伴随着肝病产生的水肿的判定方法

专利名称：伴随着肝病产生的水肿的判定方法
技术领域：
本发明涉及伴随着肝病产生的水肿的判定方法、用于判定伴随着肝病而产生的水 肿的试剂盒、可以预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的化合物的筛选方法、伴随着肝病产 生的水肿的预防或治疗剂等。
背景技术：
腹水等水肿症状由于肝硬化或肝细胞癌、细菌性腹膜炎、充血性心脏病、肾病综合 征、腹腔内各脏器的炎症性病变、腹膜炎而出现。特别是由于肝硬化而出现水肿是进入失代 偿期的征象，作为决定预后的非常重要的症状受到重视。以往，作为与水肿有关的临床检查上的检查项目，使用血清白蛋白量(非专利文 献1)。若血清白蛋白值降低至约2. 5 2. Og/dl以下，则认为胶体渗透压降低，产生腹水， 以其为指标进行疗效的监测。此外，若血清与腹水的白蛋白浓度差超过1. lg/dl则将与漏 出液的鉴别用于腹水治疗方法的选择，若为1. lg/dl以下则将与渗出液的鉴别用于腹水治 疗方法的选择。但是，为了适当地治疗肝硬化患者的水肿，不仅有必要测定血清白蛋白值，还有必 要掌握有无并发症，血清电解质的变动以及肾功能、各Na潴留或排泄因子的变动等掌握多 方面的临床检查信息来选择适当的治疗。特别是对于发现腹水的肝硬化患者中5 10%的 顽固性腹水，必须对肝内门体静脉分流术的实施进行研究，此外治疗预后的预测是重要的。 因此，期待确定能准确地反映肝病患者的水肿程度、并且定量性也优异的血清中的指标。白蛋白是在生物体内存在最多的蛋白质。作为白蛋白的生理功能，已知有胶体渗 透压的维持、物质的输送、氨基酸的供给、PH缓冲作用、氧化还原缓冲作用等。近年明确了 白蛋白中存在因翻译后的修饰所导致的微观不均一性，对白蛋白的质、而不是量的不同与 功能的不同的相关性进行了研究。血清白蛋白以从N末端起存在于第34位的半胱氨酸残基的SH基为游离状态的还 原型白蛋白、和与血中的半胱氨酸或谷胱甘肽等形成二硫(S-幻键状态的氧化型白蛋白的 混合物形式存在。在正常人血清中以还原型约75%、氧化型约25%的比率存在，但是有报 告指出肝硬化患者(非专利文献幻、慢性肾衰竭患者、糖尿病患者、麻醉或手术时的患者中 氧化型白蛋白的比率增加(非专利文献3)。有报告指出慢性肾衰竭患者由于血液透析而导致氧化型白蛋白降低，还原型白蛋 白增加(非专利文献4)。此外，有报告指出以肝硬化患者的低白蛋白血症的改善为功能效 果的BCAA颗粒制剂不仅改善白蛋白的量，还改善氧化型/还原型白蛋白比(专利文献1)， 因此白蛋白的质的改善对病状带来何种作用受到瞩目。但是，对于氧化型白蛋白水平与肝 病中的水肿(体内水分潴留)的关系完全未知。已知使用质谱分析或液相色谱高精度且稳定地对试样液体中的氧化型白蛋白和 还原型白蛋白的存在量以及它们的存在比率进行分析的方法(专利文献2)。[专利文献 1]W02007/015585
[专利文献 2]W02007/013679[非专利文献1]福井博治疗学vol.41，No. 4，p. 45-48，2007[非专利文献 2]ffatanabe, A. Nutrition 20 :351,2004[非专利文献3]惠良圣一临床检查48:501-511，2004[非专利文献 4] Sogami，M. Int. J. Peptide Protein Res 25 :398,198
发明内容
本发明的目的在于，提供准确地反映伴随着肝病产生的水肿的程度、并且定量性 也优异的血清中的指标。此外，本发明的目的在于，提供对于伴随着肝病产生的水肿的预防 或治疗有用的白蛋白制剂。本发明人在对肝硬化患者的氧化型/还原型白蛋白比进行研究的过程中，注意到 尽管为同程度的低白蛋白血症，也存在腹水显著的患者和不显著的患者。于是，对肝硬化患 者的血清中氧化型/还原型白蛋白比与水肿(水分潴留)进行评价，结果可知与白蛋白量 相比，氧化型/还原型白蛋白比与水肿之间表现出高的相关性。由这些结果发现，氧化型白 蛋白值是对肝硬化患者的腹水判定有效的指标，作为适于监测疗效的最优治疗方法采用的 指标是在临床上意义大的指标，若对患有伴随肝硬化的水肿的患者给予还原型白蛋白，主 动地减少氧化型白蛋白比率，则与给予含有氧化型白蛋白的通常白蛋白的情况相比，可以 有效地改善水肿，从而完成本发明。SP，本发明提供[1]伴随着肝病产生的水肿的判定方法，包括对由受试者得到的生物体试样中的 白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率进行定量。[2] [1]记载的方法，其中，基于氧化型白蛋白比率与水肿程度之间的正相关性来 判定水肿程度。[3]用于判定伴随着肝病而产生的水肿的试剂盒，含有用于对生物体试样中的白 蛋白中氧化型白蛋白所占的比率进行定量的试剂。[4]可以预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的化合物的筛选方法，包括以下步 骤(1)对患有伴随着肝病产生的水肿的非人哺乳动物给予候选化合物，(2)对由被给予了该候选化合物的非人哺乳动物得到的生物体试样中的白蛋白中 氧化型白蛋白所占的比率进行定量，(3)对由该非人哺乳动物得到的生物体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比 率与由未给予候选化合物的对照哺乳动物得到的生物体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白 所占的比率进行比较，和(4)基于比较结果，选择降低了氧化型白蛋白比率的化合物作为可以预防或治疗 伴随着肝病产生的水肿的化合物。[5]用于预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的白蛋白制剂，含有氧化型白蛋白比 率小于60%的白蛋白。[6]用于预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的白蛋白制剂，含有氧化型白蛋白比 率小于25%的白蛋白。
