专利名称：一种血管紧张素I(AI,Angiotensin I)免疫原制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备血管 紧张素I免疫原的方法和制备该多克隆抗体的方法。
背景技术：
在研究高血压的发病机制中，现已确认肾素-血管紧张素系统(简称RAS)对调节 人体血压和水、电解质平衡，维持人体内环境的稳定起着十分重要的作用。血管紧张素原分子量大约在66000-110000之间，本身无直接生理作用，其氨基端 的14肽为肾素底物，在肾素作用下可将其肽链上第10位和第11位上两个亮氨酸之间的肽 键打断，脱去其后无活性作用的4个氨基酸而形成一种含10肽结构的血管紧张素I (简称 为Al)。AI通过AI转化酶的作用后，脱去肽链上羧基端的2个氨基酸，转换成具有强烈血 管收缩效应的升压物质——8肽结构的血管紧张素II (简称为All)。AI正常生理浓度下没有生理活性，若在血浆中浓度很高时，能刺激肾上腺髓质释 放儿茶酚胺，作用于脑中枢神经，引起周围血管收缩，使血压升高，还对钠、水的重吸收产生 影响。血管紧张素I和血管紧张素II都属于半抗原，必须与大分子载体蛋白连接制成免 疫原才能免疫动物诱发抗体产生。上海市高血压研究所选用不同的载体(兔血清白蛋白、 牛血清白蛋白、多聚赖氨酸、聚乙烯吡咯啶酮)经碳二亚胺(EDC)或戊二醛(GDA)为联接剂 制备了五种不同的血管紧张素II免疫原。免疫动物实验比较表明其中的血管紧张素II-戊 二醛-牛血清白蛋白效果满意。血管紧张素I分子量为1295. 69，可参考上述血管紧张素II免疫原的制备方法制 备血管紧张素I免疫原。但该方法制备的AII免疫原免疫动物后产生的抗体效价不够高， 用于放射免疫分析法尚可。现今非放射性固相免疫分析法应用更为广泛，对抗体的效价、亲 和力要求更高，因而需要更有效地诱发抗体产生的免疫原及免疫方法。
发明内容
本发明提供一种制备血管紧张素I免疫原的方法和制备该多克隆抗体的方法。本 发明采用的血兰蛋白来源于低等生物，异原性较强，能更有效地刺激兔子的免疫系统。采用 硼酸缓冲液比采用PB缓冲液制备的免疫原AI活性更高，产生的抗血清滴度也更高。以血 兰蛋白为载体蛋白，在硼酸缓冲体系中与AI连接制备的免疫原AI活性最高，产生的AI抗 血清工作滴度也最高。
具体实施例方式实施例DAI的氨基酸顺序为天门冬氨酸(Asp)-精氨酸(Arg)-颉氨酸(Val)-酪氨酸 (Tyr)-异亮氨酸(Ile)-组氨酸(His)-脯氨酸(Pro)-苯丙氨酸(Phe)-组氨酸(His)-亮 氨酸(Leu)同型双功能试剂戊二醛作为连接剂。戊二醛的两个醛基分别与AI和载体蛋白上的氨基形成SChiff碱，中间以五碳键的桥连接起来。反应式如下R-NH2+HC (CH2) 3CH+H2N"P — R-N = CH (CH2) 3CH = N-P2) AI与载体蛋白的连接选用BSA和血兰蛋白作为载体蛋白，戊二醛作为连接剂，按下述A、B、C三种方法与 AI连接(A)称取 IOmg BSA 和 5mg Al，溶解于 2mL 0. IM ρΗ7· 4ΡΒ 缓冲液。加入 1 %戊二醛 0. 5mL,室温搅拌1. 5h，加入0. 25mL IM甘氨酸，室温搅拌30min，用0. IM pH 7. 4PB缓冲液 充分透析；
(B)称取IOmg BSA和5mg Al，溶解于2mL 0. IM pH9. 0硼酸缓冲液。以下步骤同 (A)，用0. 05M pH 8. 4硼酸缓冲液充分透析；(C)称取IOmg血兰蛋白和12mg Al，溶解于2ml 0. IM pH 9. 0硼酸缓冲液。加入 0. 31%戊二醛lmL，室温搅拌2h，以下步骤同(A)，用0. 05M pH 8. 4硼酸缓冲液充分透析；3) AI抗血清制备将新西兰白兔分成三组，每组三只，分别用A、B、C三种AI免疫原与福氏完全佐剂 充分混勻后皮下多点进行免疫。两周后AI免疫原与福氏不完全佐剂充分混勻加强免疫，此 后间隔3-4周免疫一次，共免疫6次，用AI RIA试剂盒检验抗体滴度。
权利要求
1.一种血管紧张素I (Al，Angiotensin I)免疫原制备方法 步骤如下DAI的氨基酸顺序为天门冬氨酸(Asp)-精氨酸(Arg)-颉氨酸(Val)-酪氨酸 (Tyr)-异亮氨酸(Ile)-组氨酸(His)-脯氨酸(Pro)-苯丙氨酸(Phe)-组氨酸(His)-亮 氨酸(Leu)同型双功能试剂戊二醛作为连接剂，戊二醛的两个醛基分别与AI和载体蛋白上 的氨基形成schiff碱，中间以五碳键的桥连接起来，反应式如下 R-NH2+HC (CH2) 3CH+H2N-P — R-N = CH(CH2)3CH = N-P 2) AI与载体蛋白的连接选用BSA和血兰蛋白作为载体蛋白，戊二醛作为连接剂，按下面的方法与AI连接 称取IOmg BSA和5mg Al，溶解于2mL 0. IM pH7. 4的PB缓冲液，加入戊二醛0. 5mL， 室温搅拌1. 5小时，加入0. 25mL IM甘氨酸，室温搅拌30分钟，用0. IM pH 7. 4的PB缓冲 液充分透析。
2.如权利要求1所述的一种血管紧张素KALAngiotensinI)免疫原制备方法上述 与AI连接的方法可以替换为称取IOmg BSA和5mg Al，溶解于2mL 0. IM pH 9. 0的硼酸 缓冲液，加入1 %戊二醛0. 5mL,室温搅拌1. 5小时，加入0. 25mL IM甘氨酸，室温搅拌30分 钟，用0. 05M pH 8. 4硼酸缓冲液充分透析。
3.如权利要求1所述的一种血管紧张素KALAngiotensinI)免疫原制备方法上述 与AI连接的方法可以替换为称取IOmg血兰蛋白和12mg Al，溶解于^iil 0. IM pH 9. 0硼 酸缓冲液，加入0. 31%戊二醛lmL，室温搅拌2小时，加入0. 25mL IM甘氨酸，室温搅拌30 分钟，用0. 05M pH 8. 4硼酸缓冲液充分透析。
全文摘要
本发明涉及一种制备血管紧张素I免疫原的方法和制备该多克隆抗体的方法，采用硼酸缓冲液比采用PB缓冲液制备的免疫原AI活性更高，产生的抗血清滴度也更高，以血兰蛋白为载体蛋白，在硼酸缓冲体系中与AI连接制备的免疫原AI活性最高，产生的AI抗血清工作滴度也最高。
文档编号C07K14/795GK102093476SQ20091025047
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者于爽, 曾玲, 白云鹏 申请人:北京北方生物技术研究所