEG-ALD(10K)和mPEG-ALD(20K)作为修饰剂，从底物:修饰剂比例、修饰pH、修饰反应时间等3个方面，筛选了LCVN的最佳PEG修饰条件。选择pH为3.5，4.0，5.0，60，7.0，离子强度为20mM的Na-Ac缓冲液，反应体系中LCVN的浓度为5mg/ml，LCVN与mPEG-ALD(10K)的摩尔比分别选择为1:1，1:3，1:5;NaCNBH3的终浓度为5mg/ml。室温下，振荡器上摇动反应，在反应3h后取样，电泳鉴定修饰反应的效果。mPEG-ALD(10K)修饰LCVN的单修饰产物在SDS-PAGE上的表观分子量约30KD，SDS-PAGE分析结果表明，在pH4.0，LCVN与mPEG-ALD(10K)的摩尔比为1:3的条件下，单修饰率最高(图6)。10类似方法，研究mPEG-ALD(20K)修饰LCVN的最佳修饰pH和投料比。mPEG-ALD(20K)修饰LCVN后，单修饰产物在SDS-PAGE上的表观分子量约50KD，实验结果表明在pH5.0，LCVN与mPEG-ALD(20K)的摩尔比为1:1的条件下，单修饰率最高(图18)。在确定了最佳的修饰pH和投料比下，mPEG-ALD(10K)和mPEG-ALD(20K)修饰LCVN分别在反应lh、3h、5h、7h、9h、12h和24h取样，Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定最佳的反应时间。SDS-PAGE分析结果表明表明反应时间对mPEG-ALD(10K)和mPEG-ALD(20K)修饰LCVN的反应没有显著影响，综合考虑时间成本，优选最佳修饰反应时间为室温振荡反应2h(图IO和图11)。5、LCVN的PEG修饰产物的分离纯化LCVN经PEG-ALD修饰后，反应混合物中主要有未修饰的LCVN，剩余的PEG,PEG多修饰的LCVN，PEG单修饰的LCVN。采用AKTAprimeplus分离纯化系统，SPsepharose层析柱分离纯化单修饰的mPEG-ALD-LCVN，流动相为20mM的Na-Ac缓冲液(bufferA)，上样前先用5倍柱体积的bufferA平衡柱子，上样后收集穿透峰，然后用含有不同浓度NaCl的bufferA进行洗脱，收集各个洗脱峰。流速是lml/min，检测波长是280nm。收集到的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。mPEG-ALD(10K)修饰LCVN的混合物，经SPsepharose阳离子层析纯化之后，修饰剂mPEG-ALD和多修饰产物不与SPsepharose结合而被穿透，含有80mMNaCl的bufferA洗脱产物为单修饰的mPEG-ALD(1()K)-LCVN;含有400mMNaCl的bufferA洗脱产物是未修饰的LCVN。图12为mPEG-ALD(I()K)-LCVN分离纯化的洗脱曲线，峰1为修饰剂和多修饰产物，峰2为单修饰产物，峰3为未修饰底物。图13为SDS-PAGE分析各洗脱组份，泳道M为蛋白质分子量标准；泳道A为上样样品，可见未修饰底物、单修饰产物和多修饰产物；泳道l是穿透峰；泳道2是单修饰产物，也就是目的蛋白mPEG-ALD(u)K)-LCVN;泳道3为未修饰产物。mPEG-ALD(20K)修饰LCVN的混合物，经SPsepharose阳离子层析纯化之后，修饰剂mPEG-ALD和多修饰产物也存在于上样穿透峰中，含有70mMNaCl的bufferA洗脱产物为单修饰的mPEG-ALD(2GK)-LCVN;含有400mMNaCl的bufferA洗脱产物是未修饰的LCVN。图14为mPEG-ALD(2QK)-LCVN分离纯化的洗脱曲线，峰1为修饰剂和多修饰产物，峰2为单修饰产物，峰3为未修饰底物。图15为SDS-PAGE分析各洗脱组份，泳道M为蛋白质分子量标准；泳道A为上样样品，可见未修饰底物、单修饰产物和多修饰产物；泳道l是穿透峰；泳道2是单修饰产物，也就是目的蛋白mPEG-ALD(K)K)-LCVN;泳道3为400mMNaCl洗脱组份，可见未修饰产物，但也含有部分单修饰产物。应用实施例lWST法测定LCVN对T细胞的细胞毒性CVN、LCVN及PEG修饰产物以RPMI-1640培养液作5倍系列稀释，加至96孔细胞培养板中，每孔50pl，CVN和LCVN稀释范围为10吗/ml至0.04吗/ml，PEG修饰LCVN的稀释范围为5(Hig/ml至0.19pg/ml。MT-4细胞调整浓度至lxl05/ml，每孔10(^1，混匀，置37'C、5%C02细胞培养箱中培养，同时设细胞对照和阳性药物对照(63nM叠氮胸苷，AZT)，每个样品均平行测定3个复孔。4天后培养板中每孔加入10nlWST-l(水溶性四氮唑，5mmol/L)溶液，继续培养4小时，置读板仪上读取吸光值(A),波长450/650nm，计算细胞存活率(Relativepercentage,RP，％)，并根据RP计算50%毒性浓度(CC50)。细胞存活率(Relativepercentage,%)=药物处理组A值/细胞对照组A值x100。/。。图16是不同浓度CVN、LCVN及其修饰产物等4种蛋白处理MT-4后的细胞存活率，图中N.C.指未处理的细胞对照，以细胞对照的密度为100%。AZT为阳性对照药物，63nM叠氮胸苷。经计算后的50%毒性浓度如表2所示。表2LCVN及其PEG修饰产物的50%毒性浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>应用实施例2WST法测定LCVN的抗人类免疫缺陷病毒活性CVN、LCVN及PEG修饰产物以RPMI-1640培养液作5倍系列稀释，加至96孔细胞培养板中，每孔50nl。MT-4细胞调整浓度至lxl05/ml，每孔lOO^d,混匀，然后加入HIV-1/IIIB病毒悬液50pl，滴度为100TCID50。