[7] [6]记载的白蛋白制剂，其中，氧化型白蛋白比率实质上为0%。[8] [5] [7]中任意一项记载的白蛋白制剂，进一步含有抗氧化剂。[9]用于预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的白蛋白制剂的制备方法，包括以下 步骤(1)提供氧化型白蛋白比率小于60%的白蛋白，和(2)通过将(1)的白蛋白溶解在水性溶剂中，得到用于预防或治疗伴随着肝病产 生的水肿的白蛋白制剂。[10]用于预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的白蛋白制剂的制备方法，包括以下 步骤(1)提供氧化型白蛋白比率小于25%的白蛋白，和(2)通过将(1)的白蛋白溶解在水性溶剂中，得到用于预防或治疗伴随着肝病产 生的水肿的白蛋白制剂。[11] [9]或[10]记载的制备方法，其中，步骤⑴通过对白蛋白实施还原处理来进 行。[12] [11]记载的制备方法，其中，在还原处理中，使用半胱氨酸作为还原剂。根据本发明，通过对由对象得到的生物体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白所占的 比率进行测定，可以迅速且准确地进行伴随着肝病产生的水肿程度的判定，例如治疗监测、 预后预测等，进而可以进行能预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的化合物的筛选。此外，若 使用本发明的白蛋白制剂，则可以主动地降低患者中的氧化型白蛋白比率，与使用以往的 白蛋白制剂的情况相比，可以更有效地预防或治疗伴随着肝病产生的水肿。


[图1]表示慢性肝病患者的血清中的氧化型白蛋白比率(％)(横轴，O-Alb)与 水肿(纵轴，水肿；ECff/TBff)之间的相关性。回归直线ECff/TBff = 0. 317+0. 001*0_Alb、R2 =0.482。[图2]表示慢性肝病患者的血清中的白蛋白水平(单位g/dL)(横轴，Alb)与水 肿(纵轴，水肿；ECW/TBW)之间的相关性。回归直线ECW/TBW = 0. 374-0. 008*Alb、R2 = 0. 277。[图3]表示慢性肝病患者的血清中的氧化型白蛋白比率(％)(横轴，O-Alb)与 Child-Pugh评分(上侧的图；纵轴，CP评分)以及MELD评分(下侧的图；纵轴，MELD)之 间的相关性。回归直线ChiId-Pugh 评分=3.013+0. 132*0_Alb、R2 = 0.268。MELD = 2+0. 316*0-Alb、R2 = 0. 066。[图4]表示血清白蛋白制剂通过半胱氨酸处理进行的还原。横轴表示质荷比(m/ ζ)、纵轴表示相对存在量。质荷比为1387. 6及1389. 5附近的峰表示氧化型白蛋白，质荷比 为1385. 2及1383. 7附近的峰表示还原型白蛋白。上图对照(未添加半胱氨酸、室温、90 分钟)，中图未添加半胱氨酸、37°C、90分钟，下图添加半胱氨酸、37°C、90分钟。
具体实施例方式本发明提供伴随着肝病产生的水肿的判定方法。本发明的判定方法包括对由受试者得到的生物体试样中的白蛋白(优选为血清白蛋白)的氧化型白蛋白比率进行定量。如实施例所示，血清白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率和伴随着肝病产生的水肿 程度表现出正相关性，氧化型白蛋白比率越高则伴随着肝病产生的水肿程度也越大。因此， 在本发明的判定方法中，基于氧化型白蛋白比率与水肿程度之间的正相关性来判定水肿程度。肝病包括可能并发水肿的所有肝病。作为肝病，可以举出肝硬化、肝炎(病毒性肝 炎(丙型肝炎、乙型肝炎等)、酒精性肝炎、非酒精性肝炎等)等。水肿指的是在细胞间质潴留过量体液的状态(水分潴留)。伴随着肝病产生的水 肿主要以腹水的症状表现出来。作为本发明的判定方法的受试者，可以举出肝病的患者以及怀疑患有肝病的健康 者。此外，这里所称的患者不限定为人，人以外的哺乳动物(小、鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿 类或兔子等实验动物，猪、牛、山羊、马、绵羊、貂等家畜，狗、猫等宠物，猴、恒河猴、狨、猩猩、 黑猩猩等灵长类等)也是本发明的对象。作为本发明的判定方法中使用的生物体试样，通常使用体液。作为体液，可以举出 血清、血浆、血液、腹水、淋巴液、尿、骨髓液等。体液优选为血清、血浆、血液或腹水。氧化型白蛋白比率指的是氧化型白蛋白在总白蛋白(氧化型白蛋白与还原型白 蛋白的总和)中所占的比率。氧化型白蛋白指的是白蛋白以外的生物体内的硫醇化合物 (半胱氨酸、谷胱甘肽等)通过二硫键与从N末端起存在于第34位的半胱氨酸残基键合而 成的白蛋白。还原型白蛋白指的是从N末端起存在于第34位的半胱氨酸残基的SH基处于 游离状态的白蛋白。对生物体试样中的氧化型白蛋白比率进行定量的方法不特别限定，可以使用本身 公知的方法。例如，可以使用以下的方法(I)利用溴甲酚绿(BCG)和溴甲酚紫(BCP)的色素结合法。BCP法由于对于还原 型白蛋白和氧化型白蛋白的反应性不同，可以由利用BCP法和BCG法求得的白蛋白定量值 的差算出氧化型白蛋白比率。(II)使用埃尔曼试剂(工>試薬)等游离SH基定量试剂，对来自还原型白蛋 白的 SH 基进行定量的方法(Sogami M, Int. Pept. Protein Res.，24 O)，96-103，1984)。