选择性外部位点抑制papp-a对igfbp-4的活性的制作方法

专利名称：选择性外部位点抑制papp-a对igfbp-4的活性的制作方法
选择性外部位点抑制PAPP-A对IGFBP-4的活性
本申请为2008年1月25日递交的美国临时专利申请序列号61/023，631和2008 年2月1日递交的临时专利申请61/025，545的非临时性版本，其在此整体引用作为参考。 美国临时专利申请序列号61/023，631和61/025，545或是本申请中引用的所有专利和非专 利参考文献也都在此整体引用作为参考。发明领域
本发明涉及一种或多种蛋白酶抑制剂，所述抑制剂通过攻击一个或多个底物结合 外部位点，会导致对于蛋白酶的两种或两种以上的生理底物的全面抑制或差异抑制。在一 个实施方式中，本发明具体涉及攻击PAPP-A的外部位点。
发明背景
胰岛素样生长因子(IGF-I和-II)是约70个残基的多肽，对细胞增殖、迁移和分 化具有自分泌和旁分泌作用。IGF结合到IGF-I受体(IGFR)上，但一系列6个结合蛋白 IGFBP-I到IGFBP-6，因为其对IGF-I和IGF-II的亲和力更高，能够将IGF从IGFR上收回。 然而，生物活性的IGF能够通过结合蛋白的蛋白水解切割从这样的复合物上释放出来，导 致产生对IGF亲和力减小的IGFBP片段。特异性的、限制性蛋白水解代表了 IGF活化的主 要机制。
许多不同的证据都表明，基质金属蛋白酶妊娠相关血浆蛋白-A((PAPP_A， pappalysin-1，EC 3. 4. 24. 79)在IGF系统中发挥作用。PAPP-A特异性地切割IGFBP-4和 IGFBP-5，从而释放游离IGF或是导致结合蛋白失活。PAPP-A基因敲除小鼠部分失聪，与野 生型同窝出生者相比，体重减少到60%。此表型与IGF-II基因敲除小鼠的表型类似，支持 了在早期胚胎发育中IGF-II的活性需要PAPP-A的活性来切除IGFBP-4，负责将IGF最终递 送到受体。出生后，PAPP-A和IGFBP-4表现为参与多种不同的细胞增殖过程，例如体内伤 口愈合、卵泡选择、移植、成肌细胞增殖和分化以及骨的形成。血管成形术后，血管平滑肌细 胞产生PAPP-A，这提示它促进内膜细胞增殖，并且它已被证明是一种急性冠状动脉综合征 的血清标志物，很可能是因为它在不稳定的动脉粥样硬化斑块中大量合成。
400kDa的PAPP-A有1547残基的2个亚基，并且属于金属蛋白酶的梅斯蛋白 (metzincin)超家族。一个未知功能的层粘连蛋白G-类模块位于蛋白水解结构域的N-端， 以及能使PAPP-A的结合到细胞表面的五个补体控制蛋白(CCP)模块位于亚基的C-末端 (图1)。此外，PAPP-A包含三个Linl2-Notch重复(LNR)模块，这是PAPP-A、其同源物 PAPP-A2以及Notch受体家族特有的。在PAPP-A和PAPP-A2中，两个LNR模块(LNR1和2) 插入到蛋白水解结构域中，而第三个(LNR3)位于CCP模块的C端(图1)。在PAPP-A 二聚 体中，LNR模块可能形三聚体形式，其中LNRl和2来源于一个亚基且LNR3来源于另一个亚 基。LNR功能下降使得PAPP-A无法切割IGFBP-4，而对IGFBP-5的切割不受影响。
IGF参与正常生理过程以及如癌症和心血管疾病等人类疾病，因此正在开发直接 抑制IGF信号传导的策略。然而，特异性地抑制促进增长的蛋白水解活性可能是一个有价 值的替代方法，特别是因为这样抑制IGF受体激活不会干预胰岛素的信号传导以及正常生理过程的其他方面。
抑制外部位点的理论与参与人类疾病的多种蛋白水解酶密切相关，尤其是多结构 域的蛋白酶例如大量的基质金属蛋白酶(MMP)以及相关酶。与直接攻击活化位点相比，通 过攻击底物结合的外部位点来进行抑制具有至少两个优点特异性和选择性。首先，针对外 部位点的抑制剂不会影响具有相似活性位点结构的其他相关蛋白酶的活性。其次，给定蛋 白酶对不同底物的酶切可能不使用同一外部位点，从而可以进行差异性的抑制。
本文包含通过攻击外部位点抑制蛋白水解的多个实施例。例如，用合成肽攻击胶 原结合结构域抑制MMP-2对I型明胶和IV型胶原的酶切；以及用合成肽攻击不同于β -APP 切割酶催化位点的底物结合区进行抑制。同样，也开发了针对凝血酶因子VIIa的多种外部 位点抑制剂，并且尽管特异性地针对这个蛋白酶，用这些抑制剂可以攻击它的全部生物底 物。因此，就我们所知，PAPP-A对IGFBP-4蛋白水解的抑制代表了通过攻击外部位点对一 个天然蛋白酶底物进行选择性抑制的第一个实施例。
发明简述
在一个实施方式中，本发明涉及如单克隆SCFv抗体等抗体的产生，所述抗体结合 到包含PAPP-A的LNR3的区域上，并且有效抑制IGFBP-4的蛋白水解，且对IGFBP-5的影响 较小。包含LNR3的区域代表了底物结合的外部位点，可以作为选择性蛋白水解抑制的攻击 位点。因此，在一个实施方式中，本发明涉及通过攻击外部位点差异性地抑制天然蛋白酶底 物。
在另一个实施方式中，本发明涉及包含以下序列或由以下序列构成的多肽SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 中任一个，或 SEQ ID NO =USEQID NO :2 和 SEQ ID NO 3中任一个的多肽片段，所述多肽或其片段能够结合到一个分子上，从而抑制多肽或其 片段的活性。
本发明还涉及与SEQ ID NO =USEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3有至少70%序列相 同性的 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2和 SEQ ID NO :3 的多肽变体，或是 SEQ ID NO =USEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的片段的多肽变体。
本发明还涉及一种能与如上所述的来源于PAPP-A的多肽相互作用的分子。
本发明的另一个方面涉及一种抗体或其结合片段，其特异性地结合到选自下组的 氨基酸序列上SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3，或是其天然存在的变体。
本发明还涉及一种包含以下序列或由以下序列构成的多肽SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6，或SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的结合片段，所述抗体或其片段能与PAPP-A的 外部位点相互作用。本发明还涉及SEQ ID NO :5或SEQ IDNO :6的变体。
此外，本发明还涉及一种包含以下序列或由以下序列构成的多肽SEQ IDNO :7、或 SEQ ID NO :7的结合片段，所述抗体或其片段能在外部位点之外与PAPP-A相互作用。本发 明还涉及SEQ ID NO 7的变体。
本发明的另一个优选实施方式涉及一种生产如上所述的多肽的方法，所述方法包 含下列步骤提供编码所述多肽的多核苷酸，并且在体外表达或在合适的宿主生物体内表 达所述多核苷酸，从而产生所述多肽。
本发明还涉及编码如上所述的任一种多肽或其变体的多核苷酸。另外，本发明涉 及能够在严格条件下与编码上述多肽或其片段的多核苷酸杂交的核苷酸序列。此外，本发35明涉及一种如上所述的核苷酸序列，其中编码多肽的所述多核苷酸的一部分能在严格条件 下与核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6和SEQ ID NO :7的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种包含外部位点SEQ ID NO 2的PAPP-A的片 段。
在又一个实施方式中，本发明涉及一种复合物，其包含一个带有一个PAPP-A外部 位点的多肽序列例如SEQ ID NO =USEQ ID N0:2和/或SEQ IDNO :3，以及一个带有对所述 外部位点亲和力的结合伴侣，其中，结合伴侣结合到外部位点会改变PAPP-A的活性。
另外，本发明涉及包含如上所述的一种或多种多核苷酸的表达载体，所述多核苷 酸任选地连接到控制所述多核苷酸在合适的宿主细胞中表达的调控序列上。
本发明的另一个方面涉及包含如上所述的一种或多种多核苷酸和/或如上所述 的表达载体的分离的重组或转基因宿主细胞。
本发明还涉及一种产生转基因哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包含下列步 骤提供编码一种或多种上述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述重组或转基因宿 主细胞中，并任选在所述重组或转基因宿主细胞中表达所述多核苷酸，从而形成能产生所 述多肽的重组或转基因宿主细胞。
此外，本发明涉及包含一种或多种上述多肽和/或一种或多种上述多核苷酸和/ 或上述载体的重组细菌宿主细胞
本发明还涉及一种产生重组细菌细胞的方法，所述方法包含下列步骤，提供一种 或多种编码一种或多种上述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述细菌细胞中，并且 任选地在所述细菌细胞中表达所述多核苷酸，从而形成能产生所述多肽的重组细菌细胞。
在又一个实施方式中，本发明涉及包含一种或多种上述多肽和/或一种或多种上 述多核苷酸和/或上述载体的重组酵母细胞。
本发明还涉及一种产生重组或转基因宿主细胞的方法，所述方法包含下列步骤 提供一种或多种编码一种或多种上述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述重组或转 基因宿主细胞中，并且任选地在所述重组或转基因宿主细胞中表达所述多核苷酸，从而形 成能产生所述多肽的重组或转基因宿主细胞。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及包含上述宿主细胞的转基因哺乳动物生物 体。
本发明还涉及一种产生重组酵母细胞的方法，所述方法包含下列步骤提供一种 或多种编码一种或多种上述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述酵母细胞中，并任 选在所述酵母细胞中表达所述多核苷酸，从而形成能产生所述多肽的重组酵母细胞。
本发明还涉及包含一种或多种上述多肽和/或一种或多种上述多核苷酸和/或上 述载体的重组真菌宿主细胞。
本发明还涉及一种产生重组真菌细胞的方法，所述方法包含下列步骤提供一种 或多种编码一种或多种上述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述真菌细胞中，并任 选在所述真菌细胞中表达所述多核苷酸，从而形成能产生所述多肽的重组真菌细胞。
此外，本发明涉及一种产生特异性针对PAPP-A的外部位点的来源于单克隆噬菌 体的scFv抗体的方法，所述方法包含下列步骤用所选噬菌体感染大肠杆菌，诱导培养物进行生产，并且纯化表达的蛋白。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及一种产生特异性针对一种或多种上述多肽 的多克隆抗体或其结合片段的方法，所述方法包含下列步骤在诱发抗体反应的条件下用 所述多肽免疫哺乳动物对象，鉴定与该多肽特异性结合的抗体，并且任选从所述哺乳动物 对象分离所述抗体或其结合片段。
本发明还涉及一种产生特异性针对一种或多种上述多肽的单克隆抗体的方法，所 述方法包含下列步骤在诱发抗体反应的条件下用所述多肽免疫哺乳动物对象，制备产生 特异性针对所述多肽的单克隆抗体的杂交瘤，并且鉴定特异性与该多肽结合的抗体。
本发明还涉及一种能被上述抗体识别的多肽。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及一种包含一种或多种上述多肽以及生理可 接受的运载体的组合物。
另外，本发明涉及一种包含一种或多种上述的多肽以及药学可接受的运载体、以 及任选地一种或多种附加生物活性药剂的药物组合物。
另外，本发明涉及一种包含一种或多种上述多肽以及一种或多种附加生物活性药 剂的药物组合物，所述附加生物活性药剂选自下组抗血小板药物，抗凝血剂，纤维蛋白溶 解剂，用于治疗心血管疾病的药物，用于治疗骨质疏松的药物，用于医疗的抗癌药物。
本发明还涉及一种包含一种或多种上述多肽或是上述的药物组合物，以及至少一 种附加组分的组合试剂盒，所述附加组分例如用于治疗一种或多种癌症.一种或多种心血 管疾病以及骨质疏松的药物。
本发明还涉及一种鉴别与一种或多种上述多肽结合伴侣的方法，所述方法包括提 取多肽并且分离所述结合伴侣的步骤。
在另一个实施方式中，本发明涉及用作药物的一种或多种上述多肽或是药物组合 物。
本发明还涉及一种用外部位点作用因子对有需要的个体进行治疗的方法，例如用 如PAC-I和/或PAC-2等PAPP-A外部位点作用因子来抑制一种或多种PAPP-A底物的蛋白 水解。
本发明还涉及通过攻击底物结合外部位点、全面抑制带有外部位点的蛋白酶的一 种或多种生理底物的外部位点作用因子。
本发明还涉及通过攻击底物结合外部位点、差异抑制带有外部位点的蛋白酶的一 种或多种生理底物的外部位点作用因子。
定义/缩写
PAPP-A 妊娠相关血浆蛋白-A。在本文中所有提到的PAPP-A也涉及本文中所述 的任何PAPP-A的变体。
PAC-I =PAPP-A外部位点抗体。在本文中所有提到的PAC-I也涉及本文中所述的 任何PACl的变体。
PAC2 =PAPP-A外部位点抗体。在本文中所有提到的PAC-2也涉及本文中所述的任 何PAC2的变体。
PAC5 =PAPP-A非外部位点抗体。在本文中所有提到的PAC5也涉及本文中所述的 任何PAC5的变体。37
如本发明所用，术语“处理”、“治疗”和“疗法”同等地指治愈性治疗、预防性或防护 性治疗以及改善性治疗。该术语包括获得有益的或者预期的生理结果的方法，该方法可以 在临床上建立。出于本发明的目的，有益的或者预期的临床效果包括但不限于，减轻症状， 疾病程度缓解，病情稳定(即不恶化)，延迟或减缓病情/症状的发展或恶化，病情或症状的 改善或缓解、以及(不论全部或部分)好转，这可以是能检测到的或是不能检测到的。如本 发明所用，术语“缓解”或其变体，是指与不给予本发明的组合物相比，生理病情或症状的程 度和/或非预期的表现减轻，和/或病情发展减缓或延长。
术语“二级预防”指在如心肌梗死、缺血性中风、心绞痛、外周动脉疾病等病理症状 初次发生后的预防性治疗，
“治疗效果”或“疗效”表现为如用术语“处理”和“治疗”定义界定的标准来检测，所 治疗的病情是否有变化。所治疗的病情的“变化”是指是否有至少5%的改善，优选为10% 的改善，更优选为至少25%，进一步更优选为至少50%，例如至少75%，以及最优选为至少 100%的改善。该变化基于个体中所治疗病情的严重程度的改善，或是在用本发明的生物活 性药剂或是生物活性药剂以及药物组合物治疗和不治疗的个体群之间病情改善的频率的 差异。
“生物活性药剂”的“药理学有效量”、“药学有效量”或“生理有效量”是指在本发 明所述的药物组合物中活性药剂的量，这是当给予这样的组合物时，在所治疗个体的血流 或是作用位点(如肺、胃系统、大肠系统、前列腺等)提供所需的活性药剂水平，以产生所预 期的生理应答。精确的量取决于许多因素，例如活性药剂、组合物的活性、所用的递送装置、 组合物的物理性质、目标患者的使用(即每天给药的次数)、患者的考量等等；并且可以由 本领域的技术人员基于本发明所提供的信息来确定。生物活性药剂的“有效量”可以在一 次给药中给予，或是将总共为有效量的量通过多次给药来给予，优选在M小时内。可以用 标准临床方法来确定合适的量和给药时间。应该理解，“有效量”可以是进行治疗的医护人 员和/或个人根据经验确定的，和/或个性化确定的(具体情况具体分析)。
如本发明所用，术语“提高”和“改善”有益的效果及其变体，是指相对安慰剂，生 物活性药剂的治疗效果，或是与给予不带有生物活性药物的本发明的药物组合物时正常获 得的效果相比，上述先进技术水平的药物治疗的治疗效果提高。“疗效提高”表示作为给予 生物活性药物的结果，获得治疗效果加快和/或强度和/或程度提高。它也包括受益于治 疗的时间延长。它也表示为与给予较高量的不含生物活性药剂的药物组合物相比，当与本 发明提供的生物活性药剂共同给药时，只需要较低量的药物组合物就能获得同样的益处和 /或效果。效果提高优选但不必需用于治疗一些急性症状，对于这些急性症状单独使用药 物组合物没有效果或者治疗效果不佳。当与单独给予药物组合物相比，本发明的生物活性 药剂与药物组合物共同给药，其治疗效果至少提高5 %，例如治疗效果提高10%时，实现了 疗效的提高。优选为提高至少25%，更优选至少50%，甚至更优选至少75%，最优选至少 100%。
如本发明所用，“共同给予”或“共同给药”生物活性药剂或是生物活性药剂和先进 技术水平的药物，指在某一个时间段内给予一种或多种本发明的生物活性药剂，或是给予 一种或多种本发明的生物活性药剂和先进技术水平的药物组合物。时间段优选少于72小 时，例如48小时，例如少于M小时，如少于12小时，例如少于6小时，例如少于3小时。然而，这些术语也表示生物活性药剂和治疗组合物一起给药。
术语“个体”指脊椎动物，哺乳动物中的特殊成员，并且包括但不限于家畜，如牛、 马、猪、羊、貂、狗、猫、小鼠、豚鼠、兔、大鼠等；运动动物，如马、小型马、狗、骆驼等；以及包 括人的灵长类动物等。
“多肽”为氨基酸残基的多聚物，优选全部用肽键连接，可以是天然产生的或合成 的。表达非宿主DNA分子产生的多肽为“异源”肽或多肽。如本发明所用，术语“多肽”涵 盖蛋白、肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以是经过或没经过翻译后修饰的。翻译后修 饰可为如磷酸化、甲基化和葡糖基化。
如本发明所用，术语“骨质疏松”是指表现为正常骨密度和弹性流失导致骨骼脆弱 的病症。
术语“如SEQ ID NO 1同源物”是指带有与如SEQ ID NO 1相似但不相同的序列 的多肽，因此它是包含或由例如SEQ ID NO :1或其片段构成的多肽。
术语“如SEQ ID NO 1的变体”是指带有与如SEQ ID NO 1相似但不相同的序列 的多肽，因此它是SEQ ID NO :1或其片段的多肽变体。变体多肽具有本发明的多肽进行修 饰的氨基酸序列。修饰包括改变了序列但不改变其生物活性的，如SEQ ID NO :1的多肽的 一个或多个氨基酸的一个或多个保守取代或一个或多个等效取代。
本发明还涉及多肽SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 5,SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7或其片段的变体，其中取代是由计算机分析设计的， 采用序列同源性来预测取代是否会影响蛋白功能。(如2001年5月《基因组研究》第11卷 第 5 册 963-874 页 Pauline C. Ng 和 Meven 的文章(Pauline C. Ng and Steven Henikoff, Genome Research, Vol. 11,Issue 5，863-874，May 2001))。
“分离的多肽”为基本从沾染的细胞组分中游离出来的多肽，所述细胞组分如碳水 化合物、脂类、或其它天然情况下与多肽结合的蛋白杂质等。代表性地，分离的多肽制剂包 含高度纯化形式的多肽、即纯度至少约80%、纯度至少约90%、纯度至少约95%、纯度大 于95%、或纯度大于99%。表明特定蛋白制剂包含分离的多肽的一种方法，是在蛋白制剂 的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及凝胶考马斯亮蓝染色后表现为单一条 带。然而，术语“分离的”并不排除存在任选物理形式的同一多肽，例如二聚体或任选的糖 基化或衍生化形式。
术语“直系同源物”表示来源于一个物种的多肽或蛋白，与来源于不同物种的多肽 或蛋白在功能上是等价的。直系同源物间的序列差异是物种差异的结果。
“旁系同源物”是一个生物体产生的截然不同但结构相关的蛋白。认为旁系同源物 是通过基因倍增产生的。例如，α-球蛋白，β-球蛋白和肌红蛋白互为旁系同源物。
如本发明所用，“核酸”或“核酸分子”指如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA) 等多核苷酸、寡核苷酸、由多聚酶链式反应(PCR)产生的片段、以及由连接、切断、内切酶作 用和外切酶作用中任一种产生的片段。核酸分子可以是由单体构成的，该单体是天然存在 的核苷酸(如DNA和RNA)、或天然存在的核苷酸类似物(如天然存在的核苷酸α -对映体 形式)，或两者的组合。修饰的核苷酸可以在糖基和/或嘌呤或嘧啶基团发生变化。糖基修 饰包括例如用卤素、烷基，羟基和叠氮基替换一个或多个羟基，或糖可以功能化为醚或酯。 此外，整个糖基部分可以被空间位阻和电荷相似的结构替换，如氮糖和碳环糖类似物。碱基部分修饰的例子包括烷基化嘌呤和嘧啶，酰化嘌呤或嘧啶或其他熟知的杂环取代。核酸单 体可以通过磷酸二酯键或该键的类似物来连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯，硫 代磷酸酯，硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯，苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等等。术 语“核酸分子”也包括所谓的“肽核酸”，其中包括天然存在的或修饰的核酸碱基连接到聚酰 胺主干上。核酸可以是单链或双链的。
术语“天然核苷酸”指四种脱氧核糖核苷酸dA、dG、dT和dC(DNA的成分)；以及四 种核糖核苷酸A、G、U和C(RNA的成分)中的任一种。每一个天然核苷酸包含或基本由一 个糖基(核糖或脱氧核糖)、一个磷酸基以及一个天然/标准碱基构成。天然核苷酸根据 熟知的碱基配对法则(沃森和克里克)结合到互补核苷酸上，其中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶 (T)或尿嘧啶(U)配对，且鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对，其中相应的碱基对是互补的、反平 行的核苷酸链的一部分。碱基配对导致预先确定且互补的核苷酸之间的特异性杂交。该碱 基配对是酶能催化与模板寡核苷酸互补的寡核苷酸合成的基础。在这个合成中，由模板寡 核苷酸引导结构单元(通常是A、T、U、C或G的核糖或脱氧核糖衍生物的三磷酸盐)，形成 一个具有正确的、互补的序列的互补寡核苷酸。互补序列对一个寡核苷酸序列的识别，是通 过相应的且相互作用的碱基形成碱基对来介导的。在自然界中，导致碱基配对的特定相互 作用是由这些碱基的尺寸和碱基的氢键供体和受体的模式来控制的。大嘌呤碱基(A或G) 与小嘧啶碱基(T、U或C)配对。此外，碱基之间的碱基对识别受到碱基之间形成氢键的影 响。在沃森-克里克碱基对的几何学中，一个六元环(天然寡核苷酸中的嘧啶)与一个环 系统平行，所述环系统由一个融合的六元环和一个五元环(天然寡核苷酸中的嘌呤)构成， 中间由一个氢键连接两个环原子，并且氢键的两侧连接了附加到每个环上的功能基团以及 与受体基团配对的供体基团。
“本发明所述的多核苷酸”或“本发明所述的核酸”是指编码“本发明所述的多肽” 的任意多核苷酸，包括本专利申请或基于本专利申请的权利要求的专利的权利要求列举的 任意多肽。
术语“核酸分子的互补物”是指与对照核苷酸序列相比，带有互补序列的反向核酸 分子。例如，5' ATGCACGGG 3'序列与 5' CCCGTGCAT 3'互补。
术语“简并核苷酸序列”表示与编码多肽的对照核酸分子相比，包含一个或多个简 并密码子的核苷酸序列。简并密码子包含不同的核苷酸三联密码子，但是编码相同的氨基 酸残基(即GAU和GAC三联密码子都编码Asp)
术语“结构基因”是指转录成信使RNA(mRNA)、然后翻译成特定多肽的特征氨基酸 序列的核酸分子。
“分离的核酸分子”为没有整合到生物体基因组DNA中的核酸分子。例如，从细胞 的基因组DNA中分离出来的编码生长因子的DNA分子为一个分离的核酸分子。独立核酸分 子的另一个例子为没有整合到生物体基因组中的化学合成的核酸分子。从特定物种分离的 核酸分子要比这个物种染色体上的完整DNA分子小。
“核酸分子建构物”为一种经过人工改造的单链或双链核酸分子，包含结合并且并 置了天然不存在的排列的核酸片段。
“线性DNA”表示带有游离5，和3，末端的非环状DNA分子。线性DNA可以通过酶 切或物理破坏从如质粒等封闭环状DNA分子制备。
“互补DNA(cDNA) ”为通过酶逆转录从mRNA模版形成的单链DNA分子。典型地，用 与mRNA的部分互补的引物起始逆转录。本领域的熟练技术人员也用术语“cDNA”指包含这 样的单链DNA分子及其互补DNA链的双链DNA分子。术语“cDNA”也指从RNA模板合成的 cDNA分子的克隆。
“启动子”指引导结构基因转录的核苷酸序列。典型地，启动子位于基因的5’ -非 编码区，靠近结构基因的转录起始位点。在用于起始转录的启动子内的序列元件通常具 有保守的核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点，TATA序列，CAAT序列， 分化特异性元件(DSE，McGehee等，Mol. Endocrinol. 7 :551 (199 )，环磷酸腺苷应答元件 (CRE)，血清应答元件(SRE, Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1 :47 (1990))，糖皮质激 素应答元件(GRE)，以及其它转录因子的结合位点，例如CRE/ATF(0' Reilly等，J.Biol. Chem. 267 19938 (1992)), AP2 (Ye 等，J. Biol. Chem. 269 :25728 (1994)), SPl,环磷酸腺苷 酸应答元件结合蛋白(CREB ；Loeken, Gene Expr. 3 :253 (1993))以及八聚体因子(通常参 见Watson等编的《基因分子生物学》(Molecular Biology of the Gene)第四版(本杰 明-卡明斯出版公司(The Benjamin/Cummings Publishing Company, he.)，1987)(，以及 Lemaigre和Rousseau, Biochem. J. 303 :1(1994))。如果启动子是一个诱导型启动子，那么 对诱导剂产生应答，转录速率上升。相反地，如果启动子是一个组成型启动子，转录速率不 被诱导剂调控。也有抑制型启动子。
“核心启动子”包含启动子功能的关键核苷酸序列，包括TATA框和转录起始位点。 根据这个定义，在缺少能提高活性或是提供组织特异性活性的特定序列时，核心启动子可 能有能检测到的活性，也可能检测不到活性。
“调控元件”是调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可以包含与专 用或是优选在特定细胞、组织或细胞器中激活转录的细胞因子结合的核苷酸序列。这些类 型的调控元件通常与“细胞特异性”、“组织特异性”或是“细胞器特异性”表达的基因相关。
“增强子”是一种能提高转录效率的调控元件，不受增强子相对于转录起始位点的 位置或方向的影响。
“异源DNA”指在给定宿主细胞中天然不存在的一种DNA分子或一群DNA分子。对 于特定宿主细胞为异源的DNA分子，可能含有来自宿主细胞物种的DNA (即内源性DNA)的， 只要该宿主DNA是与非宿主DNA (S卩外源DNA)相结合的。例如，带有一个编码多肽的非宿主 DNA片段连接到包含转录启动子的宿主DNA片段上的DNA分子，被认为是异源DNA分子。相 反，异源DNA分子可以包含与一个外源启动子相连的内源基因。作为另一个例子，如果DNA 分子导入到了缺乏野生型基因的突变细胞中，一个包含来源于野生型细胞的基因的DNA分 子，被认为是异源DNA。
“整合的基因元件”是插入宿主细胞染色体的一段DNA，然后通过人的操作将元件 导入到细胞中。在本发明中，整合的基因元件通常是来源于通过电转或其他技术导入细胞 的线性化质粒。整合的基因元件从最初的宿主细胞传递给了它的后代。
“克隆载体”是一种能在宿主细胞内自主复制的核酸分子，如质粒、粘粒或细菌噬 菌体。克隆载体通常包含一个或多个限制性内切酶识别位点，这些位点能允许以可确定的 方式插入核酸分子而不丧失载体的主要生物功能；以及一个编码适用于鉴别和选择转入了 克隆载体的细胞的标记物基因的核苷酸序列。标记物基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
“表达载体”是编码在宿主细胞内表达的基因的核酸分子。典型地，表达载体包含 一个转录启动子、一个基因和一个转录终止子。基因表达通常放在启动子的控制下，并且这 样的基因称为“操作性连接到”启动子上。同样地，如果调控元件调节核心启动子的活性， 调控元件和核心启动子是操作性连接的。
“重组宿主”是一种包含如克隆载体或表达载体等异源核酸分子的细胞。
“整合转化子”是异源DNA开始整合到细胞的基因组DNA上的重组宿主细胞。
术语“分泌信号序列”表示编码肽(分泌肽)的DNA序列，所述肽作为较大的多肽 的一个组分，引导较大的多肽通过合成多肽的细胞的分泌通路。在经分泌通路传递的过程 中，通常切割较大的多肽去除分泌肽。
如本发明所用，术语“剪接变体”表示从基因转录来的RNA的任选形式。剪接变异 是通过使用一个转录的RNA分子内或是比较少见的几个分开转录的RNA分子之间的任选剪 接位点而自然产生的，并且可能会导致从同一个基因转录出数个mRNA。剪接变体可编码带 有改变的氨基酸序列的多肽。本发明中术语剪接变体也表示从一个基因转录的mRNA的剪 接变体编码的多肽。
术语“互补物/抗互补物对”表示在合适条件下形成非共价结合的稳定配对的不 相同的部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或链霉亲和素)是互补物/抗互补物对的典 型成员。其他示例性的互补物/抗互补物对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或 表位)对、正义/反义多核苷酸对等等。当需要互补物/抗互补物对后续解离时，互补物/ 抗互补物对优选结合亲和力小于IO9MA
术语“在严格条件下杂交”根据1989年冷泉港实验室出版社出版的Sambrook 等的《分子克隆实验指南》的第1101-1104页(Sambrook et al.，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1. 101—1· 104) 3 ^fT 定义。优选地，在严格条件下杂交表示在50°C下用IX SSC^PO. 1% SDS洗涤1小时，优选 在55°C下，更优选在62°C且最优选在68°C，特定地在50°C下用0. 2 X SSC^PO. SDS洗涤 1小时，优选在下，更优选在62°C且最优选在68°C，然后观察到阳性杂交信号。在上述 洗涤条件下，能与如SEQ ID NO :1的核苷酸序列或是其在遗传密码的兼并性范围内相应的 核苷酸序列杂交的核苷酸序列也包含在本发明的范围内
在本发明中，术语“抗体”包括全抗体和任何抗原结合片段(即抗原结合部分)或 是其单链。“抗体”指包含相互用二硫键连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白， 或是其抗原结合部分。每个重链由一个重链可变区(本发明中缩写为Vh)和一个重链恒定 区(本发明中缩写为Ch)构成。每个轻链由一个轻链可变区(本发明中缩写为^和一个轻 链恒定区(本发明中缩写为CJ构成。V1^nt区还可进一步分成称为“互补决定区” (CDR) 的超变区，由称为“框架区”(FR)的更为保守的区域相间隔。每个Vh和八由3个CDR和4 个FR构成，从氨基端到羧基端按照下列序列排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重 链和轻链的可变区包含一个与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋 白结合到宿主组织或因子上，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的 第一组分(Clq)。
如本发明所用，术语抗体的“抗原结合部分”指能够特异性结合到抗原上的抗体的一个或多个片段。已经表明，可以通过全长抗体的片段来实现抗体的抗原结合功能。术语 抗体的“抗原结合部分”所包含的结合片段的例子包括(i)Fab片段，包含\、Vh、(^和Cm结 构域的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包含由铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二 价片段；(iii)Fd片段，包含Vh和Chi结构域；(iv)Fv片段，包含抗体单臂的Vl和Vh结构域； (ν) dAb片段，包含V1^构域；(vi)分离的互补决定区域(CDR)；以及(vii)任选通过合成的 接头连接的两个或多个独立的⑶R的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域\和Vh是由分 开的基因编码的，可以用重组方法将它们与合成的接头连接起来，使它们形成一个\和Vh 区域配对形成单价分子的蛋白单链(称为单链Fv(ScFv)；参见如Bird等.(1988) Science 242 :423-426 ；和 Huston 等.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。这样的单 链抗体也包含在术语抗体的“抗原结合部分”的范围内。又一个例子为结合结构域免疫球 蛋白融合蛋白，包含(i)融合到免疫球蛋白铰链区多肽上的结合结构域多肽；(ii)融合到 铰链区的免疫球蛋白重链CH2恒定区，以及(iii)融合到CH2恒定区的免疫球蛋白重链CH3 恒定区。结合结构域多肽可为重链可变区或轻链可变区。这些抗体片段可以用本领域技术 人员已知的常规技术获得，并可以用筛选完整抗体的相同方式来筛选这些片段。
“抗体片段”为抗体的一部分，例如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab等等。不管结构 如何，抗体片段同与完整抗体识别的相同抗原结合。例如，针对本发明所述多肽的单克隆抗 体片段结合到本发明所述的多肽的表位上。术语“抗体片段”也包括与特定抗原结合的合 成的或是基因工程化的多肽，例如包含重链和轻链可变区的多肽、包含重链和轻链可变区 的Fv片段、由肽接头连接重链和轻链可变区的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)、以及由 模拟超变区的氨基酸残基构成的最小识别单位。
术语“表位”指决定能与抗体特异性结合的蛋白决定部位。表位通常包含如氨基 酸或糖侧链等分子的化学活性的表面基团，并且通常有特定的三维结构特征以及特定的电 荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，前者的结合特性消失，而 后者的结合特性不变。
如本发明所用，术语“非连续表位”指由蛋白一级序列上的至少两个独立区域形成 的蛋白抗原上的构象表位。
“可检测标签”是指一种分子或原子，其能够偶联到抗体部分上产生能用于诊断的 分子。可检测标签的例子包括螯合剂、光活性剂、放射性同位素、荧光剂、顺磁性离子或其它 标记物部分。
与抗体片段相反，“未加修饰的抗体”是没有偶联到治疗剂上的完整抗体。未加 修饰的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及诸如嵌合抗体和人源化抗体等一些重组抗 体。
如本发明所用，术语“抗体组分”包括完整的抗体和抗体片段。
CDR(互补决定区)互补决定区是在抗原受体(如免疫球蛋白/抗体和T细胞受 体)蛋白的可变区中发现的短氨基酸序列，它与抗原互补，从而提供了受体对于特定抗原 的特异性。由于与免疫球蛋白和T细胞受体相关的大多数序列变化是在CDR中发现的，这 些区域有时也被称为超变结构域。
如本发明所用，术语“抑制”可以为完全抑制或是部分抑制。如本发明所用，“完全 抑制”指全部或者基本全部抑制，例如大于90%的抑制。“部分抑制”指比不完全抑制更少43的抑制，例如少于90%的抑制。
“目标多肽”或“目标肽”是包含至少一个表位且在靶细胞中表达的氨基酸序列，靶 细胞例如肿瘤细胞或带有传染性病原体抗原的细胞。T细胞识别了主要组织相容性复合物 分子递呈的对目标多肽或目标肽的肽表位，并且通常裂解靶细胞或招募其他免疫细胞来到 靶细胞的位点，从而杀死靶细胞。
“抗原性肽”为结合到主要组织相容性复合物分子上的肽，以形成被T细胞识别的 MHC-肽复合物，从而递呈到T细胞后诱导细胞毒性淋巴细胞应答。因此，抗原性肽能够与 合适的主要组织相容性复合物分子结合，并且诱导细胞毒性的T细胞应答，例如细胞裂解 或是释放出针对结合或表达该抗原的靶细胞的特定细胞因子。在抗原递呈细胞或是靶细胞 上，抗原性肽能够结合到I类或II类主要组织相容性复合物分子上。
“抗独特型抗体”是一种与免疫球蛋白的可变区结合的抗体。在本文中，抗独特型 抗体与抗体的可变区结合，并且从而抗独特型抗体模拟了如本发明所述多肽的一个表位。
术语“双特异性分子”指包括具有2种不同的结合特异性的任何药剂，如蛋白、肽、 或蛋白或肽复合物。例如，这种分子能与(a)细胞表面抗原及(b)效应细胞表面的Fc受体 相结合或是相互作用。术语“多特异性分子”或“异特异性分子”，指包括具有两种以上不同 结合特异性的任何药剂，如蛋白质、肽、或蛋白质或肽的复合物。例如，这种分子能与(a)细 胞表面抗原、及(b)效应细胞表面的Fc受体、以及(c)至少一个其它组分相结合或相互作 用。因此，本发明包括但不限于，针对PAPP-A和如效应细胞Fc受体等其它细胞表面抗原或 目标的双特异性、三特异性、四特异性或其它多特异性分子。
如本发明所用，如果抗体是采用人免疫球蛋白序列从系统中获得的，人抗体“来源 于”特定的胚系序列，如通过免疫带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或是通过在人免疫 球蛋白基因库中进行筛选，且其中选出的人抗体的氨基酸序列与胚系免疫球蛋白基因编码 的氨基酸序列至少90%相同，更优选至少95%相同，甚至更优选至少96%,97^^98%或 99%相同。典型地，与胚系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比，来源于特定人胚系序列 的人抗体表现出不多于10个氨基酸的差异，更优选不多于5个，或甚至更优选不多于4个、 3个、2个或1个氨基酸的差异。
如本发明所用，术语“人抗体”指带有来源于人胚系免疫球蛋白序列的可变区和恒 定区的抗体。本发明的人抗体可包含不是由人胚系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例 如通过体外随机突变或是位点特异性突变、或是体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本 发明所用，术语“人抗体”不包括来源于如小鼠等另一个哺乳动物物种胚系的CDR序列接入 人的编码框序列的抗体。
“人源化抗体”是小鼠的单克隆抗体互补决定区从小鼠免疫球蛋白的重和轻可变 链转入到了人可变结构域的重组蛋白。
如本发明所用，“重组人抗体”包括用重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗 体，例如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(如小鼠)或是其制备的杂交 瘤分离的抗体(如下文第一部分进一步描述)；(b)从如转染瘤等表达抗体的转化宿主细胞 分离的抗体；(c)从重组、组合的人抗体库中分离的抗体；以及(d)用包括人免疫球蛋白基 因序列与其它DNA序列剪接的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗 体带有从人胚系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在一些实施方式中，这些重组人抗体可以进行体外突变(或是当使用人Ig序列的转基因动物时，为体内体细胞突变)，因此 重组抗体的Vh和\区的氨基酸序列是人胚系Vh和\序列来源且相关的序列，可为在体内 人抗体胚系清单中天然不存在的
如本发明所用，“异种抗体”根据产生这样抗体的转基因非人生物来定义。这一术 语指带有与不包含转基因非人动物的生物体内的氨基酸序列或编码核酸序列相对应序列 的抗体，并且通常来源于转基因非人动物之外的物种。
如本发明所用，“分离的抗体”指基本不含有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗 体(例如特异性结合RAPP-A的分离的抗体基本不含有特异性结合除PAPP-A之外的抗原的 抗体)。与人PAPP-A的表位、异构体或变体特异性结合一个分离的抗体可以与如来源于其 它物种的其它相关抗原(如PAPP-A物种类似物)交叉反应。此外，分离的抗体可基本上不 含有其他细胞物质和/或化学品。在本发明的一个实施方式中，具有不同特异性的“分离 的”单克隆抗体组合可以在一个确定成分的组合物中混合。
如本发明所用，“特异性结合”指抗体结合到预先确定的抗原上。典型地，当基于 FACS中IC5tl值检测表观亲和力时，抗体结合亲和力Kd为约1(ΓΜ或更低，例如约IO-8M或更 低，例如约101或更低，例如约KTkiM或更低，例如约10_"Μ或更低；且结合到预先确定的 抗原的亲和力Kd要比它结合到除了预先确定的抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗 原(如BSA、酪蛋白)的亲和力低至少10倍，例如至少低100倍。
亲和力受体及其配体之间的结合强度，例如抗体与其抗原之间。
亲合力抗体与抗原的功能结合强度，与表位和抗原结合部位之间的反应亲和力 以及抗体和抗原的化学价都有关。
抗体种类根据他们的重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的种类。 免疫球蛋白有至少5个主要类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的一些类别可以进一步划 分成亚型(同种型)，例如IgG-1, IgG-2，IgG-3和IgG-4 ；IgA-I和IgA-2。对应于不同免 疫球蛋白家族的重链恒定区分别称为α、δ、ε、Y和μ。抗体的轻链也可根据它们恒定 区的氨基酸序列分为2个明显不同的类型中的一个称为κ和λ。免疫球蛋白不同类别 的亚基结构和三维构象是众所周知的。
抗体结合位点抗体结合位点是包含特异性与抗原结合(发生免疫反应)的重链 和轻链可变区和超变区的抗体分子的结构部分。术语各种形式的免疫反应表示带有抗原决 定部分的分子与如全抗体分子或其一部分等带有抗体结合位点的分子之间的特异性结合。 任选地，抗体结合位点也称为抗原结合位点。
嵌合抗体可变区来源于一种动物且恒定区来源于另一种动物的一种抗体。例如， 嵌合抗体可为带有来源于小鼠单克隆抗体的可变区和人的恒定区的抗体。
互补决定区或CDR:抗体V结构域内的区域，一起构成抗体识别和结合结构域。
恒定区或恒定结构域或C结构域恒定区为包含给定同种型中氨基酸序列的抗体 分子的结构部分，其可以包含保守取代。重链免疫球蛋白恒定区的例子为本领域已知的免 疫球蛋白分子部分如CH1、CH2、CH3、CH4和CH5。轻链免疫球蛋白恒定区的例子为本领域已 知的免疫球蛋白分子部分Q。
双功能抗体该术语指带有2个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段包含在同 一多肽链(VH-VL)中重链可变区(VH)连接到轻链可变区(VL)上。通过使用短到不允许同一链上两个结构域之间配对的接头，结构域只能与另一条链上的互补区配对并且产生2个 抗原结合位点。
Fv 包含Vh和\的双链抗体片段。
人抗体框架一个带有来源于人免疫球蛋白的抗原结合位点以及该分子的基本所 有剩余免疫球蛋白来源的部分的分子。
人源化的抗体框架一种分子，带有来源于非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位 点、而分子的一些或全部剩余免疫球蛋白部分来源于人免疫球蛋白。抗原结合位点可包括 融合到一个或多个人恒定区上的非人免疫球蛋白来源的完整可变区，或是一个或多个互补 决定区(CDR)接到可变区的合适人框架区。在一个人源化抗体中，CDR可来源于小鼠单克 隆抗体，而抗体其他区域来源于人。
亲和体一种重组免疫活性分子，选自由非抗体的蛋白Fc结合表面多样化组合构 成的文库，优选为58个残基的葡萄球菌蛋白A(SPA)
免疫球蛋白血清抗体，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。
免疫球蛋白同种型对于有不同H链的Ig的命名，称为IgG(IgG1^4)、IgM、 IgA(IgA1J)、sIgA、IgE、IgD。
词组“免疫学独特的”指能够区分两个多肽间的抗体特异性结合到一个多肽而不 特异性结合到另一个多肽上的能力。
各种语法形式的词组“单克隆抗体”是指只包含能与特定抗原免疫反应的一种抗 体结合位点的抗体分子群。因此，单克隆抗体通常表现出对与其发生免疫反应的任意抗原 的单一结合亲和力。单克隆抗体可包含带有多个抗体结合位点的抗体分子，每个位点对于 一个不同的抗原具有免疫特异性，例如双功能单克隆抗体。
“多克隆抗体”是识别特殊给定抗原的抗体分子的混合物，所以多克隆抗体可以识 别所述抗原内的不同表位。
单链抗体或scFv指包含一个或多个抗原结合位点的单个多肽。此外，尽管Fv片 段的H和L链是由分开的基因编码的，他们可以直接连接或通过肽间接地连接起来，例如 可以用重组的方法使用合成的接头使他们形成单个蛋白链(称为单链抗体，sAb, Bird等 1988Science 242 :423-426 ；以及 Huston 等.1988PNAS 85 :5879-5883)。这样的单链抗体 也包含在术语“抗体”内，并且可用作多特异性结合分子的设计和工程化改造中的结合决定 部位。
化合价术语“化合价”指一个多肽上潜在抗体结合位点即结合结构域的数量。多 肽可以是单价的，并且包含一个抗原结合位点；或者多肽可为二价的，且包含两个抗原结合 位点。此外，多肽可为四价的，并且包含四个抗原结合位点。每个抗原结合位点特异性地结 合一个抗原。当一个多肽包含一个以上的抗原结合位点时，每个抗原结合位点可以特异性 地结合相同的或不同的抗原。因此，一个多肽可以包含多个抗原结合位点，并且成为多价 的，并且一个多肽可以特异性的结合相同的或不同的抗原。
V-结构域可变结构域为包含形成抗原结合位点的氨基酸残基序列的抗体分子 的结构部分。轻链免疫球蛋白可变区的例子为本领域称为\的免疫球蛋白分子部分。
轻链可变结构域
VH:重链可变结构域
术语“变体基因”，是指编码如本发明所述多肽上带有修饰的氨基酸残基序列的多 肽的核酸分子。这些变体包括如本发明所述的基因的自然发生的多态性，以及包含如本发 明所述的多肽的氨基酸序列有保守氨基酸取代的合成基因。基因的其他变体形式为包含如 本发明所述的核苷酸序列的插入或缺失的核酸分子。通过确定基因是否能在严格条件下与 带有如本发明所述的多肽的核苷酸序列的核酸分子或是其互补物杂交，可以识别如本发明 所述的变体基因。
任选地，可以通过序列比较来识别变体基因。如果当排列最大程度对应时，如果 两个氨基酸序列的氨基酸残基是相同的，两个氨基酸序列具有“ 100 %氨基酸序列同一性”。 同样地，如果当排列最大程度对应时，如果两个核苷酸序列的核苷酸残基是相同的，两个 核苷酸序列具有“100%核苷酸序列同一性”可以用标准软件程序来进行序列比较，例如 DNASTAR公司(麦迪逊，威斯康星州)生产的LASERGENE生物信息学计算套件中包含的程 序。通过确定最佳排列比较两个核苷酸或氨基酸序列的其他方法是本领域技术人员所熟 知的(参见例如1997年ASM出版公司出版的Peruski和Peruski的《互联网和新生物学 基因组禾口分子研究的工具》(Peruski and Peruski，The Internet and the New Biology Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)) ；1997 年 CRC 出版 公司出版的mi等编的《基因生物技术方法》的123-155页的“信息高速公路和核酸和蛋 t^WMiW' (Wu et al. (eds. ), “ Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins, " in Methods in Gene Biotechnology, pages 123 151 (CRC Press, Inc. 1997))；以及1998年学术出版社出版的Bishop编的《人类基因组计算 指南》第 2 版(Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998))。确定序列同一性的特定方法在下文有述。
不管用于识别变体基因的特定方法，变体基因编码一个具有能特异性结合到抗 (本发明所述的多肽)抗体特性的多肽。
本发明所用术语“等位基因变体”指位于同一染色体位点的基因的两个或多个任 选形式。等位基因变异天然通过突变产生，并且导致种群的表型多态性。基因突变可为沉默 的(编码的多肽没有变化)或可编码带有改变的氨基酸序列的多肽。在本发明中术语“等 位基因变体”也指基因的等位基因变体编码的蛋白。
“氨基酸残基”为用肽键或不同于肽键的键连接的天然或非天然氨基酸残基。氨 基酸残基可为D型的或是L型的。氨基酸残基包含一个氨基末端(NH2)和一个羧基末端 (C00H)，两者中间用一个包含碳原子或是碳原子链的中间部分分隔开来，至少其中一个带 有至少一个侧链或功能基团。NH2指位于氨基酸或肽的氨基末端的氨基，且C00H指位于氨基 酸或肽的羧基末端的羧基。通称氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸。天然氨基酸的标准 命名法在 J. Biol. Chem.，243 :3552-59(1969)中列出，在 37C. F. R.，section 1. 822(b) (2) 中被采用，属于这组氨基酸列在了下文的表1中。非天然氨基酸为表1中没有列出的氨基 酸。非天然氨基酸的例子在37C. F. R. section 1.822(b) (4)中列出，这些都引入本发明作 为参考。同样，非天然氨基酸残基包括但不限于，修饰的氨基酸残基，L型氨基酸残基，以及 D型氨基酸残基的立体异构体。
符号氨基酸1个字母 3个字母YTyr酪氨酸GGly甘氨酸FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer丝氨酸IIle异亮氨酸LLeu亮氨酸TThr苏氨酸VVal缬氨酸PPro脯氨酸KLys赖氨酸HHis组氨酸QGln谷氨酰胺EGlu谷氨酸WTrp色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺CCys半胱氨酸
表1、天然氨基酸及其各自的代码
“等价氨基酸残基”指能够替换多肽中另一个氨基酸残基而基本不影响多肽的结 构和/或功能的氨基酸残基。因此，等价氨基酸具有相似的特性，例如侧链的蓬松度，侧链 极性(极性或非极性)、疏水性(疏水的或亲水的)、pH(酸性、中性或碱性)以及侧链碳原 子的组织(芳香族/脂肪族的)。因此，“等价氨基酸残基”也可视为“保守氨基酸取代”
在一个实施方式中，等价氨基酸分成下列种类1)HRK、2)DENQ、3)C、4)STPAG、5) MILV 禾口 6)FYW。
如本发明所用，术语“等价氨基酸取代”，指在一个实施方式中，一个氨基酸被如本 发明下面所列出的氨基酸组中的另一个氨基酸所取代
i)带有极性侧链的氨基酸(Asp，Glu, Lys, Arg, His, Asn，Gin, Ser, Thr, Tyr，和 Cys,)
ii)带有非极性侧链的氨基酸(Gly，Ala, Val, Leu, lie, Phe, Trp, Pro 和 Met)
iii)带有脂肪族侧链的氨基酸(Gly, Ala Val, Leu, lie)
iv)带有环状侧链的氨基酸(Phe，Tyr, Trp, His, Pro)
ν)带有芳香族侧链的氨基酸(Wie，Tyr，Trp)
vi)带有酸性侧链的氨基酸(Asp，Glu)
vii)带有碱性侧链的氨基酸(Lys，Arg, His)
viii)带有酰胺侧链的氨基酸(ASn，Gln)48
ix)带有羟基侧链的氨基酸Ger，Thr)