置37'C、5%C02细胞培养箱中培养，同时设细胞对照、病毒对照和阳性药物对照(叠氮胸苷，AZT),每个样品均平行测定3个复孔。4天后培养板中每孔加入10piWST-1(水溶性四氮唑，5mmol/L)溶液，继续培养4小时，置读板仪上读取吸光值(A)，波长450/650nm。细胞存活率(Relativepercentage,%)=药物处理组A值/细胞对照组A值x1000/。。病毒抑制率(％)=(药物处理组A450腳-病毒对照组A450/65G)/(细胞对照组A4遍50-病毒对照组A45歸0)xlOO%Reed-Muench法计算50%抑制浓度(IC50),并根据实施例x的50。/。毒性浓度(CC50)，并算选择指数(TI)，TI=CC50/IC50。由表3可以看出，对于阳性药物AZT而言，CVN、LCVN对HIV-1/IIIB增殖的抑制活性更强。表3CVN和LCVN对HIV-1/IIIB增殖的抑制活性SampleIC50(nM)_CC50(岸)_SIAZT36.55±5.64〉4.482122CVN21.83±2.790.160±0.0097.3LCVN14.17±6.430.658±0.27746.4应用实施例3融合抑制法测定LCVN及其PEG修饰产物的抗人类免疫缺陷病毒活性现有研究表明，HIV在T细胞之间的传播主要是通过感染细胞表面表达的gpl20的介导，而与未感染的细胞上的受体结合，形成融合细胞而发生。CVN可以特异性结合gpl20而抑制感染细胞与正常细胞之间的融合而阻断病毒的传播，因此，我们应用细胞融合抑制模型测定LCVN及其衍生物的抗病毒活性[TochikuraTS,NakashimaH,TanabeA,YamamotoN.Humanimmunodeficiencyvirus(HIV)-inducedcellfUsion:quantificationanditsapplicationforthesimpleandrapidscreeningofanti-HIVsubstancesinvitro.Virology,1988，164(2):542-546]。生长至对数期的MOLT-4细胞和MOLT-4/IIIB细胞调整密度至lxl06/ml，各取250^1细胞悬液，等体积混合，加至24孔细胞培养板中(细胞总数为5xl()S/50(Vl/孔)；CVN、LCVN及其PEG修饰产物以含胎牛血清和抗生素的RPMI-1640培养基作4倍系列稀释，每种受试药物选择3个浓度(452nM，113nM，28nM)，等体积加至细胞悬液中，同时设置各种对照组，所有样品平行2个复孔，37'C、5%C02培养24小时。24h后取细胞悬液，台盼蓝染色后充入细胞计数池，显微镜下计数存活的MOLT-4细胞数目。由于MOLT-4/IIIB细胞能不断产生HIV-I/niB病毒颗粒，并且通过与正常MOLT-4细胞的融合，形成大的多核细胞(合胞体)而感染正常宿主细胞，在细胞计数时，融合细胞无法进入计数池，因此，计数细胞计数池中正常大小MOLT-4或MOLT-4/IIIB细胞数，可以推算形成合胞体的细胞数目，比较给药共培养组的细胞数和未进行共培养组的MOLT-4细胞数，计算融合指数(FI，fusionindex)-13FI=1—(共培养细胞孔的细胞数+只含MOLT-4细胞的对照孔中的细胞数)比较给药共培养细胞和未给药共培养细胞的融合指数，计算融合抑制率(FIR，fusioninhibitionrate):FIR(%)=[l-(FIT/FIc)]xl00，其中FlT是给药样品的融合指数，FIc是未给药共培养细胞的融合指数。表4LCVN及其PEG修饰产物对细胞的融合抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4可以看出，LCVN对HIV-1/IIIB的融合抑制活性不论在何剂量组中，均明显高于CVN;另外，在中剂量和高剂量时，LCVN的PEG修饰产物的活性要高于未修饰的LCVN。图18(a)是相差显微镜下观察培养24h后的(l)MOLT-4细胞、(2)MOLT-4/IIIB细胞、(3)共培养后的细胞、(4)假处理的共培养后的细胞、(5-8)浓度为113nM的CVN/LCVN/10kPEG-LCVN/20kPEG-LCVN处理后的共培养细胞，黑色箭头所示处为融合的巨大细胞，可见未共培养组中无融合细胞，共培养组中出现典型融合细胞，而给药组基本看不到融合细胞。图18(b)是CNV、LCVN、10kPEG-LCVN、20kPEG-LCVN的融合抑制活性，所有实验至少是3次独立实验后的统计学处理结果。可见LCVN对HIV-1/IIIB的融合抑制活性不论在何剂量组中，均明显高于CVN;另外，在中剂量和高剂量时，LCVN的PEG修饰产物随着分子量的增大，活性逐步增强，但在低剂量组中，PEG修饰产物的活性随分子量增大而逐步降低。应用实施例4MTT法测定LCVN的抗单纯疱疹病毒(HSV-1)活性单纯疱疹病毒I型(HSV-I)是一种在人群中引起广泛感染的DNA病毒，人类是其唯一的宿主，健康成人中约有9(P/。感染HSV-1。HSV-I可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎、新生儿脑炎等多种疾病，由于HSV-I可在神经节内潜伏感染，故症状易复发。本实验用MTT法测定重组LCVN及其修饰产物、野生型CVN对Vero细胞的毒性；CPE法观察药物对细胞的活性。单层Vero细胞中，加入不同稀释度的受试药物和100TCID50的HSV-l病毒液各50ul，同时设正常细胞对照及病毒对照组。5%C02培养48h，每孔加入5mg/mlMTT10pl，5%<302继续培养4h，弃上清液，每孔加入200ialDMSO，室温避光放置30min，振摇培养板10min左右，酶标读数仪比色(波长570nm，参比波长630nm)，测定吸光度并计算样品的50%毒性浓度(50%cytotoxicconcentration,CC50)。