(III)使用高效液相色谱(HPLC)的方法(Sogami M.，J. Chromatogr.，332，19-27， 1985 ；日本特开昭 61-155397 ；日本特公平 2-4863 ；Int. J. Peptide Protein Res. 24 :96 ； 1984)。分离并检测还原型白蛋白和氧化型白蛋白，可以由分离得到的色谱图上的峰面积比 求得氧化型白蛋白比率。(IV)使用质谱仪进行的白蛋白的分析方法(安川惠子，临床检查，44(8)， 907-910, 2000) 0氧化型白蛋白，由于加成的化合物(例如半胱氨酸)的质量份，比还原型 白蛋白重。因此，通过用具有充分的质量分辨率的质谱仪进行测定，可以分离并检测还原型 白蛋白和氧化型白蛋白。(V)使用通过将试样溶液的pH调整为特定范围(pH 4 9，优选为5. 8 6. 2)得 到改善的HPLC或质谱的方法(W02007/013679)。将试样溶液的pH调整为特定范围，优选以 特定范围的比率稀释试样制成稀释溶液或利用色谱方法或超滤等除去低分子物质，由此显 著抑制试样溶液中的还原型白蛋白的氧化，可以非常稳定地进行高精度的白蛋白测定。
若考虑到分析精度的稳定性或高度，则生物体试样中的氧化型白蛋白比率优选通 过上述(III) (V)中的任意一种方法进行定量。生物体试样中的氧化型白蛋白比率的定量优选在生物体外进行。然后，使用测定得到的氧化型白蛋白比率，对伴随着肝病产生的水肿程度进行判 定。该判定基于氧化型白蛋白比率与水肿程度之间的正相关性来进行。例如，由判明并发有一定水平水肿的肝病患者(阳性对照)和健康人(阴性对照) 制备生物体试样，将受试者的生物体试样中的氧化型白蛋白比率与阳性对照及阴性对照的 氧化型白蛋白比率进行比较。在阳性对照和阴性对照中，优选通过与受试者相同的采取方 法得到生物体试样，通过与受试者相同的测定方法测定氧化型白蛋白比率，这从提高数据 的精度方面考虑优选。此外，还可以预先制作氧化型白蛋白比率与水肿程度的相关性图，将 受试者的氧化型白蛋白比率与该相关图进行比较。氧化型白蛋白比率的比较优选基于有无 显著性差异来进行。然后，根据氧化型白蛋白比率的比较结果，在受试者的氧化型白蛋白比率相对高 的情况下，可以判定水肿程度相对高(或在受试者的氧化型白蛋白比率相对低的情况下， 判定水肿程度相对低)。此外，还可以通过预先设定氧化型白蛋白比率的阈值(cut-off value)，对测定得 到的氧化型白蛋白比率与该阈值进行比较来进行。例如，测定得到的氧化型白蛋白比率为 上述阈值以上时，可以判定水肿程度相对高，低于上述阈值时，可以判定水肿程度相对低。 阈值例如可以为基于氧化型白蛋白比率与水肿程度的相关曲线，得到所需水肿程度的氧化 型白蛋白比率。或者，在本发明的判定方法中，还可以对由治疗中的受试者得到的生物体试样中 的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率与由治疗前和/或治疗后的同一受试者得到的生物 体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率进行比较。治疗中指的是对患者实施给药等 处置的期间。在治疗前、治疗中和/或治疗后分别由患者得到生物体试样至少1次。优选在 治疗前、治疗中以及治疗后分别以适当的时间间隔由患者采取试样数次。如此，可以更详细 地调查患有伴随着肝病产生的水肿的患者的生物体试样中的氧化型白蛋白比率的经时性 变化，可以更详细地解析水肿程度。例如，可以更详细地调查患者对于治疗的响应的有无、 程度，或患者处于何种治疗阶段等状况，可以高精度地预测水肿程度的变化。因此，本发明的判定方法可以用于伴随着肝病产生的水肿的治疗监测以及预后的 预测。进一步地，本发明提供伴随着肝病产生的水肿的判定用试剂盒。该试剂盒含有用 于在上述本发明的判定方法中，对生物体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率进行 定量的试剂。氧化型白蛋白比率的定量方法公知有上述各种方法，可以适当选择来使用。例 如，通过上述(I)的方法对氧化型白蛋白比率进行定量时，本发明的试剂盒含有溴甲酚绿 (BCG)和溴甲酚紫(BCP)。通过上述(II)的方法测定氧化型白蛋白比率时，本发明的试剂 盒含有埃尔曼试剂等游离SH基定量试剂。通过上述(V)方法对氧化型白蛋白比率进行定 量时，本发明的试剂盒含有用于稀释试样的PH为4 9(优选为5.8 6. 2)的缓冲液。此 时，本发明的试剂盒可以进一步含有用于除去低分子物质的超滤膜或色谱柱。若使用本发 明的试剂盒，则可以使用上述本发明的判定方法来容易地判定伴随着肝病产生的水肿。
进一步地，本发明提供可以预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的化合物的筛选方 法。该方法包括以下方法(1)对患有伴随着肝病产生的水肿的非人哺乳动物给予候选化合物，(2)对由被给予了该候选化合物的非人哺乳动物得到的生物体试样中的白蛋白中 氧化型白蛋白所占的比率进行定量，(3)对由该非人哺乳动物得到的生物体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比 率与由未给予候选化合物的对照哺乳动物得到的生物体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白 所占的比率进行比较，和(4)基于比较结果，选择降低了氧化型白蛋白比率的化合物作为可以治疗伴随着 肝病产生的水肿的化合物。用于本发明的筛选方法的候补化合物可以为任意公知化合物和新型化合物，可以 举出例如核酸、糖类、脂质、蛋白质、肽、有机低分子化合物、使用组合化学(二 > Ε t卜U Τ" > * $ χ卜υ 一)技术制备的化合物库、随机肽库，或来自微生物、动植物、海洋生物等 的天然成分等。