χ)带有含硫侧链的氨基酸(Cys，Met)，
xi)中性、弱疏水性的氨基酸(Pro, Ala, Gly，Ser，Thr)
xii)亲水酸性氨基酸(Gin, Asn, Glu, Asp)，以及
xiii)疏水氨基酸(Leu, lie, Val)
维恩图解是根据他们的特性对氨基酸进行分类的另一种方法 (Livingstone&Barton, CABI0S，9，745-756，1993)。在另一个优选实施方式中，一个或多个 氨基酸残基可被相同维恩图解分组中的另一个氨基酸取代。
术语“氨基端”和“羧基端”在本发明中用于表示多肽内的位置。当上下文允许时， 这些术语用于表示相对于多肽的特定序列或部分的距离或相对位置。例如，位于多肽内靠 近参照序列羧基端的一些序列位于靠近参照序列的羧基末端，但是不需要位于完整多肽的羧基端。
“融合蛋白”是通过包含至少2个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。 例如，融合蛋白可包含至少一部分如本发明所述的多肽融合到一个结合到亲和基质上的多 肽上。这样的融合蛋白提供了一种采用亲和层析分离大量如本发明所述的多肽的方法。
术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，对于结构基因，表达包括结构基因转 录成为mRNA，并且mRNA翻译成一个或多个多肽。
本发明中，术语“亲和标签”表示能结合到第二多肽上的一种多肽片段，提供了 对第二多肽的纯化或检测，或是提供了第二多肽结合到底物上的位点。理论上，用于抗体 或其他特异性结合剂的任何肽或蛋白可用作亲和标签。亲和标签包括多聚组氨酸束，蛋 白 A(Nilsson 等，EMBO J. 4 :1075(1985) ；Nilsson 等，Methods Enzymo 1. 198 :3(1991)), 谷胱甘肽巯基转移酶(Smith和Johnson，Gene 67 :31 (1988))，Glu-Glu亲和标签 (Grussenmeyer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :7952 (1985))，P 物质，FLAG 肽(Hopp 等， Biotechnology 6 1204 (1988))，链霉亲和素结合肽，或是其他抗原性表位或结合结构域。 通常参见 Ford 等，Protein Expression and Purification 2 :95 (1991)。可以从贸易供应 商(如法玛西亚生物技术公司，皮斯卡塔韦，新泽西州(Pharmacia Biotech, Piscataway, N. J))处获得编码亲和标签的DNA。
“胰岛素样生长因子”或IGF为与胰岛素序列高度相似的多肽。IGF是细胞用于与 其生理环境交流的复合物系统的一部分。这一复合物系统(通常称为“IGF轴”)包含两种 细胞表面受体(IGF1R和IGF2R)，两种配体(IGF-1和IGF-2)，6个高亲和力IGF结合蛋白 组成一个家族(IGFBP1-6)，以及相关的IGFBP降解酶，统称为蛋白酶。胰岛素样生长因子 1 (IGF-I)主要是肝脏分泌的，是生长激素(GH)刺激的结果。IGF-I对于正常的生理调节、 以及包括癌症等一些病理状态都起到了重要作用。IGF轴已被证实参与了促进细胞增殖作 用和抑制细胞死亡(凋亡)。胰岛素样生长因子2(IGF-2)被认为是一个早期发育所需的主 要生长因子，实现最大生长需要IGF-I的表达。而IGF-2可能主要在胚胎发挥作用，对如大 脑，肝脏和肾脏等器官的发育和功能也是必需的。
"IGF结合蛋白”或IGFBP,以复杂的方式帮助调节IGF的作用。这些包括通过防止 它结合到IGF-I受体上来抑制IGF作用，以及可能通过协助传递到受体或是提高IGF半衰 期来提高IGF的作用。目前，有6种已经鉴定的IGF结合蛋白(IGFBP1-6)。目前还有表明IGFBP除了能调节IGF外还具有其他功能的重要数据。
LNR :Linl2-Notch重复序列。PAPP-A包含三个LNR模块，这是PAPP-A、其同源物 PAPP-A2以及Notch受体家族特有的。在PAPP-A和PAPP-A2中，两个LNR模块(LNR1和2) 插入到蛋白水解结构域中，而第三个(LNR3)位于CCP模块的C端。在PAPP-A 二聚体中， LNR模块可能形成三聚体形式，其中LNRl和2来源于一个亚基且LNR3来源于另一个亚基。 LNR功能下降使得PAPP-A无法酶切IGFBP-4，而对IGFBP-5的酶切不受影响。
“补体系统”是一个帮助从生物体内清除病原的生化级联。它是大免疫系统的一个 部分，在个体的一生中不可修改并且也不会发生改变，因此它属于先天性免疫系统。但是， 它可以被适应性免疫系统招募并且发挥作用。补体系统由一些血液中发现的小蛋白构成， 通常作为无活性酶原进行循环。当被几种激发因子中的某一个激活后，系统中的蛋白酶切 割特定蛋白以释放细胞因子，并启动进一步切割的放大级联。这种活化级联最终结果是应 答急剧放大并且活化细胞杀伤性膜攻击复合物。超过20个蛋白和蛋白片段组成了补体系 统，包括血清蛋白，浆膜蛋白和细胞膜受体。
“补体控制蛋白”或CCP存在于细胞表面，并且参与补体系统的调控。这些调控因 子用于破坏转换酶的形成，转换酶是在活化级联早期形成的双分子复合物。他们存在于自 身表面，或是他们在外源颗粒的表面不存在，意味着当需要阻止宿主组织活化时，这些调控 因子在对所需位置(细菌、病毒、细胞碎片和抗体-抗原复合物)的补体攻击中起到了重要 作用。“补体活化调控因子(RAC) ”为术语CCP的同义词。
“酶联免疫吸附测试”或ELISA是主要在免疫学上用于检测样品中是否存在抗体或 抗原的一种生物化学技术。实施ELISA测试涉及至少一种对特定抗原具有特异性的抗体。 带有未知量抗原的样品固定在一种固体支持物上(通常是聚苯乙烯微孔板)，可为非特异 性地(通过表面吸附)或是特异性地(通过特异性针对同一抗原的另一个抗体捕获，在“三 明治"ELISA)。当抗原固定化后，加入检测抗体，从而形成一个带有抗原的复合物。该检测抗 体可以共价连接到酶上，也可以被本身生物偶联到一种酶上的第二抗体检测到。在每个步 骤之间，通常用温和去垢剂溶液洗涤，来去除非特异性结合的任何蛋白或抗体。最后一步洗 涤后，向板中加入酶底物进行显色，产生了指示在样品中抗原量的可见信号。较老的ELISA 采用显色底物，而较新的检测采用灵敏度要高得多的荧光底物。“酶免疫测定法”或EIA，是 ELISA的同义词。
MMP =基质金属蛋白酶，为锌依赖的内肽酶；其他家族成员为蛇毒蛋白酶，沙雷肽 酶和虾红素。MMP属于一个称为金属锌蛋白酶(metzincin)超家族的蛋白酶大家族。总体 来说，他们是能够降解全部种类的细胞外基质蛋白，也可以加工许多生物活性分子。已知它 们参与酶切细胞表面受体，释放细胞凋亡陪体(如Fas配体)，以及活化或去活化趋化因子。 也认为MMP在如细胞增殖、迁移(粘连/分散)、分化、血管生成、细胞凋亡和宿主防御等细 胞行为中发挥重要作用。
外部位点定义为‘在蛋白酶的催化核心之外的额外的底物结合位点’。促进MMP的 底物结合和后续切割的一种策略，是通过对不连续的底物结合结构域上的第二底物结合位 点、或是位于活化位点之外的较小的功能模块进行特异化。加入蛋白结合结构域和模块提 高了蛋白酶对于特定底物的亲和力，并且改变了 MMP催化结构域的主要功能的特异性，即 切割易于断裂的键。这些第二特异性位点被称为“胞外结构域”或“外部位点。一个结构域或模块可以表现出对相同或不同底物的多个结合位点。底物与外部位点相互作用会以多种 方式影响一个蛋白酶的行为。通过提供不受第一特异性亚位点影响的额外结合区域，外部 位点调节和扩大了 MMP的底物特异性范围。这些模块或结构域的底物结合特性的变化可以 改变MMP的底物偏好，并且作为MMP降解系统的一部分，可以增加蛋白酶降解特定底物的竞 争优势。这样，完善了蛋白酶的功能并且通常特异性更强或功效更强。底物结合往往是特 异化模块的主要功能。因此，模块设计的简单化是一个有吸引力的概念，向蛋白酶催化结构 域加入模块或结构域，产生了底物偏好的新的多样性。除了将底物束缚在酶上来加强酶切 之外，外部位点可能参与酶切前所必需的“底物准备”。例如，MMP对天然胶原底物的定位化 “解链”称为三重解旋酶活性。外部位点也可使酶攻击组织上的底物或是细胞相关底物。因 此，识别底物外部位点以及开发用于结合且封锁这些位点的特殊药物，提供了高度选择性 抗-MMP治疗的新途径，选择性地针对该MMP对特定底物的降解。这预示了一种副作用降低 的新型治疗方法。外部位点可以多种重要方式影响MMP的行为。首先，通过增加MMP对底 物的亲和力，外部位点可以高度有效地适应，使蛋白酶能攻击如组织上或细胞上的纤维等 底物大分子组合物。除了空间靶向MMP到底物，外部位点结合也用其他方式影响蛋白酶的 动力学性质。
由于标准分析方法的不精确性，多聚物的分子量和长度理解为近似值。当这个值 表示为“约为”X或“近似于”X，X的设定值应理解为精确到+/-20%，例如+/-10%，例如 +/-5% ο


图1、PAPP-A亚基的示意图
图2、多克隆抗体对PAPP-A蛋白水解活性的差异抑制。
图3、特异性针对PAPP-A的C末端的scFv抗体抑制对IGFBP-4的切割。
图4、IGFBP-4蛋白水解抑制剂部分抑制IGFBP-5的蛋白水解。
图5、PACl对合成的肽底物没有抑制活性。
图6、PA-IA对IGFBP-4和IGFBP-5的蛋白水解的不完全抑制。
图7、PAC-I没有抑制PAPP-A2的蛋白水解活性
图8、PACl和PAC2对PAPP-A的钙离子依赖表位的定位。
附图详述
图1、PAPP-A亚基的示意图
1547残基的PAPP-A亚基的已鉴定的蛋白模块包括一个N端层粘连蛋白G类模块 (LamG)、一个蛋白水解结构域(PD)、3个Linl2-N0tch重复模块(LNR1-3)，以及5个补体控 制蛋白模块(CCP1-5)。特别标出了用于免疫的(小鼠PAPP-A的1129-1545残基)和用于 噬菌体选择的(人PAPP-A的1133-1547残基)C段重组片段的位置。
图2、多克隆抗体对PAPP-A蛋白水解活性的差异抑制
A)在不存在(第1和3道)或存在(第2和4道)多克隆抗PAPP-A抗体(20 μ g/ mL)的条件下，放射性标记的168 -4或-5(101^)与人PAPP_A(0. InM) 一起孵育(37°C，1 小时)。可以在SDS-PAGE后用磷屏成像系统进行放射自显影，使得可以观察到蛋白水解酶 切。标出了完整底物(i)和共迁移酶切产物(c)的位置。B)代表1129-1545残基的小鼠PAPP-A的纯化C末端片段的考马斯亮兰染色的SDS-PAGE。蛋白在细胞中表达，并且 在后续步骤中用镍亲和层析和肝素亲和层析纯化。C)在不存在(第1和3道)或存在(第 2禾口 4道)如B所示产生的针对PAPP-A的C末端片段的多克隆鸡抗体(80 μ g/mL IgY)的 条件下，放射性标记的IGFBP-4或-5 (IOnM)被小鼠PAPP-A (0. InM)消化(37°C，1小时)。
图3、特异性针对PAPP-A的C末端的scFv抗体抑制对IGFBP-4的切割
A)在 PAC1(1. 5 μ M)存在下,用人 ΡΑΡΡ-Α (0. InM)切割 IGFBP-4 (IOnM)。酶切反应 在37°C孵育，并且如每道上方所示，在从0到60分钟间隔一段时间取出样品。用SDS-PAGE 后的放射自显影来观察酶切。在60分钟可以在切割产物(c)的位置看到一条微弱的条带。 B)如每道上方所示，在0-750nM PACl存在下，用小鼠PAPP-A (0. InM)切割I GFBP-4 (IOnM)， 37°C孵育1小时，。C)在不同浓度的PACl下，分析PAPP-A(0. InM)对IGFBP_4(10nM)的酶 切。用独立确定的相对起始速率对PACl的浓度作图。通过氨基酸分析(IGFBP-4和PAC1)或 ELISA (PAPP-A)来确定所有的浓度。假设存在竞争抑制，计算抑制常数(Ki = 1. 2nM士0. 1)。 D)显示PACl与固定化的人PAPP-A结合的传感图。纯化的PACl (0. 35,0. 7,1. 4,2. 8、5. 5和 IlnM)注射到芯片上37°C，120秒，然后解离300秒。采用1 1结合模型，基于全面拟合来 计算动力学参数:ka = 4. 36 X IOfiITV ;kd = 1. 09 X IO^s"1 ；Kd = 0. 25nM(X2 = 0. 23)。
图4、IGFBP-4蛋白水解抑制剂部分抑制IGFBP-5的蛋白水解。
A)比较PACl对PAPP-A酶切IGFBP-4和_5的影响。在不存在(第1和3道)或存 在(第2和4道)PACl QOnM)条件下，放射性标记的IGBP-4或-5 (IOnM)与人PAPP_A(0. InM) 一起孵育(37°C，1小时)。在SDS-PAGE后用放射自显影显示蛋白水解切割。B)在不同PACl 浓度下，分析PAPP-A (0. InM)对IGFBP-5 (IOnM)的酶切。用相对起始速率对PACl的浓度作 图。在饱和浓度的PACl下，PAPP-A对IGFBP-5的活性接近45%。根据数据拟合S型剂量 应答曲线。用氨基酸分析(IGFBP-5和PAC1)或ELISA(PAPP-A)确定所有的浓度。
图5、PACl对合成的肽底物没有抑制活性。
A)用人PAPP-A (5nM)切割来源于IGFBP-4的合成肽(5 μ M)。该肽得自荧光供体 /淬灭剂对，他允许通过蛋白水解切割肽后420nm发射光的提高来检测PAPP-A的活性。B) 在PACl(IyM)存在下，进行一个类似的实验。C)如图所示，在单抗PA-IA(0. 39-50nM)存在 下，PAPP-A(5nM)介导的对肽底物(10 μ M)的酶切的进程曲线。D)从进程曲线确定的相对 起始速率对单抗PA-IA的浓度作图。该图显示了单抗PA-IA对PAPP-A的紧密结 合有效抑制了肽的酶切，但是在饱和浓度的单抗PA-IA下，没有观察到完全抑制。
图6、PA-IA对IGFBP-4和IGFBP-5的蛋白水解的不完全抑制
Α)在不同浓度的单抗PA-IA下，分析人PAPP-A(0. InM)对IGFBP_4(10nM)的切割， 并且用相对起始速率对PA-IA作图。根据数据拟合S型剂量应答曲线。B)对IGFBP-5的类 似分析。
图7、PAC-I没有抑制PAPP-A2的蛋白水解活性
A.如每道上方所示，在0-750nM的PAC-I存在下，用小鼠PAPP-A(0. InM)切割 IGFBP-4(10nM)，37°C，l小时。B.如每道上方所示，在0_1500nM的PAC-I存在下，用人 PAPP-A2 (接近0. InM)切割IGFBP-5 (IOnM)，37°C，1小时。在SDS-PAGE后用放射自显影显 示蛋白水解切割。
图8、PACl和PAC2对PAPP-A的钙离子依赖表位的定位
A，用ELISA分析PACl与人PAPP-A/PAPP-A2嵌合体或是截短的人PAPP-A变体。用 开放框表示来源于PAPP-A的序列，用㈠表示没有结合或⑴表示结合。B，通过表面等离 子体共振显示PACl (175nM)对固定化的PAPP-A的结合。带有或者不带有EDTA (IOmM)的样 品注射(120秒)后进行解离(180秒)(实线)。虚线显示了在含有钙离子的电泳缓冲液 中细胞流重新平衡后PACl的结合，表明PAPP-A LNR3与钙离子可逆结合。C，PAC1、PAC2和 PAC5与PAPP-A LNR3突变体的结合，其中预测协助钙离子作用的残基Asp-1484、Asp-1499 和Asp-1502分别被丙氨酸取代，用ELISA分析。用(-)表示没有结合或(+)表示结合。用 作正对照的PAC5，结合到了位于CCPl的N端的PAPP-A的表位上。
发明详述
外部位点作用因子
在一个实施方式中，本发明涉及一种或多种外部位点作用因子(exosite interactor)。外部位点相互作用可为能与任何蛋白中的外部位点相互作用的任何物质。这 些相互作用可依赖于钙离子。在一个实施方式中，所述蛋白为酶。
一种或多种外部位点作用因子可为一种或多种外部位点拮抗剂和/或一种或多 种外部位点激动剂。相应地，一种或多种外部位点作用因子可为一种或多种外部位点抑制 剂和/或一种或多种外部位点激活剂。
在一个优选实施方式中，外部位点作用因子导致全面抑制对已知或未知底物的底 物蛋白水解。在另一个优选实施方式中，外部位点抑制剂导致抑制IGFBP-4的蛋白水解。在 又一个优选实施方式中，外部位点抑制剂导致激活了 IGF的释放。
本发明涉及一种或多种蛋白酶抑制剂，其通过攻击底物结合外部位点，导致对蛋 白酶的一种或多种生理底物的全面抑制。本发明还涉及一种或多种蛋白酶抑制剂，其通过 攻击底物的外部位点，导致对蛋白酶的两种或多种生理底物的差异抑制。
在一个实施方式中，一种或多种外部位点作用因子包含一种或多种抗体。
在一个实施方式中，一种或多种外部位点作用因子包含一种或多种小分子药物。
在又一个实施方式中，外部位点作用因子包含一种或多种蛋白。这一种或多种蛋 白可为合成蛋白和/或天然蛋白。在另一个实施方式中，外部位点作用因子包含一种或多 种多肽。这一种或多种多肽可为合成多肽和/或天然多肽。
本发明还涉及使用任何一种上述外部位点作用因子来作为药物。
本发明还涉及产生任何一种上述外部位点作用因子的方法。产生外部位点作用因 子的方法可包含下列一个或多个步骤1)PCR;2)克隆；3)产生质粒构建物，如包含标签的 质粒构建物；4)在如哺乳动物、细菌或酵母细胞中表达蛋白力)表达和纯化蛋白。
本发明还涉及识别外部位点和/或外部位点作用因子的方法。外部位点作用因子 可为外部位点激动剂或拮抗剂。在一个实施方式中，识别外部位点作用因子包含对半合成 的噬菌体文库的筛选。所选的文库可为噬菌体抗体/肽文库，以及适配体文库或是基于有 机化合物的文库。
本发明还涉及采用一种或多种外部位点作用因子来调控IGF释放(激活或抑制)。 此外，本发明还涉及用一种外部位点作用因子来调控IGFBP-4的蛋白水解(激活或抑制)。
在一个优选实施方式中，如本发明所述的外部位点作用因子分子量在 100-1，000, 000道尔顿的范围内，例如100-500道尔顿，例如500-1，000道尔顿，例如1，000--1，500道尔顿，例如1, 500-2, 000道尔顿，例如2，000-2，500道尔顿，例如2，500--3，000道尔顿，例如3, 000-3, 500道尔顿，例如3，500-4，000道尔顿，例如4，000-_4，500道尔顿，例如4，500-5, 000道尔顿，例如5，000-5，500道尔顿，例如5，500-_6，000道尔顿，例如6，000-6, 500道尔顿，例如6，500-7，000道尔顿，例如7，000-_7，500道尔顿，例如7，500-8，000道尔顿，例如8，000-8，500道尔顿，例如8，500-_9，000道尔顿，例如9000-9, 500道尔顿，例如9，500-10,000道尔顿，例如10，000-20, 000道尔顿，例如20，000-30, 000道尔顿，例如30，000-40, 000道尔顿，例如 40，000-50, 000道尔顿，例如50，000-60, 000道尔顿，例如60，000-70, 000道尔顿，例如 70，000-80, 000道尔顿，例如80，000-90, 000道尔顿，例如90，000-100, 000道尔顿，例如 100，000-150, 000 道尔顿，例如 150，000-200, 000 道尔顿，例如 200，000-250, 000 道尔顿， 例如 250，000-300, 000 道尔顿，例如 300，000-350, 000 道尔顿，例如 350，000-400, 000 道尔 顿，例如 400，000-450, 000 道尔顿，例如 450，000-500, 000 道尔顿，例如 500，000-550, 000 道尔顿，例如550, 000-600, 000道尔顿，例如600, 000-650, 000道尔顿，例如 650，000-700, 000 道尔顿，例如 700，000-750, 000 道尔顿，例如 750，000-800, 000 道尔顿， 例如 800，000-850, 000 道尔顿，例如 850，000-900, 000 道尔顿，例如 900，000-950, 000 道尔 顿，例如 950，000-1，000，000 道尔顿。
PAPP-A
本发明涉及包含PAPP-A的天然外部位点或如本发明所述的PAPP-A外部位点的任 意变体的PAPP-A蛋白或DNA序列。
人PAPP-A的序列称为SEQ ID NO :1。
人 PAPP-A 的序列(SEQ ID NO 1)为
EARGATEEPSPPSRALYFSGRGEQLRVLRADLELPRDAFT
LQVffLRAEGGQRSPAVITGLYDKCSYISRDRGffVVGIHTISDQDNKDPRYFFSLKTDRAR
QVTTINAHRSYLPGQffVYLAATYDGQFMKLYVNGAQVATSGEQVGGIFSPLTQKCKVLML
GGSALNHNYRGYIEHFSLffKVARTQREILSDMETHGAHTALPQLLLQENW DNVKHAffSPM
KDGSSPKVEFSNAHGFLLDTSLEPPLCGQTLCDNTEVIASYNQLSSFRQPKVVRYRVVNL
YEDDHKNPTVTREQVDFQHHQLAEAFKQYNISffELDVLEVSNSSLRRRLILANCDISKIG
DENCDPECNHTLTGHDGGDCRHLRHPAFVKKQHNGVCDMDCNYERFNFDGGECCDPEITN
VTQTCFDPDSPHRAYLDVNELKNILKLDGSTHLNIFFAKSSEEELAGVATWPffDKEALMH
LGGIVLNPSFYGMPGHTHTMIHEIGHSLGLYHVFRGISEIQSCSDPCMETEPSFETGDLC
NDTNPAPKHKSCGDPGPGNDTCGFHSFFNTPYNNFMSYADDDCTDSFTPNQVARMHCYLD
LVYQGffQPSRKPAPVALAPQVLGHTTDSVTLEffFPPIDGHFFERELGSACHLCLEGRILV
QYASNASSPMPCSPSGHWSPREAEGHPDVEQPCKSSVRTffSPNSAVNPHTVPPACPEPQG
CYLELEFLYPLVPESLTIffVTFVSTDffDSSGAVNDIKLLAVSGKNISLGPQNVFCDVPLT
IRLffDVGEEVYGIQIYTLDEHLEIDAAMLTSTADTPLCLQCKPLKYKVVRDPPLQMDVAS
ILHLNRKFVDMDLNLGSVYQYffVITISGTEESEPSPAVTYIHGRGYC⑶GIIQKDQGEQC
DDMNKINGDGCSLFCRQEVSFNCIDEPSRCYFHDGDGVCEEFEQKTSIKDCGVYTPQGFL
DQffASNASVSHQDQQCPGffVIIGQPAASQVCRTKVIDLSEGISQHAffYPCTISYPYSQLA
QTTFffLRAYFSQPMVAAAVIVHLVTDGTYYGDQKQETISVQLLDTKDQSHDLGLHVLSCR
NNPLIIPVVH DLSQPFYHSQ AVRVSFSSPL VAISGVALRS FDNFDPVTLS SCQRGETYSP
AEQSCVHFAC EKTDCPELAV ENASLNCSSS DRYHGAQCTV SCRTGYVLQI RRDDELIKSQ
TGPSVTVTCT EGKffNKQVAC EPVDCSIPDH HQVYAASFSC PEGTTFGSQC SFQCRHPAQL
KGNNSLLTCM EDGLffSFPEA LCELMCLAPP PVPNADLQTA RCRENKHKVG SFCKYKCKPG
YHVPGSSRKS KKRAFKTQCT QDGSffQEGAC VPVTCDPPPP KFHGLYQCTN GFQFNSECRI
KCEDSDASQG LGSNVIHCRK DGTffNGSFHV CQEMQGQCSV PNELNSNLKL QCPDGYAIGS
ECATSCLDHN SESIILPMNV TVRDIPHWLN PTRVERVVCT AGLKffYPHPA LIHCVKGCEP
FMGDNYCDAI NNRAFCNYDG GDCCTSTVKT KKVTPFPMSC DLQ⑶CACRD PQAQEHSRKD
LRGYSHG
SEQ ID NO=I的变体在本发明的其他地方有所描述。
在另一个实施方式中，本发明涉及LNR功能降低的PAPP-A。LNR功能性降低包括 LNR3功能降低。
本发明还涉及采用带有或不带任何上述PAPP-A外部位点序列变体的PAPP-A序列 来产生一种或多种抗体。
本发明还涉及采用带有或不带任何上述PAPP-A外部位点序列变体的PAPP-A序列 来产生一种或多种PAPP-A外部位点相互作用分子。
本发明还涉及采用PAPP-A序列和任何上述PAPP-A外部位点序列来产生一种或多 种能与PAPP-A外部位点相互作用的合成肽。
PAPP-A的外部位点
本发明涉及编码PAPP-A外部位点的DNA序列
本发明还涉及PAPP-A蛋白外部位点的蛋白序列。
人PAPP-A 外部位点称为 SEQ ID NO :2。SEQ ID NO 2 是 SEQ ID NO 1 的一部分， 人的PAPP-A外部位点序列(SEQ ID NO 2)为
1133TDCPELAV ENASLNCSSS DRYHGAQCTV SCRTGYVLQI RRDDELIKSQ
TGPSVTVTCT EGKffNKQVAC EPVDCSIPDH HQVYAASFSC PEGTTFGSQC SFQCRHPAQL
KGNNSLLTCM EDGLffSFPEA LCELMCLAPP PVPNADLQTA RCRENKHKVG SFCKYKCKPG
YHVPGSSRKS KKRAFKTQCT QDGSffQEGAC VPVTCDPPPP KFHGLYQCTN GFQFNSECRI
KCEDSDASQG LGSNVIHCRK DGTffNGSFHV CQEMQGQCSV PNELNSNLKL QCPDGYAIGS
ECATSCLDHN SESIILPMNV TVRDIPHWLN PTRVERVVCT AGLKffYPHPA LIHCVKGCEP
FMGDNYCDAI NNRAFCNYDG GDCCTSTVKT KKVTPFPMSC DLQ⑶CACRD PQAQEHSRKD
LRGYSHG 1547
根据Kristensen 等.(1994)，Biochemistry 33 :1592-8.进行编号(PMID 7508748)。
SEQ ID NO 2的变体在本文的其他部分有描述。
本发明还涉及采用PAPP-A外部位点序列和任何上述PAPP-A外部位点序列变体来 产生一种或多种抗体。
本发明还涉及采用PAPP-A外部位点序列和任何上述PAPP-A外部位点序列变体来 产生一种或多种PAPP-A外部位点相互作用分子。
本发明还涉及采用PAPP-A外部位点序列和任何上述PAPP-A外部位点序列变体来产生一种或多种能与PAPP-A外部位点相互作用的合成肽。
本发明还涉及包含SEQ ID NO 2的SEQ ID NO=I片段。该片段包含少于1547个 SEQ ID NO 1的连续氨基酸残基，例如少于1530个连续氨基酸残基，例如少于1510个连 续氨基酸残基，例如少于1490个连续氨基酸残基，例如少于1470个连续氨基酸残基，例如 少于1450个连续氨基酸残基，例如少于1430个连续氨基酸残基，例如少于1410个连续氨 基酸残基，例如少于1390个连续氨基酸残基，例如少于1370个连续氨基酸残基，例如少于 1350个连续氨基酸残基，例如少于1330个连续氨基酸残基，例如少于1310个连续氨基酸 残基，例如少于1290个连续氨基酸残基，例如少于1270个连续氨基酸残基，例如少于1250 个连续氨基酸残基，例如少于1230个连续氨基酸残基，例如少于1210个连续氨基酸残基， 例如少于1190个连续氨基酸残基，例如少于1170个连续氨基酸残基，例如少于1150个连 续氨基酸残基，例如少于1130个连续氨基酸残基，例如少于1110个连续氨基酸残基，例如 少于1090个连续氨基酸残基，例如少于1070个连续氨基酸残基，例如少于1050个连续氨 基酸残基，例如少于1030个连续氨基酸残基，例如少于1010个连续氨基酸残基，例如少于 990个连续氨基酸残基，例如少于970个连续氨基酸残基，例如少于950个连续氨基酸残 基，例如少于930个连续氨基酸残基，例如少于910个连续氨基酸残基，例如少于890个连 续氨基酸残基，例如少于870个连续氨基酸残基，例如少于850个连续氨基酸残基，例如少 于830个连续氨基酸残基，例如少于810个连续氨基酸残基，例如少于790个连续氨基酸残 基，例如少于770个连续氨基酸残基，例如少于750个连续氨基酸残基，例如少于730个连 续氨基酸残基，例如少于710个连续氨基酸残基，例如少于690个连续氨基酸残基，例如少 于670个连续氨基酸残基，例如少于650个连续氨基酸残基，例如少于630个连续氨基酸残 基，例如少于610个连续氨基酸残基，例如少于590个连续氨基酸残基，例如少于570个连 续氨基酸残基，例如少于550个连续氨基酸残基，例如少于530个连续氨基酸残基，例如少 于510个连续氨基酸残基，例如少于490个连续氨基酸残基，例如少于470个连续氨基酸残 基，例如少于450个连续氨基酸残基，例如少于430个连续氨基酸残基，例如少于410个连 续氨基酸残基，例如少于390个连续氨基酸残基，例如少于370个连续氨基酸残基，例如少 于350个连续氨基酸残基，例如少于330个连续氨基酸残基，例如少于310个连续氨基酸残 基，例如少于290个连续氨基酸残基，例如少于270个连续氨基酸残基，例如少于250个连 续氨基酸残基，例如少于230个连续氨基酸残基，例如少于210个连续氨基酸残基，例如少 于190个连续氨基酸残基，例如少于170个连续氨基酸残基，例如少于150个连续氨基酸残 基，例如少于130个连续氨基酸残基，例如少于110个连续氨基酸残基，例如少于90个连续 氨基酸残基，例如少于70个连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于30 个连续氨基酸残基。
PAPP-A外部位点作用因子
在一个实施方式中，本发明涉及一种或多种PAPP-A外部位点作用因子。PAPP-A外 部位点作用因子可为能与PAPP-A外部位点相互作用的任何物质。这种相互作用可依赖于 钙离子。
一种或多种PAPP-A外部位点作用因子可为一种或多种PAPP-A外部位点拮抗剂和 /或一种或多种PAPP-A外部位点激动剂。相应地，一种或多种PAPP-A外部位点作用因子可 为一种或多种PAPP-A外部位点抑制剂和/或一种或多种PAPP-A激活剂。
在一个优选实施方式中，PAPP-A外部位点抑制剂导致全面抑制对已知或未知底物 的底物蛋白水解。在另一个优选实施方式中，PAPP-A外部位点抑制剂导致对IGFBP-4蛋白 水解的抑制。在又一个优选实施方式中，外部位点抑制剂导致激活IGF的释放。
本发明还涉及一种或多种PAPP-A外部位点抑制剂，其通过攻击底物结合的 PAPP-A外部位点，导致全面抑制PAPP-A的一种或多种生理底物。本发明还涉及一种或多 种PAPP-A外部位点抑制剂，其通过攻击底物结合的PAPP-A外部位点，导致对PAPP-A的两 种或多种生理底物的差异抑制。
在一个实施方式中，一种或多种PAPP-A外部位点作用因子包含一种或多种抗体。 一种或多种抗体可对PAPP-A有抑制或激活作用。
在一个实施方式中，一种或多种PAPP-A外部位点作用因子包含一种或多种小分 子药物。
在一个实施方式中，一种或多种PAPP-A外部位点作用因子包含一种或多种抗体 或其片段。
在又一个实施方式中，PAPP-A外部位点作用因子包含一种或多种蛋白。一种或多 种蛋白可为合成蛋白和/或天然蛋白。在另一个实施方式中，PAPP-A外部位点作用因子包 含一种或多种肽。一种或多种肽可为合成肽和/或天然肽。
在一个优选实施方式中，PAPP-A外部位点作用因子导致部分或全部抑制PAPP-A 对已知或未知底物的活性。在另一个优选实施方式中，PAPP-A外部位点作用因子导致抑制 PAPP-A对其底物IGFBP-4的活性。在又一个优选实施方式中，PAPP-A外部位点作用因子导 致抑制了 PAPP-A对IGFBP-4的活性(全面抑制)，并且较少程度地抑制对IGFBP-5的活性 (部分抑制)。
本发明还涉及采用任何上述PAPP-A外部位点作用因子作为药物。
本发明还涉及产生上述PAPP-A外部位点作用因子的方法。该产生PAPP-A外部位 点作用因子的方法可包含一个或多个下列步骤1)PCR;2)克隆；3)产生质粒构建物，如包 含标签的质粒构建物；4)在如哺乳动物、细菌或酵母细胞中表达蛋白力)表达和纯化蛋白。
本发明还涉及识别PAPP-A外部位点和/或PAPP-A外部位点作用因子的方法。 PAPP-A外部位点作用因子可为外部位点激动剂或拮抗剂。在一个实施方式中，识别外部位 点作用因子包含对半合成的噬菌体文库的筛选。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种调控PAPP-A活性的方法，例如抑制或激活 PAPP-A。本发明还涉及调控PAPP-A的产生，例如通过使用miRNA (微小RNA)或siRNA(小 分子干扰RNA)。
在一个优选实施方式中，如本发明所述的PAPP-A外部位点作用因子分子 量在100-1，000, 000道尔顿的范围内，例如100-500道尔顿，例如500-1，000道尔 顿，例如1，000-1，500道尔顿，例如1，500-2，000道尔顿，例如2，000-2，500道尔顿， 例如2，500-3，000道尔顿，例如3，000-3，500道尔顿，例如3，500-4，000道尔顿，例 如4，000-4，500道尔顿，例如4，500-5，000道尔顿，例如5，000-5，500道尔顿，例 如5，500-6，000道尔顿，例如6，000-6，500道尔顿，例如6，500-7，000道尔顿，例 如7，000-7，500道尔顿，例如7，500-8，000道尔顿，例如8，000-8，500道尔顿，例 如8，500-9，000道尔顿，例如9，000-9，500道尔顿，例如9，500—10，000道尔顿，例如10，000-20, 000道尔顿，例如20，000-30, 000道尔顿，例如30，000-40, 000道尔顿，例如 40，000-50, 000道尔顿，例如50，000-60, 000道尔顿，例如60，000-70, 000道尔顿，例如 70，000-80, 000道尔顿，例如80，000-90, 000道尔顿，例如90，000-100, 000道尔顿，例如 100，000-150, 000 道尔顿，例如 150，000-200, 000 道尔顿，例如 200，000-250, 000 道尔顿， 例如 250，000-300, 000 道尔顿，例如 300，000-350, 000 道尔顿，例如 350，000-400, 000 道尔 顿，例如 400，000-450, 000 道尔顿，例如 450，000-500, 000 道尔顿，例如 500，000-550, 000 道尔顿，例如550, 000-600, 000道尔顿，例如600, 000-650, 000道尔顿，例如 650，000-700, 000 道尔顿，例如 700，000-750, 000 道尔顿，例如 750，000-800, 000 道尔顿， 例如 800，000-850, 000 道尔顿，例如 850，000-900, 000 道尔顿，例如 900，000-950, 000 道尔 顿，例如 950，000-1，000，000 道尔顿。
在又一个实施方式中，本发明涉及一种包含一个如SEQ ID NO :1、SEQ IDNO 2和/或SEQ ID NO :3等含有PAPP-A外部位点的多肽序列，以及一个带有对所述外部 位点亲和力的结合伴侣的复合物，其中结合伴侣结合到外部位点，改变了 PAPP-A的活 性。在一个优选实施方式中，结合伴侣的分子量在100-1，000，000道尔顿的范围内，例 如100-500道尔顿，例如500-1，000道尔顿，例如1，000-1，500道尔顿，例如1，500-2，000 道尔顿，例如2，000-2，500道尔顿，例如2，500-3，000道尔顿，例如3，000-3，500道 尔顿，例如3，500-4，000道尔顿，例如4，000-4，500道尔顿，例如4，500-5，000道尔 顿，例如5，000-5，500道尔顿，例如5，500-6，000道尔顿，例如6，000-6，500道尔顿， 例如6，500-7，000道尔顿，例如7，000-7，500道尔顿，例如7，500-8，000道尔顿，例 如8，000-8，500道尔顿，例如8，500-9，000道尔顿，例如9，000-9，500道尔顿，例如 9，500-10, 000道尔顿，例如10，000-20, 000道尔顿，例如20，000-30, 000道尔顿，例如 30，000-40, 000道尔顿，例如40，000-50, 000道尔顿，例如50，000-60, 000道尔顿，例如 60，000-70, 000道尔顿，例如70，000-80, 000道尔顿，例如80，000-90, 000道尔顿，例如 90，000-100, 000 道尔顿，例如 100，000-150, 000 道尔顿，例如 150，000-200, 000 道尔顿，例 如 200，000-250, 000 道尔顿，例如 250，000-300, 000 道尔顿，例如 300，000-350, 000 道尔 顿，例如 350，000-400, 000 道尔顿，例如 400，000-450, 000 道尔顿，例如 450，000-500, 000 道尔顿，例如500, 000-550, 000道尔顿，例如550, 000-600, 000道尔顿，例如 600，000-650, 000 道尔顿，例如 650，000-700, 000 道尔顿，例如 700，000-750, 000 道尔顿， 例如 750，000-800, 000 道尔顿，例如 800，000-850, 000 道尔顿，例如 850，000-900, 000 道尔 顿，例如 900，000-950，000 道尔顿，例如 950，000-1，000，000 道尔顿。
与PAPP-A外部位点相互作用的小分子药物
本发明涉及一种或多种能与PAPP-A外部位点相互作用的小分子药物。在一个实 施方式中，小分子药物针对包含LNR3的PAPP-A的C端部分。C端部分显示在图1中，包含 CCP1-5和LNR3。这些都包括在SEQ ID NO :2中。
在一个实施方式中，小分子药物针对PAPP-A的LNR3。在另一个实施方式中，小分 子药物与PAPP-A的外部位点(SEQ ID NO 2)或是本文其他部分所述的它的任何变体相互 作用。这些相互作用可依赖于钙离子。
本发明还涉及开发一种或多种小分子药物的方法，所述小分子药物与PAPP-A的 外部位点(SEQ ID NO :2)、或是本文其他部分所述的它的任何变体、或是PAPP-A的LNR3、或是PAPP-A的另一片段相互作用。这一方法可以包含选择需要钙离子存在的相互作用对象。
本发明也涉及使用一种或多种小分子药物来作为药物，所述小分子药物与PAPP-A 的外部位点(SEQ ID NO :2)、或是本文其他部分所述的它的任何变体、或是PAPP-A的LNR3、 或是PAPP-A的另一片段相互作用。
本发明还涉及选择PAPP-A、PAPP-A外部位点和/或PAPP-A上的PACl和PAC2表位 的结合剂。在一个实施方式中，获取如抑制剂等PAPP-A作用因子的筛选策略基于破坏钙离 子结合的特异性洗脱。在一个优选实施方式中，PAPP-A的C端片段可以直接或通过PAPP-A 特异性抗体进行固定化。然后可以将化合物的组合文库经过固定化的PAPP-A，然后彻底洗 涤。通过加入EDTA或其他钙离子结合化合物，破坏如LNR3模块的结构或该模块的钙离子 结合，可洗脱结合的化合物。特异性洗脱可允许选择对PAPP-A的特定区域的结合剂。
筛选文库可为噬菌体抗体/肽文库，以及适配体文库或是基于有机化合物的文 库。这一筛选策略还可用于识别小分子药物或是任何其他PAPP-A外部位点作用因子。
“小分子”如本发明所用，术语“小分子”指天然存在的或人工产生(如通过化学 合成)的分子量相对低的分子。通常，小分子为单体，并且他们优选分子量小于约1500克 /摩尔。优选的小分子是具有生物活性的，他们在动物中产生局部或系统性效果，优选为哺 乳动物，更优选为人。在一些优选实施方式中，小分子为药物。优选但不是必需地，药物为 已经被合适的政府机构或组织认为是使用安全有效的。例如在FDA的21 C.F.R的第330.5 章、第331-361章以及第440-460章列出的人用药物，或是FDA的21C. F. R第500-589章中 列出的兽用药物，引入本发明作为参考，都被认为是可以用于根据本发明进行使用。
在一个优选实施方式中，与PAPP-A的外部位点(SEQ ID NO 2)、或是本文其他部 分所述的它的任一变体、或是PAPP-A的LNR3、或是本发明的PAPP-A的另一个片段相互作 用的小分子，其分子量在在10-10，000道尔顿的范围内，例如10-50道尔顿，例如50-100道 尔顿，例如100-150道尔顿，例如150-200道尔顿，例如200-250道尔顿，例如250-300道尔 顿,例如300-350道尔顿，例如350-400道尔顿，例如400-450道尔顿，例如450-500道尔顿， 例如500-550道尔顿，例如550-600道尔顿，例如600-650道尔顿，例如650-700道尔顿， 例如700-750道尔顿，例如750-800道尔顿，例如800-850道尔顿，例如850-900道尔顿，例 如900-950道尔顿，例如950-1，000道尔顿，例如1，000-2，000道尔顿，例如2，000-3，000 道尔顿，例如3，000-4, 000道尔顿，例如4，000-5, 000道尔顿，例如5，000-6, 000道尔顿， 例如6，000-7, 000道尔顿，例如7，000-8, 000道尔顿，例如8，000-9, 000道尔顿，例如 9，000-10，000 道尔顿。
特异性的PAPP-A外部位点抗体
在一个实施方式中，一种或多种PAPP-A外部位点抑制剂为PAPP-A特异性抗体。优 选地，这些抗体不会结合和抑制相关蛋白酶PAPP-A2。
在一个优选实施方式中，PAPP-A特异性抗体为PACl。在另一个优选实施方式中， PAPP-A特异性抗体为PAC2。这些相互作用可依赖于钙离子。
在人PAPP-A中被PACl和PAC2识别的表位称为SEQ ID NO :3。
SEQ ID NO 3 的序列为
1478CEPFMGDNYC DAINNRAFCN YDGGDCCTST VKTKKVTPFP MSCDLQ⑶CA
CRDPQAQEHS RKDLRGYSHG 1547
在小鼠PAPP-A中被PACl和PAC2识别的表位称为SEQ ID NO :4。
SEQ ID NO 4 的序列为
1476
CEPFMGDNYCDAINNRAFCNYDGGDCCTSTVKTKKVTPFPMSCDLQNDCACRDPEAQEHN
RKDLRGYSHG 1545
SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的变体在本文的其他部分有描述。
PACl和PAC2分别称为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6。下面给出了抑制剂PACl和 PAC2的氨基酸序列。序列为scFv PACl和PAC2的全长序列，并且来源于cDNA。这些序列 包括His-标签和c-myc标签(都加了下划线)。这些His-标签和/或c-myc标签可以被 适用于纯化的任何其他标签所取代。任选地，His-和/或c-myc标签可以从序列中去除。 序列还包括⑶R(互补决定区)(用粗体标出)。
PACl 序列(SEQ ID NO 5)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVITDMGRT
TRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLRQFDYffGQGTLVT
VSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKP
GKAPKLLIYHASQLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYGGNPTTFG
QGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA
PAC2 序歹Ij (SEQ ID NO 6)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIQADGTRT
GYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQRGIFDYWGQGTLVTVS
SGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGK
APKLLIYRASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHHYPSTFGQGT
KVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA
SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6的变体在本文的其他部分有描述。
抗体的CDR区是高度可变的。在本发明中CDR区的多变的残基用粗体表示。总共 18 个残基是多变的H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、 L92、L93、L94和L96 (H =重链，L =轻链)。数字表示氨基酸的位点，根据用于筛选PAC抗 体的"Tomlinson I和J文库的制造商所确定的。
在一个实施方式中，如PAC1、PAC2和PAC5(如后文所述)或是任何其他PAPP-A抗 体或是任何其他外部位点抗体等抗体的CDR区，在CDR区的至少18个氨基酸残基是保守 的，或至少17个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，或至少15个氨基酸残基，例如至 少14个氨基酸残基，或至少13个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，或至少11个氨 基酸残基，例如所述抗体超变CDR区的至少10个氨基酸残基。
在一个实施方式中，当⑶R区的至少18个氨基酸残基是保守的，如PACl、PAC2和 PAC5 (如后文所述)或是任何其他PAPP-A抗体或是任何其他外部位点抗体等抗体的剩余氨 基酸序列与所述抗体至少99. 9 %的序列相同性，或至少99 %，例如至少98 %，或至少97 %， 例如至少96%，或至少95%，例如至少94%，或至少93%，例如至少92%，或至少91%，例 如至少90%，或至少89%，例如至少88%，或至少87%，例如至少86%，或至少85%，例如 至少84%，或至少83%，例如至少82%，或至少81%，例如至少80%，或至少79%，例如60至少78%，或至少77%，例如至少76%，或至少75%，例如至少74%，或至少73%，例如 至少72%，或至少71%，例如至少70%，或至少69%，例如至少68%，或至少67%，例如 至少66%，或至少65%，例如至少64%，或至少63%，例如至少62%，或至少61%，例如 至少60%，或至少58%，例如至少56%，或至少，例如至少52%，或至少50%，例如 至少48%，或至少46%，例如至少44%，或至少42%，例如至少40%，或至少38%，例如 至少36%，或至少34%，例如至少32%，或至少30%，例如至少观％，或至少沈％，例如至 少对％，或至少22%，例如至少20%，或至少18%，例如至少16%，或至少14%，例如至少 12%,或至少10%，例如至少8%，或至少6%，例如至少4%，或至少2%，或至少0.5%的序 列与所述抗体或其直系同源物是相同的。
在一个方面，本发明提供了带有与本发明的抗体基本相同序列的分离的多肽，例 如PACl或PAC2或是其直系同源物。
如本发明所用，术语“基本序列相同性”指多肽与SEQ ID NO 5或SEQ IDNO 6或 其直系同源物有至少70 %序列相同性，例如至少72 %，例如至少74%，例如至少76 %，例如 至少78%，例如至少80%，例如至少82%，例如至少84%，例如至少86%，例如至少88%, 例如至少90%，例如至少91%，例如至少92%，例如至少93%，例如至少94%，例如至少 95 %，例如至少96 %，例如至少97 %，例如至少98 %，例如至少99 %，或是大于99 %的序列 相同性。
本发明还涉及使用PAPP-A特异性抗体用作药物。
本发明还涉及采用PACl用作药物。本发明还涉及使用PAC2用作药物。
本发明也涉及产生PACl和/或PAC2的方法。产生PACl和/或PAC2的方法可包 含一个或多个下列步骤1)PCR ；2)克隆；3)产生质粒构建物，如包含标签的质粒构建物； 4)在如哺乳动物、细菌或酵母细胞中表达蛋白力)表达和纯化蛋白。
在又一个优选实施方式中，PACl和PAC2结合到PAPP-A完全依赖于C末端PAPP-A 外部位点序列LNR3、或是LNR3模块的C端侧、以及钙离子的存在。因此，被PACl和PAC2识 别的表位包含至少一部分沈个残基的LNR3模块中的氨基酸序列。
本发明也涉及PACl和PAC2结合到PAPP-A外部位点上，导致全面抑制对已知或未 知底物的底物蛋白水解。在一个优选实施方式中，所述抑制为全抑制或部分抑制。
在另一个优选实施方式中，PACl或PAC2导致抑制对IGFBP-4的蛋白水解。在又 一个优选实施方式中，外部位点抑制剂导致激活IGF释放。
在另一个优选实施方式中，本发明还涉及PACl或PAC2结合到PAPP-A外部位点 上，通过攻击底物结合的PAPP-A外部位点，全面抑制一种或多种PAPP-A的生理底物。
本发明也涉及PAC1或PAC2结合到PAPP-A外部位点上，通过攻击底物结合的 PAPP-A外部位点，差异抑制两种或多种PAPP-A的生理底物。
在又一个优选实施方式中，PACl或PAC2结合到PAPP-A外部位点上，导致全面抑 制PAPP-A介导的对IGFBP-4的切割，以及部分抑制IGFBP-5的切割，从而导致对PAPP-A底 物的部分差异抑制作用。在一个实施方式中，PACl和PAC2抗体不会导致对其他已知或未 知的PAPP-A底物的抑制，其他底物的切割不依赖于对于同一外部位点的结合。
特异性PAPP-A非外部位点抗体
在一个实施方式中，一种或多种PAPP-A外部位点抑制剂包含PAPP-A特异性抗体。优选地，这些抗体不会结合和抑制相关蛋白酶PAPP-A2。
在一个优选实施方式中，PAPP-A特异性抗体为PAC5。
在人PAPP-A中被PAC5识别的表位的定位显示PAC5的结合位点位于包含600-937 残基的PAPP-A部分。可以不给出确切的边界，但是结合位点1)不在蛋白水解结构域中，并 且2)不在包含1133-1547残基的带有外部位点的片段(与SEQ ID N0:2相同)中。“PA 1-950”是包含1-950氨基酸残基的PAPP-A片段。“PA937-1547”是包含937-1547氨基酸 残基的PAPP-A片段。“PA 1-599”是包含1-599氨基酸残基的PAPP-A片段。
PAC5结合到PAPP-A的定位
PA 1-950结合
PA 937-1547 不结合
PA 1-599不结合
PAC5称为SEQ ID NO :7。下面给出了抑制剂PAC5的氨基酸序列。序列为scFv PAC5的全长序列并来源于cDNA。该序列包括His标签和c-myc标签(都用下划线标出)。 该His-标签和/或c-myc标签可以被适用于纯化的任何其他标签所取代。任选地，His标 签和/或c-myc标签可从序列中删除。序列还包括CDR(互补决定区)(用粗体标出)。
PAC5 序列 (SEQ ID NO 7)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISPAGVM
TQYADSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQQGGFDYffGQGTLVTVKG
VSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKP
GKAPKLLIYRASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPIARPPTFGQ
GTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA
SEQ ID NO 7的变体在本文其他部分有描述。