图19是一次典型实验后细胞在相差显微镜下的形态，可见病毒对细胞所致的细胞病变效应，以及药物对细胞的保护效应。结果表明，LCVN及其修饰产物均具有良好的抗HSV-1活性，在质量浓度接近、摩尔浓度更低的条件下，LCVN及其PEG修饰产物表现出与阳性对照药物ACV基本接近的抗病毒活性。毒性测定结果表明，PEG修饰后的LCVN对Vero细胞的毒性也明显降低。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING〈110>暨南大学<120>—种蓝藻病毒蛋白N突变体、其修饰衍生物及应用<130>090831〈160〉11<170>Patentlnversion3.3<210>1〈211〉15<212>PRT〈213>人工序列<220><221>PEPTIDE<222>(1)..(15)<223>柔性连接肽(linker)<400>1GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer151015<210>2〈211〉101<212>PRT<213>人工序列〈220〉<221>PEPTIDE<222>(I)..(IOI)<223>CVN的氨基酸序列<400〉2LeuGlyLysPheSerGinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySer151015ValLeuThrSer20SerlieAspLeu35TrpGinProSer50GlySerSerGlu65ValSerThrLysThrl>euLysTyr100<210>3〈211>348<212>DNA<213>人工序列<220>〈221〉CDS〈222〉(l)..(348)<223>LCVN的编码核苷酸序列<400>3ggtggcggagggageggtggagggggcagtggcggaggaggtagectt48GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeu151015ggtaaattcteccagacctgctacaactecgetatecagggttctgtt96GlyLysPheSerGinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerVal202530ctgacctctacctgcgaacgtaccaacggtggttacaacacctectct144LeuThrSerThrCysGluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerThrCysGluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSer2530AsnSerVallieGluAsnValAspGlySerLeuLys4045AsnPhelieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAla5560LeuAlaAlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPhe707580lieAsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGly85恥95Glu35ategacctgaaclieAspLeuAsn50cagccgtctaacGinProSerAsn65tectctgaactgSerSerGluLeutctaccaaaateSerThrLyslie100ctgaaatacgaaLeuLysTyrGlu115<210>4<211>116<212>PRT<213>人工序列<400〉4GlyGlyGlyGly1GlyLysPheSer20LeuThrSerThr35lieAspLeuAsn50GinProSerAsn4045tecgttategaaaacgttgacggttctctgaaatgg192SerVallieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrp5560ttcategaaacctgccgtaacacccagctggetggt240PhelieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGly707580getgetgaatgcaaaacccgtgetcagcagttcgtt288AlaAlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPheVal859095aacctggacgaccacategetaacategacggtacc336AsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThr105110348SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeu51015GinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerVal2530CysGluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSer4045SerVallieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrp5560PhelieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGly18SerSerGluLeuSerThrLyslie100LeuLysTyrGlu115<210>5<211>669〈212〉DNA〈213〉人工序列<220>〈221〉CDS<222>(1)..