作为非人哺乳动物，可以使用作为本发明的判定方法中的受试者例子所举出的哺 乳动物。作为患有伴随着肝病产生的水肿的非人哺乳动物，可以使用公知的肝病(肝硬化、 肝炎等)模型动物。(2)中的氧化型白蛋白比率的定量可以使用本发明的判定方法中列举的方法来进 行。(3)中的氧化型白蛋白比率的比较优选基于有无显著性差异来进行。而且，对照哺 乳动物中的氧化型白蛋白比率，相对于给予了候补化合物的哺乳动物中的氧化型白蛋白比 率的定量，可以为事前测定得到的值或同时测定得到的值，但是从实验的精度、重现性的观 点考虑，优选为同时测定得到的值。然后，选择由比较的结果得到的降低了氧化型白蛋白比率的化合物作为可以预防 或治疗伴随着肝病产生的水肿的物质。进一步地，本发明提供白蛋白制剂。本发明的白蛋白制剂可以用于预防或治疗伴 随着肝病产生的水肿。通过对有可能患有伴随着肝病产生的水肿的患者或患有伴随着肝病 产生的水肿的患者给予本发明的白蛋白制剂，可以预防或治疗该患者的水肿。本发明的白蛋白制剂中含有的白蛋白的特征在于，氧化型白蛋白比率小于25%。 生物体内的血清白蛋白的氧化型与还原型的存在比率在正常时约为25 75。上述患有伴 随着肝病产生的水肿的患者中，氧化型白蛋白的比率增加。因此，通过给予本发明的白蛋白 制剂，可以主动地降低患有伴随着肝病产生的水肿的患者中的氧化型白蛋白比率，改善至 正常时的比率或接近正常时的比率，由此与以往的白蛋白制剂相比，可以有效地预防或治 疗伴随着肝病产生的水肿。为了强化降低患者中的氧化型白蛋白比率的效果，本发明的白蛋白制剂中含有的 白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率越低越优选。因此，该氧化型白蛋白比率通常小于25%， 优选小于15%，更优选小于5%，进一步优选小于1%，最优选小于0.5% (例如实质上为 0%).氧化型白蛋白比率实质上为0%指的是所含有的白蛋白实质上全是还原型。本发 明的白蛋白制剂中含有的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率可以通过HPLC法(参照^it.
8J. Peptide Protein Res. 24 :96 ； 1984)来确定。在新的方案中，本发明的白蛋白制剂中含有的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率 通常小于60%，优选小于51 %，更优选小于25%，进一步优选小于15%，更进一步优选小于 5 %，尤其优选小于1%，最优选小于0.5% (例如实质上为0%)。如上所述，生物体内的血 清白蛋白的氧化型与还原型的存在比率在正常时约为25 75，令人惊讶的是，若白蛋白中 的氧化型白蛋白比率小于60% (优选小于51% )，则该白蛋白可以预防或治疗伴随着肝病 产生的水肿。通过给予氧化型白蛋白比率为25%以上的白蛋白来改善伴随着肝病产生的水 肿的准确机理还不明确。本发明的白蛋白制剂中含有的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率 可以通过 HPLC 法(参照 Int. J. P印tide Protein Res. 24 :96 ； 1984)来确定。而且，本说明书中，氧化型白蛋白比率的数值，在不特别说明的情况下，指的是通 过 HPLC 法(参照 ht. J. Peptide Protein Res. 24 :96 ； 1984)确定的数值。本发明的白蛋白制剂中含有的白蛋白通常为上述哺乳动物(优选为人)的血清白 蛋白。作为人血清白蛋白，可以举出含有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的多肽。本发明 的白蛋白制剂中含有的白蛋白可以为由血清分离或纯化得到的白蛋白、或通过基因重组技 术制备的重组型白蛋白中的任意一种。作为可以用于本发明的白蛋白制剂中的白蛋白，可以举出日本特开2002-12553 号公开的以下白蛋白。[1]通过人血清白蛋白的着色抑制方法得到的、未结合着色成分的、通过基因操作 表达的人血清白蛋白，所述人血清白蛋白的着色抑制方法的特征在于，培养通过基因操作 制备的人血清白蛋白产生宿主来表达血清白蛋白时，在添加有选自阴离子交换体、疏水性 载体和活性炭中的至少一种的培养液中培养该宿主，由此在人血清白蛋白与着色成分结合 之前分离该人血清白蛋白与该着色成分。使用含有该白蛋白的组合物作为本发明的白蛋 白制剂时，该制剂的着色度，优选按照A35Qmi/A28Qmi的吸光度比计为0. 0035 0. 0163，按照 Α405 /Α280 的吸光度比计为0. 0018 0. 0179。此外，白蛋白与其它蛋白质的融合蛋白质也包括在本发明的白蛋白制剂中使用的 白蛋白中。作为该融合蛋白质，可以举出日本特表2007-522806号、日本特表2004-506407 号、日本特表2003-530838号、日本特表2003-530839号、日本特表2003-530846号、日本特 表2003-530847号、日本特表2003-530852号和日本特表2003-531590号中公开的以下白