在一个方面，本发明提供了带有与本发明的抗体基本相同序列的分离的多肽，例 如PAC5或其直系同源物。
如本发明所用，术语“基本序列相同性”指多肽与SEQ ID NO 7或其直系同源物有 至少70%序列相同性，例如至少72%，例如至少74%，例如至少76%，例如至少78%，例如 至少80%，例如至少82%，例如至少84%，例如至少86%，例如至少88%，例如至少90%, 例如至少91%，例如至少92%，例如至少93%，例如至少94%，例如至少95%，例如至少 96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%，或是大于99%的序列相同性。
本发明还涉及使用PAPP-A特异性抗体用作药物。
本发明还涉及使用PAC5用作药物。本发明还涉及产生PAC5的方法。产生PAC5 的方法可包含下列一个或多个步骤1)PCR;2)克隆；3)产生质粒构建物，如包含标签的质 粒构建物；4)在如哺乳动物、细菌或酵母细胞中表达蛋白力)表达和纯化蛋白。
不同于PACl和PAC2的结合位点，PAC5的结合位点不是底物结合的PAPP-A外部位 点。然而，PAC5数据表明，通过攻击位于蛋白水解结构域和CCPl之间的序列段上的表位， 可以获得对PAPP-A的抑制。抑制的机制可能为空间位阻。
本发明还涉及PAC5结合到PAPP-A，导致全面抑制对已知或未知底物的底物蛋白 水解。在一个优选实施方式中，所述抑制为全抑制或部分抑制。
在另一个优选实施方式中，本发明还涉及PAC5结合到PAPP-A上，导致全面抑制PAPP-A的一个或多个生理底物。
在另一个优选实施方式中，PAC5导致抑制IGFBP-4和IGFBP-5的蛋白水解。在又 一个优选实施方式中，外部位点抑制剂导致激活IGF释放。
组合试剂盒(kit-of-parts)
在一个优选实施方式中，本发明涉及包含一种或多种外部位点作用因子的组合试剂盒。
在另一个实施方式中，本发明涉及包含一种或多种外部位点抑制剂的组合试剂品.ο
在另一个实施方式中，本发明涉及包含一种或多种外部位点激活剂的组合试剂品.ο
在一个优选实施方式中，本发明涉及包含一种或多种PAPP-A外部位点作用因子 的组合试剂盒。
在一个优选实施方式中，本发明涉及包含一种或多种PAPP-A外部位点抑制剂的组合试剂盒。
在一个优选实施方式中，本发明涉及包含一种或多种PAPP-A外部位点激活剂的 组合试剂盒。
在另一个实施方式中，本发明涉及包含PACl和/或PAC2的组合试剂盒。
在又一个实施方式中，本发明涉及包含一种或多种PACl和/或PAC2的变体的组 合试剂盒。
如本发明所用，术语“组合试剂盒”提供了一种或多种如本发明所述的外部位点作 用因子，以及用于联合给药的第二生物活性药剂。联用的活性药物可为同时给药、依次给药 或是分别给药。在所有情况下，任何本发明所述的药物和生物活性药剂优选为以药学有效 量给药，即给予的药物或药物组合物或方法的每个活性组分的总量都足以使患者获得有意 义的改善。采用本领域技术人员所熟知的方法，可以将制剂方便地配成单位剂量形式。试剂 盒优选包含足够量的一种或多种活性化合物，使得其给予对象时能够获得预期的效果。因 此，优选药物包装含有对应于相关给药方案的剂量单位的量。相应地，在一个实施方式中， 药物包装包含一种包含如上定义的化合物或是其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的 运载体、载体和/或赋形剂的药物组合物。药物包装可为任何合适的形式，例如肠道给药 (经过消化道)或肠胃外给药(经由消化道以外其他途径)。在另一个优选实施方式中，包 装为药剂盒的形式，例如注射笔的药剂盒，注射笔为例如用于胰岛素治疗的注射笔。优选 地，组合试剂盒包含说明使用剂量形式以获得预期效果、以及在一段特定时间段内服用的 剂量形式的量的使用说明书。相应地，在一个实施方式中，药物包装包含药物组合物给药的 使用说明书。按照设想，至少一种(例如2或3种)附加药物用于止血或是治疗止血或其 风险的潜在因素，以及至少一种(例如2或3种)如本发明所述的多肽，可用于制造向有需 要的个体给药的任何本发明所述的组合试剂盒。
抗体
本发明的一个方面提供了特异性识别和结合SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4上的表位或其功能类似物的抗体或其功能等价物。表位为任何如本 发明下文所述的表位。
抗体或其功能等价物可为本领域已知的任何抗体，例如来源于哺乳动物的多克隆 或单克隆抗体或是合成的抗体，例如单链抗体或包含抗体片段的混合物。而且，抗体可为单 克隆抗体或人造多克隆抗体的混合物。此外，抗体的功能等价物可为抗体片段，尤其是表位 结合片段。而且，抗体或其功能等价物可为模拟抗体的小分子模拟物。天然存在的抗体为 由重链和轻链构成的免疫球蛋白分子。在本发明的一个优选实施方式中，抗体为单克隆抗 体。
单克隆抗体(Mab)为抗体，其中每个抗体分子是相似的并且识别相同的表位。单 克隆抗体通常是由杂交瘤细胞株产生的。制备单克隆抗体和合成抗体的杂交瘤的方法是本 领域技术人员所熟知的。产生抗体的杂交瘤可为例如通过将产生抗体的B淋巴细胞与一个 永生化的B淋巴细胞株融合来制备。如本发明所述的单克隆抗体可为如根据1988年冷泉 港实验室出版社出版的Ed Harlow和David Lane的《抗体实验室指南》中(Antibodies A Laboratory Manual, By Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory I^ess，1988.)所述来制备。所述单克隆抗体可来源于任何合适的哺乳动物种类，然而单克 隆抗体常常为啮齿动物抗体，例如小鼠或大鼠单克隆抗体。本发明的抗体优选为单克隆抗 体或来源于单克隆抗体。
多克隆抗体为识别特殊给定抗原的抗体分子的混合物，所以多克隆抗体可以识别 所述抗原上的不同表位。通常，多克隆抗体从预先用抗原免疫的哺乳动物的血清中纯化。多 克隆抗体可为例如通过如1988年冷泉港实验室出版社出版的Ed Harlow和David Lane的 《抗体实验室指南》中(Antibodies :ALaboratory Manual,By Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，1988.)所述任何方法来制备。多克隆抗体可来源 于任何合适的哺乳动物种类，例如来源于小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、绵羊、牛或骆驼。抗体优 选不来源于非哺乳动物物种，即抗体优选不为如鸡抗体。抗体也可为如人工多克隆抗体，例 如US 5，789，208或US 6，335，163所述，两个专利说明书都在此整体引入本发明作为参考。
本发明的抗体也可为重组抗体。重组抗体为通过重组技术产生的抗体或其片段或 其功能等价物。例如，重组抗体可以用合成的文库或是通过噬菌体展示来生产。重组抗体 可用任何传统方式来生产，例如在1999年9月乔瑟巴斯出版社出版的Frank Breitling和 Stefan Dubel 白勺《1 &δ #》巾("Recombinant Antibodies", Frank Breitling, Stefan Dubel, Jossey-Bass, September 1999.)所述的方法。
本发明的抗体可为双特异性抗体，即抗体特异性的识别2个不同的表位。双特异 性抗体通常是从单克隆抗体、或从重组抗体开始制备的，例如通过融合两个杂交瘤从而联 合他们的特异性，或通过化学交联或是采用重组技术。本发明的抗体也可为三特异性抗体。
在一个实施方式中，抗体的功能等价物可为抗体片段，优选为抗原结合片段或可 变区。可用于本发明的抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段。木瓜蛋白酶消 化抗体产生了 2个相同的抗原结合片段，叫做Fab片段，每个带有一个抗原结合位点；以及 一个残余的Fc片段，这是因为它很容易结晶所以这么命名。胃蛋白酶处理产生了 F(ab' )2 片段，其具有能交联抗原的2个抗原结合片段，以及一个残余的其他片段QlSpFc')。其 他片段可包括由抗体片段形成的双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和多特异性抗体。如 本发明所用，抗体的“功能性片段”指Fv、F(ab)和F(ab' )2片段。
优选的抗体片段保留了抗体选择性结合到它的抗原或受体上的部分或是基本上全部的能力。一些优选片段定义如下
(I)Fab为包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段。可以用木瓜蛋白酶消化全抗 体，产生一个完整的轻链和一条重链的一部分，从而产生Fab片段。
(2)Fab'是抗体分子的片段，可以通过下列方法获得用胃蛋白酶处理全抗体、然 后进行还原，以产生完整的轻链和重链的一部分。每个抗体分子获得2个Fab’片段。Fab’ 片段与Fab片段不同，在重链CHl结构域的羧基端加入了几个残基，包括来自于抗体铰链区 的一个或多个半胱氨酸。
(3) (Fab’ )2为通过用胃蛋白酶处理全抗体而不进行后续的还原而获得的抗体片 段。(Fab’)2为2个Fab’片段通过2个二硫键联在一起形成的二聚体
(4)Fv为包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价 结合的一条重链和一条轻链的可变区的二聚体构成的(VH-\ 二聚体)。在这个构象中，每 个可变区的三个CDR相互作用在二聚体表面确定了一个抗原结合位点。然而，甚至单 个可变区(或只包含特异性针对一个抗原的3个CDR的半个Fv)能够识别和结合抗原，尽 管要比完整的结合位点亲和力更低。
在本发明的一个实施方式中，抗体为单链抗体(“SCA”)，定义为一个基因工程改 造的分子，包含轻链的可变区、重链的可变区，通过一个合适的多肽接头连接，形成一个基 因工程融合的单链分子。这样的单链抗体也称为“单链Fv”或“scFv”抗体片段。一般，Fv 多肽还包含一个VH和VL结构域之间的多肽接头，使scFv能形成抗原结合所需的结构。
抗体也可根据有用的特性进行选择，例如可能需要控制抗体在血清中的半衰期。 通常，完整的抗体分子在血清中的留存时间非常长，而片段(< 60_80kDa)会很快被肾脏过 滤。通常全抗体上的糖基化能延长其在血清中的留存时间。如果需要PAPP-A抗体的长期 作用，优选PAPP-A抗体为完整的抗体。
在本发明的另一个实施方式中，抗体的功能等价物为一个模拟抗体的小分子模拟 物。
人抗体
本发明的人单克隆抗体可以用各种方法生产，包括传统的单克隆抗体方法，如 Kohler和Milstein的标准的体细胞杂交技术(Nature 256 :495(1975))。尽管优选体细胞 杂交技术，理论上也可使用其他产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性 转化、或是采用人抗体基因的文库的噬菌体展示技术。
在一个优选实施方式中，直接针对PAPP-A的人单克隆抗体可以用带有人免疫系 统部分而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括 本发明分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，在本发明中统称为“转基因小鼠”。
HuMAb小鼠包含一个人免疫球蛋白基因的微位点，该位点编码非重排人重链(μ 和Y)以及κ轻链免疫球蛋白序列，并带有使得内源μ和γ链位点失活(Lonberg， N等· (1994)Nature 368(6474) :856-859)。相应地，小鼠表现为免疫后小鼠IgM或κ 的表达低，转入的人重链和轻链转基因，发生了类型转换和体细胞突变，产生高亲和力 的人IgG，κ单克隆抗体(Lonberg, N等· (1994)，见上；综述参见Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacologyl13 :49-101 ；Lonberg, N.禾口 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65-93 ；以及 Harding, F.禾口 Lonberg，N. (1995) Ann.N. Y. Acad. Sci 764 =536-546)。HuMAb小鼠的制备在下列文献中有详细描述:Taylor, L.等.(1992) Nucleic Acids Research 20 :6287-6295 ；Chen, J.等.(1993) International Immunology 5 :647-656 ；Tuaillon 等.(1994)J.Immunol. 152 :2912-2920 ；Lonberg 等，(1994)Nature368(6474) :856-859 ；Lonberg, N. (1994)Handbook of Experimental Pharmacologyl 13 :49-101 ；Taylor, L 等· (1994) International Immunology 6 :579-591 ； Lonberg, N.禾口 Huszar, D. (1995)Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65-93 ；Harding, F.禾口 Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764 :536-546 ；Fishwild, D.等· (1996) NatureBiotechnology 14 :845-851。还可参见 Lonberg 和 Kay 的美国专利 5, 545, 806 ； 5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，789，650 ；5，877，397 ；5，661，016 ；5，814，318 ； 5，874，299 和 5，770，429 ；以及 Surani 等的 US 5，545，807 ；WO 98/24884，W094/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 和 WO 01/09187。
KM小鼠包含人重链转染色体和人κ轻链转基因。在KM小鼠中内源小鼠重链和轻 链基因也已经被破坏，使得免疫小鼠会产生人免疫球蛋白而不是小鼠免疫球蛋白。KM小鼠 的构建以及他们在产生人免疫球蛋白上的应用在WO 02/43478中有详细描述。
免疫
为了产生PAPP-A的全长人单克隆抗体，可用PAPP-A抗原的浓缩制剂和/或表达 PAPP-A的细胞免疫包含人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(如HCol2、HCo7或KM 小鼠)，例如 Lonberg 等.(1994)，见上文；Fistiwild 等.(1996)，见上文和 WO 98/24884 H 选地，可用编码人PAPP-A的DNA来免疫小鼠。优选地，小鼠在第一次灌输时为6-16周龄。 例如，可用PAPP-A抗原的浓缩制剂(5-50 μ g)腹膜内免疫HuMab小鼠。在采用PAPP-A抗 原的纯化或浓缩制剂进行免疫不会产生抗体的情况下，也可用如细胞株等表达PAPP-A的 细胞来免疫小鼠以提高免疫应答。
对于各种抗原的累积经验表明，当最初用弗氏完全佐剂中的表达PAPP-A的细胞 HuMAb腹膜内(i.p.)或皮下(s. c.)免疫，然后每隔一周用PBS中的表达PAPP-A的细胞 i. P.免疫(直到总共10周)，转基因小鼠的免疫应答最佳。在免疫过程中，可以通过从眼窝 取血获得的血浆来监测免疫应答。可通过FACS分析筛选血清，带有足够滴度的抗-PAPP-A 人免疫球蛋白的小鼠可以用于融合。可以在杀死小鼠取脾脏之前，例如4、3天前，给小鼠静 脉注射表达PAPP-A的细胞。
产生针对PAPP-A的人单克隆抗体的杂交瘤的制备
为了产生表达对PAPP-A的人单克隆抗体的杂交瘤，可从免疫过的小鼠获得脾细 胞和淋巴结细胞，并且与合适的永生化细胞株进行融合，例如小鼠骨髓瘤细胞株。然后可 以从获得的杂交瘤中筛选表达抗原特异性抗体的杂交瘤。例如来自免疫过小鼠的脾淋巴 细胞的单细胞悬液可以在50% PEG(重量/体积比)中与SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细 胞(ATCC，CRL 1581)进行融合。细胞可以约每孔1 X IO5的量铺到平底微孔板中，然后在选 择性培养基中培养两周，该选择性培养基除了通常的试剂外还含有10% FETACL0NE血清、 5-10%初始杂交瘤克隆因子(IGEN)和IXHAT(西格玛，Sigma)。在约2周后，细胞可在用 HT代替了 HAT的培养基中培养。然后单独的孔可以用ELISA筛选带有人κ轻链的抗体，并 且用表达PAPP-A细胞的FACS分析筛选PAPP-A的特异性。一旦杂交瘤大量生长，通常可以 在10-14天后在培养基观察到。可将分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，并且如果仍然是人IgG阳性的，可以通过有限稀释进行至少2次抗-PAPP-A单克隆抗体的亚克隆。然后 可以在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养液中产生抗体供鉴定。
产生针对PAPP-A的人单克隆抗体的转染瘤的制备
还可采用如本领域熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，在宿主细胞转染 瘤中产生本发明的人抗体，参见如Morrison，S. (1985) Science 229:1202。例如，为了表达 抗体或其抗体片段，可以用标准分子生物学技术(如PCR扩增、定点突变)获得表达部分或 全长轻链和重链的DNA，并且插入到表达载体中，这样基因有效的连接到了转录和翻译控制 序列上。在本文中，术语“操作性连接”用于表示抗体基因连接到载体上，使得载体上的转 录和翻译控制序列起到他们调控抗体基因表达和翻译的功能。可以选择与所用表达宿主细 胞兼容的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到分开的载体 中，或是更典型地，两个基因都插入到同一表达载体上。通过标准方法把抗体基因插入到表 达载体中(如，抗体基因片段和载体上的互补限制性酶切位点的连接，或是如果没有限制 性酶切位点用平末端连接)。本发明所述的轻链和重链可变区抗体可用于产生任何抗体同 种型的全长抗体基因，通过将它们插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区 的表达载体上，使得Vh片段操作性连接到在载体上的Ch片段上，并且\片段操作性连接到 载体上的Q片段。额外地或任选地，重组表达载体可编码一个促进抗体链从宿主细胞分泌 的信号肽。抗体链基因可克隆到载体上，使得信号肽基因不影响编码框地连接到抗体链基 因的氨基端上。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来源于非免疫球蛋白蛋白 的信号肽)。
除了抗体链基因之外，本发明的重组表达载体带有在宿主细胞内控制抗体链基因 表达的调控序列。术语“调控序列”包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其 他表达控制元件(如多聚腺苷酸信号)。这样的调控序列在如1990年加利福尼亚州圣地 亚哥的学术出版社出版的Goeddel的《基因表达技术酶学方法》第185页(Goeddel ；Gene Expression Technology. Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif. (1990))中有描述。本领域的熟练技术人员会希望，包括调控序列选择在内的表达载体设计 是依靠下列因素如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等等。哺乳动物宿主细 胞表达的优选调控序列包括使蛋白在哺乳动物细胞内高水平表达的病毒元件，例如来源于 巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多 瘤病毒的启动子和/或增强子。任选地，可以使用非病毒调控序列，如泛素启动子。
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体可携带有另外的序列， 例如调控载体在宿主细胞内复制的序列(如复制起点)和选择性标记物基因。选择性标记 物基因有助于选择已转入载体的宿主细胞(参见如Axel等的US 4, 399, 216,US 4，634，665 和US 5，179，017)。例如，通常选择性标记物基因提供给导入了载体的宿主细胞对如G418、 潮霉素或甲氨喋呤等药物的抗性。优选的选择性标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR) 基因(用于dhfr-宿主细胞的甲氨喋呤筛选/扩增)和neo基因(用于G418筛选)。
为了表达轻链和重链，采用标准技术用编码重链和轻链的表达载体转染宿主细 胞。术语“转染”的各种形式包含通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的各种技 术，例如电转、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、脂质体转染等等。
在一个实施方式中，抗体在真核细胞中表达，例如哺乳动物宿主细胞。用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞(包括dhfr-CHO细胞，如tolaub和 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220 ；与 DHFR 选择性标记物连用，如 R. J.Kaufman 和 P. A.Sharp (1982) Mol. Biol. 159 :601-621)中所述；NS/0 骨髓瘤细胞，COS 细胞，HEK293细胞和SP2. O细胞。特别是与NS/0骨髓瘤细胞连用，另一个优选表达系统为 WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338841所公开的GS (谷氨酰胺合成酶)基因表达系统。 当编码抗体基因的重组表达载体导入到哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段足 够使抗体在宿主细胞中表达的时间来产生抗体，或更优选，将抗体分泌到宿主细胞生长的 培养基中。用标准的蛋白纯化方法，可以从培养基中回收抗体。
产生针对PAPP-A的人单克隆抗体的其他重组方法
任选地，克隆的抗体基因可在其他表达系统中表达，包括原核细胞如微生物，如用 于产生scFv抗体的大肠杆菌，藻类，以及昆虫细胞。此外，抗体可在非人类的转基因动物 中产生，例如从羊奶和兔奶或鸡蛋，或是转基因植物。参见例如Verma，R等.(1998) “抗 体工程细菌、酵母、昆虫和哺乳动物表达系统的比较”，J. Immunol. Meth. 216 :165-181 ； Pollock等.(1999) “转基因奶作为生产重组抗体的方法”，J. Immunol. Meth. 231 :147-157 ； 以及Fischer, R.等· (1999) “植物中重组抗体的分子农业”，Biol. Chem. 380 :825_839。
使用部分抗体序列来表达完整的抗体
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(OTR)的氨基酸残基与目标抗原 相互作用。为此，在各个抗体之间CDR内的氨基酸序列要比CDR外的序列差异更大。因为 ⑶R序列负责多数的抗体-抗原相互作用，可以通过构建表达载体来表达模拟天然存在的 特定抗体特性的重组抗体，所述表达载体包含来自天然存在的特定抗体的CDR序列接到来 自具有不同特性的一个不同抗体的框架序列上(参见如Riechmann，L等.(1998)Nature 332 :323-327 Jones, P.等· (1986)Nature 321 :522-525 ；禾口 Queen, C.等· (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :10(^9-10033)。可以从包含胚系抗体基因序列的公共DNA数据库获 得这样的框架序列。这些胚系序列可以与成熟的抗体基因序列不同，因为他们不包括在B 细胞成熟过程中通过V(D) J连接形成的完整组装的可变区基因。胚系基因序列也可与高亲 和性的第二全套抗体的序列有所不同，所述第二全套抗体在可变区基因中到处都有突变但 突变通常集中在CDR。例如，在框架区1的氨基端部分和框架区4的羧基端部分，体细胞突 变相对罕见。因此，为了重新产生带有与原始抗体相似的结合特性的完好的重组抗体，获取 整个DNA序列并不是必需的(参见WO 99/45962)。跨越⑶R区的部分重链和轻链通常足以 满足这一需求。部分序列用于确定哪个胚系可变和连接基因片段对重组抗体可变基因发挥 作用。然后用胚系序列填充可变区缺失的部分。在蛋白成熟过程中，重链和轻链的前导序 列被切除，并且对最终抗体的特性不产生影响。为了加入缺失的序列，可以通过连接或PCR 扩增，将克隆的cDNA序列和合成的寡核苷酸连接起来。任选地，可以通过PCR扩增将整个 可变区合成为一套短的、重叠的寡核苷酸并且连接起来，产生完整合成的可变区克隆。这种 方法有一定的优越性，例如去除或插入特殊的限制性位点，或是优化特定的密码子。
来源于杂交瘤的重链和轻链转录本的核苷酸序列用于设计一套重叠的合成寡核 苷酸，以产生具有与天然序列相同的核苷酸编码能力的合成的V序列。这些合成的重链 和K链序列与天然序列的不同可以有3种方式打断重复的核苷酸碱基串联，以方便寡 核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak法则插入最佳翻译起始位点(Kozak,1991, J.Biol.Chem. 266 :19867-19870)；在翻译起始位点上游工程化加入Hind III位点。
对重链和轻链可变区，优化的编码序列和对应的非编码链序列打断成30-50核苷 酸，接近对应非编码核苷酸的中点。因此，对于每条链，寡核苷酸可以组装成重叠的双链集 合，片段跨度为150-400核苷酸。然后用这些库作为模板来产生150-400核苷酸的PCR扩 增产物。通常，单个可变区核苷酸集合可以分成2个库，分别扩增产生2个重叠的PCR产 物。然后，用PCR扩增连接这些重叠的产物，以形成完整的可变区。在PCR扩增中也希望能 包括重链或轻链恒定区的一个重叠片段(包括κ轻链的m^sl位点，或是γ重链的AgeI 位点)，以产生能方便地克隆到表达载体构建物中的片段。
然后，将改造的重链和轻链可变区连接到克隆的启动子、前导序列、翻译起始位 点、恒定区、3’非翻译区、多聚腺苷酸和转录终止序列上，构成表达载体构建物。重链和轻链 表达构建物可以连接到单个载体上，共转染、依次转染或分别转染到宿主细胞中，然后融合 宿主细胞，形成表达两条链的宿主细胞。
在本发明的另一个方面，利用本发明的人抗PAPP-A抗体的结构特性，用于产生 保留了本发明的至少一种功能特性的结构相关的人抗PAPP-A抗体，所述功能特性例如与 PAPP-A结合。更特殊地，可以将一个或多个2C6的⑶R区通过重组连接到已知的人框架区 和⑶R上，产生另外的重组工程化的本发明的人抗PAPP-A抗体。
单价抗体
单特异性的结合成员可为单价的，即只有一个结合结构域。
对于单价抗体，免疫球蛋白恒定区氨基酸残基序列包含本领域已知的抗体分子的 结构部分，如CH1、CH2、CH3和CH4。本领域已知的结合成员优选为Cp优选的C^多肽选自 下组包含Ck和Ca。
另外，只要恒定区可为重链或轻链的恒定区(分别为Ch或⑦，各种单价结合成员 组合物都是本发明可预见的。例如，轻链恒定区可以通过二硫键与另一个轻链恒定区或是 重链恒定区连接。相反，重链恒定区可以形成两个独立的二硫桥键，允许桥联到另一个重链 和轻链，或是形成重链多聚体。
因此，在另一个实施方式中，本发明包括一种包含单价多肽的组合物，其中恒定链 区C带有能形成至少一个二硫桥键的一个半胱氨酸残基，并且组合物包含通过所述二硫桥 键共价连接的至少两个单价多肽。
在优选实施方式中，恒定链结构域C可为Q或CH。当C为Q时，Q多肽优选选自 下组包含Ck和Ca。
在另一个实施方式中，本发明包含一种结合成员复合物，其包含带有能形成二硫 桥键的一个半胱氨酸残基的上述单价抗体，除了 C为Q时，使得这样的复合物包含通过所 述二硫桥键共价连接的两个单价多肽。
抗体多特异性，包括双特异性
在一个优选实施方式中，本发明涉及多特异性结合成员，其带有亲和力并能结合 至少两个不同的实体。多特异性结合成员可包括双特异性结合成员。
在一个实施方式中，多特异性分子为双特异性抗体(BsAb)，其带有至少两个不同 的结合结构域，其中至少一个为抗体来源的。
本发明的双特异性分子也可为单链双特异性分子，例如单链双特异性抗体，包含69一个单链抗体和一个结合结构域的单链双特异性分子，或是包含两个结合结构域的单链双 特异性分子。多特异性分子也可为单链分子，或可包含至少2个单链分子。
包括双特异性抗体的多特异性抗体可通过本领域熟练技术人员已知的任何合适 的方式来生产。
产生双特异性全抗体的传统方法为融合两个杂交瘤细胞株，每个细胞株生产带有 所需特异性的抗体。因为免疫球蛋白重链和轻链随机结合，这些混合的杂交瘤产生了多达 10种不同的重链和轻链组合的混合物，其中只有一种为双特异性抗体。因此，这些双特异性 抗体必须用繁琐的方法进行纯化，这将很大程度上降低所需产物的产量。
任选方法包括通过铰链区的半胱氨酸残基或是如上所述的基因工程导入的C末 端半胱氨酸的化学交联，将2种抗原特异性体外连接起来。可以通过Fab’与促进异源二聚 体形成的肽进行重组融合，来改进这种体外组装。然而这些方法的双特异性产物的产量要 远低于100%。
产生二价或双特异性抗体片段的更有效的方法，不包含体外化学组装步骤，在 Holliger等(199 有描述。这一方法利用了从细菌分泌的scFv通常以单体和二聚体两种 形式存在的这一发现。这一发现提示不同链的V1^nt可以配对，从而形成二聚体和大的复 合物。二聚体抗体片段，也被Hollinger等命名为“双功能抗体”，事实上是体内组装的二价 抗体片段。通过将两种不同抗体1和2的％和八连接起来，形成“交叉链” Vh I-Vl 2_\1，二聚化过程表现为重新组装两个抗体结合位点。两个结合位点的亲和力与起相同，或甚至当去除共价连接Vh和\的多肽接头时要比起始scFv提高10倍，从而产生了 2个蛋白，每个蛋白包含直接且共价连接到一个没有与Vh配对的\上的一个VH。这种产生 双特异性抗体片段的策略也在一些专利申请中有描述。专利申请WO 94/09131 (SC0TGEN公 司；优先权日1992年10月15日)涉及一种双特异性结合蛋白，其中结合结构域来源于一 个Vh和一个\区，所述Vh和\区可以存在于两条链上或是在一个scFv中连接在一起，采 用如C端恒定区等其他融合的抗体结构域来稳定二聚体构建物。专利申请WO 94/13804(剑 桥抗体技术/医药研究委员会，第一优先权日1992年12月4日)涉及一种包含不能相互 结合的一个Vh和一个\的一种多肽，其中V结构域可以通过或不通过接头连接。
Mallender和Voss，1994(也在专利申请WO 94/13806中有描述；陶氏化学公司， 优先权日1992年12月11日)报道了在大肠杆菌内体内生产单链双特异性抗体片段。该 二价蛋白的双特异性基于具有不同特异性的两个原先生产的单价scFv分子在遗传水平通 过可弯曲的多肽接头连接起来。传统上，单链抗体分子片段指包含在存在或不存在多肽接 头的情况下一条重链连接到一条(对应)轻链的一种单分子。当通过“双功能抗体”方法 (Holliger 等，(1993)和专利申请 WO 94/09131)或是通过“双 scFv” 方法(Mallender 和 Voss, 1994以及专利申请WO 94/13806)来制备二价或双特异性抗体片段时，Vh连接到一个 (对应的)八上。
上述多特异性分子可以通过多种方法制备。例如，所有的特异性可以在同一载体 中编码，并且在同一宿主细胞中表达和组装。当多特异性分子为一个mAb X mAb.mAb X Fab、 Fab X F(ab' )2或配体X Fab融合蛋白时，这种方法特别有用。制备二价或多价抗体的各 种其他方法在如美国专利第5，260，203号、第5，455，030号、第4，881，175号、第5，132，405 号、第 5，091，513 号、第 5，476，786 号、第 5，013，653 ；5，258，498 号和第 5，482，858 号中有描述。
通过使用本发明的双特异性或多特异性结合成员，与单特异性/单价结合成员相 比，本发明提供了一些优越性。
双特异性/多特异性结合成员带有能特异性识别和结合链球菌蛋白的第一结合 结构域，尤其是肺炎球菌溶血素，其中其他结合结构域可用于其他目的。
在一个实施方式中，至少一个其他结合结构域用于结合链球菌蛋白，例如结合到 与第一结合结构域相比同一链球菌蛋白上的另一个表位上。因此可以提高对于链球菌属的 特异性，以及提高结合成员的亲合力。
在另一个实施方式中，至少一个其他结合结构域可用于特异性结合一种哺乳动物 细胞，例如人细胞。优选至少一个其他结合结构域能结合一种免疫活性细胞，例如白细胞、 巨噬细胞、嗜碱性细胞和/或嗜曙红细胞，以提高结合成员在治疗方法中的效果。这可以通 过建立至少一个能特异性结合一种哺乳动物蛋白的其他结合结构域来实现，所述哺乳动物 蛋白例如人蛋白，例如选自任何分化蛋白群(CD)的蛋白，尤其是CD64和/或CD89。一种生 产带有⑶64特异性的双特异性抗体的方法在Medarex公司的美国专利US 6，071，517中有 描述。
因此，本发明包括带有至少一种针对PAPP-A的第一结合特异性和针对第二目标 表位的第二结合特异性的双特异性和多特异性分子。在本发明的一个特定实施方式中，第 二目标表位为Fc受体，如人Fc y RI (⑶64)、或人Fc α受体(⑶89)、或T细胞抗体如⑶3。 所以，本发明包括与表达Fc y R、Fc α R或Fc ε R的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形 核细胞(PMN))以及表达PAPP-A的靶细胞都能结合的双特异性和多特异性分子。这些双特 异性和多特异性分子引导表达PAPP-A的细胞到效应细胞，并且像本发明的人单克隆抗体 一样，促进Fc受体接到的效应细胞活性，例如表达PAPP-A细胞的噬菌作用、抗体依赖的细 胞毒性作用(ADCC)、细胞因子释放、或是产生超氧阴离子。
本发明的双特异性和多特异性分子还可包括除了抗Fc结合特异性和抗PAPP-A结 合特异性之外的一种第三结合特异性。在一个实施方式中，第三结合特异性为一个抗增强 因子(EF)部分，如结合到参与细胞毒性活性的一个表面蛋白上的一个分子，并且从而提高 针对靶细胞的免疫应答。“抗增强因子部分”可为抗体、功能性抗体片段、或是结合如抗原或 受体等给定分子的配体，并且从而导致提高对Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的效果。 “抗增强因子部分”可结合Fc受体或靶细胞抗原。任选地，抗增强因子部分能结合到与第 一和第二结合特异性所结合的实体不同的实体上。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性 T细胞(如通过⑶2、⑶3、⑶8、⑶观、⑶4、⑶40、ICAM-I或能提高针对靶细胞的免疫应答的 其他免疫细胞)。
在一个实施方式中，本发明的双特异性和多特异性分子包含对至少一种其他抗体 的结合特异性，包括如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv或单链Fv。抗体也可为轻链或重链二聚 体，或其任何最小片段，例如Ladner等在US 4，946，778中所述的Fv或单链构建物。抗体 也可为如US 2003/0118592和US 2003/0133939中所公开的一种结合结构域免疫球蛋白融合蛋白ο
在一个实施方式中，通过人单克隆抗体提供对Fc受体的结合特异性，其结合不会 被人免疫球蛋白G(IgG)所抑制。如本发明所用，“IgG受体”指位于染色体1上的8个γ-链基因中的任一种。这些基因编码总共12个跨膜或可溶受体异构体，可以分成3个Fcy受 体类型Fc yRI(CD64)、Fc yRII(CD32)和 Fc γ RIII (CD16)。在一个优选实施方式中，Fc γ 受体为高亲和力人Fc YRI。
这些优选单克隆抗体的产生和鉴定由Fanger等在TO 88/00052和US4，954，617 中有描述。这些抗体结合到Fc YRI、FcyRII或Fc γ RIII的一个表位上，该位点不同于受 体的Fc γ结合位点，并且他们的结合不会被IgG的生理水平所充分抑制。可用于本发明的 特异性的抗Fc γ RI抗体为mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。在其他实施方式 中，抗Fc γ受体抗体为mAb 22 (H22)的人源化形式。H22抗体的产生和鉴定在Graziano， R. F 等.(1995) J. Immunol. 155(10) :4996-5002 和 WO 94/10332 中有描述。产生 H22 抗体 的细胞株1992年11月4日存放在美国模式培养物集存库中，命名为HA022CL1，检索号为 CRL11177。
在其他优选实施方式中，通过结合如Fc α受体(Fe α I (⑶89))等人IgA受体提供 了对Fc受体的结合特异性，其结合优选不被人免疫球蛋白A(IgA)所抑制。术语“IgA受 体”指包括位于19号染色体上的一个α-基因(FcaRI)的基因产物。已知这个基因编码 55-1 IOkDa的几个选择性剪接的跨膜异构体。Fc α RI (⑶89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜曙 红粒细胞和嗜中性粒细胞中组成型表达，但在非效应细胞群中不表达。Fca RI对IgAl和 IgA2都有中度亲和力，当接触如G-CSF或GM-CSF等细胞因子时亲和力提高(Morton，H. C 等(1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。已经描述了确定为 A3、A59、 A62和A77的四种Fc α RI特异性单克隆抗体，其在IgA配体结合结构域之外结合Fc α RI。 (Monteiro, R. C 等.(1992) J. Immunol. 148 :1764).
优选人的单克隆抗体时，可用于本发明的双特异性或多特异性分子的其他抗体为 小鼠、嵌合且人源化的单克隆抗体。这种小鼠、嵌合且人源化的单克隆可以用本领域已知的 方法来制备。本发明的双特异性和多特异性分子可用化学技术(参见D.M. Kranz等(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :5807)、“多杂交瘤”技术(参见 US 4，474，893)或重组 DNA 技 术来制备。
特别地，本发明的双特异性和多特异性分子可以通过采用本领域已知的方法使 组分的结合特异性偶联起来来制备，例如抗FcR和抗PAPP-A的结合特异性。例如双特异 性和多特异性分子的每种结合特异性可以分别产生，并且然后相互偶联起来。当结合特 异性为蛋白或肽时，可用各种接合剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的离子包括蛋白A、 碳二亚胺、S乙酰基巯基乙酸N羟基丁二酰亚胺酯(SATA)、5，5’ - 二硫代双(2-硝基苯 甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)_丙酸酯 (SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(硫代-SMCC)。(参 见如 Karpovsky 等.(1984) J. Exp. Med. 160 1686 ；Liu, Μ. A.等.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648。其他方法包括如 Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78，118-132)、 Brennan 等· (1985)Science 229 :81-83 和 Glennie 等· (1987)J. Immunol. 139 :2367-2375 所描述的那些方法。优选的偶联剂为SATA和硫代-SMCC，都可从皮尔斯化学公司(罗克福 德，伊利诺斯州)(Pierce Chemical Co. (Rockford, IL))获得。
当结合特异性为抗体时，他们通过两条重链的C末端铰链区的巯氢键偶联起来。 在一个特定优选实施方式中，修饰铰链区使其在偶联前包含奇数量的巯基残基，优选为1
任选地，两种结合特异性可都在同一载体中编码，并且在同一宿主细胞中表达和 组装。当双特异性和多特异性分子为一个mAb X mAb、mAb X Fab、FabX F(ab' )2或配体 X Fab融合蛋白时，这种方法特别有用。本发明的一种如双特异性分子等双特异性或多特 异性分子可为单链分子，例如单链抗体和结合决定簇，或是包含两个结合决定簇的单链双 特异性分子。双特异性和多特异性分子也可为单链分子，或可包含至少两个单链分子。制 备双特异性和多特异性分子的方法在如US 5，260，203、US 5，455，030、US 4，881，175、US 5, 132, 405,US5, 091, 513,US 5, 476, 786,US 5, 013, 653,US 5，258，498 和 US 5，482，858 中 有描述。
可以用酶联免疫吸附测试(ELISA)、放射免疫测试(RIA)、FACS分析、生物测试(如 生长抑制)或蛋白印迹测试来确认双特异性和多特异性分子与他们特异性目标之间的结 合。每个这样的测试通常采用特异性针对感兴趣的复合物的标记试剂(如抗体)来检测所 感兴趣的特定蛋白-抗体复合物的存在。例如，FcR-抗体复合物可以用如识别且特异性结 合到抗体-FcR复合物上的酶联抗体或抗体片段来检测。任选地，可以用各种其他免疫测试 来检测复合物。例如，可以对抗体进行放射活性标记，并且用于放射免疫测试(RIA)中(参 见1986年3月内分泌学会的放射配体测试技术的第七次培训课程中ffeintraub，B的《放 身寸免疫测试原理》(Weintraub, B. , Principles of Radio immunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society，March，1986)))。可 以通过如使用Y计数器或闪烁计数器或通过放射自显影等方法来检测放射性同位素。
人源化抗体框架
并不是一直希望采用非人抗体来进行人类治疗，因为非人的“外源”表位可激发待 治疗的个体的免疫应答。为了消除或是尽可能降低与非人抗体相关的问题，需要工程化改 造嵌合抗体衍生物，即结合了非人Fab可变区结合决定簇和人恒定区(Fe)的“人源化”抗 体分子。这样的抗体具有与上述单克隆和多克隆抗体等价的抗原特异性和亲和力，并且给 予人时免疫原性较低，所以更容易被待治疗的个体所接受。
相应地，在一个实施方式中，结合成员具有人源化抗体框架上携带的结合结构域， 也称为人源化抗体。
人源化抗体一般为带有来源于人抗体的区域和来源于如啮齿动物抗体等非人抗 体的区域的嵌合抗体。人源化(也称为改型和CDR移植)是一种降低来自异种(通常为啮 齿动物)的单克隆抗体(mAb)的免疫原性、提高与人免疫球蛋白的同源性并且改善人免疫 系统的活化的完善技术。因此，人源化抗体通常为一些CDR残基和可能一些框架残基被来 自啮齿动物抗体相似位点的残基所取代的人抗体。
更重要的是，人源化抗体保留了对抗原的高亲和力以及其他有利的生物特性。为 了实现这一目的，根据一个优选方法，用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和 各种概念上的人源化产物的方法，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可以获得 的，并且是本领域技术人员所熟知的。可以利用计算机程序，来说明和显示所选的候选免疫 球蛋白序列可能的三维构象结构。观察这些显示，能够分析某些残基在候选免疫球蛋白序 列的机能中可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合到其抗原上的能力的残基。以这 种方式，可以从接受序列和供体序列选择并结合FR残基，使得如提高对目标抗原的亲和力等所需抗体特性最大化，尽管是CDR残基直接并且最充分地影响抗原结合。
人源化单克隆抗体的一种方法涉及产生嵌合抗体，其中包含一个抗体的完全可变 结构域的抗原结合位点融合到来源于第二抗体的恒定结构域上，所述第二抗体优选为人 抗体。进行这些嵌合化步骤地方法例如EP-A-O 120 694(细胞科技有限公司(Celltech Limited))、EP-A-O 125 023(基因泰克公司(GenentecMnc.))、ΕΡ-Α-0 171 496(日本研 究开发公司(Res. Dev. Corp. Japan) )、EP-A-0173494(斯坦福大学)和 EP-A-O 194 276 (细 胞科技有限公司(Celltech Limited))中描述。抗体人源化的更为复杂的形式涉及重新 设计可变区结构域，使得构成非人抗体结合位点的氨基酸整合到人抗体可变区的框架中 (Jones 等，1986)。
本发明的人源化抗体可以采取能用来源于非人抗体的CDR替换至少人抗体的一 部分CDR的任何方法来制备。Winter描述了一种可用于制备本发明的人源化抗体的方法 (1987年3月沈日递交的英国专利申请GB 2188638A)，其内容在此引用作为参考。可以用 如下列实施例中所述的寡核苷酸定点突变的方法用非人CDR来置换人的CDR。
作为一个例子，本发明的人源化抗体可如下简要说明中所述的进行制备。可以通 过下列步骤来生产本发明的人源化抗体
(a)通过常规技术构建带有编码抗体重链的DNA序列的操纵子的表达载体，其中 保持抗体结合特异性所需的CDR和可变结构域框架区的最小部分是来源于非人免疫球蛋 白，且抗体链的剩余部分来源于人免疫球蛋白抗体。然后生产本发明的载体。
(b)通过常规技术构建带有编码互补抗体轻链的DNA序列的操纵子的表达载体， 其中保持供体抗体结合特异性所需的CDR和可变结构域框架区的最小部分是来源于非人 免疫球蛋白，且抗体链的剩余部分来源于人免疫球蛋白抗体。然后生产本发明的载体。
(c)通过常规技术将表达载体转入宿主细胞中，以产生本发明的转染的宿主细胞； 并且
(d)通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的人源化抗体。
宿主细胞可以用本发明的两种载体共转染，第一载体带有编码来源于多肽的轻链 的操纵子，且第二载体带有编码来源于多肽的重链的操纵子。两个载体带有不同的选择性 标记物，但是除了抗体的重链和轻链编码序列外，其他部分优选为相同的，以保证重链和轻 链多肽的表达相同。任选地，可以使用单个载体，载体包含编码轻链和重链多肽的序列。轻 链和重链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA或两者都有。
用于表达本发明的改造抗体的宿主细胞可为如大肠杆菌等细菌细胞，或真核细 胞。尤其是为了这一目的，可以使用明确类型的哺乳动物细胞，例如骨髓瘤细胞或中国仓鼠 卵巢细胞。
构建本发明载体的通常方法、产生本发明的宿主细胞所需的转染方法、以及从这 样的宿主细胞产生本发明的抗体所需的培养方法都是常规技术。同样的，一旦产生了本发 明的人源化抗体，可以根据下述标准方法来纯化抗体。
人抗体框架
在一个更优选的实施方式中，本发明涉及一个结合成员，其中结合结构域是由人 抗体框架所携带的，即其中抗体要比人源化的抗体带有更多的人肽序列。
直接针对人蛋白的人单克隆抗体可用带有完整的人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠来产生。使用来源于以感兴趣的抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞，来生产 分泌对人蛋白的表位有特异性亲和力的人单抗(参见如Wood等.国际申请WO 91/00906 ； Kucherlapati 等 PCT 公报 WO 91/10741 ;Lonberg 等.国际申请 WO 92/03918 ;Kay 等.国 际申请 92/03917 ；Lonberg, N 等.1994Nature 368 :856-859 ；Green, L. L 等.1994Nature Genet. 7 :13-21 ；Morrison, S. L.等· 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman 等.1993 YearImmunol 7 :33-40 ；Tuaillon 等.1993 PNAS 90 :3720-3724 ； Bruggeman 等· 1991 EurJ Immunol 21:1323—1326)。
这样的转基因小鼠可以从加利福尼亚州弗里蒙特的Abgenix公司(Abgenix， Inc.，Fremont, Calif)禾口新泽西州安女那代尔的 Medarex 公司(Medarex, Inc.，Annandale, N. J)获得。嵌合和胚系突变小鼠中抗体重链连接区(IH)基因的同源缺失导致完全抑制内 源抗体的产生。在这样的胚系突变小鼠中转入人胚系免疫球蛋白基因阵列会导致在抗原 刺激时产生人抗体。参见如 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :2551 (1993)； Jakobovits 等，Nature 362:255-258 (1993) ；Bruggermann 等，Year in Immunol. 7 33(1993)；以及Duchosal等Nature355 :258(1992)。人抗体也可通过噬菌体展示文库 来产生(Hoogenboom 等，J. Mol. Biol. 227 :381 (1991) ；Marks 等·，J. Mol. Biol. 222 581-597(1991) ；Vaughan 等·，Nature Biotech 14:309(1996))。
可选“结合成员”
天然单结构域抗体。重链抗体(HCAb)可为由骆驼科(骆驼、单峰骆驼和 无峰骆驼)天然产生的。HCAb为只有重链的同源二聚体，不带有轻链和第一恒定区 (Hamers-Casterman等，1993)。可以免疫这些动物，来进行只包含单结构域的抗原结合单元 的克隆、选择和生产。此外，这些最小尺寸的抗原结合片段在细菌中很好地表达，与抗原发 生高亲和力的相互作用，并且非常稳定。
新或护士鲨抗原受体(NAR)蛋白以不结合轻链的两条重链二聚体的形式存在。每 条链由一个可变(V)结构域和5个恒定结构域构成。NAR蛋白组成单个免疫球蛋白类可变 结构域(Greenberg, A. S. , Avila, D. , Hughes, Μ. , Hughes, Α. , McKinney, Ε. C. &Flajnik, Μ. F. (1995) Nature (London) 374，168-173.)，要比抗体分子轻得多。
非免疫球蛋白结合成员在一个优选实施方式中，本发明涉及来源于天然存在 的蛋白或多肽的结合成员；所述蛋白或多肽可以重新设计或可从一个文库筛选。结合成 员可为单个部分，例如多肽或蛋白结构域，或是它可包含两个或两个以上的部分，例如一 对多肽。结合成员例如但不限于脂质运载蛋白，单链MHC分子，Anticalin (皮尔斯公司 (Pieris))、Affibody 、或 Trinectin (Phylos)、纳米抗体(Ablynx)。可用本领域熟练技 术人员已知的重组方法来筛选或设计结合成员。
亲和体可用重组DNA技术领域技术人员所熟知的方法来重组产生。可用噬 菌体展示技术来识别能特异性识别特定抗原的亲和体。亲和体可以在任何合适的宿 主内产生，例如但不限于大肠杆菌或酿酒酵母(参见下文)(Hansson M等，“一个体外 筛选的结合蛋白(亲和体)显示了呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白的构象依赖的识别”， Immunotechnology. 1999/3 ；4 (3-4) :237-52.)