(669)〈223〉pET3c-6His-SUMO-LCVN载体中编码His-SUMO-LCVN的核苷酸序列〈400〉5atgcatcatcatcatcatcacggcatgteggacteagaagtcaatcaaMetHisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGin151015gaagetaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacateGluAlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislie202530aatttaaaggtgtecgatggatctteagagatettcttc肌gateaaaAsnLeuLysValSerAspGlySerSerGluliePhePhe)LyslieLys35404533gaccsetccttt33g3Eiggctgatggaagcgttcget朋a3gaceigLysThrThrProLeuArgArgLeuMetGluAlaPheAlaLysArgGin505560ggtaaggaaatggactecttaagattcttgtacgacggtattagaatt707580AlaAlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPheVal859095AsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThr105110GlyLysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglie65707580caagetgatcagacccctgaagatttggacatggaggat犯cgatate288GinAlaAspGinThrProGluAspLeuAspMetGluAspAsnAsplie859095attgaggetcelc卿gaacagattggtggtggtggcggagggageggt336lieGluAlaHisArgGluGinlieGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGly100105110ggagggggcagtggcgga鹏ggtagecttggtaaattcteccagacc384GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeuGlyLysPheSerGinThr115120125tgctacaactecgetatecagggttctgttctgacctctacctgcgaa432CysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThrSerThrCysGlu130135140cgtacc犯cggtggttac犯cacctectctategacctgaactecgtt480ArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSerVal145150155160ategaaaacgttgacggttctctgaaatggcagccgtctaacttcate528lieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrpGinProSerAsnPhelie165170175gaaacctgccgtaacacccagctggetggttectctgaactggetget576GluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAlaAla180185190gaatgcaaaacccgtgetcagcagttcgtttctacc犯aateaacctg624GluCysLysThrArgAlaGinGinPheValSerThrLyslieAsnLeu195200205gacgaccacategetaacategacggtaccctgaaatacgaatga669AspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrLeuLysTyrGlu210215220<210〉6<211>222<212>PRT<213>人工序列<400〉6MetHisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGin151015GluAlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislie202530AsnLeuLysValSerAspGlySerSerGluliePhePheLyslieLys354045LysThrThrProLeuArgArgLeuMetGluAlaPheAlaLysArgGin505560GlyLysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglie65707580GinAlaAspGinThrProGluAspLeuAspMetGluAspAsnAsplie859095lieGluAlaHisArgGluGinlieGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGly100105110GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeuGlyLysPheSerGinThr115120125CysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThrSerThrCysGlu130135140ArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSerVal145150155160lieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrpGinProSerAsnPhelie165170175GluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAlaAla180185190GluCysLysThrArgAlaGinGinPheValSerThrLyslieAsnLeu195200205AspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrLeuLysTyrGlu210215220<210>7<211>45〈212〉丽<213>人工序列<220><221〉misc—feature<222>(l)..(45)<223〉引物F1-CVN<400>7ggagggggcagtggcggaggaggtagccttggtaaattctcccag45〈210〉8<211>49〈212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<222>(l)..(69)<223>引物F2-CVN<220><221>misc—feature<222>(l)..(49)<223>引物F-CVN<400>8cagattggtggtggtggcggagggagcggtgg鄉gggcagtggcggag49<210〉9<211>32<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<222>(l)..咖<223>引物R-CTN<400〉9agaggatcctcatcattcgtatttcagggtac32<210〉10<211〉22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<222>(l)..咖<223>引物F-SUM0<400>10cagcatatgcatcatcatcatc22<210>11<211>33<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<222>(l)..咖<223>引物R-SUM0<400>11ctccctccgccaccaccaccaatctgttctctg3权利要求1、一种蓝藻病毒蛋白N突变体，其特征在于其氨基酸序列由序列A和序列B组成，序列A位于序列B的N端，序列A如下述之一a.序列表中的SEQIDNO1；b.将序列表中的SEQIDNO1的氨基酸残基序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，其具有亲水柔性的特点；序列B如下述之一c.序列表中的SEQIDNO2；d.将序列表中的SEQIDNO2的氨基酸残基序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但不改变其N端的前三个残基，且其具有特异性地抗HIV病毒活性。2、权利要求1所述蓝藻病毒蛋白N突变体的编码核苷酸序列。3、根据权利要求2所述蓝藻病毒蛋白N突变体的编码核苷酸序列，其特征在于包括下述序列之一e.序列表中的SEQIDNO:3;f.在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNO:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。4、一种表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。5、一种宿主菌，其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。6、一种蓝藻病毒蛋白N突变体修饰衍生物，其特征在于是将权利要求1所述蓝藻病毒蛋白N突变体的N末端进行PEG修饰。7、根据权利要求6所述蓝藻病毒蛋白N突变体修饰衍生物，其特征在于所述PEG修饰的修饰剂使用单甲氧基醚PEG-丙醛。8、根据权利要求6所述蓝藻病毒蛋白N突变体修饰衍生物，其特征在于:所述mPEG-ALD的分子量为10KD-20KD。9、权利要求1所述蓝藻病毒蛋白N突变体在制备预防和/或治疗艾滋病的药物中的应用。10、权利要求6-8中任一项所述蓝藻病毒蛋白N突变体的修饰衍生物在制备预防和/或治疗艾滋病的药物中的应用。全文摘要本发明属于生物医药领域，具体涉及一种蓝藻病毒蛋白N突变体、其PEG修饰衍生物和它们在制药中的应用。本发明的蓝藻病毒蛋白N突变体由两段序列组成，一段是具有亲水柔性的连接肽，一段为蓝藻病毒蛋白N经过密码子优化的序列。本发明的蓝藻病毒蛋白N突变体经过PEG修饰成为得到衍生物。该突变体及其衍生物均显示了较好的抗HIV活性。具有应用于制备抗HIV或其他病毒微生物的药物的前景。文档编号C07K14/405GK101638435SQ20091019206公开日2010年2月3日申请日期2009年9月4日优先权日2009年9月4日发明者北里海雄,盛熊,王一飞,钱垂文,伟陈申请人:暨南大学