蛋白融合蛋白质。[2] -1白蛋白融合蛋白质(日本特表2007-522806)，含有选自下述(a) (k)中 的成分(a)治疗用蛋白质X，和含有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的白蛋白；(b)治疗用蛋白质X，和具有白蛋白活性的SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的片段或 突变体；(c)治疗用蛋白质X，和非融合状态的治疗用蛋白质与X的贮存寿命相比，可以 延长治疗用蛋白质x的贮存寿命的进而具有白蛋白活性的SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的 片段或突变体；(d)治疗用蛋白质X，和具有白蛋白活性、进而含有SEQ ID NO. 1的氨基酸1 387 的氨基酸序列的SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的片段或突变体；
(e)具有治疗用蛋白质X的生物活性的治疗用蛋白质X的片段或突变体，和含有 SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的白蛋白；(f)治疗用蛋白质X、其片段或突变体，和(a) (e)的白蛋白、其片段或突变体， 其中，该治疗用蛋白质x、其片段或突变体与白蛋白的N-末端、或白蛋白的片段或突变体 的N-末端融合；(g)治疗用蛋白质X、其片段或突变体，和(a) (e)的白蛋白、其片段或突变体， 其中，该治疗用蛋白质x、其片段或突变体与白蛋白的C-末端、或白蛋白的片段或突变体 的C-末端融合；(h)治疗用蛋白质X、其片段或突变体，和(a) (e)的白蛋白、其片段或突变体， 其中，该治疗用蛋白质x、其片段或突变体与白蛋白的N-末端及C-末端、或白蛋白的片段 或突变体的N-末端及C-末端融合；(i)含有第一治疗用蛋白质X、其片段或突变体以及第二治疗用蛋白质X、其片 段或突变体，第一治疗用蛋白质x、其片段或突变体与第二治疗用蛋白质x、其片段或突 变体不同的治疗用蛋白质x、其片段或突变体，和(a) (e)的白蛋白、其片段或突变体；(j)治疗用蛋白质X、其片段或突变体，和(a) (i)的白蛋白、其片段或突变体， 其中，该治疗用蛋白质χ、其片段或突变体通过接头从白蛋白、或白蛋白的片段或突变体分 离；和(k)治疗用蛋白质X、其片段或突变体，和(a) (j)的白蛋白、其片段或突变体， 其中，白蛋白融合蛋白质具有以下的式R1-L-R2 ；R2-L-R1 或 R1-L-R2-L-R1，进一步地，Rl为治疗用蛋白质X、其片段或突变体，L为肽接头，R2为含有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的白蛋白、白蛋白的片段或突变体。[2]-2白蛋白融合蛋白质(日本特表2007-522806)，含有插入到含有SEQ ID NO. 1 的氨基酸序列、其片段或突变体的白蛋白、其片段或突变体中的治疗用蛋白质X、其片段或 突变体。[2]-3白蛋白融合蛋白质(日本特表2007-522806)，含有插入到含有选自下述 (a) (1)中的氨基酸序列的白蛋白、其片段或突变体中的治疗用蛋白质X、其片段或突变 体，(a)SEQIDNO.1的氨基画I 54 ‘61 ；
(b) SEQIDNO.1的氨基画I 76 ,89 ；
(c) SEQIDNO.1的氨基画I 92 ‘100 ；
(d) SEQIDNO.1的氨基画I 170 ‘ 176
(e) SEQIDNO.1的氨基画I 247 ‘ 252
(f) SEQIDNO.1的氨基画I 266 ‘ 277
(g) SEQIDNO.1的氨基画I 280 ‘ 288
(h)SEQIDNO.1的氨基画I 362 ‘ 368
(i)SEQIDNO.1的氨基画I 439 ‘ 447
(j)SEQIDNO.1的氨基画I 462 ‘ 475
(k)SEQIDNO.1的氨基画I 478 ‘ 486
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(I)SEQ ID NO. 1 的氨基酸 560 566。上述[2]_1 [2]_3的白蛋白融合蛋白质可以不进行糖基化。上述[2]_1 [2]_3的白蛋白融合蛋白质可以在酵母(糖基化缺损的酵母、糖基 化缺损及蛋白酶缺损的酵母等)中表达。上述[2]_1 [2]_3的白蛋白融合蛋白质可以通过哺乳类细胞表达。该哺乳类细 胞可以为培养下的哺乳类细胞。上述[2]_1 [2]_3的白蛋白融合蛋白质可以进一步含有分泌前导序列。在上述[2]_1 [2]_3的白蛋白融合蛋白质中使用的治疗用蛋白质指的是1种或 更多种具有治疗活性和/或生物活性的蛋白质、多肽、抗体、肽或其片段或突变体。本发明 中包含的治疗用蛋白质包括蛋白质、多肽、肽、抗体和生物制剂(肽、蛋白质和多肽等用语 在本说明书中同义地使用)，但是不限于此。特别是认为用语“治疗用蛋白质”包括抗体及 其片段和突变体。因此，本发明的蛋白质可以含有治疗用蛋白质的至少一个片段或突变体 和/或抗体的至少一个片段或突变体。进一步地，用语“治疗用蛋白质”还可以言及治疗用 蛋白质的内源性或天然存在的对应物。通过表现出“治疗活性”的多肽或具有“治疗上活性”的蛋白质，来说明与本说明 书中记载的或本技术领域中已知的1种或更多种治疗用蛋白质等治疗用蛋白质相关的1种 或更多种已知的具有生物活性和/或治疗活性的多肽。例如，“治疗用蛋白质”为对疾病、状 态或障碍的处置、预防或改善有用的蛋白质，但是不限于此。作为非限定性的例子，“治疗用 蛋白质”可以与特定的细胞型(正常的(例如淋巴细胞)或异常的(例如癌细胞))特异性 地结合，因此，还可以将化合物(药物或细胞毒性剂)用于特异性地靶向该细胞型。