亲和体-抗体嵌合体。在本发明的另一个实施方式中，所述结合成员为亲和体-抗 体嵌合体(Ronnmark J等，“大肠杆菌中产生的亲和体-Fc嵌合体的构建和鉴定”.J ImmunolMethods. 2002/3/1 ；261(1-2) :199-211)。本发明的亲和体-抗体嵌合体可以用几种方法 构建，例如通过核苷酸序列的融合、多肽序列的融合。可以通过DNA重组技术，将亲和体的 核酸序列融合到抗体的核酸序列上，在合适的宿主中产生结合成员。亲和体核苷酸序列可 例如融合到抗体轻链核苷酸序列上或是抗体重链核苷酸序列上。在本发明的一个实施方式 中，亲和体序列可以融合到一个抗体序列的片段上。例如但不限于，亲和体序列可以融合到 抗体的Fc片段上，因此可能通过同源二聚化允许二聚体形成。亲和体抗体嵌合体可以包含 多个亲和体序列，例如至少六个亲和体序列中的至少两个、三个、四个。在本发明的一个实 施方式中，两个亲和体的融合物，可以与一个Fc片段融合，一旦二聚化产生一个四价结合 成员。
任选地，可以通过本领域技术人员已知的方法将两个蛋白/多肽分子连接起来。
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产生本发明所述多肽的一般方法
可以用一种或多种下述方法来产生具有SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQID NO 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7 或是本文其他地方所述的上 述序列的任何变体的多肽。
本发明的多肽，包括全长多肽、功能片段和融合蛋白，可以用常规技术在重组宿主 细胞中产生。为了表达如本发明所述的基因，编码多肽的核酸分子必须可操作的连接到控 制表达载体中转录表达的调控序列上，然后导入到宿主细胞中。除了如启动子和增强子等 转录调控序列外，表达载体可包括翻译调控序列和适用于筛选带有表达载体的细胞的标记 物基因。
包含本发明所述的多肽的宿主细胞的例子可为动物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细 胞、真菌细胞、酵母细胞、细菌细胞和植物细胞。
适用于在真核细胞中产生外源蛋白的表达载体，通常包含(1)编码细菌复制起始 位点和一个抗生素抗性标记物的原核DNA元件，以提供在细菌宿主中表达载体的生长和选 择；( 控制转录起始的真核DNA元件，例如启动子；以及C3)控制转录本加工的DNA元件， 例如转录终止/多聚腺苷酸序列。如上所述，表达载体还可包括编码引导异源多肽进入宿 主细胞的分泌通路的分泌序列的核苷酸序列。例如，一个表达载体可包含如本发明所述的 基因，以及来源于所述基因或另一个分泌基因的分泌序列。
通常用于细菌的载体例子包括pET系列(Novagen)，pGEX系列(GE医疗集团)， PBAD系列(英杰公司)。用于酵母的载体例子有用于毕赤酵母酵母的pPic系列(英 杰公司)、来源于乳酸克鲁斯酵母的PKlac系列(新英格兰生物公司)、酿酒酵母载体 (Patel, 0.，Fearnley, R禾口 Macreadie, I. · 3002. “带有可被凝血酶酶切的N末端和C末 端6x (His)标签的酿酒酵母表达载体”，Biotechnol Lett. 2003 25(4) =331-334)以及用 于酿酒酵母的PYes系统(英杰公司)。用于真菌的载体的例子pBAR系列(如Pall，Μ. L 和J. Brunelli. 1993. “带有唯一限制性位点的多聚接头的一系列6个真菌转化载体”(A series of six compact fungal transformation vectors containing polylinkers with unique restrictions sites). Fungal Genetics Newsletter 40 :59-61)。基于 pIEx 质粒 的系统(默克公司)或基于杆状病毒系统(默克公司)是可用于昆虫细胞的两个例子。相 似的产品可以从其他公司获得。
可用于昆虫细胞的载体的例子包括四环素调控系统pTet和pTre，基于腺病毒的 系统Adeno-X，基于逆转录病毒的系统Rethro-X(都为克隆科技公司)和pcDNA载体(英杰 公司)。此外，在市场上还存在许多更多的例子。
如本发明所述的多肽可在哺乳动物细胞中表达。合适的哺乳动物宿主细胞的例 子包括非洲绿猴肾细胞(Vero ;ATCC CRL 1587)、人胎肾细胞Q93-HEK ;ATCC CRL 1573)、 幼仓鼠肾细胞(BHK-21, BHK-570 ；ATCC CRL 8544，ATCCCRL 10314)、狗肾细胞(MDCK ；ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CH0-K1 ；ATCC CCL61 ；CHO DG44 [Chasin 等，Som. Cell. Molec. Genet. 12 :5551986])、大鼠垂体细胞(GHl ；ATCC CCL82)、HeLa S3 细胞(ATCC CCL2. 2)、大 鼠肝癌细胞(H-4-II-E ；ATCC CRL 1548)、SV40-转化的猴肾细胞(C0S-1 ；ATCC CRL 1650) 和小鼠胚胎细胞(NIH-3T3 ；ATCC CRL 1658)。
用于表达本发明所述的多肽的哺乳动物宿主细胞并没有作为修饰人的胚系基因 同一性的方法，在这个方法中只描述了永生化的或转化的二倍体人细胞。
对于哺乳动物宿主，转录和翻译调控信号可以来自病毒来源，例如腺病毒、牛乳头 状瘤病毒、猿病毒等等，其中调控序列与高水平表达的特定基因相关。合适的转录和翻译调 控序列也可从如肌动蛋白，胶原蛋白，肌球蛋白和金属硫蛋白基因等哺乳动物基因获得。
转录调控序列包括足以引导RNA合成起始的启动子区。合适的真核启动子包 括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，J. Molec. Appl. Genet. 1 :273 (1982))、疱 疹病毒的 TK 启动子(McKnight，Cell 31 :355 (1982))、SV40 早期启动子(Benoist 等.， Nature 290 :304 (1981))、劳氏肉瘤病毒启动子(Gorman 等，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA 79 :6777(1982))、巨细胞病毒启动子(Foecking 等，Gene 45 101 (1980))、以及小鼠 乳腺瘤病毒启动子(一般参见1996年约翰威立国际出版公司出版的Cleland等编的《蛋 白工程理论与实践》第163188页的Kcheverry的“哺乳动物细胞培养中工程化蛋白 白勺表达，，(Etcheverry， “ Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein Engineering :Principles and Practice,Cleland et al. (eds.), pages 163 181 (John ffiley&Sons, Inc.1996)
任选地，如果原核启动子受到真核启动子的调控，如细菌噬菌体T3RNA聚合酶启 动子等原核启动子可用于在哺乳动物细胞中调控基因表达(aiou等，Mol. Cell. Biol. 10 4529 (1990)，和 Kaufman 等，Nucl. Acids Res. 19 :4485 (1991))。
可以用各种标准技术将表达载体导入到宿主细胞中，包括磷酸钙转染、脂质体介 导的转染、基因枪介导的递送、电转等等。这些转染的细胞可以筛选并且繁殖，以提供表 达载体稳定整合到宿主细胞基因组中的重组宿主细胞。将载体导入到真核细胞的技术和 利用显性选择性标记物筛选这样的稳定转化子的技术在Ausubel (19%)和1991年胡马 纳出版社出版的Murray编的《基因转移和表达方法》(Murray (ed.)，Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991))中有描述。
例如，一种合适的选择性标记物是提供对抗生素新霉素抗性的基因。在这一情况 下，在如G418等新霉素类药物存在下进行筛选。也可用筛选系统来提高感兴趣的基因的表 达水平，方法称为“扩增”。在低水平的选择性药剂存在下培养转染物，然后提高选择性药剂 的量来筛选高水平表达导入基因的产物的细胞，进行扩增。一种合适的可扩增的选择性标 记物为二氢叶酸还原酶，它提供了对甲氨蝶呤的抗性。也可以使用其他药物抗性基因(如潮霉素抗性，多药物抗性，嘌呤霉素乙酰转移酶)。任选地，引入改变表型的标记物，例如绿 色荧光蛋白，或如CD4、CD8、MHC-I类和胎盘碱性磷酸酶，可以采用如FACS分选或磁珠分离 技术等方法将转染的细胞从未转染的细胞中分选出来。
如本发明所述的多肽也可用病毒递送系统从培养的哺乳动物细胞中产生。用于这 个目的的病毒的例子包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、腺病毒相关病毒(AAV)。腺病毒为 一种双链DNA病毒，是目前研究得最成熟的用于异源核酸递送的基因传递载体(综述参见 Becker 等，Meth. Cell Biol. 43 :161(1994)，以及 Douglas 和 Curiel，Science&Medicine 4 44(1997))。腺病毒系统的优点包括可以容纳相对较大的DNA插入，能够生长达到高滴度， 能感染广泛类型的哺乳动物细胞，并且具有能使用大量带有不同启动子的现有载体的灵活 性。
通过删除部分腺病毒基因组，可以容纳较大的异源DNA(直到71Λ)插入。这些 插入可以通过直接连接或通过与共转染质粒的同源重组结合到病毒DNA中。一种方法是 从病毒载体上去除关键的El基因，使得除非宿主细胞提供El基因否则病毒无法复制。例 如，腺病毒载体感染的人293细胞(ATCC序列号CRL-1573，45504，4550 ，可以作为贴壁 细胞或在相对高细胞浓度的悬浮培养中生长，以产生显著量的蛋白(参见Garnier等， Cytotechnol. 15 :145(1994))。
杆状病毒系统提供了一种将本发明所述的克隆基因导入昆虫细胞的有效手段。 合适的表达载体基于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)，并含有诸如果蝇的热休克 蛋白(HSP)70启动子等熟知的启动子。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒立即早期基因启动 子(ie-Ι)和延迟早期39K启动子，杆状病毒plO启动子和果蝇金属硫蛋白启动子。制造 重组杆状病毒的第二种方法利用了如Luckow所述的以转座子为基础的系统(Luckow，等， J. Virol. 67 :4566(1993))。采用转移载体的这一系统以BAC-to-BAC试剂盒的形式销售(生 命科技公司，罗克维尔，马里兰州(Life Technologies, Rockville,Md.))。该系统采用了一 种转移载体，含有转座子Tn7的杆状病毒(生命科技公司(Life Technologies))，将编码本 发明所述多肽的DNA移动到在大肠杆菌中保留的秆状病毒基因组中，形成一个称为“杆状 病毒质粒”(bacmid)的大质粒。参见Hill-Perkins和Possee，J. Gen. Virol. 71 :971(1990)； Bonning,等·，J. Gen. Virol. 75 :1551(1994)，以及 Chazenbalk 和 Rapoport，J. Biol. Chem. 270 :1543(1995)。此外，转移载体可以包括一个编码表位标签的DNA与如本发明所述 的表达多肽的C端或N端符合读码框的融合，例如，Glu-Glu表位标签(Grussenmeyer等， Proc. Nat' 1 Acad. Sci. 82 7952 (1985)) 0使用本领域已知的技术，用带有本发明的基因 的转移载体转化大肠杆菌，然后筛选带有指示重组杆状病毒的被破坏的IacZ基因的杆状 病毒质粒。然后采用常规技术分离带有重组杆状病毒基因组的杆状病毒质粒DNA。
示例性的PFASTBAC载体可以进行相当程度的修饰。例如，可以去除多角体启动子 并且用在杆状病毒感染早期表达的杆状病毒碱性蛋白启动子(也称为Pcor、p6. 9或MP启 动子)来取代，并且已经证明对于表达分泌蛋白有利(参见例如Hill-Perkins和Possee， J. Gen. Virol. 71 :971 (1990)，Bonning 等·，J. Gen. Virol. 75 :1551 (1994)，以及 Chazenbalk 和Rapoport，J. Biol. Chem. 270 1543 (1995)) 在这样的转移载体构建物中，可以使用短 版本或长版本的碱性蛋白启动子。而且，转移载体可以构建成用来源于昆虫蛋白分泌信 号序列替换本发明多肽的天然分泌信号序列。例如，来源于蜕皮葡糖基转移酶(EGT)、蜜蜂蜂毒肽(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(Invitrogen Corporation ；Carlsbad, Calif.))，或杆状病毒gp67 (PharMingen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，(PharMingen =San Diego, Calif.))的分泌信号肽可以用于在构建物中替换天然分泌信号序列。
用重组病毒或杆状病毒质粒转染宿主细胞。合适的昆虫宿主细胞包括来源于 IPLB-Sf-21的细胞株，草地夜蛾蛹卵巢细胞系，例如Sf9(ATCC CRL 1711)、Sf21AE和 Sf21 (英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)，以及果蝇khneider-2细胞，来源于粉纹 夜蛾的HIGH FIVEO细胞株(英杰公司)(美国专利第5，300，435号)。市售无血清培 养基可用于细胞的生长和维持。合适的培养基为用于Sf9细胞的Sf900II (生命科技 公司)或ESF 921 (表达系统公司(Experssion Systems))；以及用于粉纹夜蛾细胞的 Ex-cel 10405 (JRH 生命科学公司，列涅萨，堪萨斯州(JRH Biosciences, Lenexa, Kans.)) 或Express Five0TM(生命科技公司)。当使用重组病毒时，细胞通常从约2_5 X IO5细胞密 度的接种量生长到为1-2 X IO6细胞的密度，此时以0. 1-10的感染复数(MOI)加入重组病 毒，更典型地为接近3。
已经建立的在杆状病毒系统中生产重组蛋白的技术在下列文献中提供1991年 胡马纳出版社出版的Murray编的《分子生物学方法》第7卷《基因转移和表达方法》中 第 147-168 页 Bailey 等的“杆状病毒载体操作”(Bailey et al.，“ Manipulation of Baculovirus Vectors, “ in Methods in Molecular Biology, VoIume7 :Gene Transfer and Expression Protocols, Murray(ed. ), pages 147168 (TheHumana Press, Inc. 1991))，1995年牛津大学出版社出版的Glover等编的《DNA克隆2 表达系统》第二 版的第205-244页I^atel等的“杆状病毒表达系统”(Patelet al.，“ The baculovirus expression system, " in DNA Cloning 2 -Expression Systems,2nd Edition, Glover et al. (eds·)，pages 205244(Oxford University Pressl995), ),1995 年胡马纳出 版社出版的Richardson编的《杆状病毒表达方法》第1637-1657页Ausubel (1995) (Ausubel (1995)at pages 16 37 to 16 57,byRichardson(ed. ),Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, he. 1995))，以及1996年约翰威立国际出版公司出版的 Cleland等编的《蛋白工程理论与实践》中第183-218页的Lucknow的“昆虫细胞表达技 术，，(Lucknow, “ Insect Cell Expression Technology, " in Protein Engineering Principles and Practice, Cleland et al. (eds. ), pages 183 218(John Wiley&Sons， Inc. 1996))。
包括酵母细胞在内的真菌细胞也可用于表达本发明所述的基因。在这方面特别 感兴趣的酵母种类包括酿酒酵母、毕赤酵母、甲醇毕赤酵母。用于在酵母中表达的合适的 启动子包括来源于GALl (半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(乙醇脱氢酶)、AOXl (乙 醇氧化酶)、HIS4(组氨醇脱氢酶)等等的启动子。已经设计了许多酵母克隆载体，并且随 时可用。这些载体包括基于YIp的载体，例如YIp5 ；YRp载体，例如YRp 17 ；Yep载体，例如 ΥΕρ13 ；以及YCp载体，例如YCpl9。用外源DNA转化酿酒酵母细胞并且由此产生重组多肽 的方法在下列文献中公开例如Kawasaki，美国专利第4，599，311号；Kawasaki等，美国专 利第4，931，373号；Brake，美国专利第4，870，008号；Welch等，美国专利第5,037, 743， 号，以及Murray等，美国专利第4，845，075号。根据选择性标记物确定的表型来筛选转化 的细胞，通常为药物抗性或是能够在缺乏特定营养物(如亮氨酸)的情况下生长。用于酿酒酵母的一种合适载体系统为Kawasaki等(美国专利第4，931，373号)公开的POTl载 体系统，允许通过在含有葡萄糖的培养基中生长来选择转化的细胞。可用于酵母的其他合 适的启动子和终止子包括来自糖分解酶基因(参见如Kawasaki的美国专利第4，599，311 号；Kingsman等的美国专利第4，615，974号；以及Bitter的美国专利第4，977，092号) 和乙醇脱氢酶的启动子和终止子。也参见美国专利第4，990，446号、第5，063，154号、第 5，139，936号和第4，661，妨4号。适用于酵母的常用的和/或市场有售的载体的其他例子为 PPic系列(英杰公司)，来自乳酸克鲁斯酵母的pKlac系统(新英格兰生物公司)和酿酒酵 母载体(Patel 等，Biotechnology letters 2003 vol25(4) :331-334)以及来自酿酒酵母 的pYes系统(英杰公司)。在真菌中，可以使用pBAR系列(Pall等1993 vol.40 =59-61, Functional Genetics Newsletter)。用于包括多形汉逊酵母(Hansenula po lymorpha) > 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、 脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)、毕赤酵 母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)，季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)等其他酵母的转化系统是本领域 已知的。参见如Gleeson等，J. Gen. Microbiol. 132 :3459(1986)以及Cregg的美国专利第 4，882，279号。可以根据.McKnight等的美国专利第4，935，349号的方法使用黑曲霉细胞。 转化枝顶黄青霉的方法在Sumino等的美国专利第5，162，228号中公开。转化脉胞菌的方 法在Lambowitz的美国专利第4，486，533.号中公开。
例如，使用甲醇毕赤酵母作为产生重组蛋白的宿主在Raymond的美国专利第 5，716，808 号、Raymond 的美国专利第 5，736，383 号、Raymond 等，Yeast 14 :1123(1998)以 及国际公报WO 97/17450, WO 97/1745UW0 98/02536和W098/02565中公开。用于转化甲 醇毕赤酵母的DNA分子通常制成双链、环状质粒，在转化前可以进行线性化。对于甲醇毕赤 酵母中产生多肽，质粒中的启动子和终止子可为甲醇毕赤酵母的启动子和终止子，例如甲 醇毕赤酵母中的乙醇利用基因(AUG1或AUG》。其他可用的启动子包括二羟基丙酮合成酶 (DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了促进DNA整合到宿主 染色体上，优选在宿主DNA序列的两端连接质粒的完整表达片段。一种用于甲醇毕赤酵母 的合适选择性标记为甲醇毕赤酵母ADE2基因，其编码磷酸核糖-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC ； EC 4. 1. 1.21)，并且允许ade2宿主细胞在缺乏腺苷酸的条件下生长。对于需要尽可能减少 甲醇使用的大规模工业化方法，可以使用两个甲醇利用基因(AUG1和AUG2)都缺失的宿主 细胞。对于分泌蛋白的生产，可以使用空泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)缺陷的宿主细胞。 使用电转促进带有编码感兴趣多肽的DNA的质粒导入到甲醇毕赤酵母细胞中。可以用电 转来转化甲醇毕赤酵母细胞，采用场强为2. 5-4. 5kV/cm的指数衰减的脉冲电场，优选为约 3. 75kV/cm，并且时间常数(t)为1-40毫秒，最优选为约20毫秒。
也可以将表达载体导入植物原生质体、完整的植物组织、或是分离的植物细胞中。 将表达载体导入植物组织的方法包括农杆菌直接感染或与植物组织共培养，基因枪介导 的递送，DNA注射，电转等等。参见例如Horsch等，Science227 12 (1985)，Klein等， Biotechnology 10 :268(1992)以及1993年CRC出版社出版的Glick等编的《植物分子 生物学和生物技术方法》第67-88页Miki等的“将外源DNA转入植物的方法”(Miki et al. , “ Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants, " in Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), pages 67 88(CRC Press,1993))。
任选地，如本发明所述的基因可以在原核宿主细胞中表达。可用于在原核宿主中 表达本发明所述多肽的合适的启动子为本领域技术人员所熟知的，并且包括能够识别T4、 T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，细菌噬菌体λ的1\和1\启动子，大肠杆菌的trp、recA、热休 克蛋白、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA和IacZ启动子，枯草杆菌的启动子、杆菌的细菌噬 菌体的启动子、链霉菌启动子、细菌噬菌体λ的int启动子，pBR322的bla启动子，以及氯 霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子在Glick，J. Ind. Microbiol. 1 :277(1987), 1987年本杰明-卡明斯公司出版的Watson等的《基因分子生物学》第4版(Watson etal.， Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987)),以及 Ausubel 等 (1995)中有综述。
合适的原核宿主包括大肠杆菌和枯草杆菌。合适的大肠杆菌菌株包括BL21 (DE3)、 BL21 (DE3)pLysS、BL21 (DE3)pLysE、DHU DH4I、DH5、DH5I、DH5IF、DH5IMCR、DH10B、DHIOB/ p3、DH11S、C600、HB10U JM10U JM105, JM109, JMl 10, K38、RRU Y1088、Y1089、CSH18、 ER1451和ER1647(参见例如1991年学术出版社出版的Brown等编的《分子生物学实验介 绍》(Brown(ed. ) ,Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991))。合适的枯草杆菌 菌株包括BR151、YB886、MI119、MI120和B170(参见例如1985年IRL出版社出版的Glover 编的((DNA克隆实践方法》中的Hardy的“杆菌克隆方法” (Hardy, “ Bacillus Cloning Methods, ‘’ in DNA Cloning :A Practical Approach, Glover (ed. ) (IRL Press 1985))。
当在如大肠杆菌等细菌中表达如本发明所述的多肽，多肽可以留在胞浆中，通常 作为不可溶的颗粒，或是通过细菌分泌序列引导进入外周胞质空间。在前一种情况下，裂解 细胞，并且采用如异硫氰酸胍或尿素回收颗粒并且变性。然后通过稀释变性剂将这些变性 的多肽进行复性并且二聚化，例如通过对尿素和还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽混合物 的溶液进行透析，然后对生理盐水缓冲溶液进行透析。在后一种情况下，可以从外周胞质回 收可溶性且有功能形式的多肽，通过分裂细胞(例如通过超声或者渗压休克)释放出外周 胞质空间的内容物，并且回收蛋白，从而避免了需要变性和复性。
在原核宿主中表达蛋白的方法是本领域技术人员所熟知的(参见例如1995年牛 津大学出版社出版的Glover等编的《DNA克隆2 表达系统》第二版的第15页Williams等 的“采用质粒载体在大肠杆菌中表达外源蛋白并且纯化特异性的多克隆抗体”(Williams et al. ， “ Expression of foreign proteins in Ε.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies, 〃 in DNACloning 2 Expression Systems,2nd Edition，Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)) ；1995年威立-里斯出版公司出版的《单克隆抗体理论和应用》第137 页Ward等的“抗体的遗传操作和表达”(Ward et al.，“ Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, " in Monoclonal Antibodies Principles and Applications, page 137 (ffiley-Liss, Inc. 1995)),以及 1996 年约翰威立出版公司出版 的Cleland等编的《蛋白工程理论与实践》第101页的Georgiou的“蛋白在细菌中的表 达，，(Georgiou, “ Expression of Proteins in Bacteria, " inProtein Engineering Principles and Practice, Cleland et al. (eds. ) , page 101 (John ffiley&Sons，81Inc.1996))。
将表达载体导入细菌、酵母、昆虫和植物细胞的标准方法在如Ausubel (1995)中提供。
表达并且回收由哺乳动物细胞系统产生的外源蛋白的常规方法在如1996年 威立-里斯出版公司出版的Cleland等编的《蛋白工程理论和实践》中第163页的 Etcheverry的“在哺乳动物培养中工程化蛋白的表达”中提供(Etcheverry，‘‘ Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture, " in Protein Engineering Principles and Practice, Cleland et al. (eds. ), pages 163(Wiley—Liss，Inc.1996))。 回收细菌系统产生的蛋白的标准技术在如1995年牛津大学出版社出版的Glover等编的 ((DNA克隆2 表达系统》第二版第5992页的Grisshammer等“从大肠杆菌细胞回收过表达 的蛋白，，中提供(Grisshammer et al. , “ Purification of over-produced proteins from Ε.coli cells, " in DNA Cloning 2 :Expression Systems,2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 59 92 (Oxford University Pressl995))。已经建立的从杆状病毒 系统中分离重组蛋白的方法在1995年胡马纳出版社出版的Richardson编的《杆状病毒 表达方法》(Richardson (ed. ), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995))中有描述。
作为替代方案，本发明的多肽可以通过排除固相合成、部分固相方法、片段缩 合或是经典的溶液合成来合成。这些合成方法是本领域技术人员所熟知的(参见例如 Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 :2149(1963) ； 1984 年皮尔斯化学公司出版的 Stewart 等 的《固相肽合成》第二版(Stewart et al.，“ Solid Phase P印tide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984)) ；Bayer 禾口 Rapp, Chem. Pept. Prot. 3 3 (1986)； 1989年IRL出版社出版的Atherton等的《固相肽合成实践方法》(Atherton et al.， Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach(IRL Press 1989)) ；1997 ^Ξ 学术出版社出版的《酶学方法》第289卷的Fields和Colowick的“固相肽合成”(Fields and Colowick, “ Solid-Phase Peptide Synthesis, " Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997))；以及 1997 年 CRC 出版社出版的 Lloyd-Williams 等的《合 成多Jft和蛋白的化学方法》(Lloyd-Williams et al.，Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, he. 1997))。整个化学合成策略的变 化，例如“天然化学连接”和“表达的蛋白连接”也是标准的(参见例如Dawson等，Science 266 :776(1994) ;Hackeng 等，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA 94 :7845(1997) ；Dawson, Methods Enzymol. 287 :34(1997) ；Muir 等，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 95:6705(1998)； 以及 kverinov 和 Muir，J. Biol. Chem. 273 16205 (1998)).
本发明包括带有如本发明所述的肽或多肽的组合物。这样的组合物还包含一种运 载体。该运载体可为常规的有机或无机运载体。运载体的例子包括水、缓冲溶液、乙醇、丙 二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油等。
本发明所述多肽的分离
本发明的多Jft(SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7或本文其他地方所述的上述序列的任何变体)可以纯 化到至少约80%的纯度，到至少约90%的纯度、到至少约95%的纯度，或甚至大于95%的纯度，相对于污染的大分子，尤其是其他蛋白和核酸，并且不含感染剂和热原。本发明的多 肽也可纯化到药学纯的水平，即纯度大于99. 9 %。在一些制剂中，纯化的多肽基本不含有其 他多肽，尤其是动物来源的其他多肽。
可用分馏法和/或常规纯化方法获得从天然来源纯化的本发明所述的多肽的 制剂，以及从重组宿主细胞纯化的本发明所述的重组多肽和本发明所述的融合多肽。一 般而言，可以用硫酸铵沉淀以及酸或离液剂萃取来分馏样品。示例性的纯化步骤可包 括羟基磷灰石、尺寸排阻层析，FPLC和反相高效液相色谱法。合适的色谱介质包括衍生 的右旋糖酐，琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺，特种二氧化硅等等。优选PEI、DEAE、QAE和 Q衍生物。示例性的层析介质包括与苯基，丁基或辛基衍生化的介质，如苯基琼脂糖凝 1 FF(Phenyl-SepharoseFF)(法玛西亚公司((Pharmacia)),日本珠丁基 650 (Toyopearl butyl 650)(托索哈斯公司，蒙哥马利，宾夕法尼亚州((Toso Haas, Montgomeryville, 1 .)),辛基琼脂糖凝胶(Octyl-kpharose)(法玛西亚公司(Wmrmacia))等等；或聚丙烯 树脂，如Amberchrom CG71 (托索哈斯公司)等等。合适的固体支持物，包括玻璃珠，基于硅 胶的树脂，纤维素树脂，琼脂糖珠，交联琼脂糖珠，聚苯乙烯珠，交联聚丙烯酰胺树脂等等， 在其使用条件下为不可溶的。这些支持物可以用反应活性基团进行修饰，使得蛋白可以通 过氨基、羧基、巯基、羟基和/或糖基部分连接上去。
化学耦合的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化，环氧化物活化，巯基 活化，酰胼活化，以及碳二亚胺化学耦合的羧基和氨基衍生物。这些和其他固体介质是本 领域所熟知的并且广泛应用的，并可以从商业供应商处获得。选择分离和纯化多肽的特定 方法是一个常规设计问题，部分取决于所选择的支持物的属性。例如参见《亲和层析原 理与方法》，(法玛西亚LKB生物技术公司，1988年)和Doonan的《蛋白质纯化方法》(胡 马纳出版社，1996 年)(Affinity Chromatography :Principles&Methods (Pharmacia LKB Biotechnologyl988), and Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996))。
分离和纯化本发明所述多肽的其他变化是本领域技术人员可以想到的。例如，如 下所述获得的识别本发明的多肽及其片段的特异性抗体可以用来通过免疫亲和纯化分离 大量的蛋白。
本发明的多肽也可通过利用特定的性质来进行分离。例如固定化金属离子吸附 (IMAC)层析可以用来纯化富含组氨酸的蛋白，包括带有多聚组氨酸标签的蛋白。简要地说， 首先给胶带上二价金属离子形成螯合物(Sulkowski，"Trendsin Biochem. 3 1 (1985)) 0根 据所用的金属离子，富含组氨酸的蛋白以不同的亲和力吸附到这一基质上，然后可以通过 竞争性洗脱、降低PH或使用强螯合剂来洗脱。纯化的其他方法包括通过凝集素亲和层析和 离子交换层析来纯化糖基化蛋白(M. Deutscher编，Meth. Enzymol. 182 =529(1990)).。在本 发明的其他实施方式中，可以构建一个感兴趣的多肽和亲和标签的融合物(如麦芽糖结合 蛋白，免疫球蛋白结构域)来方便纯化。
如本发明所述的多肽及其片段也可如上文所述通过化学合成来制备。如本发明所 述的多肽可为单体或多体，糖基化的或非糖基化的、聚乙二醇化的或非聚乙二醇化的，并且 可以带有或不带有一个起始甲硫氨酸氨基酸残基。
序列同源性
在本发明的一个方面，天然存在的或分离的多肽与本发明所述的多肽序列基本相 同，例如 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7，或其直系同源物。
如本发明所用，术语“基本序列相同性”指多肽与SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :2、SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 或 SEQ IDNO :7 或其直系同源物有至少 70%序列相同性，例如至少72%，例如至少74%，例如至少76%，例如至少78%，例如至少 80 %，例如至少82 %，例如至少84 %，例如至少86 %，例如至少88 %，例如至少90 %，例如至 少91 %，例如至少92%，例如至少93%，例如至少94%,例如至少95%，例如至少96%，例 如至少97%，例如至少98%，例如至少99%，或是大于99%的序列相同性。
在另一个实施例中，如本发明所用，术语“基本序列相同性”指多肽与SEQID NO :1、 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO 6 或 SEQ ID NO 7 或 其直系同源物有至少80%的序列相同性，例如至少81%序列相同性，例如至少82%序列相 同性，例如至少83%序列相同性，例如至少84%序列相同性，例如至少85%序列相同性，例 如至少86%序列相同性，例如至少87%序列相同性，例如至少88%序列相同性，例如至少 89%序列相同性，例如至少90%序列相同性，例如至少91%序列相同性，例如至少92%序 列相同性，例如至少93%序列相同性，例如至少94%序列相同性，例如至少95%序列相同 性，例如至少96%序列相同性，例如至少97%序列相同性，例如至少98%序列相同性，例如 至少99%序列相同性，例如至少99. 5%的序列相同性。
在又一个实施方式中，如本发明所用，术语“基本序列相同性”指多肽包含少于 99. 5%的 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7或其直系同源物的氨基酸残基，例如少于98%，例如少于97%，例如 少于96%，例如少于95%,例如少于94%,例如少于93%，例如少于92%,例如少于91%, 例如少于90%，例如少于88%，例如少于86%，例如少于84%，例如少于82%，例如少于 80 %，例如少于75 %，例如少于70 %，例如少于65 %，例如少于60 %，例如少于55 %，例如少 T 50%,例如少于45%，例如少于40%，例如少于35%，例如少于30%，例如少于25%，例 如少于20%，例如少于15%，例如少于10%。
在一个实施方式中，如SEQ ID NO 1所述的多肽为一个片段，其中片段包含少于 1547个SEQ ID NO 1的连续氨基酸残基，例如少于1530个连续氨基酸残基，例如少于1510 个连续氨基酸残基，例如少于1490个连续氨基酸残基，例如少于1470个连续氨基酸残基， 例如少于1450个连续氨基酸残基，例如少于1430个连续氨基酸残基，例如少于1410个连 续氨基酸残基，例如少于1390个连续氨基酸残基，例如少于1370个连续氨基酸残基，例如 少于1350个连续氨基酸残基，例如少于1330个连续氨基酸残基，例如少于1310个连续氨 基酸残基，例如少于1290个连续氨基酸残基，例如少于1270个连续氨基酸残基，例如少于 1250个连续氨基酸残基，例如少于1230个连续氨基酸残基，例如少于1210个连续氨基酸残 基，例如少于1190个连续氨基酸残基，例如少于1170个连续氨基酸残基，例如少于1150个 连续氨基酸残基，例如少于1130个连续氨基酸残基，例如少于1110个连续氨基酸残基，例 如少于1090个连续氨基酸残基，例如少于1070个连续氨基酸残基，例如少于1050个连续 氨基酸残基，例如少于1030个连续氨基酸残基，例如少于1010个连续氨基酸残基，例如少 于990个连续氨基酸残基，例如少于970个连续氨基酸残基，例如少于950个连续氨基酸残基，例如少于930个连续氨基酸残基，例如少于910个连续氨基酸残基，例如少于890个连 续氨基酸残基，例如少于870个连续氨基酸残基，例如少于850个连续氨基酸残基，例如少 于830个连续氨基酸残基，例如少于810个连续氨基酸残基，例如少于790个连续氨基酸残 基，例如少于770个连续氨基酸残基，例如少于750个连续氨基酸残基，例如少于730个连 续氨基酸残基，例如少于710个连续氨基酸残基，例如少于690个连续氨基酸残基，例如少 于670个连续氨基酸残基，例如少于650个连续氨基酸残基，例如少于630个连续氨基酸残 基，例如少于610个连续氨基酸残基，例如少于590个连续氨基酸残基，例如少于570个连 续氨基酸残基，例如少于550个连续氨基酸残基，例如少于530个连续氨基酸残基，例如少 于510个连续氨基酸残基，例如少于490个连续氨基酸残基，例如少于470个连续氨基酸残 基，例如少于450个连续氨基酸残基，例如少于430个连续氨基酸残基，例如少于410个连 续氨基酸残基，例如少于390个连续氨基酸残基，例如少于370个连续氨基酸残基，例如少 于350个连续氨基酸残基，例如少于330个连续氨基酸残基，例如少于310个连续氨基酸残 基，例如少于290个连续氨基酸残基，例如少于270个连续氨基酸残基，例如少于250个连 续氨基酸残基，例如少于230个连续氨基酸残基，例如少于210个连续氨基酸残基，例如少 于190个连续氨基酸残基，例如少于170个连续氨基酸残基，例如少于150个连续氨基酸残 基，例如少于130个连续氨基酸残基，例如少于110个连续氨基酸残基，例如少于90个连续 氨基酸残基，例如少于70个连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于30 个连续氨基酸残基。
在另一个实施方式中，如SEQ ID NO 1所述的多肽为一个片段，其中片段包含SEQ ID NO :1的6个或更多个连续氨基酸残基，例如7个或更多个连续氨基酸残基，例如8个或 更多个连续氨基酸残基，例如9个或更多个连续氨基酸残基，例如10个或更多个连续氨基 酸残基，例如12个或更多个连续氨基酸残基，例如14个或更多个连续氨基酸残基，例如16 个或更多个连续氨基酸残基，例如18个或更多个连续氨基酸残基，例如20个或更多个连续 氨基酸残基，例如22个或更多个连续氨基酸残基，例如M个或更多个连续氨基酸残基，例 如沈个或更多个连续氨基酸残基，例如观个或更多个连续氨基酸残基，例如30个或更多 个连续氨基酸残基。
在一个实施方式中，如SEQ ID NO :2所述的多肽为一个片段，其中片段包含少于 415个SEQ ID NO 2的连续氨基酸残基，例如少于410个连续氨基酸残基，例如少于405个 连续氨基酸残基，例如少于400个连续氨基酸残基，例如少于395个连续氨基酸残基，例如 少于390个连续氨基酸残基，例如少于385个连续氨基酸残基，例如少于380个连续氨基酸 残基，例如少于375个连续氨基酸残基，例如少于370个连续氨基酸残基，例如少于365个 连续氨基酸残基，例如少于360个连续氨基酸残基，例如少于355个连续氨基酸残基，例如 少于350个连续氨基酸残基，例如少于345个连续氨基酸残基，例如少于340个连续氨基酸 残基，例如少于335个连续氨基酸残基，例如少于330个连续氨基酸残基，例如少于325个 连续氨基酸残基，例如少于320个连续氨基酸残基，例如少于315个连续氨基酸残基，例如 少于310个连续氨基酸残基，例如少于305个连续氨基酸残基，例如少于300个连续氨基酸 残基，例如少于295个连续氨基酸残基，例如少于290个连续氨基酸残基，例如少于285个 连续氨基酸残基，例如少于280个连续氨基酸残基，例如少于275个连续氨基酸残基，例如 少于270个连续氨基酸残基，例如少于265个连续氨基酸残基，例如少于260个连续氨基酸85残基，例如少于255个连续氨基酸残基，例如少于250个连续氨基酸残基，例如少于245个 连续氨基酸残基，例如少于240个连续氨基酸残基，例如少于235个连续氨基酸残基，例如 少于230个连续氨基酸残基，例如少于225个连续氨基酸残基，例如少于220个连续氨基酸 残基，例如少于215个连续氨基酸残基，例如少于210个连续氨基酸残基，例如少于205个 连续氨基酸残基，例如少于200个连续氨基酸残基，例如少于195个连续氨基酸残基，例如 少于190个连续氨基酸残基，例如少于185个连续氨基酸残基，例如少于180个连续氨基酸 残基，例如少于175个连续氨基酸残基，例如少于170个连续氨基酸残基，例如少于165个 连续氨基酸残基，例如少于160个连续氨基酸残基，例如少于155个连续氨基酸残基，例如 少于150个连续氨基酸残基，例如少于145个连续氨基酸残基，例如少于140个连续氨基酸 残基，例如少于135个连续氨基酸残基，例如少于130个连续氨基酸残基，例如少于125个 连续氨基酸残基，例如少于120个连续氨基酸残基，例如少于115个连续氨基酸残基，例如 少于110个连续氨基酸残基，例如少于105个连续氨基酸残基，例如少于100个连续氨基酸 残基，例如少于95个连续氨基酸残基，例如少于90个连续氨基酸残基，例如少于85个连续 氨基酸残基，例如少于80个连续氨基酸残基，例如少于75个连续氨基酸残基，例如少于70 个连续氨基酸残基，例如少于65个连续氨基酸残基，例如少于60个连续氨基酸残基，例如 少于55个连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于45个连续氨基酸残 基，例如少于40个连续氨基酸残基，例如少于35个连续氨基酸残基，例如少于30个SEQID NO: 2连续氨基酸残基。
在另一个实施例中，如SEQ ID NO :2所述的多肽为一个片段，其中片段包含SEQ ID NO :2的6个或更多个连续氨基酸残基，例如7个或更多个连续氨基酸残基，例如8个或更多 个连续氨基酸残基，例如9个或更多个连续氨基酸残基，例如10个或更多个连续氨基酸残 基，例如12个或更多个连续氨基酸残基，例如14个或更多个连续氨基酸残基，例如16个或 更多个连续氨基酸残基，例如18个或更多个连续氨基酸残基，例如20个或更多个连续氨基 酸残基，例如22个或更多个连续氨基酸残基，例如M个或更多个连续氨基酸残基，例如沈 个或更多个连续氨基酸残基，例如观个或更多个连续氨基酸残基，例如30个或更多个连续 氨基酸残基。
在一个实施方式中，如SEQ ID NO :3所述的多肽为一个片段，其中片段包含少于 70个SEQ ID NO :3的连续氨基酸残基，例如少于65个连续氨基酸残基，例如少于60个连续 氨基酸残基，例如少于55个连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于45 个连续氨基酸残基，例如少于40个连续氨基酸残基，例如少于35个连续氨基酸残基，例如 少于30个连续氨基酸残基，例如少于25个连续氨基酸残基，例如SEQ ID No 3的少于20 个连续氨基酸残基。
在另一个实施方式中，如SEQ ID NO :3的多肽为一个片段，其中多肽包含SEQ ID NO :3的6个或更多个连续氨基酸残基，例如7个或更多个连续氨基酸残基，例如8个或更多 个连续氨基酸残基，例如9个或更多个连续氨基酸残基，例如10个或更多个连续氨基酸残 基，例如12个或更多个连续氨基酸残基，例如14个或更多个连续氨基酸残基，例如16个或 更多个连续氨基酸残基，例如18个或更多个连续氨基酸残基，例如20个或更多个连续氨基 酸残基，例如22个或更多个连续氨基酸残基，例如M个或更多个连续氨基酸残基，例如沈 个或更多个连续氨基酸残基，例如观个或更多个连续氨基酸残基，例如30个或更多个连续氨基酸残基。本发明还包含能用2个标准识别的变体核酸分子a)确定带有SEQ IDNO :1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 或SEQ ID NO :7氨基酸序 列的多肽之间的同一性和相似性，以及b)在严格条件下进行杂交测试。例如一些基因变体 带有保留了能与编码例如 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7等本发明所述的多肽的多核苷酸或是这样的多核苷酸 的互补物杂交的多核苷酸，然后在严格洗涤条件下进行洗涤，洗涤严格程度等于含有0. 1% SDS的0. 5X到2X SSC在55°C到65°C洗涤。任选地，变体基因鉴定为带有保留了能与编码 例如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO :7等本发明所述的多肽的核酸分子或是这样的多核苷酸的互补物杂交的多 核苷酸，然后在严格洗涤条件下进行洗涤，洗涤严格程度等于含有0. 1% SDS的0. 5X到2X SSC在55 °C到65 °C洗涤。采用常规方法确定序列相同性性的百分比。参见如Altschul等，Bull. Math. Bio. 48 603 (1986)以及 Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915(1992)。简要地说，比较两个氨基酸序列，用缺口开口罚分10、缺口延伸罚分1、以及 Henikoff和Henikoff (ibid.)的“BL0SUM62”得分矩阵来优化比较评分。然后按照下式计 算同一性百分比(相同配对的总数/较长序列的长度加上为了使两个序列对齐导入较长 序列的缺口 )xl00。本领域的熟练技术人员意识到存在多种已经建立的算法能用于比较两个氨基酸 序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是一种检测本发明公开的氨基酸序 列与氨基酸序列的推定或变体所分享的相同序列水平的一种合适蛋白比较方法。FASTA算 法在 Pearson 禾口 Lipman，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA85 2444 (1988)；禾口 Pearson，Meth. Enzymo 1. 183 63(1990)中有描述。简要地说，FASTA首先通过识别检测序列(如SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7)和具有最高度同一性 (如果ktup变量为1)或部分同一性(如果ktup = 2)的测试序列来鉴定序列的相似性， 不考虑保守氨基酸取代、插入或缺失。通过用氨基酸取代矩阵来比较所有配对氨基酸的相 似性，对具有最高度同一性的10个区域进行重新评分，并且“修整”这些区域的末端使其只 包括那些对于最高评分起到作用的残基。如果有数个区域的值高于“阈值”(通过基于序列 长度和ktup值的预先确定的公式来进行计算)，然后检测“修整”的起始区来确定这些区域 是否能连接以形成带有缺口的近似对齐。最后，采用修改过的Needleman-Wunsch-SeIlers 算法(Needleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 444(1970) ；Sellers, SIAM J. App 1. Math. 26 787(1974))来比较两个氨基酸序列的最高评分区，允许氨基酸插入和缺失。FASTA分析的 优选参数为ktup = 1 ；缺口开口罚分=10，缺口延伸罚分=1，以及取代矩阵=BL0SUM62。 如Pearson，Meth. Enzymo 1. 183 63 (1990)的附录2中所述，通过修改评分矩阵文件 ("SMATRIX“)，将这些参数导入FASTA程序。FASTA也可用于使用上述公开的比率确定核酸分子的序列同一性。对于核苷酸序 列比较，ktup值可以在1-6的范围内，优选为3-6，更优选为3。其他参数可以设为缺口开 口罚分=10，且缺口延伸罚分=1。
如本发明所述的多肽中的氨基酸取代本发明还涉及与SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7的氨基酸序列相比，带有一个或多个保守氨基酸取代 的多肽，以及编码带有一个或多个保守氨基酸取代的多肽的多核苷酸。也就是可以获得如 包含 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6
或SEQ ID NO :7的一个或多个氨基酸取代的变体。变体包括下列序列，其中用烷基氨基酸 取代烷基氨基酸、用芳香族氨基酸取代芳香族氨基酸、用含硫氨基酸取代含硫氨基酸、用带 羟基的氨基酸取代带羟基的氨基酸，用酸性氨基酸取代酸性氨基酸、用碱性氨基酸取代碱 性氨基酸、或用二元单羧酸氨基酸取代二元单羧酸氨基酸。在常见氨基酸中，例如“保守氨基酸取代”也可以表示为在下列每个组中的氨基酸 取代(1)甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸，(3) 丝氨酸和苏氨酸，(4)天门冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，(6)赖氨酸，精氨酸 和组氨酸。BL0SUM62表为来源于代表超过500组相关蛋白高度保守区的蛋白序列片段的约 2000个局部多重比较的氨基酸取代矩阵(Henikoff和Henikoff，Proc. Nat' IAcad. Sci. USA 89:10915(1992))。相应地，BL0SUM62取代频率可用于说明可导入本发明的氨基酸序 列的保守氨基酸取代。尽管可以只根据化学性质(如上所述)来设计氨基酸取代，术语“保 守氨基酸取代”优选指BL0SUM62值大于-1的取代，例如，如果取代的特性为BL0SUM62值 等于0、1、2或3，氨基酸取代为保守的。根据这个系统，优选的保守氨基酸取代的特征为 BL0SUM62值至少为1 (如1、2或3)，而更优选的保守氨基酸取代的特征为BL0SUM62值至少 为2 (如2或3)。多肽的特定变体的特征为与本发明公开的对应氨基酸序列(即SEQ IDNO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7)有至 少70 %序列相同性，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %或大于95 %的序列相同性， 例如当氨基酸序列的变化是由于一个或多个保守氨基酸取代时。如“保守氨基酸”变体等氨基酸序列的变体，可以通过下列方法获得，如寡核苷 酸定向突变、接头扫描突变、采用多聚酶链式反应的突变等等(参见如Ausubel (1995)的 第810-822页；以及1991年IRL出版社出版的McPherson编的《定向突变实践方法》 (McPherson(ed. )，Directed Mutagenesis :A Practical Approach(IRL Press 1991))。如本发明所述的多肽还可包含非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包 括但不限于，如反式-3-甲基脯氨酸，2，4_甲醇基脯氨酸，顺式-4-羟脯氨酸，反式-4-羟脯 氨酸，N-甲基氨基乙酸、别-苏氨酸，甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸，羟乙基同型半胱氨酸， 硝基谷氨酰胺，同型谷氨酰胺，哌啶酸，噻唑烷酸，脱氢脯氨酸，3-和4-甲基脯氨酸，3，3- 二 甲基脯氨酸，叔亮氨酸，正缬氨酸，2-苯偶氮基丙氨酸，3-苯偶氮基丙氨酸，4-苯偶氮基丙 氨酸，4-氟苯基丙氨酸。本领域已知用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白的几种方法。例如，可以使 用一种体外系统，其中通过采用化学氨基酰化抑制因子tRNA来抑制无义突变。用于合成 氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域已知的。带有无义突变的质粒的转录和翻译通常 在含有大肠杆菌S30提取物和商业化的酶和其他试剂的无细胞系统中进行。蛋白通过层析来纯化。参见例如 Robertson 等，J. Am. Chem. Soc. 113 2722(1991)，Ellman 等，Methods Enzymo 1. 202 301 (1991)，Chung 等，Science 259 806 (1993)和 Chung 等，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA90 10145(1993)。多重氨基酸取代可采用已知的突变和筛选方法来制备和测试，例如 Reidhaar-Olson 禾口 Sauer(Science 241 53 (1988))或 Bowie 禾口 Sauer(Proc. Nat‘ IAcad. Sci. USA 86:2152(1989))所公开的方法。简单地说，这些作者公开了一些方法，同时打乱 一条多肽上两个或多个位点、筛选功能性多肽，并且然后对突变的多肽测序来确定每个位 点允许的取代的范围。其他可以使用的方法包括噬菌体展示(如Lowman等，Biochem. 30 10832(1991) ；Ladner 等，美国专利第 5，223，409 号；Huse，国际公报第 WO 92/06204 号)，以 及区域定点突变(Derbyshire 等.，Gene 46 145 (1986)；和 Ner 等，DNA 7:127，(1988))。本发明公开的核苷酸和多肽序列的变体也可通过DNA改组来产生，如Stemmer， Nature 370 389(1994) ,Stemmer,Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 91 10747(1994)和国际专 利公报第WO 97/20078号所公开。简要地说，DNA变体分子可以通过体外同源重组来产生， 亲本DNA的随机片段然后用PCR进行重新组装，导致随机引入的点突变，这一技术可以进行 一些调整，通过使用例如来自不同物种的等位变体或DNA分子等一个亲本DNA分子家族，在 过程中引入其他的可变性。对所需活性的选择或筛选，然后进行额外的重复突变和测试，通 过选择所需的突变且同时选择排除有害的变化，提供了序列的快速“进化”。如本发明所公开的突变方法可以与高通量、自动化筛选方法联用，来检测宿主细 胞中克隆的、突变的多肽的活性。编码生物活性多肽或是结合特定抗体的多肽的突变的DNA 分子，可以从宿主细胞中回收，并且用现代装置快速测序。这些方法可以快速确定感兴趣的 多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能用于未知结构的多肽。如本发明所述的多肽的片段本发明也包括多肽的“功能性片段”以及编码这些功能片段的本发明的核酸分子。 可以进行核酸分子的常规缺失分析，以获得编码本发明的多肽的核酸分子的功能性片段。 作为示例说明，编码SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、 SEQ ID NO 6或SEQ ID NO -J的DNA分子，可用Bal31核酸酶消化，来获得一系列的嵌套缺 失。然后将这些片段以正确的读码框插入到表达载体中，并且分离表达的多肽且测试其特 异性结合抗体的能力，外切核酸酶消化的一种替代方法是使用寡核苷酸定点突变来引入缺 失或终止密码子，以特异化产生所需的片段。任选地，如本发明所述的基因的特定片段可以 用多聚酶链式反应来合成。识别功能性结构域的方法是本领域熟练技术人员所熟知的。例如在干扰素的一个 或两个末端的截短研究已经在Horisberger和Di Marco, Pharmac. Ther. 66 507 (1995)中 总结。而且蛋白功能分析的标准技术在下列文献中有描述，例如Treuter等，Molec. Gen. Genet. 240 =113(1993) ； 1987年干扰素系统进展的ISIR-TNO会议的Cantell编的《生物干 扰素系统》第65-72页的Content等的“人干扰素诱导的42kDa 2 5A合成酶的表达和初步 缺失分析，，(Content et al.，“ Expression and preliminary deletion analysis of the 42kDa 2 5A synthetase induced by human interferon, " in Biological Interferon Systems, Proceedings ofISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pages 65 72 (Ni jhoff 1987)); 1985年学术出版社出版的Boynton等编的《动物细胞增殖的控制》第1卷的第169-199页的Herschman的“EGF受体”(Herschman，“ The EGFReceptor, “ in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds. ) pages 169 199 (Academic Press 1985)) ；Coumailleau 等，J. Biol. Chem. 270 29270(1995) ；Fukunaga 等，J. Biol. Chem. 270 25291 (1995) ；Yamaguchi 等，Biochem. Pharmacol. 50 1295 (1995)；以及 Meisel 等，Plant Molec. Biol. 30 1 (1996).本发明还包括与SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7的氨基酸序列相比，带有一个或多个氨基酸取代的本 发明所述多肽的功能片段。通过确定与本发明所公开的特定氨基酸序列的同一性水平，根 据结构来识别变体多肽。基于结构识别变体多肽的一种任选方法为，确定编码潜在变体多 肽的核酸分子是否能与编码如上所述的SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO -J 的核酸分子进行杂交。本发明还提供了包含如本发明所述多肽的带有表位的部分的多肽片段或肽。这些 片段或肽可以包含一个“免疫原性表位”，当用整个蛋白作为免疫原时这部分的蛋白能引发 抗体应答。免疫原性的带有表位的肽可以用标准方法来识别(参见如Geysen等.，Proc. Nat ‘ IAcad. Sci. USA 81 3998(1983))。相反地，多肽片段或肽可以包含一个“抗原性表位”即抗体能特异性结合的蛋白分 子的一个区域。某些表位由氨基酸的线性或连续拉伸构成，并且这些表位的抗原性不会被 变性剂破坏。本领域已经知道，模拟蛋白表位的相对较短的合成肽可用于刺激针对蛋白的 抗体的产生(参见例如Sutcliffe等，Science219 :660(1983))。因此，本发明的带有表位 的抗原性肽和多肽可用于产生能与本发明所述多肽结合的抗体。带有表位的抗原性肽和多肽可包含如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7 的至少 4-10 个氨基酸，例如至 少5-10个氨基酸，例如至少6-10个氨基酸，例如至少7-10个氨基酸，例如至少10-15个氨 基酸，例如约15-30个氨基酸。如本发明所述，这样带有表位的肽和多肽可以通过如本发明所述多肽的片段 化、或通过肽的化学合成来产生。而且，表位可以通过随机肽文库的噬菌体展示来选择 (参见例如 Lane 禾口 St印hen, Curr. Opin. Immunol. 5 268(1993)；禾口 Cortese 等，Curr. Opin. Biotechnol. 7 =616(1996)) 0从包含表位的小肽来识别表位并且产生抗体的标准 方法在下列文献中有描述，例如1992年胡马纳出版社出版的Manson编的《分子生物学 方法》第 10 卷的第 105-116 页 Mole 的“表位定位”(Mole，“ Epitope Mapping, “ in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages 105 116(The Humana Press, Inc. 1992)，)，1995年剑桥大学出版社出版的Ritter和Ladyman编的《单克隆抗 体产生、工程化和临床应用》第60-84页的Price的“合成多肽来源的抗体的产生和鉴 定，，(Price, “ Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, " inMonoclonal Antibodies Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman(eds. ), pages 6084(Cambridge University Press 1995))，1997年约翰威立出版社出版的Coligan编的《免疫学现有方法》第9. 3. 1-9. 3. 5页 禾口第9. 4. 1—9. 4. 11 页(Coligan et al. (eds.),Current Protocols in Immunology,pages 9. 3. 19. 3. 5and pages 9. 4. 1 9. 4. 11 (John ffiley&Sons 1997))。
无论如本发明所述的变体基因的特定核苷酸序列，基因编码一种具有能特异性结 合到抗体上的多肽，所述抗体能特异性的结合SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ IDNO :7。融合多肽包含如本发明所述多肽的融合蛋白可用于在重组宿主中表达如本发明所述的多 肽，并且分离表达的多肽。一种融合蛋白包含从重组宿主细胞引导如本发明所述的多肽 的肽。为了引导如本发明所述的多肽进入到真核宿主细胞的分泌通路，一个分泌信号序 列(也称为信号肽，前导序列，前促序列或前序列)在合适的表达载体中提供。分泌信号 序列可来源于本发明所述的多肽，合适的信号序列也可来源于另一个分泌的蛋白或是重新 合成。分泌信号序列操作性连接到编码如本发明所述的序列的基因上，使得两个序列按照 正确的读码框连接起来，并且定位成引导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌通路中。分泌 信号序列通常位于编码感兴趣的多肽的核苷酸序列的5’端，尽管某些分泌信号序列可以 定位在感兴趣的核苷酸序列上的任何位置(参见例如Welch等美国专利第5，037，743号； Holland等美国专利第5，143，830号)。尽管如本发明所述的基因或是哺乳动物细胞产生的其它蛋白(组织型纤溶酶原 激活因子信号序列，例如美国专利第5，641，655号所述)的分泌信号序列可用于在重组哺 乳动物宿主中表达如本发明所述的基因，酵母信号序列优选用于在酵母细胞中表达。合适 的酵母信号序列的例子为来源于酵母交配信息素α因子(由MF-al基因编码)，转化酶 (由SUC2基因编码)，或酸性磷酸酶(由PH05基因编码)的信号序列。参见例如1995年牛 津大学出版社出版的Glover和Hames编的《DNA克隆2 实践方法》第二版的第123-167页 的Romanos等的“克隆基因在酵母中的表达”(Romanos et al.，“ Expression of Cloned Genes in Yeast," in DNA Cloning 2 :A Practical Approach,2. sup. nd Edition,Glover and Hames(eds. ), pages 123 167(Oxford University Press 1995))。在细菌细胞中，通常希望以融合蛋白形式表达异源蛋白，以降低毒性、提高稳定 性，并且提高表达蛋白的回收率。例如，如本发明所述的基因可以表达为一种带有谷胱甘肽 巯基转移酶多肽的融合蛋白。谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白通常为可溶的，并且可以方便 的在固定化的谷胱甘肽柱上从大肠杆菌裂解液中纯化。在类似的方法中，带有麦芽糖结合 蛋白多肽的如本发明所述的融合蛋白可以用直链淀粉树脂柱来进行分离，而带有截短的蛋 白A基因的C末端的融合蛋白可以用IgG-琼脂糖凝胶进行纯化。在细菌细胞中以融合蛋 白的形式表达异源多肽的已经建立的技术在下列文献中有描述例如1995年牛津大学出 版社出版的Glover和Hames编的《DNA克隆2 实践方法》第二版的第15-58页Williams 等的“使用质粒载体在大肠杆菌中表达外源蛋白并且纯化特异性的多克隆抗体”(Williams et al. , “ Expression of Foreign Proteins in Ε. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies, " in DNACloning 2 :A Practical Approach,2. sup. nd Edition, Glover and Hames(Eds. ), pagesl558(Oxford University Press 1995))。此外，也可以采用市售的表达系统。例如PINPOINT Xa蛋白纯化系统(普洛 麦格公司，麦迪逊，威斯康辛州(PromegaCorporation ；Madison，Wis.))提供了一种使用带 有抗生物素蛋白的树脂来分离带有一种在表达过程中生物素化的多肽的融合蛋白的方法。可以用于分离在原核或真核细胞中表达异源多肽的肽标签包括多聚组氨酸标签(带有对镍螯合树脂的亲和力)，c-myc标签，钙调蛋白结合蛋白(用钙调蛋白亲和层 析分离)，P物质，RYIRS标签(与抗-RYIRS抗体结合)，Glu-Glu标签和FLAG标签(与 抗-FLAG 抗体结合)。参见例如 Luo 等，Arch. Biochem. Biophys. 329 215 (1996)，Morganti 等，Biotechnol. Appl. Biochem. 23 67 (1996)，和 Zheng 等，Gene 186 55 (1997)。编码这些 肽标签的核酸分子可以从如西格玛奥德里奇公司(圣路易斯，密苏里州)(Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, Mo.))获得。融合蛋白的另一种形式包含一个如本发明所述的多肽和一个免疫球蛋白重链恒 定区，通常为一个Fc片段，其包含两个恒定区结构与一个铰链区但缺乏可变区。作为一个 示例说明，Chang等的美国专利第5，723，125号描述了一种包含人干扰素和免疫球蛋白Fc 片段的融合蛋白。干扰素的C末端通过一个肽接头部分连接到Fc片段的N末端。肽接头 的一个例子为一个主要带有T细胞惰性序列的肽，其为免疫惰性的。一个示例性的肽接头 带有GGSGG SGGGGSGGGG S的氨基酸序列。在这个融合蛋白中，优选的Fc部分为人Y 4链， 其在溶液中稳定并且只有很少或没有激活补体的活性。因此，本发明包含一种带有一个如 本发明所述的多肽或其片段、以及一个人Fc片段的融合蛋白，其中本发明所述的多肽或其 片段的C末端经由一个肽接头连接到Fc片段的N末端。在另一个变体中，带有如本发明所述的多肽的融合蛋白还包含一个IgG序列。如 本发明所述的多肽部分共价连接到IgG序列的氨基末端，并且一个共价连接到如本发明所 述的多肽部分的氨基酸的信号肽，其中IgG序列包含或由按照下列顺序排列的下列元件构 成一个铰链区、一个CH2结构域和一个CH3结构域。因此，IgG序列缺乏一个CH1结构域。 如本发明所述的多肽部分显示出蛋白酶抑制活性。产生带有抗体和非抗体部分的融合蛋白 的上述一般方法在LaRochelle等的EP 742830 (WO 95/21258)中有描述。融合蛋白可以用本领域熟练技术人员已知的方法来制备，制备融合蛋白的每一个 组分，并且把他们化学偶联起来。任选地，为正确编码框的编码融合蛋白的两个组分的多核 苷酸可以用已知技术产生，并且用本发明所述的方法来表达。融合蛋白酶切或化学酶切的 一般方法在如Ausubel (1995)的第1619-1625页有描述。药物组合物在另一个方面，本发明涉及一种包括药学上可接受的运载体以及如PAPP-A外部 位点作用因子等外部位点作用因子的药物组合物，以及识别这些药剂的方法。这些药物组 合物可以药理学有效量给予有需要的个体，以获得治疗效果、改善效果或是预防效果。将PAPP-A认定为IGFBP-4蛋白酶，提供了使用PAPP-A作为治疗目标在体内影响 生长和分化的方法。抑制PAPP-A可以降低生物可利用的IGF-I或IGF-II的量。例如，抑 制PAPP-A的活性可用于如再狭窄、动脉粥样硬化和纤维化等病症。激活因子或提高PAPP-A 活性的药剂将会提高生物可利用的IGF-I和IGF-II的量。改变PAPP-A活性或是改变PAPP-A与细胞表面粘附的药剂可以加入到药物组合物 中。例如，如PACl和/或PAC2等PAPP-A抗体可以通过与药学上可接受的无毒赋形剂或运 载体混合起来配制成药物组合物。肠胃外给药的制剂可以包含如常用赋形剂(即药学上可接受的运载体)无菌水或 生理盐水，聚亚烷基二醇例如聚乙二醇，植物油、氢化萘等等。特别是，生物相容性的、生物 可降解的丙交酯多聚物、丙交酯/聚乙二醇共聚物，或是聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物，是用于控制本发明的化合物在体内的释放的赋形剂的例子。其他合适的肠胃外递送系统包括乙 烯醋酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵、植入式输液系统和脂质体。如果需要的话，用于吸入式 给药的制剂可包含如乳糖等赋形剂。吸入式制剂可为包含如聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘 胆酸盐和脱氧胆酸盐的水性溶液，或是也可为用于滴鼻剂形式给药的油性溶液。如果需要， 这些化合物可以配制成用于鼻腔内施用的凝胶。肠胃外给药的制剂也可包括用于口腔内给 药的甘胆酸盐。疾病的治疗攻击IGF信号传导，被认为是与人类疾病高度相关的，尤其是癌症和心血管疾病。 特异性地抑制促进生长的蛋白水解活性可以作为直接抑制IGF信号传导的一种有用的替 代方法，尤其是因为这样抑制IGF受体的活化不会干扰如胰岛素的信号传导。在一个实施方式中，本发明涉及使用一种或多种攻击PAPP-A上外部位点的蛋白 酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，来治疗一种 或多种疾病。本发明还涉及采用一种或多种外部位点作用因子在有需要的个体中调控PAPP-A 的活性和/或产生、和/或IGF释放和/或IGFBP-4酶切。这一个体可为如哺乳动物例如 人类。本发明还涉及用如本发明所述的一种或多种外部位点作用因子调控一种或多种 促进生长的状态，例如再狭窄、动脉粥样硬化、排卵、卵泡发育、伤口愈合、纤维化或癌症，所 述外部位点作用因子例如像PACl或PAC2等PAPP-A外部位点作用因子。本发明还涉及用如本发明所述的一种或多种外部位点作用因子调控一种或多种 抑制生长的状态，例如骨质疏松、骨骼重塑或癌症，所述外部位点作用因子例如像PACl或 PAC2等PAPP-A外部位点作用因子。例如，PAPP-A活性提高可用于伤口愈合、骨折、骨质疏松、或排卵。骨质疏松或其 他骨流失疾病可以从骨骼形成提高和骨再吸收下降中受益。例如用于稳定骨骼的骨板或接骨螺丝、或是通常是在体内用于恢复或保持体腔畅 通的支架等医疗装置，可用一种或多种PAPP-A外部位点作用因子来包被。一种或多种癌症的治疗在一个实施方式中，本发明涉及使用一种或多种攻击PAPP-A上外部位点的蛋白 酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，来治疗一种
或多种癌症。在一个实施方式中，本发明涉及使用一种或多种攻击PAPP-A上外部位点的蛋白 酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体等，来治疗选 自下组的一种或多种癌症急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，肾上腺皮质癌，艾滋 病相关的癌症，艾滋病相关淋巴瘤，肛门癌，星形细胞瘤(如儿童小脑或儿童大脑星形细胞 瘤)，基底细胞癌，肝外胆道癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤， 脑肿瘤，乳腺癌，男性乳腺癌，支气管腺瘤/类癌，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，原发灶不明的 癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤，脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性 淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性疾病，大肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子 宫内膜癌，室管膜瘤(如儿童室管膜瘤)，食道癌，尤文氏家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤(如儿童颅外生殖细胞肿瘤)，性腺外生殖细胞肿瘤，眼癌(眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)， 胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌， 肝细胞(肝)癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤(如儿童下丘脑 和视觉通路的神经胶质瘤)，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)，卡波西氏肉瘤， 肾(肾细胞)癌，喉癌，唇及口腔癌，肺癌(非小细胞或小细胞肺癌)，淋巴瘤(如艾滋病相 关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤)，巨球蛋白血症(如瓦尔登 斯特伦巨球蛋白血症)，骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤，髓母细胞瘤(如儿童髓母细胞 瘤)，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，间皮瘤(如成人恶性间皮瘤或儿童间皮瘤)，原发灶不明的 转移性颈部鳞癌，多发性内分泌腺瘤综合征(例如发生在童年)，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤， 蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病，骨髓瘤(如多发性骨 髓瘤)，慢性骨髓增生性疾病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，鼻咽癌(如儿童鼻咽癌)，神经母细胞 瘤，口咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌(如儿童卵巢癌)，卵巢上皮癌，卵巢生 殖细胞肿瘤，卵巢恶性程度低的肿瘤，胰腺癌，胰腺癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌， 嗜铬细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列 腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(如儿童横纹肌肉瘤)，唾液 腺癌，成人软组织肉瘤，软组织肉瘤(如儿童软组织肉瘤)，子宫肉瘤，塞扎里综合征，皮肤 癌(如非黑色素瘤皮肤癌)，梅克尔细胞皮肤癌，小肠癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(如发生 在儿童)，皮肤T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞 癌，滋养细胞肿瘤(如妊娠滋养细胞肿瘤)，尿道癌，子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视 觉通路和下丘脑胶质瘤(如儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症 和肾母细胞瘤。一种或多种心血管疾病的治疗在一个实施方式中，本发明涉及使用一种或多种攻击PAPP-A上外部位点的蛋白 酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，来治疗一种
或多种心血管疾病，。例如，用PAPP-A抑制剂来包被或浸渗医疗装置可以有助于防止在球囊成形术之 后再狭窄的发生，或是可防止动脉粥样硬化斑块尺寸的进一步增加。带有支架置入的冠状 动脉血管成形术是目前治疗冠状动脉粥样硬化的首要治疗方法，冠状动脉疾病的血管成形 术的一个重要目的就是防止急性和慢性的并发症。现代方法是相当成功的消除了直接问 题。不幸的是，再狭窄仍然出现在20-30%植入支架的患者中。没有已知的药物干预可以防 止再狭窄。并没有界定特定机制，在人中对血管生成术产生应答，在新生内膜形成前，冠状 动脉平滑肌细胞表达IGFBP-4提高。在一个实施方式中，本发明涉及用一种或多种攻击PAPP-A外部位点的蛋白酶抑 制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，来治疗选自下组 的一种或多种心血管疾病动脉瘤，心绞痛，心律失常，动脉硬化，心肌病，脑血管意外(中 风)，脑血管疾病，先天性心脏病，充血性心力衰竭，心力衰竭，心肌炎，瓣膜病，冠状动脉疾 病，扩张型心肌病，舒张功能障碍，心内膜炎，高血压(高血压)，肥厚性心肌病，二尖瓣脱 垂，心肌梗死(心脏病发作)和静脉血栓。在一个实施方式中，本发明涉及使用一种或多种攻击PAPP-A上外部位点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，来治疗选自 下组的一种或多种心血管疾病急性冠脉综合征，例如心肌缺血和心肌梗死，脑血管意外/ 中风，心房颤动，心律失常，心绞痛，稳定型心绞痛，不稳定心绞痛，深静脉血栓和肺栓塞，血 栓(血凝块)，周围动脉闭塞，原发性或继发性动脉血栓或栓塞，血栓形成倾向(发展成血 栓的趋势)，心脏手术和肾功能衰竭血液透析的心肺体外循环，常规抗血栓治疗，凝血因子 异常，血友病，A型血友病(因子VIII缺乏)，B型血友病(因子IX缺乏症或“克里斯马斯 氏病”)和C型血友病(因子XI缺乏症，轻度出血倾向)，血管性血友病，出血，血友病，血小 板障碍(先天性或后天性)，格兰兹曼血小板机能不全，巨血小板综合征(糖蛋白Ib-IX-V 复合物异常)，灰色血小板综合征(缺乏阿尔法颗粒)，δ贮积池缺陷(缺乏致密颗粒)，出 血，血小板数量减少，骨髓增生异常综合征，骨髓疾病，免疫系统造成的破坏，免疫血小板减 少性紫癜/ΙΤΡ，血栓性血小板减少性紫癜/ΤΤΡ，溶血尿毒综合征/HUS，阵发性睡眠性血红 蛋白尿破坏/ΡΝΗ，弥漫性血管内凝血/DIC，肝素诱导的血小板减少症/HIT)，血栓，人工/假 体心脏瓣膜，心脏瓣膜病，细菌性心内膜炎，风湿性二尖瓣病变，二尖瓣狭窄，二尖瓣脱垂， 二尖瓣环钙化，分离主动脉瓣膜疾病，血栓形成倾向(即发展为血栓趋势)，血栓形成倾向， 凝血因子V Leiden，高凝血症，编码凝血因子V的基因突变，深静脉血栓(DVT)，肺栓塞，中 风，心脏病发作，短暂性脑缺血发作，凝血酶原突变，凝血因子II突变，MTHFR突变或维生素 缺乏(维生素B6，B12和叶酸)导致的同型半胱氨酸水平高，抗磷脂综合征(或抗磷脂抗体 综合征)(APS)，动脉和静脉都有血栓，纤溶酶原和纤维蛋白溶解症，阵发性睡眠性血红蛋白 尿，C蛋白缺乏症，S蛋白缺乏症和抗凝血酶III缺乏症。一种或多种骨质疏松的治疗骨质疏松是一种导致骨折风险提高的骨骼疾病。在骨质疏松中，骨矿物质密度 (BMD)下降，骨微结构破坏，并且骨骼中非胶原蛋白的量和多样性发生改变。术语“确定的 骨质疏松”包括出现脆性骨折。骨质疏松是绝经后的妇女中最常见的，此时称为绝经后骨质 疏松，但在存在特定激素紊乱或其他慢性疾病的男性和绝经前妇女中也会发生，或是作为 吸烟和特别是糖皮质激素等药物导致的结果，此时疾病被称为类固醇_或糖皮质激素诱导 的骨质疏松(SI0P或GI0P)。骨质疏松骨折的危险因素可以分为不可改变的或是(潜在)可改变的。此外，在 一些特定疾病和病症中，骨质疏松是一种公认的并发症。药物使用为理论上可改变的因素， 尽管在很多情况下，使用增加骨质疏松风险的药物是不可避免的。不可改变的风险因素骨质疏松的最重要的风险因素为年龄增长(男性和女性) 和女性性别，绝经后的雌激素缺乏与BMD的快速减少相关，而在男性中睾酮水平下降起到 了类似(但较不明显)的效果。虽然骨质疏松在各个种族的人中都有发生。欧洲或亚洲血 统的人容易发生骨质疏松。有骨折或骨质疏松症家族史的人风险提高，对骨折以及骨矿物 密度低的遗传相对较高，从25%到80%。有至少30个基因与骨质疏松的发生相关。那些 已经有过骨折的人要比同样年龄的性别的人发生另一次骨折的机率高至少两倍。潜在可改变的吸烟_吸烟抑制了成骨细胞的活性，是骨质疏松的一种独立风险 因素。体重指数低_体重超重可防止骨质疏松症，无论是通过增加负荷或通过激素瘦素。 营养不良。酒精中毒。运动量不足-骨对物理压力产生应答进行骨骼重塑。在一生中保持 体育活动的人患骨质疏松的风险较低。对骨骼最有效的体育活动类型是负重练习。跑步的人的骨性突起和附着的形状和大小与举重的人不同。在青少年时期体育活动影响最大，对 高峰骨量的影响最大。在成年人中，体育活动有助于维持骨量并能将其提高1或2%。老 年时的身体适应性与摔倒的风险降低要比与骨矿物质密度提高相关性更大。相反地，卧床 不起的人风险显著增加。体育活动过量_过度运动可导致骨骼持续损害，可导致如上所述 的结构耗尽。有大量的例子表明，马拉松选手在后来发生了严重的骨质疏松。在女性中，剧 烈运动导致闭经(月经周期的抑制)，这与雌激素水平下降有关。重金属_已经确定镉、铅 和骨骼疾病之间的强烈相关。接触较低水平的镉在两种性别中都与骨质密度缺失的增加相 关，导致疼痛和增加骨折的风险，特别是在老年人和女性中。接触较高水平的镉导致软骨病 (骨软化)。软饮料-一些研究表明，软饮料(其中许多都含有磷酸)可能会增加骨质疏松 症的风险，其他研究提示软饮料可能取代饮食中的含钙饮料，而不是直接导致骨质疏松。药物-对于潜在导致骨质疏松的药物，需要比较他们的正面作用与对骨骼的退化 作用。由于使用糖皮质激素引起类固醇诱导的骨质疏松(SIOP)-类似库欣氏综合征，主要 影响中轴骨骼。经过长时间摄入后，合成的糖皮质激素处方药强的松龙是一种主要候选因 素。一些专业指导方针建议服用超过30毫克氢化可的松(强的松龙7. 5毫克)的等价物的 患者进行预防，尤其是超过3个月的患者。巴比妥酸盐和一些其他酶诱导抗癫痫药物_这 可能加速维生素D的新陈代谢。质子泵抑制剂_这些药物抑制胃酸的生产，认为这干扰了 钙的吸收。抗凝血剂-长期使用肝素与骨密度下降相关，长期使用华法林(和相关香豆素) 已经与骨质疏松性骨折的风险增加联系了起来。噻唑烷二酮(治疗糖尿病用)_罗格列酮 和可能的吡格列酮等PPARy抑制剂，已经与骨质疏松和骨折的风险增加联系了起来。在一个实施方式中，本发明涉及使用一种或多种攻击PAPP-A外部位点的蛋白酶 抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，用于治疗有选 自下组的风险因素引起的骨质疏松疾病绝经、衰老、荷尔蒙失调、雌激素缺乏、睾丸激素下 降、慢性疾病、吸烟、遗传易感性、身体质量指数低、营养不良、酗酒、身体活动不足、接触重 金属(如镉和铅)、过量饮用软饮料和使用药物，如类固醇/糖皮质激素、或巴比妥类药物或 其它酶诱导抗癫痫药物或质子泵抑制剂或抗凝血剂或噻唑烷二酮(治疗糖尿病用)。给药和剂量方案有效量的本发明的复合物可以采用任何合适的给药途径提供给哺乳动物，尤其是 人。例如，可以采用口腔、直肠、阴道、局部、肠胃外、眼、肺、鼻、等途径。给药的其他例子包 括舌下、静脉内、肌肉内、鞘内、皮下、皮肤和经皮给药。在一个优选实施方式中，给药包括吸 入、注射或灌输。给予如本发明所述的化合物会导致局部(表面)效果或全身(系统性) 效果。剂量形式包括药片、锭剂、分散剂、悬浮剂、溶液、胶囊、乳霜、药膏、气雾剂等等。优 选本发明的化合物是口服或静脉内给药的。所用活性成分的有效剂量可根据所用的特定化合物、给药的方式、所治疗的病症 以及所治疗的病症的严重程度而变化。这个剂量可方便地由本领域的熟练技术人员来确定。在一个实施方式中，本发明的复合物按照每日剂量约0. 1-100毫克每公斤动物体 重来给药，优选为一个单次每日剂量或是分成2-6次每天的剂量给予，或者是以缓释形式 给药，对于最大的哺乳动物，每日总剂量为约1.0-1000毫克，优选为约1-500毫克。在70公斤成年人的情况下，每日总剂量通常为约1-350毫克。对于一个特别有效的化合物，对于 一个成年人的剂量可以低至0. 1毫克。剂量方案可以在这个范围内或者甚至这个范围外进 行调整，以提供最佳治疗应答。口服给药通常采用药片来进行。药片内的剂量的例子为0. 5毫克、1毫克、2毫克、 5毫克、10毫克、25毫克、50毫克、100毫克和250毫克。其他口服形式也可采用相同的剂量 (如胶囊)。如本发明所述的化合物以有效量给予有需要的个体。在一个优选实施方式中，如 本发明所述的化合物的量为从约0. 01毫克/公斤体重/剂到约20毫克/公斤体重/剂的 范围内，例如从约0. 01毫克/公斤体重/剂到约20毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 02 毫克/公斤体重/剂到约18毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 04毫克/公斤体重/剂到 约16毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 06毫克/公斤体重/剂到约14毫克/公斤体重/ 剂，例如从约0. 08毫克/公斤体重/剂到约12毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 1毫克/ 公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 2毫克/公斤体重/剂到约10毫 克/公斤体重/剂，例如从约0. 3毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如 从约0. 4毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 5毫克/公斤体重 /剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 6毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体 重/剂，例如从约0. 7毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 8毫 克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 9毫克/公斤体重/剂到约10 毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 0毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例 如从约1. 2毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 4毫克/公斤体 重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 6毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公 斤体重/剂，例如从约1. 8毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约2. 0 毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约2. 2毫克/公斤体重/剂到约 10毫克/公斤体重/剂，例如从约2. 4毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/齐U， 例如从约2. 6毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约2. 8毫克/公斤 体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约3. 0毫克/公斤体重/剂到约10毫克/ 公斤体重/剂，例如从约3. 2毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约 3. 4毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约3. 6毫克/公斤体重/剂 到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约3. 8毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重 /齐 ，例如从约4. 0毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约4. 2毫克/ 公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约4. 4毫克/公斤体重/剂到约10毫 克/公斤体重/剂，例如从约4. 6毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如 从约4. 8毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约5. 0毫克/公斤体重 /剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约5. 2毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤 体重/剂，例如从约5. 4毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约5. 6 毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约5. 8毫克/公斤体重/剂到约 10毫克/公斤体重/剂，例如从约6. 0毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂， 例如从约6. 2毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约6. 4毫克/公斤 体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约6. 6毫克/公斤体重/剂到约10毫克/
97公斤体重/剂，例如从约6. 8毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约 7. 0毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约7. 2毫克/公斤体重/剂 到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约7. 4毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重 /齐 ，例如从约7. 6毫克/公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约7. 8毫克/ 公斤体重/剂到约10毫克/公斤体重/剂，例如从约8. 0毫克/公斤体重/剂到约10毫 克/公斤体重/剂，例如从约0. 2毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从 约0. 3毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 4毫克/公斤体重/ 剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 5毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重 /剂，例如从约0. 6毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 7毫克/ 公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 8毫克/公斤体重/剂到约8毫克 /公斤体重/剂，例如从约0. 9毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约 1. 0毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 2毫克/公斤体重/剂到 约8毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 4毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/齐U， 例如从约1. 6毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 8毫克/公斤 体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约2. 0毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公 斤体重/剂，例如从约2. 2毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约2. 4 毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，从约2. 6毫克/公斤体重/剂到约8毫 克/公斤体重/剂，例如从约2. 8毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从 约3. 0毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约3. 2毫克/公斤体重/ 剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约3. 4毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重 /剂，例如从约3. 6毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约3. 8毫克/ 公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约4. 0毫克/公斤体重/剂到约8毫克 /公斤体重/剂，例如从约4. 2毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约 4. 4毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，从约2. 6毫克/公斤体重/剂到约8 毫克/公斤体重/剂，例如从约4. 8毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如 从约5. 0毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约5. 2毫克/公斤体重/ 剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约5. 4毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重 /剂，例如从约5. 6毫克/公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约5. 8毫克/ 公斤体重/剂到约8毫克/公斤体重/剂，例如从约6. 0毫克/公斤体重/剂到约8毫克 /公斤体重/剂，例如从约0. 2毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约 0. 3毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 4毫克/公斤体重/剂到 约6毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 5毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/齐U， 例如从约0. 6毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 7毫克/公斤 体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约0. 8毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公 斤体重/剂，例如从约0. 9毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 0 毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 2毫克/公斤体重/剂到约 6毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 4毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例 如从约1. 6毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约1. 8毫克/公斤体 重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约2. 0毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤
98体重/剂，例如从约2. 2毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约2. 4毫 克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，从约2. 6毫克/公斤体重/剂到约6毫克 /公斤体重/剂，例如从约2. 8毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约 3. 0毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约3. 2毫克/公斤体重/剂到 约6毫克/公斤体重/剂，例如从约3. 4毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/齐U， 例如从约3. 6毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约3. 8毫克/公斤 体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约4. 0毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公 斤体重/剂，例如从约4. 2毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从约4. 4 毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，从约2. 6毫克/公斤体重/剂到约6毫 克/公斤体重/剂，例如从约4. 8毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂，例如从 约5. 0毫克/公斤体重/剂到约6毫克/公斤体重/剂。本发明还展示了一种放置在患者体内的医疗装置(如植入体)，其包括外部位点 作用因子例如PAPP-A外部位点作用因子，例如PACl和/或PAC2。共同给药一种或多种抗癌药物的共同给药在一个实施方式中，本发明涉及一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位点的蛋白 酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以及一种或 多种抗癌药物。在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位 点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以 及一种或多种选自下组的抗癌药物阿地白介素/ 普留净(希龙公司)(Aldesleukin/Proleukin(Chiron Corp)),阿仓单抗/ 坎帕斯(美礼联和 ILEX 公司)(Alemtuzumab/Campath (MiIlenniumand ILEX Partners, LP))，阿利维A 酸 / 盘雷汀(里甘药业)(alitretinoin/Panretin(Ligand Pharmaceuticals))，别嘌呤醇/ 赛洛平(葛兰素史克)(allopurinol/Zyloprim(GlaxoSmithKline))，六甲蜜胺/克瘤灵(美国生物科学公司)(altretamine/ Hexalen(USBioscience))，氨磷汀/阿密磷定(美国生物科学公司)(altretamine/ Hexalen(USBioscience))，阿那曲唑/ 瑞宁得(阿斯利康)(anastrozole/Arimidex (AstraZeneca)),三氧化二砷/特瑞森诺(细胞治疗公司)(arsenic trioxide/Trisenox(Cell Therapeutic)),天冬酰胺酶/ 优适宝(默克公司)(Asparaginase/Elspar (Merck&Co，Inc)，卡介苗活菌/蒂斯卡介苗(欧加农公司)(BCG Live/TICE BCG (Organon Teknika Corp)),贝沙罗汀胶囊 / 塔革雷汀(里甘药业)(bexarotene capsules/Targretin (Ligand Pharmaceuticals))，
博莱霉素/ 博莱诺松(百时美施贵宝)(bleomycin/Blenoxane (Bristol-Myers Squibb)),白消安 / 白舒非(葛兰素史克)(busulfan/Busulfex(GlaxoSmithKline))，卡普睾酮/ 二甲睾酮(法玛西亚普强公司)(calusterone/ Methosarb(Pharmacia&Upjohn Company))，卡培他滨/ 希罗达(罗氏)(capecitabine/Xeloda (Roche))，卡钼/ 伯尔(百时美施贵宝)(carboplatin/Paraplatin(Bristol-Myers Squibb)),卡莫司汀/卡氮芥、BiCNU(百时美施贵宝)(carmustine/BCNU， BiCNU(Bristol-Myers Squibb)),带有聚苯丙生20的卡莫司汀植入体/格立得膜剂(吉尔福德制药公 司)(carmustine with Polifeprosan 20 Implant/Gliadel Wafer(Guilford Pharmaceuticals Inc.))，塞来昔布 / 西乐葆(塞尔公司)(celecoxib/Celebrex (Searle))，苯丁酸氮芥/瘤克宁(葛兰素史克)(chlorambucil/ Leukeran (GlaxoSmithKline))，顺钼/ 顺氯氨钼(百时美施贵宝)(cisplatin/Platinol (Bristol-Myers Squibb))，克拉屈滨/鲁斯塔汀、2_CdA(强生药物研究所)(cladribine/Leustatin， 2~CdA(R. W. Johnson Pharmaceutical Research Institute))，环磷酰胺、环磷氮芥/癌得星(百时美施贵宝)(cyclophosphamide Cytoran/ Neosar(Bristol-Myers Squibb))，阿糖胞苷/赛德萨-U(法玛西亚普强公司)(cytarabine/ Cytosar-U (Pharmacia&Upjohn Company)),达卡巴嗪/ 氮烯咪胺(拜尔)(dacarbazine/DTIC-Dome (Bayer))，更生霉素/放线菌素D、可美净(默克)(dactinomycin/actinomycin DCosmegen(Merck)),阿法达贝泊汀 / 血红升(安进公司)(Darkpoetin alfa/Aranesp (Amgen, Inc))，柔红霉素/道诺霉素/正定霉素(贝德福德公司)(daunorubicin/daunomycin/ Daunorubicin(Bedford Labs)),柔红霉素道诺霉素/柔毛霉素(惠氏药厂)(daunorubicin/daunomycin/ Cerubidine (ffyeth Ayerst))，地尼白介素-毒素连接物/恩塔克(塞拉根公司)(Denileukin/diftitox/ Ontak(Seragen, Inc))，右雷佐生/因乐咔(法玛西亚普强公司)(dexrazoxane/Zinecard)，多西紫杉醇/泰索帝(安万特制药)(docetaxel/Taxotere (Aventis Pharmaceutical))，阿霉素、亚德里亚霉素/罗拜克斯(法玛西亚普强公司)(doxorubicin Adr i amyc in/Rub ex(Pharmac i a&Up j ohn Company)),
屈他雄酮丙酸酯/马斯特龙注射液(先达公司)(dromostanolone propionate/ masterone injection (Syntex))，埃利奥溶液(欧范医药公司)(Elliott's B Solution (Orphan Medical，Inc))，表阿霉素/表柔比星(法玛西亚普强公司)(印irubicin/ Ellence (Pharmacia&Up john Company))，磷酸依托泊苷(百时美施贵宝)(etoposidephosphate (Bristol-Myers Squibb)),依托泊苷/VP-16/凡必治(百时美施贵宝)(etoposide/VP-16/ Vepesid(Bristol-Myers Squibb)),依西美坦/阿诺新(法玛西亚普强公司)(exemestane/ Aromasin(Pharmacia&Upjohn Company))，非拉司汀/ 优保津(安进公司)(Filgrastim/Neupogen(Amgen，Inc))，氟尿苷/FUDR(罗氏)(floxuridine/FUDR(Roche))，氟达拉滨/福达华(贝莱克公司)(fludarabine/FIudara (Berlex LaboratoriesInc.))，氟尿嘧啶/5-FU/安瑞欣(fluorouracil/5-FU/Adrucil(ICN Puerto Rico))，氟维司群/ 法洛德(IPR) (fulvestrant/Faslodex (IPR))，吉西他滨/ 健择(礼来制药)(gemcitabine/Gemzar (Eli Lilly)),吉妥珠单抗奥唑米星/麦罗塔(惠氏药厂)(gemtuzumab/ozogamicin/ Mylotarg(Wyeth Ayerst))，醋酸戈舍瑞林/诺雷德植入物(阿斯利康制药)(goserelin acetate/Zoladex Implant(AstraZeneca Pharmaceuticals))，羟基脲/爱治(百时美施贵宝)(hydroxyurea/Hydrea(Bristol_Myers Squibb)),替伊莫单抗/泽瓦林(IDEC制药公司)(Ibritumomab Tiuxetan/ Zevalin(IDECPharmaceuti cals Corp))，去甲氧柔红霉素/依达比星(亚德里亚制药)(idarubicin/Idamycin(Adria Laboratories))，异环磷酰胺/IFEX(百时美施贵宝)(ifosfamide/IFEX(Bristol-Myers Squibb)),甲磺酸伊马替尼/格列卫(诺华公司)(imatinib mesylate/ Gleevec(Novartis))，干扰素α -2a/罗扰素(霍夫曼罗氏公司)(Interferon alfa-2a/ Roferon-A(Hoffmann-La Roche Inc)),干扰素α-2b/甘乐能(先灵公司)(Interferon alfa-2b/Intron A(Schering Corp)),伊立替康/开普拓(法玛西亚普强公司)(irinotecan/ Camptosar(Pharmacia&Upjohn Company))，来曲唑/ 弗隆(诺华公司)(1 etrozole/Femara(Novartis))，亚叶酸、维尔康沃林/亚叶酸钙(伊姆尼克斯公司)(leucovorin Wellcovorin/Leucovorin(Immunex Corporation)),左旋咪唑/俄格米嗦(杨森研究基金会)(levamisole/Ergamisol (Janssen Research Foundation)),洛莫司汀/CCNU/CeeBU(百时美施贵宝)(lomustine/CCNU/CeeBU(Bristol-Myers Squibb)),双氯乙基甲胺/氮芥/盐酸氮芥(默克公司)(meclorethamine/nitrogen mustard/Mustargen(Merck))，醋酸甲地孕酮/梅格施(百时美施贵宝)(megestrol acetate/ Megace(Bristol-Myers Squibb)),美法仑/L-PAM/爱克兰(葛兰素史克)(melphalan/L_PAM/ Alkeran(GlaxoSmithKline))，巯嘌呤/6-MP、乐疾宁(葛兰素史克)(mercaptopurine/6-MP Purinethol(GlaxoSmithKline)),美司那/ 美斯奈(爱斯达制药)(mesna/Mesnex (Asta Medica))，甲氨蝶呤(莱德利制药)(methotrexate (Lederle Laboratories))，甲氧沙林 / 瓦德斯(赛拉克公司)(methoxsalen/Uvadex (Therakos))，丝裂霉素C/突变霉素(百时美施贵宝公司)(mitomycin C/ Mutamycin(Bristol-Myers Squibb)),丝裂霉素C/ 丝裂吉特(超更公司)(mitomycin C/Mitozytrex (Supergen))，米托坦/ 密妥坦(百时美施贵宝)(mitotane/Lysodren (Bristol-Myers Squibb)),米托蒽醌 / 诺肖林(莱德禾丨J 制药)(mitoxantrone/Novantrone (Lederle Laboratories))，苯丙酸诺龙 / 多乐宝灵一50 (欧力口农)(nandrolone phenpropionate/ Durabolin-50(Organon)),诺非单抗/巯诺莫(勃林格殷格翰制药公司)(Nofetumomab/Verluma (Boehringer Ingelheim Pharma KG)),奥普瑞白介素/纽密伽(遗传学研究所)(Oprelvekin/Neumega (Genetics Institute))，奥沙利钼/乐沙定(赛诺菲_圣德拉堡制药)(oxaliplatin/Eloxatin(Sanofi Synthelabo)),紫杉醇/ 泰素(百时美施贵宝)(paclitaxel/Taxol (Bristol-Myers Squibb)),中白米德诺内 / 阿可达(诺华)(pamidronate/Aredia(Novartis)), 培加酶/阿达根(牛培加酶)(恩佐公司)(pegademase/Adagen (Pegademase Bovine) (Enzon)),培门冬Bl / 培力口中白Bl (恩佐公司)(Pegaspargase/Oncaspar (Enzon, Inc))，聚乙二醇非格司亭/纽拉思塔(安进公司)(Pegfilgrastim/Neulasta(Amgen， Inc)),喷妥司汀/尼喷提(帕克戴维斯制药公司)(pentostatin/Nipent (Parke-Davis