作为在上述[2]_1 [2]_3的白蛋白融合蛋白质中使用的治疗用蛋白质，可以举 出GLP-1、GLP-2、PACAP-27、PACAP-28、VIP、CD4M33、胰泌素、肠高血糖素、胃泌酸调节素、 PHM, IFNa, IFNp, ANP、BNP、NGF、BDNF、GDNF、IFN-β、IFN-α、生长抑素、IGF-U IL-2 可溶 性受体、IL-2受体拮抗剂、CTLL-2、降钙素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、GMCSF, ΕΡ0、 GCSF、胰岛素、免疫球蛋白、血清拟胆碱酯酶、α-1抗胰蛋白酶、抑肽酶、处于前体形态和 活性形态的凝血因子(含有血管假性血友病因子、纤维蛋白原、第II因子、第VII因子、 活性第VIIA因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、cl抑制因子、抗凝 血酶III、凝血酶、凝血酶原、载脂蛋白、C-反应性蛋白质及蛋白质C等，但不限于此)、人 生长激素(hGH)、单链抗体、自分泌运动因子、扩散因子、层粘连蛋白、水蛭素、τ 7 ￥ > (applaggin)、单核细胞趋化蛋白(MCP/MCAF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、骨桥蛋白、 血小板第4因子、腱生蛋白、玻连蛋白、人绒毛膜促性腺激素、瘦素、酶(例如尿激酶、B葡糖 脑苷脂酶(B-glucocerebrosidase)等)、TNF 受体、生长因子(例如，EGF、FGF-U FGF-2、 NGF、PDGF、VEGF-I 等)、白介素(例如，IL-U IL-4、IL-8、IL-10、IL-IU IL-12 等)、白介素 受体(例如IL-4受体等)、干扰素(例如，干扰素Y、干扰素ω等)、转化生长因子(例如 TGF- β、TGF- β -1、TGF- β -3)、肿瘤坏死因子(例如TNF- α )、激素(例如，促性腺激素、人 黄体生成激素、促卵泡激素等)、DNase、核心蛋白聚糖、骨保护素、Tie-2、t_PA等，但是不限 于此。治疗用蛋白质可以以单体或串联融合物的形式使用。还可以使用干扰素杂交物作为治疗用蛋白质。干扰素杂交物包括干扰素α -干扰 素α杂交物(本说明书中称为α-α杂交物)。在一方式中，α-α杂交物由与干扰素aD
11融合的干扰素αΑ构成或可以含有其(A/D杂交物)。在另一方式中，α-α杂交物由与干 扰素α F融合的干扰素α A构成或含有其(A/F杂交物)。进而在另一方式中，α - α杂交 物部分由与干扰素α B融合的干扰素α A构成或含有其(Α/Β杂交物)。这些杂交物还记载 在美国专利第4414510号中，该文献通过记载出处，将其全部作为本说明书的一部分。干扰素杂交物包括干扰素β -干扰素α杂交物(本说明书中称为β -α杂交物)。 在一个方式中，β-α杂交物由与干扰素α D(还称为干扰素α-l)融合的干扰素β _1构 成或含有其(β-1/aD杂交物)。这些杂交物还记载在美国专利第47584 号中，该文献通 过记载出处，将其全部作为本说明书的一部分。干扰素杂交物包括干扰素α -干扰素β杂交物(本说明书中称为α -β杂交物)。 在一个方式中，α-β杂交物由与干扰素β-1融合的干扰素α D(还称为干扰素α-l)构 成或含有其(α D/β-1杂交物)。这些杂交物还记载在美国专利第47584 号中，该文献通 过记载出处，将其全部作为本说明书的一部分。作为其它治疗用蛋白质，包括日本特表2007-522806号、日本特表2004-506407 号、日本特表2003-530838号、日本特表2003-530839号、日本特表2003-530846号、日本特 表2003-530847号、日本特表2003-530852号和日本特表2003-531590号的表1中“治疗用 蛋白质X”栏(栏1)所公开的1种或更多种治疗用蛋白质、肽、片段或突变体，但是不限于 这些。本发明的白蛋白制剂中含有的白蛋白可以通过对现有的白蛋白实施还原处理来 制备。作为还原处理的方法，有通过还原剂进行的方法(例如日本特开2007-197394记载的 方法)和通过电解还原进行的方法。作为更具体的还原剂，可以举出β -巯基乙醇、β -巯基 乙胺、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、硼氢化钠(NaBH4)、半胱氨酸、叔膦(三(2-羧 基乙基)膦、三(羟甲基)膦、三正丁基膦)的盐等，但是不限于这些。作为半胱氨酸，可以举出L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、DL-半胱氨酸，但是优选为 L-半胱氨酸。例如在含有白蛋白的水溶液中，添加最终浓度为5 50mg/ml (例如12mg/ml) 的L-半胱氨酸，在30 40°C (例如37°C)下温育，由此可以将氧化型白蛋白还原。未反应的还原剂、还原剂的分解物可以通过超滤步骤、色谱等方法除去。还原剂的 添加量只要是将原料或反应体系中含有的二硫键还原的量即可，此外相对于这些二硫键的 量可以过量。为了维持还原型白蛋白的还原状态，例如可以用L-抗坏血酸、L-抗坏血酸硬脂酸 酯、赤藻糖酸(异抗坏血酸)、儿茶素、二丁基羟基甲苯(BHT)、生育酚(维生素Ε、V. E)、丁基 羟基苯甲醚(BHA)、亚硫酸钠、乙二胺四乙酸钙二钠、愈创木脂、柠檬酸异丙酯、硫代硫酸钠、 L-半胱氨酸或其盐(例如L-半胱氨酸盐酸盐)、二氧化硫、焦亚硫酸钠、没食子酸丙酯等抗 氧化剂进行处理。进行了还原处理之后，对得到的白蛋白中的氧化型白蛋白比率进行测定，由此可 以确认其还原程度。对本发明的白蛋白制剂中的白蛋白含量不特别限定，通常为0.01 30w/V%，优 选为0. 1 25w/V%。若白蛋白含量小于0. 01w/V%，则有可能不能充分增强对伴随着肝病 产生的水肿的预防或治疗效果。此外，若血清白蛋白含量超过30w/V%，则制剂有可能变得 不稳定。
本发明的白蛋白制剂为含有上述白蛋白的水溶液或可以在使用时溶解的固体制 剂，以无菌水溶液的方式制备。通常，将这些成分溶解在注射用蒸馏水中。因此，考虑到人 体液的PH，该制剂的pH为5.0 7.4，优选为？!1 6. 0 7. 4。作为pH调整剂，使用盐酸、乙
酸、柠檬酸、苹果酸等酸。本发明的白蛋白制剂中，可以添加必要量的维生素，例如维生素A、维生素Bi、维 生素B2、维生素B6、维生素C、维生素D、维生素E、烟酸、泛酸、生物素、叶酸等维生素类及类 维生素化合物，钠、钾、钙、氯、磷等电解质，以及铁、锌、锰、铜、碘、硒等微量元素。进一步地，可以添加糖，例如麦芽糖、果糖、木糖醇等，以及脂质，例如大豆油、棉籽 油、芝麻油等营养素。此外，可以添加亚硫酸氢钠等稳定剂等或可以对人体给予的其它物 质。此外，本发明的白蛋白制剂中，为了维持还原型白蛋白的还原状态，例如可以添 加L-抗坏血酸、L-抗坏血酸硬脂酸酯、赤藻糖酸(异抗坏血酸)、儿茶素、二丁基羟基甲苯 (BHT)、生育酚(维生素E、V. Ε)、丁基羟基苯甲醚(BHA)、亚硫酸钠、乙二胺四乙酸钙二钠、愈 创木脂、柠檬酸异丙酯、硫代硫酸钠、L-半胱氨酸或其盐(例如L-半胱氨酸盐酸盐)、二氧 化硫、焦亚硫酸钠、没食子酸丙酯等抗氧化剂。抗氧化剂的添加量根据抗氧化剂的种类不同而不同，可以适当设定。使用L-半胱 氨酸或其盐作为抗氧化剂时，其添加量以L-半胱氨酸计为0. 1 0. 5mg/ml是适当的。本发明的白蛋白制剂可以通过本身公知的方法制备。例如，可以通过以下的步骤 来制备本发明的白蛋白制剂(1)提供氧化型白蛋白比率小于60% (优选小于25%)的白蛋白，和(2)通过将(1)的白蛋白溶解在水性溶剂中，得到用于预防或治疗伴随着肝病产 生的水肿的白蛋白制剂。在步骤(1)中，公知的白蛋白具有所需的氧化型白蛋白比率时，可以将该白蛋白 直接用于本发明。另一方面，公知的白蛋白高于所需的氧化型白蛋白比率时，可以如上所述 通过对该白蛋白实施还原处理来进行步骤(1)。作为步骤O)中使用的水性溶剂，可以举出无菌水、生理盐水、生理性缓冲液等。 溶解白蛋白的同时，还可以溶解可药用添加剂(例如上述维生素类、电解质、微量元素、营 养素、稳定化剂、抗氧化剂等)。具体地说，通过将氧化型白蛋白比率小于60 %的白蛋白及适当的添加剂溶解在无 菌水中，可以制备本发明的白蛋白制剂。在优选方式中，通过将氧化型白蛋白比率小于25 % 的白蛋白及适当的添加剂溶解在无菌水中，可以制备本发明的白蛋白制剂。在本发明的白蛋白制剂的制备方法中，特别是在使用通过基因重组技术制备的重 组型白蛋白的制备中，通过对氧化型白蛋白比率进行测定来进行适当的制备条件的选择、 步骤的维持或管理。进一步地，通过使用氧化型白蛋白比率作为制品试验的品质标准，可以 进行白蛋白制剂的适当的品质管理。在步骤(1)中，使用半胱氨酸(L-半胱氨酸等)作为还原剂，制备氧化型白蛋白比 率小于60% (优选小于25%)的白蛋白时，优选从还原反应后的混合物除去含有未反应的 半胱氨酸、胱氨酸的低分子化合物(例如分子量为IOOODa以下的化合物)，由此对氧化型白 蛋白比率小于60%的白蛋白进行纯化。然后，在步骤( 中，优选将纯化了的白蛋白溶解在水性溶剂中，每IOOml添加10 50mg的半胱氨酸(L-半胱氨酸等)作为还原维持剂。优选对本发明的白蛋白制剂进行灭菌。作为灭菌方法，可以单独或组合使用通常 的高压蒸气灭菌法、低温加热灭菌法、过滤灭菌法等。本发明的白蛋白制剂对外周静脉内或中央静脉内等进行经静脉给药，通常每1 天、每1名成人，以约100 2000ml、优选约500 IOOOml为基准，将其每1天分成1 2 次，并考虑到待给药患者的病状、营养状态、年龄、体重等适当增减来使用。以下，举出实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明不被以下所示的实施 例所限定。[实施例](实施例1)患者及方法对40名慢性肝病患者(丙型肝炎病毒、η = 31,乙型肝炎病毒、η = 3,酒精性肝 炎、η = 5，非酒精性脂肪性肝炎、η = 1)进行分析。所有患者都为肝硬化的状态。在该试验 中慢性肾衰竭的患者排除在分析之外。通过高效液相色谱对血清中的氧化型白蛋白/还原 型白蛋白比进行测定。该测定按照W02007/013679记载的方法进行。使用水分保持率(水 肿)作为白蛋白的功能。水分保持率的程度通过直接多频节段生物电阻抗分析仪(direct segmental multifrequency-bioelectrical impedance analyzer)(InBody3. 2,BI0SPACE, Tokyo, Japan)进行评价，以细胞外水/全部内水(ECW/TBW)表示。慢性肝病的重症度通过 Child-Pugh 评分或终末期肝病模型(model for end-stage liver disease,MELD)评分进 行评价。Child-Pugh评分及MELD评分为肝储备功能的指标。对氧化型白蛋白与ECW/TBW、 Child-Pugh评分或MELD评分的相关性进行调查。MM全部患者的平均年龄为68. 8士9. 7岁。氧化型白蛋白百分率、ECW/TBW、 Child-Pugh 评分及 MELD 评分分别在 20. 7 59. 3%、0. 327 0. 376,5 11 及 6 66 的范围内。图1表示以纵轴为水肿(ECW/TBW)、横轴为氧化型白蛋白百分率来作图而得到 的结果。发现在氧化型白蛋白百分率与ECW/TBW之间有显著的正相关性(σ =0.68，ρ < 0. 0001)(图1)。图2表示以纵轴为水肿(ECW/TBW)、横轴为以往测定的血清白蛋白水平 来作图而得到的结果。发现血清白蛋白水平与ECW/TBW之间的相关性(σ =-0. 49，ρ = 0. 002)在统计学上也具有显著性(图幻，但是氧化型白蛋白百分率与ECW/TBW的相关性更 显著。由这些结果可知，氧化型白蛋白百分率是水肿的优异的指标。同时可知，还原型白蛋 白与氧化型白蛋白相比，胶体渗透压保持功能优异。进一步地，为了对氧化型白蛋白百分率 与肝脏储备功能的相关性进行调查，以纵轴为Child-Pugh评分或MELD评分、横轴为氧化型 白蛋白百分率来作图。结果如图3所示，氧化型白蛋白百分率与Child-Pugh评分、MELD评 分都表现出显著的正相关性(分别为σ = 0. 51、ρ = 0. 013，σ = 0. 44、ρ = 0. 006)(图 3)。这些结果说明氧化型白蛋白百分率可以预测肝硬化患者的预后。 由上可知，氧化型白蛋白百分率与水分保持率的程度及慢性肝病的重症度两者相 关。氧化型白蛋白作为对白蛋白的机能及慢性肝病患者的重症度进行评价的新的指标是有 用的。(实施例2)