102Pharmaceutical Co·))，哌泊溴烷/ 溴丙哌嗪(雅培制药)(pipobroman/Vercyte (Abbott Labs))，光辉霉素/普卡霉素/光神霉素(辉瑞制药)(plicamycin/mithramycin/ Mithracin (Pfizer Labs)),吓吩姆钠/光吓啉(QLT光线治疗公司)(porfimer sodium/ Photofrin (QLTPhototherapeutics Inc.)),甲基苄胼/丙卡巴胼(希格玛托制药)(procarbazine/Matulane (Sigma TauPharms))，奎纳克林/ 阿的平(雅培制药)(quinacrine/Atabrine (Abbott Labs))，拉布立酶/爱立特(赛诺菲-圣德拉堡制药)(Rasburicase/ Elitek(Sanofi-Synthelabo, Inc))，利妥昔单抗 / 美罗华(基因泰克公司)(Rituximab/Rituxan (Genentech, Inc))，沙格司亭/粒细胞集落刺激因子(伊姆尼克斯公司)(Sargramostim/ Prokine (Immunex Corp)),链脲佐菌素/链佐星(法玛西亚普强公司)(str印tozocin/ Zanosar (Pharmacia&Upjohn Company))，塔司/ 司兰索(布莱恩公司)(talc/Sclerosol (Bryan)),他莫昔芬/诺瓦得士(阿斯禾丨J康制药)(tamoxifen/Nolvadex (AstraZeneca Pharmaceuticals))，替莫唑胺/ 泰道(先灵)(temozolomide/Temodar (Schering))，替尼泊苷/VM-26/威门(百时美施贵宝)(teniposide/VM-26/ Vumon(Bristol-Myers Squibb)),睾内酯酮/ 睾内酯(百时美施贵宝)(testolactone/Teslac (Bristol-Myers Squibb)),硫鸟嘌呤/6-TG/硫鸟嘌呤(葛兰素史克)(thioguanine/6-TG/ Thioguanine(GlaxoSmithKline))，噻替哌 / 塞替派(莱德利制药)(thiot印a/Thioplex (Lederle Laboratories))，拓扑替康/ 癌康定(葛兰素史克)(topotecan/Hycamtin(GlaxoSmithKline))，拓扑替康/ 癌康定(葛兰素史克)(topotecan/Hycamtin (GlaxoSmithKline))，托瑞米芬/ 法乐通(奥立安公司)(toremifene/Fareston (Orion Corp))，托西莫单抗/百克莎(科里西亚公司)(Tositumomab/Bexxar(Corixa Corporation)),曲妥单抗 / 赫赛汀(基因泰克公司)(Trastuzumab/Herc印tin (Genentech, Inc))，维甲酸/ATRA/ 凡善能(罗氏)(tretinoin/ATRA/Vesanoid(Roche))，乌拉莫司汀(罗伯茨制药)(UracilMustard (Roberts Labs)),戊柔比星/ 戊司他(美第瓦公司)(valrubicin/Valstar (Medeva))，长春碱/ 威保啶(礼来制药)(vinblastine/Velban(Eli Lilly)),长春新碱/ 安可平(礼来制药)(vincristine/Oncovin (Eli Lilly)),长春瑞滨/ 诺维本(葛兰素史克)(vinorelbine/Navelbine (GlaxoSmithKline))和唑来膦酸 / 择泰(诺华)(zoledronate/Zometa(Novartis))。与一种或多种药物共同给药来治疗一种或多种心血管疾病在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位 点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以 及一种或多种具有抗血小板活性的药物。在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位 点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以 及一种或多种选自下组的具有抗血小板活性的药物阿司匹林，阿洛普令，地他唑，卡巴匹 林钙，氯克罗孟，吲哚布芬，毗考他胺，三氟醋柳酸，氯吡格雷，双嘧达莫，普拉格雷，噻氯匹 定，贝前列素，前列环素，伊洛前列素，曲前列环素，阿昔单抗，依非巴特和替罗非班。在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位 点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以 及一种或多种具有抗凝血活性的药物。在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位 点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以 及一种或多种选自下组的具有抗凝血活性的药物肝素，贝米肝素，达肝素，依诺肝素，那屈 肝素，帕肝素，瑞维肝素，亭扎肝素，舒洛地特，达那肝素，华法林/香豆素，醋硝香豆素，氯 苯茚二酮，杀鼠迷，双香豆素，双苯茚酮，双香豆素乙酯，苯丙羟基香豆素，苯茚二酮，噻氯香 豆素，达比加群，艾卓肝素(idraparinux)，来匹卢定，比伐卢定，阿加曲班，地西卢定，水蛭 素，美拉加群，希美加群，抗凝血酶III，利伐沙班，磺达肝素，C蛋白，S蛋白，TFPI，去纤苷酸 和硫酸皮肤素。在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位 点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以 及一种或多种具有溶解纤维蛋白活性的药物。在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位 点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以 及一种或多种选自下组的具有溶解纤维蛋白活性的药物替奈普酶，阿尼普酶，安克洛酶， 替加色罗，纤维蛋白溶酶，溶栓蛋白酶(brinase)，tPA，uPA，尿激酶和链激酶。在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位 点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以 及一种或多种用于治疗心血管疾病的药物。在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部 位点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变 体，以及一种或多种选自下组的用于治疗心血管疾病的药物ACE抑制剂(如卡托普利， 佐芬普利，依那普利，雷米普利/沃塔司(Altace)，喹那普利，培哚普利，赖诺普利/捷赐 瑞(Zestril)，苯那普利，福辛普利/蒙诺普利，瑞西那明，酪激肽，乳激肽(Iactokinin))； 血管紧张素II受体拮抗剂(如坎地沙坦/阿塔坎(Atacand)，依普罗沙坦，厄贝沙坦/安 普诺(Avapro)，氯沙坦/科素亚，奥美沙坦，替米沙坦/美卡素/匹里托(Telmisartan/Micardis/Pritor)，缬沙坦/代文(Diovan))；直接血管紧张肽原酶抑制剂(如阿利吉仑 /泰克仑那/锐思力(Aliskiren/Tekturna/Rasilez))；利尿剂(如利尿磺胺，利尿酸，托 拉塞米，布美他尼，氢氯噻嗪，氯噻嗪，苄氟噻嗪，阿米洛利，螺内酯，依普利酮，氨苯蝶啶，坎 利酸钾，坎利酮，吲达帕胺，氯噻酮，喹乙宗，汞撒利，美托拉宗，可可碱，西氯他宁)；β _受 体阻滞药(如比索洛尔，卡维地洛，美托洛尔，阿替洛尔，拉贝洛尔，美托洛尔/洛普索/ 托洛XL(Metoprolol/Lopressor/ToprolXL)，普萘洛尔)；肌肉收缩增强剂(如地高辛和 多巴酚丁胺)；钙离子通道阻滞剂(如硝苯地平/拜新同/利心平(Nifedipine/Adalat/ Procardia)，氨氯地平/络活喜，非洛地平/波依定，尼卡地平/卡登(Nicardipine/ Cardene)，尼莫地平 / 尼莫托(Nimodipine/Nimotop)，尼索地平 / 苏拉尔(Nisoldipine/ Sular,)，尼群地平/心涤夫/尼特平(Nitrendipine/Cardiff/Nitr印in)，拉西地平/莫 腾(Lacidipine/Motens)，乐卡地平/再宁平，地尔硫卓/凯帝心(Diltiazem/Cardizem)， 维拉帕米/卡朗/异搏定(Verapamil/Calan/Isoptin)，戈洛帕米/D600)；任选血管扩张剂 (如硝酸异山梨酯，胼屈嗪，二氮嗪，米诺地尔，硝普盐，酚妥拉明，可可碱)；交感神经阻滞 剂(如可乐定，胍法辛，甲基多巴，莫索尼定，利血平，利美尼定，美加明，曲美芬，哌唑嗪，胍 乙啶，吲哚拉明，多沙唑嗪，特拉唑嗪)；以及其他抗高血压药(例如血清素拮抗剂例如酮色 林，血浆内皮素受体拮抗剂例如波生坦，安倍生坦和塞塔生坦)。与一种或多种佐剂共同给药在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击蛋白PAPP-A的外部位 点的蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以 及一种或多种佐剂。佐剂通常用于优化免疫原性组合物的功效。佐剂通常由包括在制剂中用于提供和 /或提高免疫原性组合物诱导所需免疫应答能力的药剂构成。会增强和/或调控免疫原性决定簇的免疫原性的强效、无毒佐剂代表了一组优选 佐剂，所述免疫原性决定簇包括抗原决定簇，包括半抗原决定簇。此外，这样的佐剂优选也 更早地、更有效地或更持久地激活免疫应答。这样的佐剂也可用于当抗原供应有限或是产 生抗原比较贵的情况下本发明所述的佐剂可以根据他们的来源进行分组，分为矿物、细菌、植物或宿主产 物。在这一分类下第一组为矿物佐剂，例如铝化合物。抗原与铝盐沉淀、或是抗原与预制的 铝化合物混合、或是抗原吸附到预制的铝化合物上，已经广泛用于在动物和人中提高免疫 应答。已经证明，在免疫后7天，铝颗粒出现在兔的区域淋巴结中，且它的另一个显著功能 是引导抗原到达在淋巴结中含有T细胞的区域。已经表明，佐剂的功效与提示引流区淋巴 结相关。很多研究已经证明，用延迟型超敏反应测定，抗原与铝盐一起给予会使体液免疫增 强，细胞介导的免疫只表现为微弱增强。也已经描述了氢氧化铝活化了补体通路。这一机 制可在局部炎症反应以及免疫球蛋白产生和B细胞记忆中发挥作用。主要由于他们在安全 性上的极佳记录，铝化合物是目前唯一用于人的佐剂。铝盐对于只需要抗体应答来产生保护的强免疫原是有效佐剂，他们与如疟疾的合 成肽等弱免疫原一起使用、或是用于引入细胞介导的免疫反应、或是需要对抗感染的类型 的IgG同种型时并不一直有效。另一大组佐剂为细菌来源的佐剂。细菌来源的佐剂可为纯化的和合成的(例如胞
105壁酰二肽，类脂A)，并且已经克隆了宿主介导因子(白细胞介素1和2)。过去十年，在化 学纯化至少3种细菌来源的活性成分的佐剂方面取得了显著进展百日咳杆菌、脂多糖和 弗氏完全佐剂(FCA)。因此，符合本发明要求的合适佐剂有如Titermax、ISCOMS、Quil A、 ALUN,参见美国专利US 58767和5，554，372，类脂A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物， LPS衍生物，合成肽矩阵，GMDP，以及与免疫增强剂混合的其他药剂(US 5，876，735)。百日咳杆菌是一种本发明感兴趣的佐剂，因为它能通过作用于T淋巴细胞群来调 控细胞介导的免疫。对于脂多糖和弗氏完全佐剂，佐剂活性基团已经确定并且合成，允许进 行结构-功能关系的研究。这些也考虑包括在本发明所述的免疫原性组合物中。已经发现，脂多糖及其各种衍生物，包括类脂A，是与脂质体或其他脂类乳剂联用 的有效佐剂。还不确定是否可以产生能够常规用于人的毒性足够低的衍生物。弗氏完全佐 剂是多数实验研究中的标准。可以采用很多其他类型的物质作为本发明的免疫原性组合物中的佐剂。他们包括 植物产物例如皂角苷，动物产物例如几丁质以及许多合成化学品。本发明的佐剂也可根据它们可能的作用机制来分类。这一种分类必然有一些武 断，因为多数佐剂是通过一种以上的机制来发挥作用的。佐剂发挥作用可以通过抗原的定 位和递送，或是直接作用于组成免疫系统的细胞，例如巨噬细胞和淋巴细胞。本发明的佐剂 提高免疫应答的另一种机制为产生一个抗原储存库。这有助于铝化合物、油乳剂、脂质体以 及合成聚合物的佐剂活性。脂多糖和胞壁酰二肽的佐剂活性做要通过巨噬细胞的活化来介 导，而百日咳杆菌对巨噬细胞和淋巴细胞都发挥作用。可用于加入本发明的免疫原性组合 物的佐剂的其他例子在US 5，554，372中有描述。与一种或多种凝血级联系统的抑制剂的共同给药在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击PAPP-A上外部位点的 蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以及一 种或多种凝血级联系统的抑制剂。凝血系统受到大量天然存在的系统抑制因子的控制。组织因子途径抑制剂(TFPI) 是一个与血浆脂蛋白和血管内皮细胞相关的34kDa的蛋白。抗凝血酶是一个58kDa的糖蛋白丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，其能使丝氨酸蛋 白酶失活；凝血酶和fXa，以及fXIIa和flXa。它是持续活化的，但通过存在硫酸乙酰肝素蛋 白多糖(粘多糖)或是给予肝素(不同类肝素提高对fXa、凝血酶、或上述两者的亲和力)， 它对于这些因子的粘附提高。抗凝血酶不会使与血凝块结合的凝血酶或fXa失活。蛋白C是一个重要的生理抗凝血剂。它是一个维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶的酶， 由凝血酶激活成活化的蛋白C(APC)。活化形式(与蛋白质S和磷脂一起作为辅助因子)降 解因子Va和因子Villa。该蛋白C途径的关键酶，活化的蛋白C，提供了生理抗血栓活性， 并且表现出抗炎和抗凋亡的活性。它的作用是与血栓形成和缺血性中风的发生相关的。蛋白S是一种在肝脏中合成的维生素K依赖性血浆糖蛋白。在循环中，蛋白S以 两种形式存在游离形式和结合到补体蛋白C4b上的复合物形式。了解最清楚的蛋白S的 功能是它在抗凝血通路中的作用，因为它作为蛋白C的辅助因子作用于因子Va和VIIIa的 失活。只有游离形式具有辅助因子活性。蛋白S也可以通过羧酸化的GLA结构域结合到带 负电荷的磷脂上。此一特性允许蛋白S在去除发生凋亡的细胞中发挥作用，这些细胞表面呈现带负电荷的磷脂。通过结合到带负电荷的磷脂上，蛋白质S作为凋亡细胞和吞噬细胞 之间的衔接分子发挥作用。在正常条件下，促进血液凝固的因子与抑制血液凝固的因子之间存在平衡。当促 凝血刺激因素压倒了抗凝血和纤溶系统时，发生静脉或动脉血栓。魏氏三因素是一组3个 已知影响血凝块形成的因素流速、血液的连贯性(厚度)和血管壁的质量。目前，用于治 疗血栓的医疗干预通过给予抗凝血剂来进行，包括肠胃外给予低分子量肝素(LMWH)然后 口服给予如华法林。一类更新的药物——直接凝血酶抑制剂目前正在开发中，有些成员已 经在临床使用，例如来匹卢定。同时还在研发直接干扰特定凝血因子酶活性的其他小分子 化合物(如利伐沙班)。抗血小板药剂包括阿司匹林，氯吡格雷，噻氯匹定和双嘧达莫；肠 胃外糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂用于血管成形术中。肝素是一种由嗜碱性细胞和肥大细胞产生的天然存在的高度硫酸化的粘多糖。肝 素作为抗凝血剂发挥作用，防止形成血栓块以及血液中存在的血栓块的扩大。虽然肝素没 有破坏已经形成的血栓块(组织型纤溶酶原激活物会破坏已经形成的血栓块)，它使机体 的天然血栓块溶解机制正常工作，来破坏已经形成的血栓块。肝素结合到酶抑制剂抗凝血 酶III (WAT-III)造成构象的变化，导致其活性位点暴露。然后，活化的AT-III使凝血酶 和参与血液凝固的其他蛋白酶失活，尤其是因子Xa。因为结合了肝素，AT-III使这些蛋白 酶的失活速率提高1000倍。AT-III结合肝素聚合物内带有的一个特定的硫酸五糖序列上。 肝素结合引起的AT-III构象变化介导了它对因子Xa的抑制。然而为了抑制凝血酶，凝血 酶也必须在靠近五糖的位置上结合到肝素聚合物上。肝素的高负电荷密度有助于其与凝血 酶很强的静电作用。AT-III、凝血酶及肝素的三元复合物的形成导致凝血酶失活。基于这 个原因，肝素对凝血酶的活性是大小依赖的，三元复合物需要至少18个糖单元来形成有效 的结构。相反地，抗因子Xa活性只需要五糖结合位点。这一大小差异导致了开发低分子量 肝素(LMWH)以及最近的磺达肝素作为药学抗凝血剂，攻击抗因子Xa活性而不是抗凝血酶 (IIa)活性。如果需要长期抗凝血，肝素通常只用于起始抗凝血治疗，直到口服抗凝血剂华 法林生效。因子II、VII、IX和X在其氨基端相互同源。在去除信号肽后，位于内质网和高尔 基体内的羧化酶结合到这些蛋白的前肽区，并且在相邻的“Gla结构域”将约10-12个谷氨 酸(Glu)残基转换成g_羧基谷氨酸(Gla)。在分泌前，从羧酸化的多肽上去除前肽。Gla残 基结合钙离子并且是这些凝血因子活性所必需的。Gla的合成需要维生素K。g-羧酸化过 程中，维生素K被氧化，并且为了循环能够继续，随后必须被还原。抗凝血药物华法林(来 自香豆素家族)抑制维生素K的还原，并且从而阻止了活性因子II、VII、IX和X的合成。抗凝血治疗，通常为短期的肝素注射和/或长期的口服抗凝血剂(通常为华法 林)，当作为预防剂给予高危患者时，或者用于治疗急性动脉或静脉血栓时，能够明显有效 地预防严重的血管事件。因此，抗凝血治疗预防血栓块的形成，并且防止现有血栓块的扩 大。然而，全剂量抗凝血也是严重内出血的常见原因，包括颅内出血、胃肠道出血或腹膜内 出血，它可以是致命的。所以，重要的是，选择最能从抗凝血治疗中获益的患者(即主要血 栓性栓塞事件的风险要超过主要出血的风险的患者)；并且使得在抗凝血治疗中血栓性栓 塞和出血的发病率和死亡率最小化。与治疗骨质疏松的药物共给药
在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击PAPP-A上外部位点的 蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以及一 种或多种用于治疗骨质疏松的药物。在一个实施方式中，一种或多种用于治疗骨质疏松的药物可以选自下面列出的例子。双磷酸盐类双磷酸盐类例如福善美(Fosamax)(阿仑膦酸钠)、骨维壮(Boniva)(伊班膦酸 钠)或安妥良(Actonel)(利塞膦酸钠)是一种帮助钙调控并且预防骨质分解的药物。骨 质转换或是用新骨替换旧骨是我们机体内的正常程序。在骨质疏松的患者中，用新骨替换 没有与旧骨分解保持同步。双磷酸盐类减缓了骨质分解的速率，以通过抑制负责骨质分解 的破骨细胞来帮助维持骨量。雷尼酸锶雷尼酸锶(普特罗锶(Protelos))是一种刺激新骨形成的药物，并且可在患者不 能很好接受双磷酸盐类的情况下使用。锶是骨健康所必需的多种痕量矿物质之一。锶支持 了健康的成骨细胞分化并且帮助破骨细胞活性保持平衡。此外，补充锶支持成骨细胞形成 健康的胶原，提高骨的抗张强度。降钙素(密钙息)降钙素是一种由甲状腺产生的天然存在的激素，可以作为注射剂给予或者作为鼻 喷剂给药。以商品名密钙息(Miacalcin)销售，降钙素也可抑制分解骨的破骨细胞的功能。 长期以来，降钙素一直被认为对骨质疏松患者有益，但是很难注射给药，并且具有讨厌的副 作用。鼻喷剂很大程度上改良了降钙素的应用，并且如今更为常用。也已经发现，降钙素能 减缓骨质流失，并且也减少了与骨质疏松性骨折相关的疼痛。雷洛昔芬雷洛昔芬是一种开发用于提供某些与雌激素(HRT)相同的益处、而没有潜在的副 作用的较新药物。雷洛昔芬是一种称为“选择性雌激素受体调控因子”或SERM的药物。已 经证明，雷洛昔芬的效果与雌激素相似，包括增加骨质和降低胆固醇。然而，SERM对于子宫 内膜没有相同的效果，所以不需要与黄体酮联用。此外，有证据表明，雷洛昔芬可降低患乳 腺癌的风险雌激素激素替代治疗或HRT不仅有助于维持而且还可在绝经后增加骨量。多项研究表明 了雌激素治疗的益处，包括降低骨质疏松和骨折的风险。此外，雌激素替代治疗对于绝经后 患者的其他益处包括降低胆固醇、减少患结肠癌的风险，并且减少绝经后症状。已经表明， HRT增加了患子宫癌的风险，但是当雌激素与黄体酮联用时这一风险被消除。已有研究显 示，在一些研究人群中，患乳腺癌的风险增加。HRT患者也表现出发生血栓块和中风的风险 略有增加。甲状旁腺激素(PTH)PTH既激活了重吸收也激活了新骨形成。间歇给药更多地激活了骨形成而不是重 吸收。迄今为止的临床试验表明，PTH治疗对于预防和治疗骨质疏松都有效，并且每日注射 给予称为骨稳(Forteo)的制剂，目前已被FDA批准用于治疗严重骨质疏松。在建立脊骨密度方面，骨稳(Forteo)要比其他治疗更为有效。然而，因为它需要每天注射，并且因为它的 花费，通常专供患有非常严重的脊柱骨质疏松的患者使用。蒂罗奈(Didronel)蒂罗奈(羟乙膦酸二钠)主要作用于骨。它可以通过化学吸附到磷酸钙表面，抑 制羟基磷灰石晶体以及他们的无定形前体的形成、增长和分解。抑制晶体重吸收发生在比 抑制晶体增长所需剂量更低的剂量。与抗衰老药物共同给药在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击PAPP-A上外部位点的 蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以及一 种或多种抗衰老药物例如下述药物。在一个实施方式中，本发明涉及共同给予一种或多种攻击PAPP-A上外部位点的 蛋白酶抑制剂，例如PACl和/或PAC2或本文所述的PACl和/或PAC2的任何变体，以及 一种或多种选自下组的抗衰老药物抗氧化剂，丁基羟基甲苯(BHT)，乙氧喹啉(二氢乙氧 三甲基喹啉)，DDC(二乙基二硫代氨基甲酸铵)，维生素Ε( α -生育酚)，MEA(巯基乙胺)， 二氨基二乙基DS ( 二氨基二乙基二硫醚)，泛酸盐，维生素，维生素混合物，矿物质，矿物质 混合物，吡哆醇(维生素Β6)，维生素C，维生素Α，维生素Β12，普鲁卡因，二甲基乙醇胺，左 旋多巴，苯乙双胍，苯妥英，ΒΗΤ，对辐射进行保护的药物，如抗辐射药物例如ΜΕΑ，已知能够 抑制自由基反应的药物，乙氧喹啉，NDHGA (去甲二氢化愈创木酸)，原花色甙，生物类黄酮， 茄红素，来源于植物的抗氧化剂，二乙基羟胺(DEHA)，EMHP, 2-乙基-6-甲基-3-羟基吡啶 盐酸，辅酶Q10，硫辛酸，叶酸，硒，类黄酮胡萝卜素，DHEA，维生素B，肉毒碱，SAM，长春西汀 (康维脑(Cavinton))，苄甲炔胺(Eld印ryl，帕定平)，植物药，草药，HGH，β-胡萝卜素，叶 酸，α-硫辛酸，乙酰-L-肉碱，肌酸，褪黑素，鱼油例如50% EPA/DHA，浓缩乳清蛋白，线粒 体抗氧化剂例如R-硫辛酸，NtBHA，艾地苯醌和叶绿酸；SOD调控因子例如苄甲炔胺，喜得镇 (Hydergine)和假马齿苋(Bacopa)；抗糖基化剂例如吡哆胺，苯磷硫胺，肌肽，ALT-711，激 动素，苄甲炔胺，普鲁卡因，铬，钼，钾，酒石酸胆碱，肌醇，PABA，亚麻籽粉，5-HTP，叶黄素，番 茄红素，硫酸盐葡糖胺，SAMe，硼，镍，硅，锡，微量矿物质混合物，钒，浓缩生物类黄酮，银杏 提取物，绿茶提取物，还原型L-谷胱甘肽，L-肉碱，L-谷氨酰胺，DL-苯丙氨酸，L-酪氨酸， 氨基酸混合物，GABA，维生素A，维生素D，维生素K，维生素Bi，核黄素，烟酸，叶酸，生物素， 泛酸，钙，碘，镁，锌，铜，锰，B3，Proleva，人生长激素和生长激素。在另一个实施方式中，一种或多种抗衰老药物包括一种或多种用于治疗和/或预 防特定的衰老疾病的药物，所述疾病例如阿尔茨海默氏症，痴呆症，关节炎，癌症，抑郁症， 糖尿病，高脂血症，高血压，免疫下降，细菌感染，真菌感染，记忆丧失，更年期，肌肉无力，骨 质疏松，帕金森氏病，前列腺增生，性功能障碍，中风危险，中风，体重增加和肥胖。
实施例本发明在下列实施例中进一步描述，这不用于限制权利要求中所述的本发明的范围。实施例1质粒构建物_通过重叠延伸制备一种表达构建物，其编码开始于模块CCPl的带有His标签的鼠PAPP-A的C末端部分(图1)。简要地说，通过PCR从编码人IGFBP-5(基因 库检索号NP_000590)的构建物获得一个编码信号肽(MVLLTAVLLLLAAYAGPAQS)的核苷酸片 段。引物为 5，-GACGAAGCTTATGGTGTTGCTCACCGCGGT-3，( 一个导入的 HindIII 位点用粗体表 示)，以及 5 ’ -TTCTGGGCAGTCGGCGCTCTGGGCCGGCCCCGCAT-3 ’ (编码小鼠 PAPP-A 的 1129-1133 残基的核苷酸序列用下划线标出。1545个残基的小鼠PAPP-A根据(Soe，R.，Overgaard, Μ. Τ. , Thomsen, A. R. , Laursen, L. S. , Olsen, I. M. , Sottrup-Jensen, L. , Haaning, J., Giudice, L. C.，Conover, C. A.，和 Oxvig, C. (2002) Eur. J. Biochem. 269 (8)，2247-2256))进 行编号。1547个残基的人PAPP-A根据(Kristensen，P.和Winter，G. (1998)Fold Des 3(5)， 321-328)进行编号。编码小鼠PAPP-A的1129-1545残基的第二核苷酸片段，后面连上了一 个His标签，是采用编码小鼠PAPP-A的pcDNA3. IiPA作为模板来制备的。引物为5’_GGG CCGGCCCAGAGCGCCGACTGCCCAGAACTGGC-3，(编码小鼠PAPP-A的核苷酸用下划线标出)以及 5 ’ -CATTTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGTCCTGAGCCATGGCTATATCCCCGAAGATCTTTCC-3 ’ ( 一个 XbaI位点用粗体表示，编码后面带有6个组氨酸残基的Gly-Ser残基的核苷酸用斜体表示， 并且编码小鼠PAPP-A的核苷酸用下划线标出)。通过连接2个片段形成的PCR产物克隆到 pcDNA3. 1⑴(英杰公司)的HindIII/Xbal位点，以获得编码后面带有GSHHHHHH氨基酸序 列的小鼠 PAPP-A 的 1129-1545 残基的 pmPA (CCP1 -C-Hi s)。编码人 PAPP-A1133-1547 氨基酸 残基的类似构建物也已经制备。这一构建物不包括His-标签。编码人PAPP-A、小鼠PAPP-A、 人 PAPP-A2、人 PAPP-A/PAPP-A2 嵌合蛋白(PAPP-A (P2-CCP5-C)、PAPP-A (P2-CCP4-C)、 PAPP-A (P2-CCP3-C)、PAPP-A (P2-CCP2-C)、PAPP-A (P2-CCP 1-C)、PAPP-A (P2-CCP3-4)和 PAPP-A (P2-LNR3)、PAPP-A截短的变体(PAPP-A (dLNR3_C))、以及带有单个氨基酸被取代为 丙氨酸的 PAPP-A 变体 PAPP-A (D1484A)、PAPP-A (D1499A)和 PAPP-A (D1502A))的表达构建 物也用于转染。最后，我们采用了一个编码活性位点的Glu483被谷氨酰胺取代的PAPP-A 的构建物 PAPP-A (E483Q)。细胞培养和哺乳动物细胞中蛋白的表达-人胎肾293T细胞(293tsA1609neO)在 含10%胎牛血清、2mM谷氨酸、非必需氨基酸和庆大霉素(英杰公司(Invitrogen))的高糖 DMEM培养基中进行培养。细胞铺到6厘米组织培养盘中，并且18小时后用10μ g以QIApr印 Spin试剂盒(恰根公司(QIAGEN))制备的质粒DNA进行磷酸钙共沉淀瞬转。48小时后，收集 培养基并且进行离心去除杂质。用编码小鼠PAPP-A (1129-1545)、人PAPP-A (1133-1547)、 和人PAPP-A (E483Q)的cDNA转染的细胞在无血清培养基中进一步培养以便于纯化。鸡多克隆抗体的产生-用螯合的琼脂糖凝胶珠(Chelating Sepharose Fast Flow bead) (ImL)(安玛西亚生命科学公司(Amersham Biosciences))的镍亲和层析从无血清 培养基中纯化小鼠PAPP-A(1129-1545)。柱子用IM NaCl、50mM磷酸钠、pH 5. 5洗涤，然 后用含有20mM EDTA的PBS洗脱结合的蛋白。收集的馏分混合起来，然后用以PBS平衡的 ImL HiTrap 肝素 HP 柱(HiTrapifeparin HP column)(安玛西亚生命科学公司(Amersham Biosciences))肝素亲和层析进一步纯化。柱子用含有250mM NaCl的PBS洗涤，并且用含 有IMNaCl的PBS洗脱结合的蛋白。通过胸肌肌内注射免疫三只鸡(伊莎褐鸡)，每轮注射15yg纯化的蛋白。在第 一轮注射中使用弗氏完全佐剂(西格玛公司)，在后续轮次中使用弗氏不完全佐剂(西格 玛公司)。每天收集鸡蛋，并且保存在4°C。定期测定滴度，从蛋黄纯化IgY，然后进行直接ELISA，其中小鼠PAPP-A (1129-1545)包被在塑料上。用HRP偶联的抗鸡IgY (西格玛公司) 进行检测，并且最高滴度的IgY制剂用于进一步的实验。检测蛋白水解活性-如以前详细描述的(45)，分析PAPP-A对IGFBP-4和-5的蛋白 水解活性。简要地说，用氨基酸分析定量纯化的底物，以125I标记(安法玛西亚公司)。在缺 乏(IGFBP-5)或存在(IGFBP-4)10倍摩尔过量的IGF(诊断系统公司(Diagnostic Systems Laboratories))的 5OmM Tris-HCl, IOOmM NaCl, ImM CaCl2, ρΗ 7. 5 中进行酶切反应。在 37°C孵育后，加入EDTA(IOmM)终止反应，并且保存在-20°C。酶切产物用10-20% SDS-PAGE 分离并且用放射自显影来显色。酶切程度的确定，通过用Typhoon图像分析系统(GE医疗 集团)对条带强度进行定量，并且减去背景水平(假信号)。如前所述，缺乏IGF条件下， 用类似的方法分析PAPP-A2对IGFBP-5的蛋白水解活性(26)。如前所述(46)，对来源于 IGFBP-4的26个残基的合成肽进行肽水解活性的分析。酶切位点N端和C端侧的残基分别 用邻氨基苯甲酸进行修饰和用3-硝基酪氨酸进行取代。反应缓冲液为50mM Tris,ρΗ 8.0， 0.01%吐温-20(Tween-20)。用310nm的光进行激发，并且在420nm检测光发射。采用竞争 性抑制方程式，用Prism 5.0(Graphpad软件)进行定量分析。在部分抑制的情况下，根据 数据拟合S型剂量应答曲线。半合成噬菌体文库的筛选-将人PAPP-A(1133-1547)固定(37°C，1小时)到3. 5mL 免疫管(NM公司(Nunc Maxisorp))，用IOOmM碳酸氢钠、ρΗ 9. 8中的多克隆PAPP-A抗体 (5 μ g/mL)在 4°C包被过夜，并且用 20mM Tris, 150mMNaCl,pH 7. 5 (TBS)中的 3%脱脂奶粉 进行封闭，我们采用了 2个半合成的噬菌体文库的组合(Tomlinson I+J) (48)，并在室温下 缓慢旋转2小时进行噬菌体捕获(每个文库IO12)。在捕获后，用含有IM NaCl和0. 吐 温-20的TBS (TBST)洗10次，然后在4°C使用蠕动泵以2L TBST洗5个小时，最后用TBS冲 5次。在室温下用稀释在TBS中的0. 5mL DPPC处理的胰蛋白酶(lmg/mL)(西格玛公司)处 理10分钟，洗脱噬菌体。任选地，噬菌体的洗脱可以包含使用EDTA。此外，也可使用除了噬 菌体文库以外的本领域已知的其他文库。将洗脱的噬菌体感染(37°C，30分钟)的大肠杆菌(TGl)铺在加有葡萄糖和 氨苄青霉素(100 μ g/mL)的TYE平板上。克隆转入含有1 %葡萄糖和氨苄青霉素(100 μ g/ mL)的2XTY培养基的96孔培养板中，并且培养(37°C过夜)。每块板的复制品孵育3小 时，并且加入KM13辅助噬菌体(每孔IO9)。孵育1小时后，将培养基换成含有氨苄青霉素 (100 μ g/mL)和卡那霉素(50 μ g/mL)的2 X TY，板子在30°C孵育20小时，然后用ELISA分析 含有噬菌体的上清液对固定化在带有多克隆PAPP-A抗体的96孔板上的人PAPP-A (E483Q) 的结合。板子用2%牛血清白蛋白(西格玛)进行封闭，用含有0.1%吐温-20的TBS进 行洗涤，并且用HRP偶联的抗M13 (GE医疗集团)进行检测。制备来自所选克隆的噬菌粒 DNA(pIT2)并且进行测序。为了也能获得将PAPP-A的N-末端区域结合到CCPl的噬菌体抗体，用全长人 PAPP-A进行相似的筛选。获得克隆PAC5，并且用作scFv形式的对照抗体。特异性与PAPP-A 不相关的克隆PAC333也用作对照抗体。表达和纯化scFv抗体并且分析抗体的抑制潜力_大肠杆菌HB2151 (琥珀终止密 码子的非抑制型)用所选的噬菌体感染，以产生单克隆scFv抗体。1升培养物用ImM IPTG 诱导4-16小时，并在螯合的琼脂糖凝胶珠(5mL) (GE医疗集团)上通过镍亲和层析纯化表
111达的蛋白质。用20mM咪唑、IOOmM NaCl、50mM磷酸钠、pH 8. 0洗涤。为了洗脱，将咪唑浓 度提高到300mM。洗脱下来的蛋白用20mM TrisUOOmM NaCUpH 8进行透析。用MonoQ柱 (GE医疗集团)或蛋白L柱(皮尔斯公司)进行进一步纯化。在功能分析前，用相关缓冲液 对纯化的蛋白进行透析。与PAPP-A结合的分析在96孔板中进行，将PAPP-A如上所述固定 化在板上，用HRP偶联的抗His-标签抗体(西格玛公司)进行检测。纯化的抗体制剂用氨基酸分析进行定量，并且通过加入受控的量进行切割反应来 分析抗体对PAPP-A活性的影响。PAC33用作负对照。表面等离子体共振分析_使用S系列CM5传感芯片和制造商提供的偶联试剂，在 BIAcore TlOO仪器(BIAcore AB，乌普萨拉，瑞典)上进行表面等离子体共振实验。IOmM醋 酸钠、pH 5. O中10 μ g/mL亲和纯化的PAPP-A(E483Q)在25°CT (以500共振单位(RU)的 水平)固定在活化的芯片上。保留的活化基团被IM乙醇胺封闭。稀释在IOmM HEPESU50mM NaClUmM CaCl2、0. 05 % 吐温-20、pH 7. 4 (HBS)中的纯化的抗体(0. 35-1 InM)，在 37 °C 以 30 μ L/分钟的流速注射到传感芯片上2分钟。记录的信号减去由注射无关抗体所确定的背 景信号。为了分析钙离子依赖，在有或没有IOmM EDTA的情况下，用175nM PACl进行一些 实验。用制造商的软件(BIAcore TlOO评估软件1. 1版)分析数据。确定抗体特异性以及定位抗体结合_用PAPP-A和PAPP-A2嵌合蛋白和PAPP-A的 突变变体进行ELISA反应，来定位抗体结合。用多克隆PAPP-A抗体将蛋白固定化，并且如 上所述进行噬菌体抗体结合分析。结果用针对PAPP-A的C端片段的多克隆抗体来抑制蛋白水解——PAPP-A蛋白水解活 性的唯一已知生理抑制剂为嗜曙红细胞主要碱性蛋白的前体形式(proMBP)，它可以通过形 成称为PAPP-A/proMBP的共价二硫键2 2复合物来使PAPP-A失活。尽管proMBP的抑制 是不可逆的，复合物形成的过程相对比较慢并且对氧化还原电位敏感。合成的低分子量化 合物，例如相关基质金属蛋白酶的许多抑制剂，都没有发现对PAPP-A有效。然而，PAPP-A对IGFBP-4和IGFBP-5的活性被多克隆抗体有效抑制(图2A)。因 为我们前面假设PAPP-A的LNR3区在底物结合中作为外部位点，我们想要测试针对PAPP-A 的C端区的抗体的抑制特性。我们制备了编码小鼠PAPP-A的1129-1545残基的质粒构建 物，其包括5个CCP结构域和LNR3 (图1)，并且纯化293T细胞中表达的重组蛋白用于免疫。 因为PAPP-A的LNR3是高度保守的(人和小鼠的PAPP-A的LNR3为100%相同)，所以不太 可能激发所选进行免疫的哺乳动物、鸡中的免疫反应。所得的多克隆IgY抗体能有效抑制 PAPP-A对IGFBP-4的蛋白水解，而对IGFBP-5的切割受到的影响要小得多(图2C)。而用 免疫前IgY对这两种底物的蛋白水解都没有发现有作用(结果未显示)。尽管用于免疫的约60kDa的C端片段的LNR3区域之外存在许多表位，本实验假 设LNR3起到了底物结合外部位点的作用。此外，发现这样的多克隆抗体不能有效抑制 IGFBP-5，提示底物结合的差异模式，并且可以获得选择性攻击PAPP-A对IGFBP-4切割的抑 制剂。用噬菌体展示筛选PAPP-A单克隆scFv抗体对IGFBP-4蛋白水解的抑制_为了获 得具有选择性抑制PAPP-A对IGFBP-4的切割的活性的单克隆抗体，如实验方法中详述，在 噬菌体抗体文库中筛选与60kDa的人PAPP-A的C端片段(1133-1547残基)结合的抗体。为了提高获得与保守的LNR3区结合的噬菌体抗体的机会，我们使用2个半合成噬菌体文库 的组合，这是在常用的单VH和VL人基因片段的框架上构建的。克隆结合的噬菌体，用ELISA 评估它们对全长PAPP-A的结合，并且然后在大肠杆菌中生产来自所选噬菌体的scFv抗体 并且评估它们的抑制活性。获得了两个抑制性scFv抗体PACl和PAC2。可变区的序列分析 表明PACl和PAC2是独特的克隆(未显示)。为了进一步鉴定，对PACl和PAC2进行大规模表达、纯化，并用氨基酸分析进行定 量。两种scFv抗体都有效的抑制了 PAPP-A对IGFBP-4的切割，如同PACl所显示的(图 3A)。还发现PACl (图3B)和PAC2也有效的抑制小鼠PAPP-A，这与小鼠和人PAPP-A的序列 高度保守性相符合。对于人和小鼠PAPP-A，PAC1是一个比PAC2略强的抑制剂(未显示)。通过用相对起始速率对抗体浓度作图，进一步分析人PAPP-A的抑制。基于这一分 析，确定PACl对人PAPP-A的抑制常数(Ki = 1. 2nM)。通过表面等离子体共振进一步分析 抗体对固定化的PAPP-A的结合，获得了 PACl的平衡解离常数(Kd = 0. 25nM,图3C)，与溶 液相实验一致。PACl只部分抑制了 PAPP-A对IGFBP-5的活性-如终端测试(图4A)以及进一 步的定量分析(图4B)所示，抗体PACl表现出对PAPP-A切割IGFBP-5的抑制活性要比对 IGFBP4的低得多。PACl的饱和浓度下，PAPP-A还显示了约45%对IGFBP-5的活性，可能是 因为PAPP-A对IGFBP-5的活性是通过空间位阻作用降低的，而不是对酶_底物结合的直接干预。有趣的是，PACl没有抑制PAPP-A对来源于IGFBP-4的合成肽的切割(图5A和 5B)。所以PACl与PAPP-A的抑制不会改变活性位点周围的结构。这与PAPP-A单克隆抗 体(单抗)PA-IA (45)的抑制特性相反，PA-IA有效地抑制了对这个肽的切割(图5C和D)。 然而单抗PA-IA对完整的IGFBP-4(图6A)和IGFBP-5 (图6B)是不佳的抑制剂。在这两个 情况下，在饱和浓度的单抗PA-IA下，还保留了约40%的PAPP-A活性，这与PACl获得的对 IGFBP-4的有效抑制(图3B)形成了鲜明对比。最有可能的，单抗PA-IA识别了位于或靠近 活性位点的一个PAPP-A的表位。与此相符，单抗PA-IA与人PAPP-A的C端片段(1133-1547 残基)不结合(未显示)。抗体PACl与LNR3结合并且依赖于钙离子-PACl (图7A)和PAC2 (未显示)有效 地抑制了小鼠PAPP-A对IGFBP-4的切割，与小鼠和人PAPP-A的序列高度保守相符合。然 而，我们发现PACl和PAC2都对同源的PAPP-A2对它的两种已知底物IGFBP-3 (未显示)和 IGFBP-5(图7)的活性没有任何作用。所以为了描述PACl与PAPP-A的结合，对一套C端可 变区与PAPP-A2的序列互换的嵌合体进行分析。只有LNR3序列来源于PAPP-A的构建物与 PACl (图8A)和PAC2 (未显示)结合。而且，PACl没有与PAPP-A的LNR3的N端侧截短的 突变体结合(图8A)。因为已经提出PAPP-A的LNR模块与钙离子协同作用，用表面等离子体共振来评估 PACl结合对钙离子可能存在的依赖性。在存在钙离子的情况下与固定化的PAPP-A结合(图 3B和3C)，但是在用螯合剂EDTA平衡的样品和流动细胞中都没有观察到结合(未显示)。 然而，只有当PACl和EDTA —起注射到用含钙离子的缓冲液平衡的芯片上时，结合才被破坏 (图8B)。在EDTA处理后，用含有钙离子的缓冲液平衡流动细胞，恢复了它与PACl结合的 能力(图8B)。所以，PACl与PAPP-A的结合需要钙离子，用EDTA从LNR3去除钙是一个可逆的过程。用PAC2获得了相似的结果(未显示)。基于这些结果，我们分析抗体与LNR3突变体的结合，其中预测与钙离子协同作用 的3个残基分别被丙氨酸取代。与用PAPP-A和PAPP-A2嵌合体的定位数据和表面等离子 体共振实验数据相一致，PACl和PAC2没有结合到这些突变体上(图8C)。实施例2 PACl和PAC2与人PAPP-A突变体的结合，突变体中C端70个残基中单个氨基酸残 基已经被取代为丙氨酸PAClPAC2
D1484A不结合不结合
D1499A不结合不结合
D1502A不结合不结合
D1509A纟 口 I=I纟 口 I=I
D1521A微弱结合微弱结合
D1525A纟 口 I=I纟 口 I=I
D1529A不结合不结合
D1530A不结合不结合
D1535A？ 口 η纟 口 I=I
实施例3PAC5 与人 PAPP-A 片段(SEQ ID NO 1)的结合"PA 1-950” 是一个包含氨基酸残基 1-950 的 PAPP-A 片段。“PA 937-1547” 是一 个包含氨基酸残基937-1547的PAPP-A片段。"PA 1_599”是一个包含氨基酸残基1-599的 PAPP-A 片段。
PAC5与PAPP-A的结合的描绘
PA PA PA
1-950
937-1547
1-599
社a
？ 口 η
不结合 不结合
11权利要求
1.一种包含以下序列或由以下序列构成的多肽SEQ ID NO =USEQ IDNO :2和SEQ ID NO 3中任一个，或SEQ ID NO =USEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3中任一个的多肽片段，所述 多肽或其片段能够结合到一个分子上，从而抑制多肽或其片段的活性。
2.一种与 SEQ ID NO =USEQ ID NO 2 禾口 SEQ ID NO :3 有至少 70%序列相同性的 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :3 的多肽变体，或是 SEQID NO =USEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO 3的片段的多肽变体。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽与SEQID NO=U SEQID NO 2和 SEQ ID NO :3、或是 SEQ ID NO =USEQ ID NO 2 禾口 SEQ ID NO :3 的片段有至少 80%的序列 相同性，例如至少81%序列相同性，例如至少82%序列相同性，例如至少83%序列相同性， 例如至少84%序列相同性，例如至少85%序列相同性，例如至少86%序列相同性，例如至 少87%序列相同性，例如至少88%序列相同性，例如至少89%序列相同性，例如至少90% 序列相同性，例如至少91%序列相同性，例如至少92%序列相同性，例如至少93%序列相 同性，例如至少94%序列相同性，例如至少95%序列相同性，例如至少96%序列相同性，例 如至少97%序列相同性，例如至少98%序列相同性，例如至少99%序列相同性，例如至少 99. 5%序列相同性。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽片段包含少于99.5%，例如少于 98%，例如少于97%，例如少于96%，例如少于95%，例如少于94%，例如少于93%，例如 少于92%，例如少于91%，例如少于90%，例如少于88%，例如少于86%，例如少于84%, 例如少于82 %，例如少于80 %，例如少于75 %，例如少于70 %，例如少于65 %，例如少于 60%，例如少于55%，例如少于50%，例如少于45%，例如少于40%，例如少于35%，例如 少于30%，例如少于25%，例如少于20%，例如少于15%，例如少于10%的SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的氨基酸残基。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述片段包含少于1547个SEQIDN0:1的连 续氨基酸残基，例如少于1530个连续氨基酸残基，例如少于1510个连续氨基酸残基，例如 少于1490个连续氨基酸残基，例如少于1470个连续氨基酸残基，例如少于1450个连续氨 基酸残基，例如少于1430个连续氨基酸残基，例如少于1410个连续氨基酸残基，例如少于 1390个连续氨基酸残基，例如少于1370个连续氨基酸残基，例如少于1350个连续氨基酸 残基，例如少于1330个连续氨基酸残基，例如少于1310个连续氨基酸残基，例如少于1290 个连续氨基酸残基，例如少于1270个连续氨基酸残基，例如少于1250个连续氨基酸残基， 例如少于1230个连续氨基酸残基，例如少于1210个连续氨基酸残基，例如少于1190个连 续氨基酸残基，例如少于1170个连续氨基酸残基，例如少于1150个连续氨基酸残基，例如 少于1130个连续氨基酸残基，例如少于1110个连续氨基酸残基，例如少于1090个连续氨 基酸残基，例如少于1070个连续氨基酸残基，例如少于1050个连续氨基酸残基，例如少于 1030个连续氨基酸残基，例如少于1010个连续氨基酸残基，例如少于990个连续氨基酸残 基，例如少于970个连续氨基酸残基，例如少于950个连续氨基酸残基，例如少于930个连 续氨基酸残基，例如少于910个连续氨基酸残基，例如少于890个连续氨基酸残基，例如少 于870个连续氨基酸残基，例如少于850个连续氨基酸残基，例如少于830个连续氨基酸残 基，例如少于810个连续氨基酸残基，例如少于790个连续氨基酸残基，例如少于770个连 续氨基酸残基，例如少于750个连续氨基酸残基，例如少于730个连续氨基酸残基，例如少于710个连续氨基酸残基，例如少于690个连续氨基酸残基，例如少于670个连续氨基酸残 基，例如少于650个连续氨基酸残基，例如少于630个连续氨基酸残基，例如少于610个连 续氨基酸残基，例如少于590个连续氨基酸残基，例如少于570个连续氨基酸残基，例如少 于550个连续氨基酸残基，例如少于530个连续氨基酸残基，例如少于510个连续氨基酸残 基，例如少于490个连续氨基酸残基，例如少于470个连续氨基酸残基，例如少于450个连 续氨基酸残基，例如少于430个连续氨基酸残基，例如少于410个连续氨基酸残基，例如少 于390个连续氨基酸残基，例如少于370个连续氨基酸残基，例如少于350个连续氨基酸残 基，例如少于330个连续氨基酸残基，例如少于310个连续氨基酸残基，例如少于290个连 续氨基酸残基，例如少于270个连续氨基酸残基，例如少于250个连续氨基酸残基，例如少 于230个连续氨基酸残基，例如少于210个连续氨基酸残基，例如少于190个连续氨基酸残 基，例如少于170个连续氨基酸残基，例如少于150个连续氨基酸残基，例如少于130个连 续氨基酸残基，例如少于110个连续氨基酸残基，例如少于90个连续氨基酸残基，例如少于 70个连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于30个SEQ ID NO 1的连 续氨基酸残基。
6.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述片段包含SEQID NO :1的6个或更多个 连续氨基酸残基，例如7个或更多个连续氨基酸残基，例如8个或更多个连续氨基酸残基， 例如9个或更多个连续氨基酸残基，例如10个或更多个连续氨基酸残基，例如12个或更多 个连续氨基酸残基，例如14个或更多个连续氨基酸残基，例如16个或更多个连续氨基酸残 基，例如18个或更多个连续氨基酸残基，例如20个或更多个连续氨基酸残基，例如22个或 更多个连续氨基酸残基，例如M个或更多个连续氨基酸残基，例如沈个或更多个连续氨基 酸残基，例如观个或更多个连续氨基酸残基，例如30个或更多个连续氨基酸残基。
7.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述片段包含少于415个SEQIDNO :2的连 续氨基酸残基，例如少于410个连续氨基酸残基，例如少于405个连续氨基酸残基，例如少 于400个连续氨基酸残基，例如少于395个连续氨基酸残基，例如少于390个连续氨基酸残 基，例如少于385个连续氨基酸残基，例如少于380个连续氨基酸残基，例如少于375个连 续氨基酸残基，例如少于370个连续氨基酸残基，例如少于365个连续氨基酸残基，例如少 于360个连续氨基酸残基，例如少于355个连续氨基酸残基，例如少于350个连续氨基酸残 基，例如少于345个连续氨基酸残基，例如少于340个连续氨基酸残基，例如少于335个连 续氨基酸残基，例如少于330个连续氨基酸残基，例如少于325个连续氨基酸残基，例如少 于320个连续氨基酸残基，例如少于315个连续氨基酸残基，例如少于310个连续氨基酸残 基，例如少于305个连续氨基酸残基，例如少于300个连续氨基酸残基，例如少于295个连 续氨基酸残基，例如少于290个连续氨基酸残基，例如少于285个连续氨基酸残基，例如少 于280个连续氨基酸残基，例如少于275个连续氨基酸残基，例如少于270个连续氨基酸残 基，例如少于265个连续氨基酸残基，例如少于260个连续氨基酸残基，例如少于255个连 续氨基酸残基，例如少于250个连续氨基酸残基，例如少于245个连续氨基酸残基，例如少 于240个连续氨基酸残基，例如少于235个连续氨基酸残基，例如少于230个连续氨基酸残 基，例如少于225个连续氨基酸残基，例如少于220个连续氨基酸残基，例如少于215个连 续氨基酸残基，例如少于210个连续氨基酸残基，例如少于205个连续氨基酸残基，例如少 于200个连续氨基酸残基，例如少于195个连续氨基酸残基，例如少于190个连续氨基酸残基，例如少于185个连续氨基酸残基，例如少于180个连续氨基酸残基，例如少于175个连 续氨基酸残基，例如少于170个连续氨基酸残基，例如少于165个连续氨基酸残基，例如少 于160个连续氨基酸残基，例如少于155个连续氨基酸残基，例如少于150个连续氨基酸残 基，例如少于145个连续氨基酸残基，例如少于140个连续氨基酸残基，例如少于135个连 续氨基酸残基，例如少于130个连续氨基酸残基，例如少于125个连续氨基酸残基，例如少 于120个连续氨基酸残基，例如少于115个连续氨基酸残基，例如少于110个连续氨基酸残 基，例如少于105个连续氨基酸残基，例如少于100个连续氨基酸残基，例如少于95个连续 氨基酸残基，例如少于90个连续氨基酸残基，例如少于85个连续氨基酸残基，例如少于80 个连续氨基酸残基，例如少于75个连续氨基酸残基，例如少于70个连续氨基酸残基，例如 少于65个连续氨基酸残基，例如少于60个连续氨基酸残基，例如少于55个连续氨基酸残 基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于45个连续氨基酸残基，例如少于40个连续氨 基酸残基，例如少于35个连续氨基酸残基，例如少于30个SEQ ID NO :2的连续氨基酸残 基。
8.如权利要求7所述的多肽，其特征在于，所述片段包含SEQID NO :2的6个或更多个 连续氨基酸残基，例如7个或更多个连续氨基酸残基，例如8个或更多个连续氨基酸残基， 例如9个或更多个连续氨基酸残基，例如10个或更多个连续氨基酸残基，例如12个或更多 个连续氨基酸残基，例如14个或更多个连续氨基酸残基，例如16个或更多个连续氨基酸残 基，例如18个或更多个连续氨基酸残基，例如20个或更多个连续氨基酸残基，例如22个或 更多个连续氨基酸残基，例如M个或更多个连续氨基酸残基，例如沈个或更多个连续氨基 酸残基，例如观个或更多个连续氨基酸残基，例如30个或更多个连续氨基酸残基。
9.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述片段包含少于70个SEQIDNO 3的连 续氨基酸残基，例如少于65个连续氨基酸残基，例如少于60个连续氨基酸残基，例如少于 55个连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于45个连续氨基酸残基，例 如少于40个连续氨基酸残基，例如少于35个连续氨基酸残基，例如少于30个连续氨基酸 残基，例如少于25个连续氨基酸残基，例如少于20个SEQ ID NO 3的连续氨基酸残基。
10.如权利要求9所述的多肽，其特征在于，所述片段包含SEQID NO :3的6个或更多 个连续氨基酸残基，例如7个或更多个连续氨基酸残基，例如8个或更多个连续氨基酸残 基，例如9个或更多个连续氨基酸残基，例如10个或更多个连续氨基酸残基，例如12个或 更多个连续氨基酸残基，例如14个或更多个连续氨基酸残基，例如16个或更多个连续氨基 酸残基，例如18个或更多个连续氨基酸残基，例如20个或更多个连续氨基酸残基，例如22 个或更多个连续氨基酸残基，例如M个或更多个连续氨基酸残基，例如26个或更多个连续 氨基酸残基，例如28个或更多个连续氨基酸残基，例如30个或更多个SEQ ID NO 3的连续 氨基酸残基。
11.如权利要求2所述的多肽变体，其特征在于，所述多肽变体与SEQIDN0:USEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO :3、或是 SEQ ID NO =USEQ ID NO 2 或 SEQID NO 3 的片段有至少 80% 的序列相同性，例如至少81%序列相同性，例如至少82%序列相同性，例如至少83%序列 相同性，例如至少84%序列相同性，例如至少85%序列相同性，例如至少86%序列相同性， 例如至少87%序列相同性，例如至少88%序列相同性，例如至少89%序列相同性，例如至 少90%序列相同性，例如至少91%序列相同性，例如至少92%序列相同性，例如至少93%序列相同性，例如至少94%序列相同性，例如至少95%序列相同性，例如至少96%序列相 同性，例如至少97%序列相同性，例如至少98%序列相同性，例如至少99%序列相同性，例 如至少99. 5%序列相同性。
12.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽变体片段包含少于99.5%，例如 少于98 %，例如少于97 %，例如少于96 %，例如少于95 %，例如少于94%，例如少于93 %， 例如少于92%，例如少于91%，例如少于90%，例如少于88%，例如少于86%，例如少于 84%，例如少于82 %，例如少于80 %，例如少于75 %，例如少于70 %，例如少于65 %，例如少 T 60%,例如少于55%，例如少于50%，例如少于45%，例如少于40%，例如少于35%，例 如少于30%，例如少于25%，例如少于20%，例如少于15%，例如少于10%的SEQ ID NO 1、SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3的氨基酸残基。
13.如权利要求12所述的多肽，其特征在于，所述多肽变体片段包含少于1547个SEQ ID NO 1的连续氨基酸残基，例如少于1530个连续氨基酸残基，例如少于1510个连续氨 基酸残基，例如少于1490个连续氨基酸残基，例如少于1470个连续氨基酸残基，例如少于 1450个连续氨基酸残基，例如少于1430个连续氨基酸残基，例如少于1410个连续氨基酸 残基，例如少于1390个连续氨基酸残基，例如少于1370个连续氨基酸残基，例如少于1350 个连续氨基酸残基，例如少于1330个连续氨基酸残基，例如少于1310个连续氨基酸残基， 例如少于1290个连续氨基酸残基，例如少于1270个连续氨基酸残基，例如少于1250个连 续氨基酸残基，例如少于1230个连续氨基酸残基，例如少于1210个连续氨基酸残基，例如 少于1190个连续氨基酸残基，例如少于1170个连续氨基酸残基，例如少于1150个连续氨 基酸残基，例如少于1130个连续氨基酸残基，例如少于1110个连续氨基酸残基，例如少于 1090个连续氨基酸残基，例如少于1070个连续氨基酸残基，例如少于1050个连续氨基酸残 基，例如少于1030个连续氨基酸残基，例如少于1010个连续氨基酸残基，例如少于990个 连续氨基酸残基，例如少于970个连续氨基酸残基，例如少于950个连续氨基酸残基，例如 少于930个连续氨基酸残基，例如少于910个连续氨基酸残基，例如少于890个连续氨基酸 残基，例如少于870个连续氨基酸残基，例如少于850个连续氨基酸残基，例如少于830个 连续氨基酸残基，例如少于810个连续氨基酸残基，例如少于790个连续氨基酸残基，例如 少于770个连续氨基酸残基，例如少于750个连续氨基酸残基，例如少于730个连续氨基酸 残基，例如少于710个连续氨基酸残基，例如少于690个连续氨基酸残基，例如少于670个 连续氨基酸残基，例如少于650个连续氨基酸残基，例如少于630个连续氨基酸残基，例如 少于610个连续氨基酸残基，例如少于590个连续氨基酸残基，例如少于570个连续氨基酸 残基，例如少于550个连续氨基酸残基，例如少于530个连续氨基酸残基，例如少于510个 连续氨基酸残基，例如少于490个连续氨基酸残基，例如少于470个连续氨基酸残基，例如 少于450个连续氨基酸残基，例如少于430个连续氨基酸残基，例如少于410个连续氨基酸 残基，例如少于390个连续氨基酸残基，例如少于370个连续氨基酸残基，例如少于350个 连续氨基酸残基，例如少于330个连续氨基酸残基，例如少于310个连续氨基酸残基，例如 少于290个连续氨基酸残基，例如少于270个连续氨基酸残基，例如少于250个连续氨基酸 残基，例如少于230个连续氨基酸残基，例如少于210个连续氨基酸残基，例如少于190个 连续氨基酸残基，例如少于170个连续氨基酸残基，例如少于150个连续氨基酸残基，例如 少于130个连续氨基酸残基，例如少于110个连续氨基酸残基，例如少于90个连续氨基酸残基，例如少于70个连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于30个SEQ ID NO 1的连续氨基酸残基。
14.如权利要求13所述的多肽，其特征在于，所述多肽变体片段包含SEQIDN0:1的6 个或更多个连续氨基酸残基，例如7个或更多个连续氨基酸残基，例如8个或更多个连续氨 基酸残基，例如9个或更多个连续氨基酸残基，例如10个或更多个连续氨基酸残基，例如12 个或更多个连续氨基酸残基，例如14个或更多个连续氨基酸残基，例如16个或更多个连续 氨基酸残基，例如18个或更多个连续氨基酸残基，例如20个或更多个连续氨基酸残基，例 如22个或更多个连续氨基酸残基，例如M个或更多个连续氨基酸残基，例如沈个或更多 个连续氨基酸残基，例如观个或更多个连续氨基酸残基，例如30个或更多个连续氨基酸残 基。
15.如权利要求12所述的多肽，其特征在于，所述多肽变体片段包含少于415个SEQ ID NO 2的连续氨基酸残基，例如少于410个连续氨基酸残基，例如少于405个连续氨基酸 残基，例如少于400个连续氨基酸残基，例如少于395个连续氨基酸残基，例如少于390个 连续氨基酸残基，例如少于385个连续氨基酸残基，例如少于380个连续氨基酸残基，例如 少于375个连续氨基酸残基，例如少于370个连续氨基酸残基，例如少于365个连续氨基酸 残基，例如少于360个连续氨基酸残基，例如少于355个连续氨基酸残基，例如少于350个 连续氨基酸残基，例如少于345个连续氨基酸残基，例如少于340个连续氨基酸残基，例如 少于335个连续氨基酸残基，例如少于330个连续氨基酸残基，例如少于325个连续氨基酸 残基，例如少于320个连续氨基酸残基，例如少于315个连续氨基酸残基，例如少于310个 连续氨基酸残基，例如少于305个连续氨基酸残基，例如少于300个连续氨基酸残基，例如 少于295个连续氨基酸残基，例如少于290个连续氨基酸残基，例如少于285个连续氨基酸 残基，例如少于280个连续氨基酸残基，例如少于275个连续氨基酸残基，例如少于270个 连续氨基酸残基，例如少于265个连续氨基酸残基，例如少于260个连续氨基酸残基，例如 少于255个连续氨基酸残基，例如少于250个连续氨基酸残基，例如少于245个连续氨基酸 残基，例如少于240个连续氨基酸残基，例如少于235个连续氨基酸残基，例如少于230个 连续氨基酸残基，例如少于225个连续氨基酸残基，例如少于220个连续氨基酸残基，例如 少于215个连续氨基酸残基，例如少于210个连续氨基酸残基，例如少于205个连续氨基酸 残基，例如少于200个连续氨基酸残基，例如少于195个连续氨基酸残基，例如少于190个 连续氨基酸残基，例如少于185个连续氨基酸残基，例如少于180个连续氨基酸残基，例如 少于175个连续氨基酸残基，例如少于170个连续氨基酸残基，例如少于165个连续氨基酸 残基，例如少于160个连续氨基酸残基，例如少于155个连续氨基酸残基，例如少于150个 连续氨基酸残基，例如少于145个连续氨基酸残基，例如少于140个连续氨基酸残基，例如 少于135个连续氨基酸残基，例如少于130个连续氨基酸残基，例如少于125个连续氨基酸 残基，例如少于120个连续氨基酸残基，例如少于115个连续氨基酸残基，例如少于110个 连续氨基酸残基，例如少于105个连续氨基酸残基，例如少于100个连续氨基酸残基，例如 少于95个连续氨基酸残基，例如少于90个连续氨基酸残基，例如少于85个连续氨基酸残 基，例如少于80个连续氨基酸残基，例如少于75个连续氨基酸残基，例如少于70个连续氨 基酸残基，例如少于65个连续氨基酸残基，例如少于60个连续氨基酸残基，例如少于55个 连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于45个连续氨基酸残基，例如少于40个连续氨基酸残基，例如少于35个连续氨基酸残基，例如少于30个SEQ ID NO 2的连续氨基酸残基。
16.如权利要求15所述的多肽，其特征在于，所述多肽变体片段包含SEQIDNO :2的6 个或更多个连续氨基酸残基，例如7个或更多个连续氨基酸残基，例如8个或更多个连续氨 基酸残基，例如9个或更多个连续氨基酸残基，例如10个或更多个连续氨基酸残基，例如12 个或更多个连续氨基酸残基，例如14个或更多个连续氨基酸残基，例如16个或更多个连续 氨基酸残基，例如18个或更多个连续氨基酸残基，例如20个或更多个连续氨基酸残基，例 如22个或更多个连续氨基酸残基，例如M个或更多个连续氨基酸残基，例如沈个或更多 个连续氨基酸残基，例如观个或更多个连续氨基酸残基，例如30个或更多个连续氨基酸残 基。
17.如权利要求12所述的多肽，其特征在于，所述多肽变体片段包含少于70个SEQID NO 3的连续氨基酸残基，例如少于65个连续氨基酸残基，例如少于60个连续氨基酸残基， 例如少于55个连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于45个连续氨基 酸残基，例如少于40个连续氨基酸残基，例如少于35个连续氨基酸残基，例如少于30个连 续氨基酸残基，例如少于25个连续氨基酸残基，例如少于20个SEQ ID NO 3的连续氨基酸 残基。
18.如权利要求17所述的多肽，其特征在于，所述多肽变体片段包含SEQIDNO :3的6 个或更多个连续氨基酸残基，例如7个或更多个连续氨基酸残基，例如8个或更多个连续氨 基酸残基，例如9个或更多个连续氨基酸残基，例如10个或更多个连续氨基酸残基，例如12 个或更多个连续氨基酸残基，例如14个或更多个连续氨基酸残基，例如16个或更多个连续 氨基酸残基，例如18个或更多个连续氨基酸残基，例如20个或更多个连续氨基酸残基，例 如22个或更多个连续氨基酸残基，例如M个或更多个连续氨基酸残基，例如沈个或更多 个连续氨基酸残基，例如28个或更多个连续氨基酸残基，例如30个或更多个SEQ ID NO 3 的连续氨基酸残基。
19.一种能与如权利要求1所述的来源于PAPP-A的多肽相互作用的分子。
20.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致调控所述PAPP-A的活性。
21.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致抑制IGFBP-4的蛋白水解。
22.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致抑制了PAPP-A对其底 物IGFBP-4的活性。
23.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致对PAPP-A的两种或多 种生理底物的差异抑制。
24.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致选择性抑制PAPP-A对 IGFBP-4而不是对IGFBP-5的活性。
25.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致刺激IGF的释放。
26.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述相互作用依赖于钙离子的存在。
27.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述分子为激动剂。
28.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述分子为拮抗剂。
29.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述分子为肽。
30.如权利要求19所述的分子，其特征在于，所述分子为抗体或其片段。
31.一种特异性结合选自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的 抗体或其结合片段，或其天然存在的变体。
32.一种包含以下序列或由以下序列构成的多肽SEQ ID NO :5或SEQ IDNO :6，或SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的结合片段，所述多肽为抗体，所述抗体或其片段能与PAPP-A的 外部位点相互作用。
33.一种与SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6有至少70%序列相同性的SEQID NO :5或SEQ ID NO 6的多肽变体，或是SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的片段的多肽变体。
34.如权利要求32所述的多肽，其特征在于，所述多肽与SEQID NO :5或SEQ ID NO: 6、或是SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的片段有至少80%的序列相同性，例如至少81 %序列 相同性，例如至少82%序列相同性，例如至少83%序列相同性，例如至少84%序列相同性， 例如至少85%序列相同性，例如至少86%序列相同性，例如至少87%序列相同性，例如至 少88%序列相同性，例如至少89%序列相同性，例如至少90%序列相同性，例如至少91% 序列相同性，例如至少92%序列相同性，例如至少93%序列相同性，例如至少94%序列相 同性，例如至少95%序列相同性，例如至少96%序列相同性，例如至少97%序列相同性，例 如至少98%序列相同性，例如至少99%序列相同性，例如至少99. 5%序列相同性。
35.如权利要求32所述的多肽，其特征在于，所述多肽片段包含少于99.5%，例如少于 98%，例如少于97%，例如少于96%，例如少于95%，例如少于94%，例如少于93%，例如 少于92%,例如少于91%，例如少于90%,例如少于88%,例如少于86%,例如少于84%, 例如少于82 %，例如少于80%，例如少于75 %，例如少于70%，例如少于65 %，例如少于 60 %，例如少于55 %，例如少于50 %，例如少于45 %，例如少于40 %，例如少于35 %，例如少 于30%，例如少于25%，例如少于20%，例如少于15%，例如少于10%的SEQ ID NO 5或 SEQ ID NO 6的氨基酸残基。
36.如权利要求33所述的多肽变体，其特征在于，所述多肽变体与SEQIDNO :5或SEQ ID NO :6、或是SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的片段有至少80%的序列相同性，例如至少 81%序列相同性，例如至少82%序列相同性，例如至少83%序列相同性，例如至少84%序 列相同性，例如至少85%序列相同性，例如至少86%序列相同性，例如至少87%序列相同 性，例如至少88%序列相同性，例如至少89%序列相同性，例如至少90%序列相同性，例 如至少91%序列相同性，例如至少92%序列相同性，例如至少93%序列相同性，例如至少 94%序列相同性，例如至少95%序列相同性，例如至少96%序列相同性，例如至少97%序 列相同性，例如至少98%序列相同性，例如至少99%序列相同性，例如至少99. 5%序列相 同性。
37.如权利要求33所述的多肽，其特征在于，所述多肽变体片段包含少于99.5%，例如 少于98%，例如少于97%，例如少于96%，例如少于95%，例如少于94%,例如少于93%， 例如少于92 %，例如少于91 %，例如少于90 %，例如少于88 %，例如少于86 %，例如少于 84 %，例如少于82 %，例如少于80 %，例如少于75 %，例如少于70 %，例如少于65 %，例如少 T 60%,例如少于55%，例如少于50%，例如少于45%，例如少于40%，例如少于35%，例 如少于30%，例如少于25%，例如少于20%，例如少于15%，例如少于10%的SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的氨基酸残基。
38.如权利要求32所述的抗体，其特征在于，所述相互作用导致调控所述PAPP-A的活性。
39.如权利要求32所述的抗体，其特征在于，所述相互作用导致抑制IGFBP-4的蛋白水解。
40.如权利要求32所述的抗体，其特征在于，所述相互作用导致抑制了PAPP-A对其底 物IGFBP-4的活性。
41.如权利要求32所述的抗体，其特征在于，所述相互作用导致对PAPP-A的两种或多 种生理底物的差异抑制。
42.如权利要求32所述的抗体，其特征在于，所述相互作用导致选择性抑制PAPP-A对 IGFBP-4而不是对IGFBP-5的活性。
43.如权利要求32所述的抗体，其特征在于，所述相互作用导致刺激IGF的释放。
44.如权利要求19和32中的任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽连接到运载体上。
45.如权利要求44所述的多肽，其特征在于，所述运载体带有一个抗生物素蛋白部分， 例如链霉亲和素，其任选为生物素化的。
46.如权利要求19和32中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽是连接到，例如共 价连接到固体支持物或是半固体支持物上的。
47.如权利要求19和32中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽操作性融合到亲 和标签上，例如组氨酸标签(His-tag)。
48.一种融合多肽，其包含操作性融合到N端侧翼序列上的如权利要求19和32中任一 项所述的多肽。
49.一种融合多肽，包含操作性融合到C端侧翼序列上的如权利要求19和32中任一项 所述的多肽。
50.如权利要求19和32中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽融合到信号肽上。
51.如权利要求19和32中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽融合到原区上。
52.如权利要求19和32中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽融合到前原区上。
53.如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽，其特征在于，一个或多个氨基酸残基 被修饰，所述修饰优选为选自下组体内或体外的化学衍生，例如乙酰化或羧化；糖基化， 例如将多肽与如哺乳动物糖基化酶或脱糖基化酶等影响糖基化的酶相接触所产生的糖基 化；磷酸化，例如对氨基酸残基进行修饰形成磷酸化的氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸、磷酸 丝氨酸和磷酸苏氨酸。
54.如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽，其特征在于，所述一个或多个氨基酸 残基被修饰，从而优选提高对于蛋白水解性降解的抗性和稳定性，或是优化溶解性，或是使 多肽能够更适用于作为治疗剂。
55.如权利要求M所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含除了天然存在的L-氨基酸 残基之外的氨基酸残基。
56.如权利要求55所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含D-氨基酸残基。
57.如权利要求55所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含非天然存在的、合成的氨基酸。
58.如权利要求19和32中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包含一个或多 个阻断基，优选为适用于保护和/或稳定多肽的N端和C端免于所不希望的降解的化学取 代基的形式。
59.如权利要求58所述的多肽，其特征在于，所述一个或多个阻断基包括不会对多肽 的体内活性起到反作用的保护基团。
60.如权利要求58所述的多肽，其特征在于，所述一个或多个阻断基是通过N端的烷基 化或酰基化引入的。
61.如权利要求58所述的多肽，其特征在于，所述一个或多个阻断基选自N端阻断基， 包括C1到C5的支链或非支链烷基和酰基，如甲酰基和乙酰基，以及其取代形式，例如乙酰氨 甲基(Acm)基团。
62.如权利要求58所述的多肽，其特征在于，所述一个或多个阻断基选自N端阻断基， 包括氨基酸的脱氨基类似物，它可以连接到肽的N端或是用于代替N端氨基酸残基。
63.如权利要求58所述的多肽，其特征在于，所述一个或多个阻断基选自C端阻断基， 其中C端的羧基被掺入或未掺入例如酯基、酮基和酰胺基，以及脱羧基化的氨基酸类似物。
64.如权利要求58所述的多肽，其特征在于，所述一个或多个阻断基选自C端阻断基， 包括形成酯或酮的烷基，例如低级(C1到C6)烷基，如甲基、乙基和丙基；以及形成酰胺的氨 基，例如伯胺基(-NH2)以及单-和双烷基胺基，例如甲氨基、乙氨基、二甲基氨基、二乙基氨 基、甲基乙基氨基等等。
65.如权利要求58所述的多肽，其特征在于，所述N末端的游离氨基和末端的游离羧基 可以一起从多肽上去除，从而产生其脱氨基和脱羧基化的形式，而对多肽的生物活性没有 显著的影响。
66.一种如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽的酸加成盐，所述盐可以通过用无 机酸或有机酸处理多肽来获得，所述无机酸为例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等；所 述有机酸例如醋酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、顺丁烯二酸、反 丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲基苯磺酸、或水杨 酸；从而提供多肽的水溶性盐。
67.一种生产如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽的方法，所述方法包含下列步 骤提供编码所述多肽的多核苷酸，并且在体外表达或在合适的宿主生物体内表达所述多 核苷酸，从而产生如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽。
68.一种编码如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽的多核苷酸。
69.一种能够在严格条件下与编码如权利要求1、19和32中任一项所述多肽的多核苷 酸或是其片段杂交的核苷酸序列。
70.如权利要求69所述的核苷酸序列，其特征在于，编码多肽的所述多核苷酸的部分 在严格条件下与核苷酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ IDNO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7 的核苷酸序列的至少 10 个连续核苷酸。
71.一种包含如权利要求68所述的多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸任选地操作性 连接到控制所述多核苷酸在合适的宿主细胞中表达的调控序列上。
72.一种包含如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽和/或如权利要求68所述的 多核苷酸和/或如权利要求71所述的表达载体的分离的重组或转基因宿主细胞。
73.—种产生重组或转基因宿主细胞的方法，所述方法包含下列步骤提供编码如权 利要求1、19和32中任一项所述的多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述重组或转基 因宿主细胞中，并任选在所述重组或转基因宿主细胞中表达所述多核苷酸，从而形成能产 生所述多肽的重组或转基因宿主细胞。
74.—种包含如权利要求72所述的宿主细胞的转基因哺乳动物生物体。
75.如权利要求74所述的转基因哺乳动物生物体，其特征在于，所述哺乳动物宿主细 胞为选自单系类群的两侧对称动物的动物细胞，包括属于后口动物、蜕皮动物、扁形动物和 冠轮动物四个主要家系中任一个的哺乳动物细胞。
76.如权利要求74所述的转基因哺乳动物生物体，其特征在于，所述哺乳动物宿主细 胞为选自下组的动物细胞卵裂球细胞、卵细胞、胚胎干细胞、红细胞、成纤维细胞、肝细胞、 成肌细胞、肌管细胞、神经细胞、卵母细胞、成骨细胞、破骨细胞、精子、T细胞和合子。
77.—种产生转基因哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包含下列步骤提供编码如 权利要求1、19和32中任一项所述的多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述重组或转 基因宿主细胞中，并任选在所述重组或转基因哺乳动物宿主细胞中表达所述多核苷酸，从 而形成能产生所述多肽的重组或转基因哺乳动物宿主细胞。
78.一种包含如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽和/或如权利要求68所述的 多核苷酸和/或如权利要求71所述的载体的重组细菌宿主细胞。
79.如权利要求78所述的细菌宿主细胞，其特征在于，所述细菌宿主细胞选自革兰氏 阳性细菌宿主细胞和革兰氏阴性细菌宿主细胞。
80.一种产生重组细菌细胞的方法，所述方法包含下列步骤提供编码如权利要求1、 19和32中任一项所述的多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述细菌细胞中，并且任选 地在所述细菌细胞中表达所述多核苷酸，从而形成能产生所述多肽的重组细菌细胞。
81.一种包含如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽和/或如权利要求68所述的 多核苷酸和/或如权利要求71所述的载体的重组酵母细胞。
82.如权利要求81所述的酵母宿主细胞，其特征在于，所述酵母宿主细胞属于酿酒酵 母属、裂殖酵母属或毕赤酵母属。
83.如权利要求81所述的酵母宿主细胞，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0
84.如权利要求81所述的酵母宿主细胞，其特征在于，所述酵母为粟酒裂殖酵母 (Scizosacchomyces pompe)0
85.如权利要求81所述的酵母宿主细胞，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)。
86.—种产生重组酵母细胞的方法，所述方法包含下列步骤提供编码如权利要求1、 19和32中任一项所述的多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述酵母细胞中，并任选在 所述酵母细胞中表达所述多核苷酸，从而形成能产生所述多肽的重组酵母细胞。
87.一种包含如权利要求1、19和32中任一项所述的多肽和/或如权利要求68所述的 多核苷酸和/或如权利要求71所述的载体的重组真菌宿主细胞。
88.如权利要求87所述的真菌宿主细胞，其特征在于，所述真菌细胞属于曲霉属。
89.—种产生重组真菌细胞的方法，所述方法包含下列步骤提供编码如权利要求1、 19和32中任一项所述的多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸导入所述真菌细胞中，并任选在 所述真菌细胞中表达所述多核苷酸，从而形成能产生所述多肽的重组真菌细胞。
90.一种产生如权利要求32所述的来源于单克隆噬菌体的scFv抗体的方法，所述方法 包含下列步骤用所选噬菌体感染大肠杆菌，诱导培养物进行生产，并且纯化表达的蛋白。
91.如权利要求31所述的抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体。
92.如权利要求31所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
93.如权利要求31所述的抗体，其特征在于，所述抗体的结合依赖于钙离子可逆地结 合到C端的PAPP-A LNR结构域模块上。
94.如权利要求31所述的抗体片段，其特征在于，所述抗体片段包含选自下组的抗体 的一部分F(ab' )2、F(ab)2、Fab'和 Fab。
95.如权利要求31所述的抗体片段，其特征在于，所述抗体片段为与特定抗原结合的 合成的或基因工程化的多肽。
96.如权利要求31所述的抗体片段，其特征在于，所述抗体片段选自下组包含或由轻 链可变区构成的抗体片段；包含或由Fv片段构成的抗体片段，所述Fv片段由重链和轻链可 变区构成；包含或由重组单链多肽分子构成的抗体片段，该分子中重链和轻链的可变区由 肽接头连接(“scFv蛋白”)；以及包含或由最小识别单位构成的抗体片段，所述最小识别 单位由模拟超变区的氨基酸残基构成。
97.如权利要求31所述的抗体，其特征在于，所述抗体为重组蛋白形式的嵌合抗体，包 含来源于啮齿动物抗体的可变区和互补决定区、而抗体分子的其余部分来源于人抗体。
98.如权利要求31所述的抗体，其特征在于，所述抗体为重组蛋白形式的人源化抗体， 其中单克隆抗体的鼠类互补决定区从鼠类免疫球蛋白的重链和轻链可变链转移到了人的 可变区。
99.如权利要求31所述的抗体，其特征在于，所述抗体还包含或连接到一个分子或原 子形式的可检测标签上，该标签能偶联到抗体部分上的，产生可以更容易检测的部分。
100.如权利要求99所述的抗体，其特征在于，所述标签选自下组螯合剂，光活性剂， 放射性同位素，荧光剂和顺磁性离子。
101.一种产生特异性针对如权利要求1所述多肽的多克隆抗体或其结合片段的方法， 所述方法包含下列步骤在诱发抗体反应的条件下用如权利要求1所述的多肽免疫哺乳动 物对象，鉴定与多肽特异性结合的抗体，并且任选从所述哺乳动物对象分离所述抗体或其 结合片段。
102.一种产生特异性针对如权利要求1所述的多肽的单克隆抗体的方法，所述方法包 含下列步骤在诱发抗体反应的条件下用如权利要求1所述的多肽免疫哺乳动物对象，制 备产生特异性针对如权利要求1所述的多肽的单克隆抗体的杂交瘤，并且鉴定特异性与多 肽结合的抗体。
103.一种能被如权利要求31、32和91-100中任一项所述的抗体识别的多肽。
104.一种包含如权利要求1、19、31和32中任一项所述的多肽以及生理可接受的运载 体的组合物。
105.一种包含如权利要求1、19、31和32中任一项所述的多肽以及药学可接受的运载 体的药物组合物。
106.一种如权利要求104-105所述的组合物，还包含一种或多种附加的生物活性药剂的组合。
107.一种如权利要求104和105所述的组合物，还包含一种或多种选自下组的附加生 物活性药剂的组合抗血小板药物，抗凝血剂，纤维蛋白溶解剂，用于治疗心血管疾病的药 物，用于治疗骨质疏松的药物，用于医疗的抗癌药物。
108.—种包含如权利要求1、19、31和32所述的多肽或是如权利要求104和105所述 的组合物，以及至少一种附加组分的组合试剂盒。
109.如权利要求108所述的组合试剂盒，其特征在于，所述附加的一种或多种组分包 含对所需给药的用法和给药方案的说明小册子。
110.如权利要求108所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分 为选自下组的生物活性药剂抗血小板药物，抗凝血剂，纤维蛋白溶解剂，用于治疗心血管 疾病的药物，用于治疗骨质疏松的药物，用于医疗的抗癌药物。
111.如权利要求110所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分 为选自下组的抗癌药物阿地白介素/普留净(希龙公司)，阿仑单抗/坎帕斯(美礼联和 ILEX公司)，阿利维A酸/盘雷汀(里甘药业)，别嘌呤醇/赛洛平(葛兰素史克)，六甲蜜 胺/克瘤灵(美国生物科学公司)，氨磷汀/阿密磷定(美国生物科学公司)，阿那曲唑/瑞 宁得(阿斯利康)，三氧化二砷/特瑞森诺(细胞治疗公司)，天冬酰胺酶/优适宝(默克 公司)，卡介苗活菌/蒂斯卡介苗(欧加农公司)，贝沙罗汀胶囊/塔革雷汀(里甘药业)， 博莱霉素/博莱诺松(百时美施贵宝)，白消安/白舒非(葛兰素史克)，卡普睾酮/ 二甲 睾酮(法玛西亚普强公司)，卡培他滨/希罗达(罗氏)，卡钼/伯尔(百时美施贵宝)，卡 莫司汀/卡氮芥、BiCNU(百时美施贵宝)，带有聚苯丙生20的卡莫司汀植入体/格立得膜 剂(吉尔福德制药公司)，塞来昔布/西乐葆(塞尔公司)，苯丁酸氮芥/瘤克宁(葛兰素史 克)，顺钼/顺氯氨钼(百时美施贵宝)，克拉屈滨/鲁斯塔汀、2-CdA (强生药物研究所)，环 磷酰胺、环磷氮芥/癌得星(百时美施贵宝)，阿糖胞苷/赛德萨-U(法玛西亚普强公司)， 达卡巴嗪/氮烯咪胺(拜尔)，更生霉素/放线菌素D、可美净(默克)，阿法达贝泊汀/血 红升(安进公司)，柔红霉素/道诺霉素/正定霉素(贝德福德公司)，柔红霉素/道诺霉 素/柔毛霉素(惠氏药厂)，地尼白介素-毒素连接物/恩塔克(塞拉根公司)，右雷佐生 /因乐咔(法玛西亚普强公司)，多西紫杉醇/泰索帝(安万特制药)，阿霉素、亚德里亚霉 素/罗拜克斯(法玛西亚普强公司)，屈他雄酮丙酸酯/马斯特龙注射液(先达公司)，埃利 奥溶液(欧范医药公司)，表阿霉素/表柔比星(法玛西亚普强公司)，磷酸依托泊苷(百 时美施贵宝)，依托泊苷/VP-16/凡必治(百时美施贵宝)，依西美坦/阿诺新(法玛西亚 普强公司)，非拉司汀/优保津(安进公司)，氟尿苷/FUDR(罗氏)，氟达拉滨/福达华(贝 莱克公司)，氟尿嘧啶/5-FU/安瑞欣，氟维司群/法洛德(IPR)，吉西他滨/健择(礼来制 药)，吉妥珠单抗奥唑米星/麦罗塔(惠氏药厂)，醋酸戈舍瑞林/诺雷德植入物(阿斯利 康制药)，羟基脲/爱治(百时美施贵宝)，替伊莫单抗/泽瓦林(IDEC制药公司)，去甲氧 柔红霉素/依达比星(亚德里亚制药)，异环磷酰胺/IFEX(百时美施贵宝)，甲磺酸伊马 替尼/格列卫(诺华公司)，干扰素α -2a/罗扰素(霍夫曼罗氏公司)，干扰素α -2b/甘乐能(先灵公司)，伊立替康/开普拓(法玛西亚普强公司)，来曲唑/弗隆(诺华公司)， 亚叶酸、维尔康沃林/亚叶酸钙(伊姆尼克斯公司)，左旋咪唑/俄格米嗦(杨森研究基金 会)，洛莫司汀/CCNU/CeeBU(百时美施贵宝)，双氯乙基甲胺/氮芥/盐酸氮芥(默克公 司)，醋酸甲地孕酮/梅格施(百时美施贵宝)，美法仑/L-PAM/爱克兰(葛兰素史克)，巯 嘌呤/6-MP、乐疾宁(葛兰素史克)，美司那/美斯奈(爱斯达制药)，甲氨蝶呤(莱德利制 药)，甲氧沙林/瓦德斯(赛拉克公司)，丝裂霉素C/突变霉素(百时美施贵宝公司)，丝裂 霉素C/丝裂吉特(超更公司)，米托坦/密妥坦(百时美施贵宝)，米托蒽醌/诺肖林(莱 德利制药)，苯丙酸诺龙/多乐宝灵-50 (欧加农)，诺非单抗/巯诺莫(勃林格殷格翰制 药公司)，奥普瑞白介素/纽密伽(遗传学研究所)，奥沙利钼/乐沙定(赛诺菲-圣德拉 堡制药)，紫杉醇/泰素(百时美施贵宝)，帕米德诺内/阿可达(诺华)，培加酶/阿达根 (牛培加酶)(恩佐公司)，培门冬酶/培加帕酶(恩佐公司)，聚乙二醇非格司亭/纽拉思 塔(安进公司)，喷妥司汀/尼喷提(帕克戴维斯制药公司)，哌泊溴烷/溴丙哌嗪(雅培 制药)，光辉霉素/普卡霉素/光神霉素(辉瑞制药)，卟吩姆钠/光卟啉OiLT光线治疗公 司)，甲基苄胼/丙卡巴胼(希格玛托制药)，奎纳克林/阿的平(雅培制药)，拉布立酶/ 爱立特(赛诺菲-圣德拉堡制药)，利妥昔单抗/美罗华(基因泰克公司)，沙格司亭/粒 细胞集落刺激因子(伊姆尼克斯公司)，链脲佐菌素/链佐星(法玛西亚普强公司)，塔司/ 司兰索(布莱恩公司)，他莫昔芬/诺瓦得士(阿斯利康制药)，替莫唑胺/泰道(先灵)， 替尼泊苷/VM-26/威门(百时美施贵宝)，睾内酯酮/睾内酯(百时美施贵宝)，硫鸟嘌呤 /6-TG/硫鸟嘌呤(葛兰素史克)，噻替哌/塞替派(莱德利制药)，拓扑替康/癌康定(葛 兰素史克)，托瑞米芬/法乐通(奥立安公司)，托西莫单抗/百克莎(科里西亚公司)，曲 妥单抗/赫赛汀(基因泰克公司)，维甲酸/ATRA/凡善能(罗氏)，乌拉莫司汀(罗伯茨制 药)，戊柔比星/戊司他(美第瓦公司)，长春碱/威保啶(礼来制药)，长春新碱/安可平 (礼来制药)，长春瑞滨/诺维本(葛兰素史克)和唑来膦酸/择泰(诺华)。
112.如权利要求110所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分 为选自下组的用于治疗骨质疏松的药物双磷酸盐类例如福善美(阿仑膦酸钠)、骨维壮 (伊班膦酸钠)或安妥良(利塞膦酸钠)，雷尼酸锶(普特罗锶)，降钙素(密钙息)，雷洛 昔芬，雌激素，甲状旁腺激素(PTH)和蒂罗奈(羟乙膦酸二钠)。
113.如权利要求110所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分 为选自下组的用于治疗心血管疾病的药物阿司匹林，阿洛普令，地他唑，卡巴匹林钙，氯克 罗孟，吲哚布芬，毗考他胺，三氟醋柳酸，氯吡格雷，双嘧达莫，普拉格雷，噻氯匹定，贝前列 素，前列环素，伊洛前列素，曲前列环素，阿昔单抗，依非巴特，替罗非班，肝素，贝米肝素，达 肝素，依诺肝素，那屈肝素，帕肝素，瑞维肝素，亭扎肝素，舒洛地特，达那肝素，华法林/香 豆素，醋硝香豆素，氯苯茚二酮，杀鼠迷，双香豆素，双苯茚酮，双香豆素乙酯，苯丙羟基香豆 素，苯茚二酮，噻氯香豆素，达比加群，艾卓肝素，来匹卢定，比伐卢定，阿加曲班，地西卢定， 水蛭素，美拉加群，希美加群，抗凝血酶III，利伐沙班，磺达肝素，C蛋白，S蛋白，TFPI，去纤 苷酸，硫酸皮肤素，替奈普酶，阿尼普酶，安克洛酶，替加色罗，纤维蛋白溶酶，溶栓蛋白酶， tPA，uPA，尿激酶和链激酶。
114.如权利要求110所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分 为选自下组的佐剂矿物质的、细菌的、植物的，合成的或宿主产生的佐剂，包括铝化合物，胞壁酰二肽，类脂A，百日咳杆菌，脂多糖，弗氏完全佐剂(FCA) ,Titermax，ISCOMS，Quil A, ALUN，类脂A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成肽基质，GMDP，植物产 物如皂角苷等，动物产物如甲壳素等，多种合成化学品，油乳剂，脂质体，合成的聚合物和胞壁酰二肽。
115.一种鉴别如权利要求1、19、31和32所述的多肽的结合伴侣的方法，所述方法包括 提取多肽并且分离所述结合伴侣的步骤。
116.如权利要求115所述的方法，其特征在于，所述结合伴侣包含一种或多种激动剂 或拮抗剂。
117.一种用作药物的如权利要求19，31和32中任一项所述的多肽或如权利要求104 和105所述的组合物。
118.一种用如权利要求116所述的激动剂或拮抗剂对有需要的个体进行治疗的方法。
119.一种用如权利要求116所述的激动剂或拮抗剂，与如权利要求19、31或32所述的 多肽或是如权利要求104-105的组合物联合使用，对有需要的个体进行治疗的方法。
120.一种治疗心血管疾病/病症的方法，包括给予有需要的个体如权利要求104-105 所述的组合物。
121.如权利要求120所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病/病症包括动脉瘤，心 绞痛，心律失常，动脉硬化，心肌病，脑血管意外(中风)，脑血管疾病，先天性心脏病，充血 性心力衰竭，心力衰竭，心肌炎，瓣膜病，冠状动脉疾病，扩张型心肌病，舒张功能障碍，心内 膜炎，高血压(高血压)，肥厚性心肌病，二尖瓣脱垂，心肌梗死(心脏病发作)，静脉血栓， 急性冠脉综合征，例如心肌缺血和心肌梗死，脑血管意外/中风，心房颤动，心律失常，心绞 痛，稳定型心绞痛，不稳定心绞痛，深静脉血栓和肺栓塞，血栓(血凝块)，周围动脉闭塞，原 发性或继发性动脉血栓或栓塞，血栓形成倾向(发展成血栓的趋势)，心脏手术和肾功能衰 竭血液透析的心肺体外循环，常规抗血栓治疗，凝血因子异常，血友病，A型血友病(因子 VIII缺乏)，B型血友病(因子IX缺乏症或“克里斯马斯氏病”)和C型血友病(因子XI 缺乏症，轻度出血倾向)，血管性血友病，出血，血友病，血小板障碍(先天性或后天性)，格 兰兹曼血小板机能不全，巨血小板综合征(糖蛋白Ib-IX-V复合物异常)，灰色血小板综合 征(缺乏阿尔法颗粒)，δ贮积池缺陷(缺乏致密颗粒)，出血，血小板数量减少，骨髓增生 异常综合征，骨髓疾病，免疫系统造成的破坏，免疫血小板减少性紫癜/ΙΤΡ，血栓性血小板 减少性紫癜/ΤΤΡ，溶血尿毒综合征/HUS，阵发性睡眠性血红蛋白尿破坏/ΡΝΗ，弥漫性血管 内凝血/DIC，肝素诱导的血小板减少症/HIT)，血栓，人工/假体心脏瓣膜，心脏瓣膜病，细 菌性心内膜炎，风湿性二尖瓣病变，二尖瓣狭窄，二尖瓣脱垂，二尖瓣环钙化，分离主动脉瓣 膜疾病，血栓形成倾向(即发展为血栓趋势)，血栓形成倾向，凝血因子V Leiden，高凝血 症，编码凝血因子V的基因突变，深静脉血栓(DVT)，肺栓塞，中风，心脏病发作，短暂性脑缺 血发作，凝血酶原突变，凝血因子II突变，MTHFR突变或维生素缺乏(维生素B6，B12和叶 酸)导致的同型半胱氨酸水平高，抗磷脂综合征(或抗磷脂抗体综合征)(APS)，动脉和静脉 都有血栓，纤溶酶原和纤维蛋白溶解症，阵发性睡眠性血红蛋白尿，C蛋白缺乏症，S蛋白缺 乏症和抗凝血酶III缺乏症。
122.如权利要求120所述的方法，其特征在于，所述治疗为预防性的，所述预防治疗可 以是一级治疗或二级治疗。
123.如权利要求120所述的方法，其特征在于，所述治疗为改善性的。
124.如权利要求120所述的方法，其特征在于，所述治疗为治愈性的。
125.如权利要求104-105所述的组合物在药物制造中的应用，所述药物用于针对选 自下组的心血管疾病/病症的治疗应用动脉瘤，心绞痛，心律失常，动脉硬化，心肌病，脑 血管意外(中风)，脑血管疾病，先天性心脏病，充血性心力衰竭，心力衰竭，心肌炎，瓣膜 病，冠状动脉疾病，扩张型心肌病，舒张功能障碍，心内膜炎，高血压(高血压)，肥厚性心肌 病，二尖瓣脱垂，心肌梗死(心脏病发作)，静脉血栓，急性冠脉综合征，例如心肌缺血和心 肌梗死，脑血管意外/中风，心房颤动，心律失常，心绞痛，稳定型心绞痛，不稳定心绞痛，深 静脉血栓和肺栓塞，血栓(血凝块)，周围动脉闭塞，原发性或继发性动脉血栓或栓塞，血栓 形成倾向(发展成血栓的趋势)，心脏手术和肾功能衰竭血液透析的心肺体外循环，常规抗 血栓治疗，凝血因子异常，血友病，A型血友病(因子VIII缺乏)，B型血友病(因子IX缺 乏症或“克里斯马斯氏病”)和C型血友病(因子XI缺乏症，轻度出血倾向)，血管性血友 病，出血，血友病，血小板障碍(先天性或后天性)，格兰兹曼血小板机能不全，巨血小板综 合征(糖蛋白Ib-IX-V复合物异常)，灰色血小板综合征(缺乏阿尔法颗粒)，δ贮积池缺 陷(缺乏致密颗粒)，出血，血小板数量减少，骨髓增生异常综合征，骨髓疾病，免疫系统造 成的破坏，免疫血小板减少性紫癜/ΙΤΡ，血栓性血小板减少性紫癜/ΤΤΡ，溶血尿毒综合征/ HUS，阵发性睡眠性血红蛋白尿破坏/ΡΝΗ，弥漫性血管内凝血/DIC，肝素诱导的血小板减少 症/HIT)，血栓，人工/假体心脏瓣膜，心脏瓣膜病，细菌性心内膜炎，风湿性二尖瓣病变，二 尖瓣狭窄，二尖瓣脱垂，二尖瓣环钙化，分离主动脉瓣膜疾病，血栓形成倾向(即发展为血 栓趋势)，血栓形成倾向，凝血因子V Leiden,高凝血症，编码凝血因子V的基因突变，深静 脉血栓(DVT)，肺栓塞，中风，心脏病发作，短暂性脑缺血发作，凝血酶原突变，凝血因子II 突变，MTHFR突变或维生素缺乏(维生素B6，B12和叶酸)导致的同型半胱氨酸水平高，抗 磷脂综合征(或抗磷脂抗体综合征)(APS)，动脉和静脉都有血栓，纤溶酶原和纤维蛋白溶 解症，阵发性睡眠性血红蛋白尿，C蛋白缺乏症，S蛋白缺乏症和抗凝血酶III缺乏症。
126.如权利要求104-105所述的组合物，其用于治疗选自下组的心血管疾病/病症 动脉瘤，心绞痛，心律失常，动脉硬化，心肌病，脑血管意外(中风)，脑血管疾病，先天性心 脏病，充血性心力衰竭，心力衰竭，心肌炎，瓣膜病，冠状动脉疾病，扩张型心肌病，舒张功能 障碍，心内膜炎，高血压(高血压)，肥厚性心肌病，二尖瓣脱垂，心肌梗死(心脏病发作)， 静脉血栓，急性冠脉综合征，例如心肌缺血和心肌梗死，脑血管意外/中风，心房颤动，心律 失常，心绞痛，稳定型心绞痛，不稳定心绞痛，深静脉血栓和肺栓塞，血栓(血凝块)，周围动 脉闭塞，原发性或继发性动脉血栓或栓塞，血栓形成倾向(发展成血栓的趋势)，心脏手术 和肾功能衰竭血液透析的心肺体外循环，常规抗血栓治疗，凝血因子异常，血友病，A型血友 病(因子VIII缺乏)，B型血友病(因子IX缺乏症或“克里斯马斯氏病”)和C型血友病 (因子XI缺乏症，轻度出血倾向)，血管性血友病，出血，血友病，血小板障碍(先天性或后 天性)，格兰兹曼血小板机能不全，巨血小板综合征(糖蛋白Ib-IX-V复合物异常)，灰色血 小板综合征(缺乏阿尔法颗粒)，δ贮积池缺陷(缺乏致密颗粒)，出血，血小板数量减少， 骨髓增生异常综合征，骨髓疾病，免疫系统造成的破坏，免疫血小板减少性紫癜/ΙΤΡ，血栓 性血小板减少性紫癜/ΤΤΡ，溶血尿毒综合征/HUS，阵发性睡眠性血红蛋白尿破坏/ΡΝΗ，弥 漫性血管内凝血/DIC，肝素诱导的血小板减少症/HIT)，血栓，人工/假体心脏瓣膜，心脏瓣膜病，细菌性心内膜炎，风湿性二尖瓣病变，二尖瓣狭窄，二尖瓣脱垂，二尖瓣环钙化，分离 主动脉瓣膜疾病，血栓形成倾向(即发展为血栓趋势)，血栓形成倾向，凝血因子V Leiden, 高凝血症，编码凝血因子V的基因突变，深静脉血栓(DVT)，肺栓塞，中风，心脏病发作，短暂 性脑缺血发作，凝血酶原突变，凝血因子II突变，MTHFR突变或维生素缺乏(维生素B6，B12 和叶酸)导致的同型半胱氨酸水平高，抗磷脂综合征(或抗磷脂抗体综合征)(APS)，动脉和 静脉都有血栓，纤溶酶原和纤维蛋白溶解症，阵发性睡眠性血红蛋白尿，C蛋白缺乏症，S蛋 白缺乏症和抗凝血酶III缺乏症。
127.—种包含如权利要求104-105所述组合物的药物组合物，其用于治疗选自下组的 心血管疾病/病症动脉瘤，心绞痛，心律失常，动脉硬化，心肌病，脑血管意外(中风)，脑 血管疾病，先天性心脏病，充血性心力衰竭，心力衰竭，心肌炎，瓣膜病，冠状动脉疾病，扩张 型心肌病，舒张功能障碍，心内膜炎，高血压(高血压)，肥厚性心肌病，二尖瓣脱垂，心肌梗 死(心脏病发作)，静脉血栓，急性冠脉综合征，例如心肌缺血和心肌梗死，脑血管意外/中 风，心房颤动，心律失常，心绞痛，稳定型心绞痛，不稳定心绞痛，深静脉血栓和肺栓塞，血栓 (血凝块)，周围动脉闭塞，原发性或继发性动脉血栓或栓塞，血栓形成倾向(发展成血栓的 趋势)，心脏手术和肾功能衰竭血液透析的心肺体外循环，常规抗血栓治疗，凝血因子异常， 血友病，A型血友病(因子VIII缺乏)，B型血友病(因子IX缺乏症或“克里斯马斯氏病”) 和C型血友病(因子XI缺乏症，轻度出血倾向)，血管性血友病，出血，血友病，血小板障碍 (先天性或后天性)，格兰兹曼血小板机能不全，巨血小板综合征(糖蛋白Ib-IX-V复合物 异常)，灰色血小板综合征(缺乏阿尔法颗粒)，δ贮积池缺陷(缺乏致密颗粒)，出血，血 小板数量减少，骨髓增生异常综合征，骨髓疾病，免疫系统造成的破坏，免疫血小板减少性 紫癜/ΙΤΡ，血栓性血小板减少性紫癜/ΤΤΡ，溶血尿毒综合征/HUS，阵发性睡眠性血红蛋白 尿破坏/ΡΝΗ，弥漫性血管内凝血/DIC，肝素诱导的血小板减少症/HIT)，血栓，人工/假体心 脏瓣膜，心脏瓣膜病，细菌性心内膜炎，风湿性二尖瓣病变，二尖瓣狭窄，二尖瓣脱垂，二尖 瓣环钙化，分离主动脉瓣膜疾病，血栓形成倾向(即发展为血栓趋势)，血栓形成倾向，凝血 因子V Leiden，高凝血症，编码凝血因子V的基因突变，深静脉血栓(DVT)，肺栓塞，中风，心 脏病发作，短暂性脑缺血发作，凝血酶原突变，凝血因子II突变，MTHFR突变或维生素缺乏 (维生素B6，B12和叶酸)导致的同型半胱氨酸水平高，抗磷脂综合征(或抗磷脂抗体综合 征)(APS)，动脉和静脉都有血栓，纤溶酶原和纤维蛋白溶解症，阵发性睡眠性血红蛋白尿，C 蛋白缺乏症，S蛋白缺乏症和抗凝血酶III缺乏症。
128.—种治疗癌症的方法，包括给予有需要的个体如权利要求104-105所述的组合物。
129.如权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述癌症包括急性淋巴细胞白血病，急 性髓细胞白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌症，艾滋病相关淋巴瘤，肛门癌，星形细胞 瘤(如儿童小脑或儿童大脑星形细胞瘤)，基底细胞癌，肝外胆道癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤 /恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，男性乳腺癌，支气管腺瘤/类癌，伯基 特淋巴瘤，类癌肿瘤，原发灶不明的癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤，脑星形细胞瘤/恶性 神经胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性 疾病，大肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤(如儿童室管膜瘤)，食道癌，尤文 氏家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤(如儿童颅外生殖细胞肿瘤)，性腺外生殖细胞肿瘤，眼癌(眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤， 神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌，肝细胞(肝)癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视 觉通路的神经胶质瘤(如儿童下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤)，眼内黑色素瘤，胰岛细胞 癌(内分泌胰腺癌)，卡波西氏肉瘤，肾(肾细胞)癌，喉癌，唇及口腔癌，肺癌(非小细胞 或小细胞肺癌)，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，非霍奇 金淋巴瘤)，巨球蛋白血症(如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)，骨恶性纤维组织细胞瘤/骨 肉瘤，髓母细胞瘤(如儿童髓母细胞瘤)，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，间皮瘤(如成人恶性间 皮瘤或儿童间皮瘤)，原发灶不明的转移性颈部鳞癌，多发性内分泌腺瘤综合征(例如发生 在童年)，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨 髓增殖性疾病，骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)，慢性骨髓增生性疾病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌， 鼻咽癌(如儿童鼻咽癌)，神经母细胞瘤，口咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌 (如儿童卵巢癌)，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢恶性程度低的肿瘤，胰腺癌，胰腺 癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚 层肿瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，视网膜母细胞瘤， 横纹肌肉瘤(如儿童横纹肌肉瘤)，唾液腺癌，成人软组织肉瘤，软组织肉瘤(如儿童软组织 肉瘤)，子宫肉瘤，塞扎里综合征，皮肤癌(如非黑色素瘤皮肤癌)，梅克尔细胞皮肤癌，小肠 癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(如发生在儿童)，皮肤T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤和胸腺 癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，滋养细胞肿瘤(如妊娠滋养细胞肿瘤)，尿道癌， 子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视觉通路和下丘脑胶质瘤(如儿童视觉通路和下丘脑 胶质瘤)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
130.如权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述治疗为预防性的，所述预防治疗是 一级治疗或二级治疗。
131.如权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述治疗为改善性的。
132.如权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述治疗为治愈性的。
133.如权利要求104-105所述的组合物在药物制造中的应用，所述药物用于针对选 自下组的癌症的治疗应用急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，肾上腺皮质癌，艾滋 病相关的癌症，艾滋病相关淋巴瘤，肛门癌，星形细胞瘤(如儿童小脑或儿童大脑星形细胞 瘤)，基底细胞癌，肝外胆道癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤， 脑肿瘤，乳腺癌，男性乳腺癌，支气管腺瘤/类癌，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，原发灶不明的 癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤，脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性 淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性疾病，大肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子 宫内膜癌，室管膜瘤(如儿童室管膜瘤)，食道癌，尤文氏家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤(如 儿童颅外生殖细胞肿瘤)，性腺外生殖细胞肿瘤，眼癌(眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)， 胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌， 肝细胞(肝)癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤(如儿童下丘脑 和视觉通路的神经胶质瘤)，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)，卡波西氏肉瘤， 肾(肾细胞)癌，喉癌，唇及口腔癌，肺癌(非小细胞或小细胞肺癌)，淋巴瘤(如艾滋病相 关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤)，巨球蛋白血症(如瓦尔登 斯特伦巨球蛋白血症)，骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤，髓母细胞瘤(如儿童髓母细胞瘤)，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，间皮瘤(如成人恶性间皮瘤或儿童间皮瘤)，原发灶不明的 转移性颈部鳞癌，多发性内分泌腺瘤综合征(例如发生在童年)，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤， 蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病，骨髓瘤(如多发性骨 髓瘤)，慢性骨髓增生性疾病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，鼻咽癌(如儿童鼻咽癌)，神经母细胞 瘤，口咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌(如儿童卵巢癌)，卵巢上皮癌，卵巢生 殖细胞肿瘤，卵巢恶性程度低的肿瘤，胰腺癌，胰腺癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌， 嗜铬细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列 腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(如儿童横纹肌肉瘤)，唾液 腺癌，成人软组织肉瘤，软组织肉瘤(如儿童软组织肉瘤)，子宫肉瘤，塞扎里综合征，皮肤 癌(如非黑色素瘤皮肤癌)，梅克尔细胞皮肤癌，小肠癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(如发生 在儿童)，皮肤T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞 癌，滋养细胞肿瘤(如妊娠滋养细胞肿瘤)，尿道癌，子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视 觉通路和下丘脑胶质瘤(如儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症 和肾母细胞瘤。
134.如权利要求104-105所述的组合物，其用于治疗选自下组的癌症疾病急性淋巴 细胞白血病，急性髓细胞白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌症，艾滋病相关淋巴瘤，肛 门癌，星形细胞瘤(如儿童小脑或儿童大脑星形细胞瘤)，基底细胞癌，肝外胆道癌，膀胱 癌，骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，男性乳腺癌，支气管 腺瘤/类癌，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，原发灶不明的癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤，脑星 形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病， 慢性骨髓增生性疾病，大肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤(如儿童室管膜 瘤)，食道癌，尤文氏家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤(如儿童颅外生殖细胞肿瘤)，性腺外生 殖细胞肿瘤，眼癌(眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，妊 娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌，肝细胞(肝)癌，霍奇金淋巴瘤，下 咽癌，下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤(如儿童下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤)，眼内黑 色素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)，卡波西氏肉瘤，肾(肾细胞)癌，喉癌，唇及口腔癌， 肺癌(非小细胞或小细胞肺癌)，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细 胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤)，巨球蛋白血症(如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)，骨恶性纤维 组织细胞瘤/骨肉瘤，髓母细胞瘤(如儿童髓母细胞瘤)，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，间皮瘤 (如成人恶性间皮瘤或儿童间皮瘤)，原发灶不明的转移性颈部鳞癌，多发性内分泌腺瘤综 合征(例如发生在童年)，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨 髓增生异常/骨髓增殖性疾病，骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)，慢性骨髓增生性疾病，鼻腔和 鼻窦癌，鼻咽癌，鼻咽癌(如儿童鼻咽癌)，神经母细胞瘤，口咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组 织细胞瘤，卵巢癌(如儿童卵巢癌)，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢恶性程度低的肿 瘤，胰腺癌，胰腺癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕 上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，视 网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(如儿童横纹肌肉瘤)，唾液腺癌，成人软组织肉瘤，软组织肉瘤 (如儿童软组织肉瘤)，子宫肉瘤，塞扎里综合征，皮肤癌(如非黑色素瘤皮肤癌)，梅克尔细 胞皮肤癌，小肠癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(如发生在儿童)，皮肤T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，滋养细胞肿瘤(如妊娠滋养细胞肿 瘤)，尿道癌，子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视觉通路和下丘脑胶质瘤(如儿童视觉 通路和下丘脑胶质瘤)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