为了观察白蛋白制剂中的氧化型/还原型白蛋白比对于通过给予白蛋白进行治 疗后的病状带来的影响，进行以下试验。用生理盐水将市售的白蛋白制剂稀释至5 %，与全血试样同样地，取样0. 9ml至加 入有稳定剂的微管中，颠倒混合并冷藏保存后，测定氧化还原白蛋白比。氧化型/还原型白蛋白比通过HPLC法(Int. J. P印tide Protein Res. 24 96 ； 1984)进行测定。结果得到以下的值。(1)化血研白蛋白氧化型白蛋白62.7%、还原型白蛋白37.3%⑵7、本一卜 氧化型白蛋白61.5%、还原型白蛋白38. 5%(3) T Jiy ^ t-氧化型白蛋白49. 2%、还原型白蛋白50.8%(4)三菱白蛋白 氧化型白蛋白50. 7%、还原型白蛋白49. 3%将这些白蛋白制剂以25g/天的用量给予肝硬化患者3天，对给药之前和之后的体 重、BMI、BUN、肌酸酐、Na、空腹时血糖、血清渗透压、水肿改善度、血清中白蛋白、ECF/TBF、总 蛋白质、淋巴细胞数、凝血酶原时间、总胆红素以及Child-Pugh评分进行比较。ECF/TBF用 人体成分分析装置(InBody)进行测定。结果分为给予了白蛋白制剂的氧化型白蛋白比为 60%以上的组(白蛋白制剂⑴和O))与51%以下的组(白蛋白制剂(3)和G))来制表。 TBF=总体液(total body fluid)，表示生物体的水分量，ECF =细胞外液(extracellular fluid)，表示细胞外液。各白蛋白制剂给药前的患者背景如表1所示。[表1]
1权利要求
1.伴随着肝病产生的水肿的判定方法，包括对由受试者得到的生物体试样中的白蛋白 中氧化型白蛋白所占的比率进行定量。
2.如权利要求1所述的方法，其中，基于氧化型白蛋白比率与水肿程度之间的正相关 性来判定水肿程度。
3.用于判定伴随着肝病而产生的水肿的试剂盒，含有用于对生物体试样中的白蛋白中 氧化型白蛋白所占的比率进行定量的试剂。
4.可以预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的化合物的筛选方法，包括以下步骤(1)对患有伴随着肝病产生的水肿的非人哺乳动物给予候选化合物，(2)对由被给予了该候选化合物的非人哺乳动物得到的生物体试样中的白蛋白中氧化 型白蛋白所占的比率进行定量，(3)对由该非人哺乳动物得到的生物体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率与 由未给予候选化合物的对照哺乳动物得到的生物体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白所占 的比率进行比较，和(4)基于比较结果，选择降低了氧化型白蛋白比率的化合物作为可以预防或治疗伴随 着肝病产生的水肿的化合物。
5.用于预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的白蛋白制剂，含有氧化型白蛋白比率小于 60%的白蛋白。
6.用于预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的白蛋白制剂，含有氧化型白蛋白比率小于 25%的白蛋白。
7.如权利要求6所述的白蛋白制剂，其中，氧化型白蛋白比率实质上为0%。
8.如权利要求5 7中任意一项所述的白蛋白制剂，进一步含有抗氧化剂。
9.用于预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的白蛋白制剂的制备方法，包括以下步骤(1)提供氧化型白蛋白比率小于60%的白蛋白，和(2)通过将(1)的白蛋白溶解在水性溶剂中，得到用于预防或治疗伴随着肝病产生的 水肿的白蛋白制剂。
10.用于预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的白蛋白制剂的制备方法，包括以下步骤(1)提供氧化型白蛋白比率小于25%的白蛋白，和(2)通过将(1)的白蛋白溶解在水性溶剂中，得到用于预防或治疗伴随着肝病产生的 水肿的白蛋白制剂。
11.如权利要求9或10所述的制备方法，其中，步骤(1)通过对白蛋白实施还原处理来 进行。
12.如权利要求11所述的制备方法，其中，在还原处理中，使用半胱氨酸作为还原剂。
全文摘要
本发明提供伴随着肝病产生的水肿的判定方法，包括对由受试者得到的生物体试样中的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率进行定量。本方法中，优选基于氧化型白蛋白比率与水肿程度之间的正相关性判定水肿程度。此外，本发明提供含有氧化型白蛋白比率小于60％的白蛋白的用于预防或治疗伴随着肝病产生的水肿的白蛋白制剂。本制剂中含有的白蛋白中氧化型白蛋白所占的比率优选小于25％。
文档编号C07K14/76GK102066938SQ20098011183
公开日2011年5月18日 申请日期2009年3月31日 优先权日2008年3月31日
发明者佐田通夫, 坂田雅浩, 川口巧, 惣中一郎 申请人:味之素株式会社, 学校法人久留米大学