135.—种包含如权利要求104-105所述组合物的药物组合物，其用于治疗选自下组的 癌症疾病急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌症，艾 滋病相关淋巴瘤，肛门癌，星形细胞瘤(如儿童小脑或儿童大脑星形细胞瘤)，基底细胞癌， 肝外胆道癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，男 性乳腺癌，支气管腺瘤/癌，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，原发灶不明的癌，原发性中枢神经系 统淋巴瘤，脑星形细胞瘤癌/恶性神经胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性淋巴细胞白血病，慢 性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性疾病，大肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤 (如儿童室管膜瘤)，食道癌，尤文氏家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤(如儿童颅外生殖细胞肿 瘤)，性腺外生殖细胞肿瘤，眼癌(眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)，胆囊癌，胃癌，胃肠道 类癌肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌，肝细胞(肝)癌，霍 奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤(如儿童下丘脑和视觉通路的神经 胶质瘤)，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)，卡波西氏肉瘤，肾(肾细胞)癌，喉 癌，唇及口腔癌，肺癌(非小细胞或小细胞肺癌)，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋 巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤)，巨球蛋白血症(如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血 症)，骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤，髓母细胞瘤(如儿童髓母细胞瘤)，黑色素瘤，梅克 尔细胞癌，间皮瘤(如成人恶性间皮瘤或儿童间皮瘤)，原发灶不明的转移性颈部鳞癌，多 发性内分泌腺瘤综合征(例如发生在童年)，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，蕈样肉芽肿，骨髓 增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病，骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)，慢性骨髓 增生性疾病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，鼻咽癌(如儿童鼻咽癌)，神经母细胞瘤，口咽癌，骨肉 瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌(如儿童卵巢癌)，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵 巢恶性程度低的肿瘤，胰腺癌，胰腺癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，松 果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列腺癌，肾盂和输 尿管移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(如儿童横纹肌肉瘤)，唾液腺癌，成人软组 织肉瘤，软组织肉瘤(如儿童软组织肉瘤)，子宫肉瘤，塞扎里综合征，皮肤癌(如非黑色素 瘤皮肤癌)，梅克尔细胞皮肤癌，小肠癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(如发生在儿童)，皮肤 T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，滋养细胞肿 瘤(如妊娠滋养细胞肿瘤)，尿道癌，子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视觉通路和下丘 脑胶质瘤(如儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
136.—种治疗骨质疏松的方法，包括给予有需要的个体如权利要求104-105所述的组 合物。
137.如权利要求136所述的方法，其特征在于，所述骨质疏松是由下列因素引起的绝 经、衰老、荷尔蒙失调、雌激素缺乏、睾丸激素下降、慢性疾病、吸烟、遗传易感性、身体质量 指数低、营养不良、酗酒、身体活动不足、接触重金属(如镉和铅)、过量饮用软饮料和使用 药物，如类固醇/糖皮质激素、或巴比妥类药物或其它酶诱导抗癫痫药物或质子泵抑制剂 或抗凝血剂或噻唑烷二酮(治疗糖尿病用)。
138.如权利要求136所述的方法，其特征在于，所述治疗为预防性的，所述预防治疗为一级治疗或二级治疗。
139.如权利要求104-105所述的组合物在药物制造中的应用，所述药物用于针对由 选自下组的风险因素所导致的骨质疏松的治疗应用，所述风险因素包括绝经、衰老、荷尔 蒙失调、雌激素缺乏、睾丸激素下降、慢性疾病、吸烟、遗传易感性、身体质量指数低、营养不 良、酗酒、身体活动不足、接触重金属(如镉和铅)、过量饮用软饮料和使用药物，如类固醇/ 糖皮质激素、或巴比妥类药物或其它酶诱导抗癫痫药物或质子泵抑制剂或抗凝血剂或噻唑 烷二酮(治疗糖尿病用)。
140.如权利要求104-105所述的组合物，用于治疗由选自下组的风险因素所导致的骨 质疏松绝经、衰老、荷尔蒙失调、雌激素缺乏、睾丸激素下降、慢性疾病、吸烟、遗传易感性、 身体质量指数低、营养不良、酗酒、身体活动不足、接触重金属(如镉和铅)、过量饮用软饮 料和使用药物，如类固醇/糖皮质激素、或巴比妥类药物或其它酶诱导抗癫痫药<物或质子 泵抑制剂或抗凝血剂或噻唑烷二酮(治疗糖尿病用)。
141.一种包含如权利要求104-105所述组合物的药物组合物，用于治疗由选自下组的 风险因素所导致的骨质疏松绝经、衰老、荷尔蒙失调、雌激素缺乏、睾丸激素下降、慢性疾 病、吸烟、遗传易感性、身体质量指数低、营养不良、酗酒、身体活动不足、接触重金属(如镉 和铅)、过量饮用软饮料和使用药物，如类固醇/糖皮质激素、或巴比妥类药物或其它酶诱 导抗癫痫药物或质子泵抑制剂或抗凝血剂或噻唑烷二酮(治疗糖尿病用)。
142.—种用作药物的、能与蛋白质的外部位点相互作用的分子。
143.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致调控所述蛋白质的 活性。
144.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致抑制IGFBP-4的蛋白 水解。
145.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致对所述蛋白质的两 种或多种生理底物的差异抑制。
146.如权利要求142所述的分子，其特征在于，相互作用导致选择性抑制所述蛋白质 对IGFBP-4而不是对IGFBP-5的活性。
147.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述相互作用导致刺激IGF的释放。
148.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述分子为所述蛋白质的激动剂。
149.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述分子为所述蛋白质的拮抗剂。
150.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述分子为肽。
151.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述分子为抗体或其片段。
152.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述分子是连接到运载体上的。
153.如权利要求152所述的分子，其特征在于，所述运载体带有一个抗生物素蛋白部 分，例如链霉亲和素，其任选为生物素化的。
154.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述分子是连接，例如共价连接到固体 支持物或是半固体支持物上的。
155.如权利要求142所述的分子，其特征在于，所述分子为多肽。
156.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽融合到了亲和标签上，例如组 氨酸标签。
157.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽融合到了信号肽上。
158.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽融合到原区上。
159.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽融合到前原区上。
160.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽包含一个或多个被修饰的 氨基酸残基，所述修饰优选为选自下组体内或体外的化学衍生，例如乙酰化或羧化；糖基 化，例如将多肽与如哺乳动物糖基化酶或脱糖基化酶等影响糖基化的酶相接触所产生的糖 基化；磷酸化，例如对氨基酸残基进行修饰形成磷酸化的氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸、磷 酸丝氨酸和磷酸苏氨酸。
161.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽包含一个或多个被修饰的氨 基酸残基，从而优选提高对于蛋白水解降解的抗性和稳定性，或是优化溶解性，或是使多肽 能够更适用于作为治疗剂。
162.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽包含除了天然存在的L-氨基 酸残基之外的氨基酸残基。
163.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽包含D-氨基酸残基。
164.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽包含非天然存在的、合成的氨 基酸。
165.如权利要求155所述的分子，其特征在于，所述多肽还包含一个或多个阻断基，优 选为适用于保护和/或稳定多肽的N端和C端免于受不希望的降解的化学取代基的形式。
166.如权利要求165所述的分子，其特征在于，所述一个或多个阻断基包括不会对多 肽的体内活性起到反作用的保护基团。
167.如权利要求165所述的分子，其特征在于，所述一个或多个阻断基是通过N端的烷 基化或酰基化引入的。
168.如权利要求165所述的分子，其特征在于，所述一个或多个阻断基选自N端阻断 基，其包括C1到C5的支链或非支链烷基和酰基，如甲酰基和乙酰基，以及其取代形式，例如 乙酰氨甲基(Acm)基团。
169.如权利要求165所述的分子，其特征在于，所述一个或多个阻断基选自N端阻断 基，其包括氨基酸的脱氨基类似物，它可以连接到肽的N端或是用于取代N端氨基酸残基。
170.如权利要求165所述的分子，其特征在于，所述一个或多个阻断基选自C端阻断 基，其中C端的羧基被掺入或未掺入例如酯基、酮基和酰胺基，以及脱羧基化的氨基酸类似 物。
171.如权利要求165所述的分子，其特征在于，所述一个或多个阻断基选自C端阻断 基，其包括形成酯或酮的烷基，例如低级(CjIjC6)烷基，如甲基、乙基和丙基；以及形成酰胺 的氨基，例如伯胺基(-NH2)以及单-和双烷基胺基，例如甲氨基、乙氨基、二甲基氨基、二乙 基氨基、甲基乙基氨基等等。
172.如权利要求155所述的分子，其特征在于，N末端的游离氨基和末端的游离羧基可 以一起从多肽上去除，从而产生其脱氨基和脱羧基化的形式，而对多肽的生物活性没有显 著的影响。
173.—种生产如权利要求155所述的多肽的方法，所述方法包含下列步骤提供编码 所述多肽的多核苷酸，并且在体外表达或在合适的宿主生物体内表达所述多核苷酸，从而产生所述的多肽。
174.—种编码如权利要求155所述的多肽的多核苷酸。
175.一种能够在严格条件下与编码如权利要求155所述多肽的多核苷酸或是其片段 杂交的核苷酸序列。
176.如权利要求151所述的抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体。
177.如权利要求151所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
178.如权利要求151所述的抗体，其特征在于，所述抗体的结合依赖于钙离子。
179.如权利要求151所述的抗体片段，其特征在于，所述抗体片段包含选自下组的抗 体的一部分F(ab' )2、F(ab)2、Fab'和 Fab。
180.如权利要求151所述的抗体片段，其特征在于，所述抗体片段为与特定抗原结合 的合成的或基因工程化的多肽。
181.如权利要求151所述的抗体片段，其特征在于，所述抗体片段选自下组包含或由 轻链可变区构成的抗体片段；包含或由Fv片段构成的抗体片段，所述Fv片段由重链和轻链 可变区构成；包含或由重组单链多肽分子构成的抗体片段，该分子中重链和轻链的可变区 由肽接头连接(scFv蛋白)；以及包含或由最小识别单位构成的抗体片段，所述最小识别单 位由模拟超变区的氨基酸残基构成。
182.如权利要求151所述的抗体，其特征在于，所述抗体为重组蛋白形式的嵌合抗体， 其包含来源于啮齿动物抗体的可变区和互补决定区，而抗体分子的其余部分来源于人抗 体。
183.如权利要求151所述的抗体，其特征在于，所述抗体为重组蛋白形式的人源化抗 体，其中，单克隆抗体的鼠类互补决定区从鼠类免疫球蛋白的重链和轻链可变链转移到了 人的可变区。
184.如权利要求151所述的抗体，其特征在于，所述抗体还包含或连接到一个分子或 原子形式的可检测标签上，该标签能偶联到抗体部分上，产生可以更容易检测的部分。
185.如权利要求184所述的抗体，其特征在于，所述标签选自下组螯合剂，光活性剂， 放射性同位素，荧光剂和顺磁性离子。
186.—种能被如权利要求151所述的抗体识别的多肽。
187.—种包含如权利要求155所述的多肽以及生理可接受的运载体的组合物。
188.—种包含如权利要求155所述的多肽以及药学可接受的运载体的药物组合物。
189.—种如权利要求187和188所述的组合物，还包含一种或多种附加的生物活性药 剂的组合。
190.一种如权利要求187和188所述的组合物，还包含一种或多种选自下组的一种或 多种附加生物活性药剂的组合抗血小板药物，抗凝血剂，纤维蛋白溶解剂，用于治疗心血 管疾病的药物，用于治疗骨质疏松的药物，用于医疗的抗癌药物。
191.一种包含如权利要求155所述的多肽或是如权利要求187和188所述的组合物， 以及至少一种附加组分的组合试剂盒。
192.如权利要求191所述的组合试剂盒，其特征在于，所述附加的一种或多种组分包 含所需给药的用法和给药方案的说明小册子。
193.如权利要求191所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分为选自下组的生物活性药剂抗血小板药物，抗凝血剂，纤维蛋白溶解剂，用于治疗心血管 疾病的药物，用于治疗骨质疏松的药物，用于医疗的抗癌药物。
194.如权利要求193所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分 为选自下组的抗癌药物阿地白介素/普留净(希龙公司)，阿仑单抗/坎帕斯(美礼联和 ILEX公司)，阿利维A酸/盘雷汀(里甘药业)，别嘌呤醇/赛洛平(葛兰素史克)，六甲蜜 胺/克瘤灵(美国生物科学公司)，氨磷汀/阿密磷定(美国生物科学公司)，阿那曲唑/瑞 宁得(阿斯利康)，三氧化二砷/特瑞森诺(细胞治疗公司)，天冬酰胺酶/优适宝(默克 公司)，卡介苗活菌/蒂斯卡介苗(欧加农公司)，贝沙罗汀胶囊/塔革雷汀(里甘药业)， 博莱霉素/博莱诺松(百时美施贵宝)，白消安/白舒非(葛兰素史克)，卡普睾酮/二甲 睾酮(法玛西亚普强公司)，卡培他滨/希罗达(罗氏)，卡钼/伯尔(百时美施贵宝)，卡 莫司汀/卡氮芥、BiCNU(百时美施贵宝)，带有聚苯丙生20的卡莫司汀植入体/格立得膜 剂(吉尔福德制药公司)，塞来昔布/西乐葆(塞尔公司)，苯丁酸氮芥/瘤克宁(葛兰素史 克)，顺钼/顺氯氨钼(百时美施贵宝)，克拉屈滨/鲁斯塔汀、2-CdA (强生药物研究所)，环 磷酰胺、环磷氮芥/癌得星(百时美施贵宝)，阿糖胞苷/赛德萨-U(法玛西亚普强公司)， 达卡巴嗪/氮烯咪胺(拜尔)，更生霉素/放线菌素D、可美净(默克)，阿法达贝泊汀/血 红升(安进公司)，柔红霉素/道诺霉素/正定霉素(贝德福德公司)，柔红霉素道诺霉素/ 柔毛霉素(惠氏药厂)，地尼白介素-毒素连接物/恩塔克(塞拉根公司)，右雷佐生/因 乐咔(法玛西亚普强公司)，多西紫杉醇/泰索帝(安万特制药)，阿霉素、亚德里亚霉素/ 罗拜克斯(法玛西亚普强公司)，屈他雄酮丙酸酯/马斯特龙注射液(先达公司)，埃利奥 溶液(欧范医药公司)，表阿霉素/表柔比星(法玛西亚普强公司)，磷酸依托泊苷(百时 美施贵宝)，依托泊苷/VP-16/凡必治(百时美施贵宝)，依西美坦/阿诺新(法玛西亚普 强公司)，非拉司汀/优保津(安进公司)，氟尿苷/FUDR (罗氏)，氟达拉滨/福达华(贝 莱克公司)，氟尿嘧啶/5-FU/安瑞欣，氟维司群/法洛德(IPR)，吉西他滨/健择(礼来制 药)，吉妥珠单抗奥唑米星/麦罗塔(惠氏药厂)，醋酸戈舍瑞林/诺雷德植入物(阿斯利 康制药)，羟基脲/爱治(百时美施贵宝)，替伊莫单抗/泽瓦林(IDEC制药公司)，去甲氧 柔红霉素/依达比星(亚德里亚制药)，异环磷酰胺/IFEX(百时美施贵宝)，甲磺酸伊马 替尼/格列卫(诺华公司)，干扰素α-2a/罗扰素(霍夫曼罗氏公司)，干扰素α _2b/甘 乐能(先灵公司)，伊立替康/开普拓(法玛西亚普强公司)，来曲唑/弗隆(诺华公司)， 亚叶酸、维尔康沃林/亚叶酸钙(伊姆尼克斯公司)，左旋咪唑/俄格米嗦(杨森研究基金 会)，洛莫司汀/CCNU/CeeBU(百时美施贵宝)，双氯乙基甲胺/氮芥/盐酸氮芥(默克公 司)，醋酸甲地孕酮/梅格施(百时美施贵宝)，美法仑/L-PAM/爱克兰(葛兰素史克)，巯 嘌呤/6-MP、乐疾宁(葛兰素史克)，美司那/美斯奈(爱斯达制药)，甲氨蝶呤(莱德利制 药)，甲氧沙林/瓦德斯(赛拉克公司)，丝裂霉素C/突变霉素(百时美施贵宝公司)，丝裂 霉素C/丝裂吉特(超更公司)，米托坦/密妥坦(百时美施贵宝)，米托蒽醌/诺肖林(莱 德利制药)，苯丙酸诺龙/多乐宝灵-50 (欧加农)，诺非单抗/巯诺莫(勃林格殷格翰制 药公司)，奥普瑞白介素/纽密伽(遗传学研究所)，奥沙利钼/乐沙定(赛诺菲-圣德拉 堡制药)，紫杉醇/泰素(百时美施贵宝)，帕米德诺内/阿可达(诺华)，培加酶/阿达根 (牛培加酶)(恩佐公司)，培门冬酶/培加帕酶(恩佐公司)，聚乙二醇非格司亭/纽拉思 塔(安进公司)，喷妥司汀/尼喷提(帕克戴维斯制药公司)，哌泊溴烷/溴丙哌嗪(雅培制药)，光辉霉素/普卡霉素/光神霉素(辉瑞制药)，卟吩姆钠/光卟啉OiLT光线治疗公 司)，甲基苄胼/丙卡巴胼(希格玛托制药)，奎纳克林/阿的平(雅培制药)，拉布立酶/ 爱立特(赛诺菲-圣德拉堡制药)，利妥昔单抗/美罗华(基因泰克公司)，沙格司亭/粒 细胞集落刺激因子(伊姆尼克斯公司)，链脲佐菌素/链佐星(法玛西亚普强公司)，塔司/ 司兰索(布莱恩公司)，他莫昔芬/诺瓦得士(阿斯利康制药)，替莫唑胺/泰道(先灵)， 替尼泊苷/VM-26/威门(百时美施贵宝)，睾内酯酮/睾内酯(百时美施贵宝)，硫鸟嘌呤 /6-TG/硫鸟嘌呤(葛兰素史克)，噻替哌/塞替派(莱德利制药)，拓扑替康/癌康定(葛 兰素史克)，拓扑替康/癌康定(葛兰素史克)，拓扑替康/癌康定(葛兰素史克)，托瑞米 芬/法乐通(奥立安公司)，托西莫单抗/百克莎(科里西亚公司)，曲妥单抗/赫赛汀(基 因泰克公司)，维甲酸/ATRA/凡善能(罗氏)，乌拉莫司汀(罗伯茨制药)，戊柔比星/戊司 他(美第瓦公司)，长春碱/威保啶(礼来制药)，长春新碱/安可平(礼来制药)，长春瑞 滨/诺维本(葛兰素史克)和唑来膦酸/择泰(诺华)。
195.如权利要求193所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分 为选自下组的用于治疗骨质疏松的药物双磷酸盐类例如福善美(阿仑膦酸钠)、骨维壮 (伊班膦酸钠)或安妥良(利塞膦酸钠)，雷尼酸锶(普特罗锶)，降钙素(密钙息)，雷洛 昔芬，雌激素，甲状旁腺激素(PTH)和蒂罗奈(羟乙膦酸二钠)。
196.如权利要求193所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分 为选自下组的用于治疗心血管疾病的药物阿司匹林，阿洛普令，地他唑，卡巴匹林钙，氯克 罗孟，吲哚布芬，毗考他胺，三氟醋柳酸，氯吡格雷，双嘧达莫，普拉格雷，噻氯匹定，贝前列 素，前列环素，伊洛前列素，曲前列环素，阿昔单抗，依非巴特，替罗非班，肝素，贝米肝素，达 肝素，依诺肝素，那屈肝素，帕肝素，瑞维肝素，亭扎肝素，舒洛地特，达那肝素，华法林/香 豆素，醋硝香豆素，氯苯茚二酮，杀鼠迷，双香豆素，双苯茚酮，双香豆素乙酯，苯丙羟基香豆 素，苯茚二酮，噻氯香豆素，达比加群，艾卓肝素，来匹卢定，比伐卢定，阿加曲班，地西卢定， 水蛭素，美拉加群，希美加群，抗凝血酶III，利伐沙班，磺达肝素，C蛋白，S蛋白，TFPI，去纤 苷酸，硫酸皮肤素，替奈普酶，阿尼普酶，安克洛酶，替加色罗，纤维蛋白溶酶，溶栓蛋白酶， tPA，uPA，尿激酶，链激酶，卡托普利，佐芬普利，依那普利，雷米普利/沃塔司，喹那普利，培 哚普利，赖诺普利/捷赐瑞，苯那普利，福辛普利/蒙诺普利，瑞西那明，酪激肽，乳激肽，坎 地沙坦/阿塔坎，依普罗沙坦，厄贝沙坦/安普诺，氯沙坦/科素亚，奥美沙坦，替米沙坦/美 卡素/匹里托，缬沙坦/代文，阿利吉仑/泰克仑那/锐思力，利尿磺胺，利尿酸，托拉塞米， 布美他尼，氢氯噻嗪，氯噻嗪，苄氟噻嗪，阿米洛利，螺内酯，依普利酮，氨苯蝶啶，坎利酸钾， 坎利酮，吲达帕胺，氯噻酮，喹乙宗，汞撒利，美托拉宗，可可碱，西氯他宁，比索洛尔，卡维地 洛，美托洛尔，阿替洛尔，拉贝洛尔，美托洛尔/洛普索/托洛XL，普萘洛尔，地高辛，多巴酚 丁胺，硝苯地平/拜新同/利心平，氨氯地平/络活喜，非洛地平/波依定，尼卡地平/卡 登，尼莫地平/尼莫托，尼索地平/苏拉尔，尼群地平/心涤夫/尼特平，拉西地平/莫腾， 乐卡地平/再宁平，地尔硫卓/凯帝心，维拉帕米/卡朗/异搏定，戈洛帕米/D600，硝酸异 山梨酯，胼屈嗪，二氮嗪，米诺地尔，硝普盐，酚妥拉明，可可碱，可乐定，胍法辛，甲基多巴， 莫索尼定，利血平，利美尼定，美加明，曲美芬，哌唑嗪，胍乙啶，吲哚拉明，多沙唑嗪，特拉唑 嗪，酮色林，波生坦，安倍生坦和塞塔生坦。。
197.如权利要求193所述的组合试剂盒，其特征在于，至少一种或多种所述附加组分为选自下组的佐剂矿物质的、细菌的、植物的，合成的或宿主产生的佐剂，包括铝化合物， 胞壁酰二肽，类脂A，百日咳杆菌，脂多糖，弗氏完全佐剂(FCA)，Titermax, ISCOMS, QuilA, ALUN，类脂A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成肽基质，GMDP，植物产 物如皂角苷等，动物产物如甲壳素等，多种合成化学品，油乳剂，脂质体，合成的聚合物和胞壁酰二肽。
198.一种用如权利要求142所述分子或如权利要求187和188所述组合物治疗有需要 的个体的方法。
199.一种治疗心血管疾病/病症的方法，包括给予有需要的个体如权利要求187和 188所述的组合物。
200.如权利要求199所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病/病症包括动脉瘤，心 绞痛，心律失常，动脉硬化，心肌病，脑血管意外(中风)，脑血管疾病，先天性心脏病，充血 性心力衰竭，心力衰竭，心肌炎，瓣膜病，冠状动脉疾病，扩张型心肌病，舒张功能障碍，心内 膜炎，高血压(高血压)，肥厚性心肌病，二尖瓣脱垂，心肌梗死(心脏病发作)，静脉血栓， 急性冠脉综合征，例如心肌缺血和心肌梗死，脑血管意外/中风，心房颤动，心律失常，心绞 痛，稳定型心绞痛，不稳定心绞痛，深静脉血栓和肺栓塞，血栓(血凝块)，周围动脉闭塞，原 发性或继发性动脉血栓或栓塞，血栓形成倾向(发展成血栓的趋势)，心脏手术和肾功能衰 竭血液透析的心肺体外循环，常规抗血栓治疗，凝血因子异常，血友病，A型血友病(因子 VIII缺乏)，B型血友病(因子IX缺乏症或“克里斯马斯氏病”)和C型血友病(因子XI 缺乏症，轻度出血倾向)，血管性血友病，出血，血友病，血小板障碍(先天性或后天性)，格 兰兹曼血小板机能不全，巨血小板综合征(糖蛋白Ib-IX-V复合物异常)，灰色血小板综合 征(缺乏阿尔法颗粒)，δ贮积池缺陷(缺乏致密颗粒)，出血，血小板数量减少，骨髓增生 异常综合征，骨髓疾病，免疫系统造成的破坏，免疫血小板减少性紫癜/ΙΤΡ，血栓性血小板 减少性紫癜/ΤΤΡ，溶血尿毒综合征/HUS，阵发性睡眠性血红蛋白尿破坏/ΡΝΗ，弥漫性血管 内凝血/DIC，肝素诱导的血小板减少症/HIT)，血栓，人工/假体心脏瓣膜，心脏瓣膜病，细 菌性心内膜炎，风湿性二尖瓣病变，二尖瓣狭窄，二尖瓣脱垂，二尖瓣环钙化，分离主动脉瓣 膜疾病，血栓形成倾向(即发展为血栓趋势)，血栓形成倾向，凝血因子V Leiden，高凝血 症，编码凝血因子V的基因突变，深静脉血栓(DVT)，肺栓塞，中风，心脏病发作，短暂性脑缺 血发作，凝血酶原突变，凝血因子II突变，MTHFR突变或维生素缺乏(维生素B6，B12和叶 酸)导致的同型半胱氨酸水平高，抗磷脂综合征(或抗磷脂抗体综合征)(APS)，动脉和静脉 都有血栓，纤溶酶原和纤维蛋白溶解症，阵发性睡眠性血红蛋白尿，C蛋白缺乏症，S蛋白缺 乏症和抗凝血酶III缺乏症。
201.如权利要求199所述的方法，其特征在于，所述治疗为预防性的，所述预防治疗是 一级治疗或二级治疗。
202.如权利要求199所述的方法，其特征在于，所述治疗为改善性的。
203.如权利要求199所述的方法，其特征在于，所述治疗为治愈性的。
204.如权利要求187和188所述的组合物在药物制造中的应用，所述药物用于针对选 自下组的疾病/病症的治疗应用动脉瘤，心绞痛，心律失常，动脉硬化，心肌病，脑血管意 外(中风)，脑血管疾病，先天性心脏病，充血性心力衰竭，心力衰竭，心肌炎，瓣膜病，冠状 动脉疾病，扩张型心肌病，舒张功能障碍，心内膜炎，高血压(高血压)，肥厚性心肌病，二尖瓣脱垂，心肌梗死(心脏病发作)，静脉血栓，急性冠脉综合征，例如心肌缺血和心肌梗死， 脑血管意外/中风，心房颤动，心律失常，心绞痛，稳定型心绞痛，不稳定心绞痛，深静脉血 栓和肺栓塞，血栓(血凝块)，周围动脉闭塞，原发性或继发性动脉血栓或栓塞，血栓形成倾 向(发展成血栓的趋势)，心脏手术和肾功能衰竭血液透析的心肺体外循环，常规抗血栓治 疗，凝血因子异常，血友病，A型血友病(因子VIII缺乏)，B型血友病(因子IX缺乏症或“克 里斯马斯氏病”)和C型血友病(因子XI缺乏症，轻度出血倾向)，血管性血友病，出血，血 友病，血小板障碍(先天性或后天性)，格兰兹曼血小板机能不全，巨血小板综合征(糖蛋白 Ib-IX-V复合物异常)，灰色血小板综合征(缺乏阿尔法颗粒)，δ贮积池缺陷(缺乏致密颗 粒)，出血，血小板数量减少，骨髓增生异常综合征，骨髓疾病，免疫系统造成的破坏，免疫血 小板减少性紫癜/ΙΤΡ，血栓性血小板减少性紫癜/ΤΤΡ，溶血尿毒综合征/HUS，阵发性睡眠 性血红蛋白尿破坏/ΡΝΗ，弥漫性血管内凝血/DIC，肝素诱导的血小板减少症/HIT)，血栓， 人工/假体心脏瓣膜，心脏瓣膜病，细菌性心内膜炎，风湿性二尖瓣病变，二尖瓣狭窄，二尖 瓣脱垂，二尖瓣环钙化，分离主动脉瓣膜疾病，血栓形成倾向(即发展为血栓趋势)，血栓形 成倾向，凝血因子V Leiden，高凝血症，编码凝血因子V的基因突变，深静脉血栓(DVT)Ji 栓塞，中风，心脏病发作，短暂性脑缺血发作，凝血酶原突变，凝血因子II突变，MTHFR突变 或维生素缺乏(维生素B6，B12和叶酸)导致的同型半胱氨酸水平高，抗磷脂综合征(或抗 磷脂抗体综合征)(APQ，动脉和静脉都有血栓，纤溶酶原和纤维蛋白溶解症，阵发性睡眠性 血红蛋白尿，C蛋白缺乏症，S蛋白缺乏症和抗凝血酶III缺乏症。
205.如权利要求187和188所述的组合物，其用于治疗选自下组的心血管疾病/病症 动脉瘤，心绞痛，心律失常，动脉硬化，心肌病，脑血管意外(中风)，脑血管疾病，先天性心 脏病，充血性心力衰竭，心力衰竭，心肌炎，瓣膜病，冠状动脉疾病，扩张型心肌病，舒张功能 障碍，心内膜炎，高血压(高血压)，肥厚性心肌病，二尖瓣脱垂，心肌梗死(心脏病发作)， 静脉血栓，急性冠脉综合征，例如心肌缺血和心肌梗死，脑血管意外/中风，心房颤动，心律 失常，心绞痛，稳定型心绞痛，不稳定心绞痛，深静脉血栓和肺栓塞，血栓(血凝块)，周围动 脉闭塞，原发性或继发性动脉血栓或栓塞，血栓形成倾向(发展成血栓的趋势)，心脏手术 和肾功能衰竭血液透析的心肺体外循环，常规抗血栓治疗，凝血因子异常，血友病，A型血友 病(因子VIII缺乏)，B型血友病(因子IX缺乏症或“克里斯马斯氏病”)和C型血友病 (因子XI缺乏症，轻度出血倾向)，血管性血友病，出血，血友病，血小板障碍(先天性或后 天性)，格兰兹曼血小板机能不全，巨血小板综合征(糖蛋白Ib-IX-V复合物异常)，灰色血 小板综合征(缺乏阿尔法颗粒)，δ贮积池缺陷(缺乏致密颗粒)，出血，血小板数量减少， 骨髓增生异常综合征，骨髓疾病，免疫系统造成的破坏，免疫血小板减少性紫癜/ΙΤΡ，血栓 性血小板减少性紫癜/ΤΤΡ，溶血尿毒综合征/HUS，阵发性睡眠性血红蛋白尿破坏/ΡΝΗ，弥 漫性血管内凝血/DIC，肝素诱导的血小板减少症/HIT)，血栓，人工/假体心脏瓣膜，心脏瓣 膜病，细菌性心内膜炎，风湿性二尖瓣病变，二尖瓣狭窄，二尖瓣脱垂，二尖瓣环钙化，分离 主动脉瓣膜疾病，血栓形成倾向(即发展为血栓趋势)，血栓形成倾向，凝血因子V Leiden, 高凝血症，编码凝血因子V的基因突变，深静脉血栓(DVT)，肺栓塞，中风，心脏病发作，短暂 性脑缺血发作，凝血酶原突变，凝血因子II突变，MTHFR突变或维生素缺乏(维生素B6，B12 和叶酸)导致的同型半胱氨酸水平高，抗磷脂综合征(或抗磷脂抗体综合征)(APS)，动脉和 静脉都有血栓，纤溶酶原和纤维蛋白溶解症，阵发性睡眠性血红蛋白尿，C蛋白缺乏症，S蛋白缺乏症和抗凝血酶III缺乏症。
206.一种包含如权利要求187和188所述的组合物的药物组合物，其用于治疗选自 下组的心血管疾病/病症动脉瘤，心绞痛，心律失常，动脉硬化，心肌病，脑血管意外(中 风)，脑血管疾病，先天性心脏病，充血性心力衰竭，心力衰竭，心肌炎，瓣膜病，冠状动脉疾 病，扩张型心肌病，舒张功能障碍，心内膜炎，高血压(高血压)，肥厚性心肌病，二尖瓣脱 垂，心肌梗死(心脏病发作)，静脉血栓，急性冠脉综合征，例如心肌缺血和心肌梗死，脑血 管意外/中风，心房颤动，心律失常，心绞痛，稳定型心绞痛，不稳定心绞痛，深静脉血栓和 肺栓塞，血栓(血凝块)，周围动脉闭塞，原发性或继发性动脉血栓或栓塞，血栓形成倾向 (发展成血栓的趋势)，心脏手术和肾功能衰竭血液透析的心肺体外循环，常规抗血栓治 疗，凝血因子异常，血友病，A型血友病(因子VIII缺乏)，B型血友病(因子IX缺乏症或“克 里斯马斯氏病”)和C型血友病(因子XI缺乏症，轻度出血倾向)，血管性血友病，出血，血 友病，血小板障碍(先天性或后天性)，格兰兹曼血小板机能不全，巨血小板综合征(糖蛋白 Ib-IX-V复合物异常)，灰色血小板综合征(缺乏阿尔法颗粒)，δ贮积池缺陷(缺乏致密颗 粒)，出血，血小板数量减少，骨髓增生异常综合征，骨髓疾病，免疫系统造成的破坏，免疫血 小板减少性紫癜/ΙΤΡ，血栓性血小板减少性紫癜/ΤΤΡ，溶血尿毒综合征/HUS，阵发性睡眠 性血红蛋白尿破坏/ΡΝΗ，弥漫性血管内凝血/DIC，肝素诱导的血小板减少症/HIT)，血栓， 人工/假体心脏瓣膜，心脏瓣膜病，细菌性心内膜炎，风湿性二尖瓣病变，二尖瓣狭窄，二尖 瓣脱垂，二尖瓣环钙化，分离主动脉瓣膜疾病，血栓形成倾向(即发展为血栓趋势)，血栓形 成倾向，凝血因子V Leiden，高凝血症，编码凝血因子V的基因突变，深静脉血栓(DVT)Ji 栓塞，中风，心脏病发作，短暂性脑缺血发作，凝血酶原突变，凝血因子II突变，MTHFR突变 或维生素缺乏(维生素B6，B12和叶酸)导致的同型半胱氨酸水平高，抗磷脂综合征(或抗 磷脂抗体综合征)(APQ，动脉和静脉都有血栓，纤溶酶原和纤维蛋白溶解症，阵发性睡眠性 血红蛋白尿，C蛋白缺乏症，S蛋白缺乏症和抗凝血酶III缺乏症。
207.一种治疗癌症的方法，包括给予有需要的个体如权利要求187和188所述的组合物。
208.如权利要求207所述的方法，其特征在于，所述癌症包括急性淋巴细胞白血病，急 性髓细胞白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌症，艾滋病相关淋巴瘤，肛门癌，星形细胞 瘤(如儿童小脑或儿童大脑星形细胞瘤)，基底细胞癌，肝外胆道癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤 /恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，男性乳腺癌，支气管腺瘤/类癌，伯基 特淋巴瘤，类癌肿瘤，原发灶不明的癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤，脑星形细胞瘤/恶性 神经胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性 疾病，大肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤(如儿童室管膜瘤)，食道癌，尤文 氏家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤(如儿童颅外生殖细胞肿瘤)，性腺外生殖细胞肿瘤，眼癌 (眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤， 神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌，肝细胞(肝)癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视 觉通路的神经胶质瘤(如儿童下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤)，眼内黑色素瘤，胰岛细胞 癌(内分泌胰腺癌)，卡波西氏肉瘤，肾(肾细胞)癌，喉癌，唇及口腔癌，肺癌(非小细胞 或小细胞肺癌)，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，非霍奇 金淋巴瘤)，巨球蛋白血症(如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)，骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤，髓母细胞瘤(如儿童髓母细胞瘤)，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，间皮瘤(如成人恶性间 皮瘤或儿童间皮瘤)，原发灶不明的转移性颈部鳞癌，多发性内分泌腺瘤综合征(例如发生 在童年)，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨 髓增殖性疾病，骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)，慢性骨髓增生性疾病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌， 鼻咽癌(如儿童鼻咽癌)，神经母细胞瘤，口咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌 (如儿童卵巢癌)，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢恶性程度低的肿瘤，胰腺癌，胰腺 癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚 层肿瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，视网膜母细胞瘤， 横纹肌肉瘤(如儿童横纹肌肉瘤)，唾液腺癌，成人软组织肉瘤，软组织肉瘤(如儿童软组织 肉瘤)，子宫肉瘤，塞扎里综合征，皮肤癌(如非黑色素瘤皮肤癌)，梅克尔细胞皮肤癌，小肠 癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(如发生在儿童)，皮肤T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤和胸腺 癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，滋养细胞肿瘤(如妊娠滋养细胞肿瘤)，尿道癌， 子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视觉通路和下丘脑胶质瘤(如儿童视觉通路和下丘脑 胶质瘤)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
209.如权利要求207所述的方法，其特征在于，所述治疗为预防性的，所述预防治疗是 一级治疗或二级治疗。
210.如权利要求207所述的方法，其特征在于，所述治疗为改善性的。
211.如权利要求207所述的方法，其特征在于，所述治疗为治愈性的。
212.如权利要求187和188所述的组合物在药物制造中的应用，所述药物应用于针 对选自下组的癌症的治疗应用急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，肾上腺皮质癌， 艾滋病相关的癌症，艾滋病相关淋巴瘤，肛门癌，星形细胞瘤(如儿童小脑或儿童大脑星形 细胞瘤)，基底细胞癌，肝外胆道癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质 瘤，脑肿瘤，乳腺癌，男性乳腺癌，支气管腺瘤/类癌，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，原发灶不明 的癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤，脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢 性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性疾病，大肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤， 子宫内膜癌，室管膜瘤(如儿童室管膜瘤)，食道癌，尤文氏家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤 (如儿童颅外生殖细胞肿瘤)，性腺外生殖细胞肿瘤，眼癌(眼内黑色素瘤或视网膜母细胞 瘤)，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈 部癌，肝细胞(肝)癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤(如儿童下 丘脑和视觉通路的神经胶质瘤)，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)，卡波西氏肉 瘤，肾(肾细胞)癌，喉癌，唇及口腔癌，肺癌(非小细胞或小细胞肺癌)，淋巴瘤(如艾滋 病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤)，巨球蛋白血症(如瓦 尔登斯特伦巨球蛋白血症)，骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤，髓母细胞瘤(如儿童髓母细 胞瘤)，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，间皮瘤(如成人恶性间皮瘤或儿童间皮瘤)，原发灶不明 的转移性颈部鳞癌，多发性内分泌腺瘤综合征(例如发生在童年)，多发性骨髓瘤/浆细胞 瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病，骨髓瘤(如多发性 骨髓瘤)，慢性骨髓增生性疾病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，鼻咽癌(如儿童鼻咽癌)，神经母细 胞瘤，口咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌(如儿童卵巢癌)，卵巢上皮癌，卵巢 生殖细胞肿瘤，卵巢恶性程度低的肿瘤，胰腺癌，胰腺癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，前 列腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(如儿童横纹肌肉瘤)，唾 液腺癌，成人软组织肉瘤，软组织肉瘤(如儿童软组织肉瘤)，子宫肉瘤，塞扎里综合征，皮 肤癌(如非黑色素瘤皮肤癌)，梅克尔细胞皮肤癌，小肠癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(如发 生在儿童)，皮肤T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细 胞癌，滋养细胞肿瘤(如妊娠滋养细胞肿瘤)，尿道癌，子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌， 视觉通路和下丘脑胶质瘤(如儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血 症和肾母细胞瘤。
213.如权利要求187和188所述的组合物，其用于治疗选自下组的癌症疾病急性淋 巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌症，艾滋病相关淋巴瘤， 肛门癌，星形细胞瘤(如儿童小脑或儿童大脑星形细胞瘤)，基底细胞癌，肝外胆道癌，膀胱 癌，骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，男性乳腺癌，支气管 腺瘤/类癌，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，原发灶不明的癌，原发性中枢神经系统淋巴瘤，脑星 形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病， 慢性骨髓增生性疾病，大肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤(如儿童室管膜 瘤)，食道癌，尤文氏家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤(如儿童颅外生殖细胞肿瘤)，性腺外生 殖细胞肿瘤，眼癌(眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，妊 娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌，肝细胞(肝)癌，霍奇金淋巴瘤，下 咽癌，下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤(如儿童下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤)，眼内黑 色素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)，卡波西氏肉瘤，肾(肾细胞)癌，喉癌，唇及口腔癌， 肺癌(非小细胞或小细胞肺癌)，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细 胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤)，巨球蛋白血症(如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)，骨恶性纤维 组织细胞瘤/骨肉瘤，髓母细胞瘤(如儿童髓母细胞瘤)，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，间皮瘤 (如成人恶性间皮瘤或儿童间皮瘤)，原发灶不明的转移性颈部鳞癌，多发性内分泌腺瘤综 合征(例如发生在童年)，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨 髓增生异常/骨髓增殖性疾病，骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)，慢性骨髓增生性疾病，鼻腔和 鼻窦癌，鼻咽癌，鼻咽癌(如儿童鼻咽癌)，神经母细胞瘤，口咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组 织细胞瘤，卵巢癌(如儿童卵巢癌)，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢恶性程度低的肿 瘤，胰腺癌，胰腺癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕 上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，视 网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(如儿童横纹肌肉瘤)，唾液腺癌，成人软组织肉瘤，软组织肉瘤 (如儿童软组织肉瘤)，子宫肉瘤，塞扎里综合征，皮肤癌(如非黑色素瘤皮肤癌)，梅克尔细 胞皮肤癌，小肠癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(如发生在儿童)，皮肤T细胞淋巴瘤，睾丸癌， 胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，滋养细胞肿瘤(如妊娠滋养细胞肿 瘤)，尿道癌，子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视觉通路和下丘脑胶质瘤(如儿童视觉 通路和下丘脑胶质瘤)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
214.—种包含如权利要求187和188所述组合物的药物组合物，其用于治疗选自下 组的癌症疾病急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌 症，艾滋病相关淋巴瘤，肛门癌，星形细胞瘤(如儿童小脑或儿童大脑星形细胞瘤)，基底细胞癌，肝外胆道癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺 癌，男性乳腺癌，支气管腺瘤/癌，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，原发灶不明的癌，原发性中枢 神经系统淋巴瘤，脑星形细胞瘤癌/恶性神经胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性淋巴细胞白 血病，慢性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性疾病，大肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，子宫内膜癌， 室管膜瘤(如儿童室管膜瘤)，食道癌，尤文氏家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤(如儿童颅外 生殖细胞肿瘤)，性腺外生殖细胞肿瘤，眼癌(眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)，胆囊癌， 胃癌，胃肠道类癌肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈部癌，肝细胞 (肝)癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤(如儿童下丘脑和视觉 通路的神经胶质瘤)，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)，卡波西氏肉瘤，肾(肾 细胞)癌，喉癌，唇及口腔癌，肺癌(非小细胞或小细胞肺癌)，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴 瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤)，巨球蛋白血症(如瓦尔登斯特伦 巨球蛋白血症，骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤，髓母细胞瘤(如儿童髓母细胞瘤)，黑色 素瘤，梅克尔细胞癌，间皮瘤(如成人恶性间皮瘤或儿童间皮瘤)，原发灶不明的转移性颈 部鳞癌，多发性内分泌腺瘤综合征(例如发生在童年)，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，蕈样肉 芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病，骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)， 慢性骨髓增生性疾病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，鼻咽癌(如儿童鼻咽癌)，神经母细胞瘤，口 咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌(如儿童卵巢癌)，卵巢上皮癌，卵巢生殖细 胞肿瘤，卵巢恶性程度低的肿瘤，胰腺癌，胰腺癌，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬 细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列腺癌， 肾盂和输尿管移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(如儿童横纹肌肉瘤)，唾液腺癌， 成人软组织肉瘤，软组织肉瘤(如儿童软组织肉瘤)，子宫肉瘤，塞扎里综合征，皮肤癌(如 非黑色素瘤皮肤癌)，梅克尔细胞皮肤癌，小肠癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(如发生在儿 童)，皮肤T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，滋 养细胞肿瘤(如妊娠滋养细胞肿瘤)，尿道癌，子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，视觉通 路和下丘脑胶质瘤(如儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾 母细胞瘤。
215.—种治疗骨质疏松的方法，包括给予有需要的个体如权利要求187和188所述的 组合物。
216.如权利要求215所述的方法，其特征在于，所述骨质疏松是由下列因素引起的绝 经、衰老、荷尔蒙失调、雌激素缺乏、睾丸激素下降、慢性疾病、吸烟、遗传易感性、身体质量 指数低、营养不良、酗酒、身体活动不足、接触重金属(如镉和铅)、过量饮用软饮料和使用 药物，如类固醇/糖皮质激素、或巴比妥类药物或其它酶诱导抗癫痫药物或质子泵抑制剂 或抗凝血剂或噻唑烷二酮(治疗糖尿病用)。
217.如权利要求215所述的方法，其特征在于，所述治疗为预防性的。
218.如权利要求187和188所述的组合物在药物制造中的应用，所述药物用于针对 由选自下组的风险因素所导致的骨质疏松的治疗应用，所述风险因素包括绝经、衰老、荷尔 蒙失调、雌激素缺乏、睾丸激素下降、慢性疾病、吸烟、遗传易感性、身体质量指数低、营养不 良、酗酒、身体活动不足、接触重金属(如镉和铅)、过量饮用软饮料和使用药物，如类固醇/ 糖皮质激素、或巴比妥类药物或其它酶诱导抗癫痫药物或质子泵抑制剂或抗凝血剂或噻唑烷二酮(治疗糖尿病用)。
219.如权利要求187和188所述的组合物，其用于治疗针对由选自下组的风险因素所 导致的骨质疏松绝经、衰老、荷尔蒙失调、雌激素缺乏、睾丸激素下降、慢性疾病、吸烟、遗 传易感性、身体质量指数低、营养不良、酗酒、身体活动不足、接触重金属(如镉和铅)、过量 饮用软饮料和使用药物，如类固醇/糖皮质激素、或巴比妥类药物或其它酶诱导抗癫痫药 物或质子泵抑制剂或抗凝血剂或噻唑烷二酮(治疗糖尿病用)。
220.一种包含如权利要求187和188所述组合物的药物组合物，其用于治疗由选自 下组的风险因素所导致的骨质疏松绝经、衰老、荷尔蒙失调、雌激素缺乏、睾丸激素下降、 慢性疾病、吸烟、遗传易感性、身体质量指数低、营养不良、酗酒、身体活动不足、接触重金属 (如镉和铅)、过量饮用软饮料和使用药物，如类固醇/糖皮质激素、或巴比妥类药物或其它 酶诱导抗癫痫药物或质子泵抑制剂或抗凝血剂或噻唑烷二酮(治疗糖尿病用)。
221.一种包含SEQ ID NO 2或其片段的PAPP-A片段。
222.如权利要求221所述的片段，其特征在于，所述片段包含少于1547个SEQID NO 1的连续氨基酸残基，例如少于1530个连续氨基酸残基，例如少于1510个连续氨基酸残基， 例如少于1490个连续氨基酸残基，例如少于1470个连续氨基酸残基，例如少于1450个连 续氨基酸残基，例如少于1430个连续氨基酸残基，例如少于1410个连续氨基酸残基，例如 少于1390个连续氨基酸残基，例如少于1370个连续氨基酸残基，例如少于1350个连续氨 基酸残基，例如少于1330个连续氨基酸残基，例如少于1310个连续氨基酸残基，例如少于 1290个连续氨基酸残基，例如少于1270个连续氨基酸残基，例如少于1250个连续氨基酸残 基，例如少于1230个连续氨基酸残基，例如少于1210个连续氨基酸残基，例如少于1190个 连续氨基酸残基，例如少于1170个连续氨基酸残基，例如少于1150个连续氨基酸残基，例 如少于1130个连续氨基酸残基，例如少于1110个连续氨基酸残基，例如少于1090个连续 氨基酸残基，例如少于1070个连续氨基酸残基，例如少于1050个连续氨基酸残基，例如少 于1030个连续氨基酸残基，例如少于1010个连续氨基酸残基，例如少于990个连续氨基酸 残基，例如少于970个连续氨基酸残基，例如少于950个连续氨基酸残基，例如少于930个 连续氨基酸残基，例如少于910个连续氨基酸残基，例如少于890个连续氨基酸残基，例如 少于870个连续氨基酸残基，例如少于850个连续氨基酸残基，例如少于830个连续氨基酸 残基，例如少于810个连续氨基酸残基，例如少于790个连续氨基酸残基，例如少于770个 连续氨基酸残基，例如少于750个连续氨基酸残基，例如少于730个连续氨基酸残基，例如 少于710个连续氨基酸残基，例如少于690个连续氨基酸残基，例如少于670个连续氨基酸 残基，例如少于650个连续氨基酸残基，例如少于630个连续氨基酸残基，例如少于610个 连续氨基酸残基，例如少于590个连续氨基酸残基，例如少于570个连续氨基酸残基，例如 少于550个连续氨基酸残基，例如少于530个连续氨基酸残基，例如少于510个连续氨基酸 残基，例如少于490个连续氨基酸残基，例如少于470个连续氨基酸残基，例如少于450个 连续氨基酸残基，例如少于430个连续氨基酸残基，例如少于410个连续氨基酸残基，例如 少于390个连续氨基酸残基，例如少于370个连续氨基酸残基，例如少于350个连续氨基酸 残基，例如少于330个连续氨基酸残基，例如少于310个连续氨基酸残基，例如少于290个 连续氨基酸残基，例如少于270个连续氨基酸残基，例如少于250个连续氨基酸残基，例如 少于230个连续氨基酸残基，例如少于210个连续氨基酸残基，例如少于190个连续氨基酸残基，例如少于170个连续氨基酸残基，例如少于150个连续氨基酸残基，例如少于130个 连续氨基酸残基，例如少于110个连续氨基酸残基，例如少于90个连续氨基酸残基，例如少 于70个连续氨基酸残基，例如少于50个连续氨基酸残基，例如少于30个连续氨基酸残基。
223.—种包含多肽序列和结合伴侣的复合物，所述多肽序列包含PAPP-A外部位点或 其片段，例如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3 ；所述结合伴侣对所述外部 位点具有亲和力，其中，所述结合伴侣结合到所述外部位点会改变PAPP-A的活性。
224.如权利要求223所述的复合物，其特征在于，所述结合伴侣的分子量在 100-1，000, 000道尔顿的范围内，例如100-500道尔顿，例如500-1，000道尔顿，例 如1，000-1，500道尔顿，例如1，500-2，000道尔顿，例如2，000-2，500道尔顿，例 如2，500-3，000道尔顿，例如3，000-3，500道尔顿，例如3，500-4，000道尔顿，例 如4，000-4，500道尔顿，例如4，500-5，000道尔顿，例如5，000-5，500道尔顿，例 如5，500-6，000道尔顿，例如6，000-6，500道尔顿，例如6，500-7，000道尔顿，例 如7，000-7，500道尔顿，例如7，500-8，000道尔顿，例如8，000-8，500道尔顿，例 如8，500-9，000道尔顿，例如9，000-9，500道尔顿，例如9，500-10，000道尔顿，例如 10，000-20, 000道尔顿，例如20，000-30, 000道尔顿，例如30，000-40, 000道尔顿，例如 40，000-50, 000道尔顿，例如50，000-60, 000道尔顿，例如60，000-70, 000道尔顿，例如 70，000-80, 000道尔顿，例如80，000-90, 000道尔顿，例如90，000-100, 000道尔顿，例如 100，000-150, 000 道尔顿，例如 150，000-200, 000 道尔顿，例如 200，000-250, 000 道尔顿， 例如 250，000-300, 000 道尔顿，例如 300，000-350, 000 道尔顿，例如 350，000-400, 000 道尔 顿，例如 400，000-450, 000 道尔顿，例如 450，000-500, 000 道尔顿，例如 500，000-550, 000 道尔顿，例如550, 000-600, 000道尔顿，例如600, 000-650, 000道尔顿，例如 650，000-700, 000 道尔顿，例如 700，000-750, 000 道尔顿，例如 750，000-800, 000 道尔顿， 例如 800，000-850, 000 道尔顿，例如 850，000-900, 000 道尔顿，例如 900，000-950, 000 道尔 顿，例如 950，000-1，000，000 道尔顿。
全文摘要
在一个实施方式中，本发明涉及如抗体等PAPP-A外部位点作用因子，所述外部位点作用因子结合到包含PAPP-A的LNR3的区域上，并且有效地抑制IGFBP-4而不是IGFBP-5的蛋白水解。包含LNR3的区域代表了底物结合外部位点，能够作为选择性抑制蛋白水解的攻击目标。因此，在一个实施方式中，本发明涉及通过攻击外部位点，差异性地抑制天然蛋白酶底物。
文档编号C07K14/47GK102037007SQ200980111456
公开日2011年4月27日 申请日期2009年1月23日 优先权日2008年1月25日
发明者C·G·尼尔森, C·奥克斯维格, J·H·米克尔森 申请人:奥尔胡斯大学