专利名称：碱性成纤维细胞生长因子的单克隆抗体的制作方法
碱性成纤维细胞生长因子的单克隆抗体相关申请的交叉引用依据35U.S.C. § 119(e)，本申请要求于2008年5月四日提交的美国专利申请号 61/057，183和于2009年4月17日提交的美国专利申请号61/170，561的权益，所述专利申 请以其整体并入本文用于所有目的。对以计算机可读格式提交的“序列表”、表格、或计算机程序列表的引用写入文件022382-000820US_SEQLIST. TXT中的序列表为12，406字节，创建于2009 年5月观日，用于随同提交的Kyimg Jin Kim等人"碱生成纤维细胞生长因子的单克隆抗 体"的申请。该文件中所包含的信息特此并入作为参考。对于在联邦政府资助的研究或开发下取得的发明的权利申明本申请中所描述的工作部分地得到美国国立卫生研究院的 Grant5R44CA101283-03资助。美国政府在本发明中拥有一定的权利。发明领域本发明一般地涉及组合单克隆抗体(mAb)和重组DNA技术用于开发新的生物学， 更具体地，例如涉及生产能够与碱性成纤维细胞生长因子结合并将其中和的单克隆抗体。
背景技术：
原型成纤维细胞生长因子(FGF)、酸性FGF(也称为FGF1)和碱性TO F(也称为 FGF2)首次分离于 20 世纪 70 年代(FGF2 由 Gospodarowicz 等人，J. Biol. Chem. 250 :2515, 1975分离)。目前有22个已知的FGF家族成员，基于其活性和序列的相似性，可分成7个 亚家族(Ornitz等人，Genome Biol. 2 :3005. 1,2001)。然而，FGF家族成员仅与以组织特异 性方式表达的4种酪氨酸激酶受体(FGFR14)及其同种型结合。FGFl亚组由FGFl和FGF2 组成，其结合所有4种FGFR，其中FGF2与FGFRlc特别强地结合(Ornitz等人，J.Biol. Chem. 271 15292，1996)。成熟形式的人FGF2是ISkDa非糖基化多肽，其由衍生自155aa前体的146个氨 基酸组成(Ornitz 等人，Genome Biol. 2 :3005. 1,2001 ；Okada-Ban 等人，Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32 :263, 2000) 0该18kDa形式的FGF2不编码信号序列，但是可以通过不依赖 ER-Golgi复合物的非常规能量依赖性通道分泌(Mignatti等人，J. Cell Physiol. 151 :81， 1992 ；Florkiewicz 等人，J. Cell Physiol. 162 :388,1995)。除该 18kDa 形式之外，单拷贝 的FGF2基因还编码该蛋白质的4个高分子量(HMW)形式，通过利用4个可选CUG起始位点 (提供各种大小的N-末端延伸)，产生22kDa(196个aa) ,22. 5kDa(201个aa) ,24kDa(210 个 aa)和 34kDa 088 个 aa)的蛋白质(Florkiewicz 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3978，1989 ；Prats 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :1836,1989)。HMW 形式不分泌，但 被转运到细胞核，在细胞核中其可以以胞内分泌方式调节细胞生长或行为(Dclrieu，FEBS Lett. 468 :6,2000)。除了以高亲和性结合FGFR1-4之外，FGF2还以较低的亲和性与硫酸肝素蛋白聚糖 (HSPG)结合。尽管FGF2以单体形式分泌，但是细胞表面HSPG使FGF2以非共价的并排构型二聚化，随后这种构型能够使FGF受体二聚化并活化(Mohammadi等人，Cytokine Growth Factor Revl6 =107,2005)。FGF和HSPG与FGFR的胞外结构域的结合诱导受体二聚化、活化和自磷酸化。FGF、特别是FGF2具有在各种细胞类型上的广谱活性(Ornitz等人，Genome Biol. 2 :3005. 1,2001)。FGF2刺激包括成纤维细胞和内皮细胞在内的某些细胞增殖(即， 促有丝分裂的)，并且是某些细胞例如神经细胞的存活因子(抗细胞凋亡)(Okada-Ban，参 见上文所引文献)。其还刺激内皮细胞的分化(形态发生)和迁移(运动性)(Dow等人， Urology 55:800,2000)。FGF2参与发育，尤其是神经系统的发育。重要的是，FGF2是强效 的生血管因子(Presta 等人，Cytokine and Growth Factor Rev. 16 :159,2005)。据认为，FGF2和其它FGF通过刺激血管生成和直接地刺激肿瘤细胞，在癌症中起 作用O^resta等人，参见上文所引文献)。在肿瘤进展期间，癌症细胞可以响应从基质细胞 分泌(旁分泌)的胞外FGF2，然后这些肿瘤细胞自身可以分泌FGF2，并以自分泌方式响应 FGF2。已经显示FGF2或其受体FGFRl在大多数神经胶质瘤中被表达或过表达(Takahashi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :5710，1990 ;Morrison 等人 Cancer Res. 54 :2794, 1994)。FGF2参与前列腺瘤的进展(Dow等人，toology 55 :800，2000)，并且是恶性黑素 瘤增殖的关键介质(Wang等人，Nature Med. 3 :887,1997) 对于唾液腺瘤(Myoken等人， J. Path. 178 :429，1996)、食管癌(Barclay 等人，Clin. Cancer Res. 11 :7683,2005)和甲状 腺癌(Boelaert 等人，J. Clin. Endocrin. Metabol. 88 :2341，2003)，也已报导 FGF2 或 FGFRl 的过表达和/或其参与肿瘤进展。已报导，FGF2的多克隆抗体(抗血清)可以抑制小鼠内可移植软骨肉瘤的肿瘤 生长(Baird 等人，J. Cell Biochem. 30 :79，1986)，体外中和 FGF2 的各种活性(Kurokawa 等人，J. Biol. Chem. 264 :7686,1989)，以及当被局部应用时可以抑制U87神经胶质瘤细 胞颅内异种移植物的生长(Man等人，J. Neurosurg. 82 :1044，1995)。在单克隆抗体中， 已报导DG2mAb可以在体外和在体内中和FGF2的活性(Reilly等人，Biochem. Biophys. Res. Com. 164 :736,1989 ；WO 91/06668)，适度抑制裸鼠中大鼠C6神经胶质瘤异种移植物的 生长(Gross等人，J.Nat. Cancer Inst. 85 :121，1993)，以及当损伤内递送而非腹膜内或 静脉内递送时适度抑制大鼠软骨肉瘤的生长(Coppola等人，Anticancer Res. 17 :2033, 1997)。类似地，已报导抗_FGF2mAb DE6体外抑制神经胶质瘤细胞的生长(Morrison等人， J. NeuroscienceRes. 34 :502，1993)。在另一方面，报导抗-FGF2mAb bFM-1 和 bFM_2 体外 抑制内皮细胞的生长，但是不体内阻断肿瘤血管生成(Matsuzaki等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :9911,1989)。已报导中和性抗-FGF2mAblE6抑制RPMI4788结肠瘤异种移植 物的生长(Aonuma等人，19 :4039,1999)。已报导抗-FGF2mAb 254F1抑制人脐静脉内皮 细胞(HUVEC)增殖，也已报导mAb FB-8体外抑制非小细胞肺癌细胞系增殖(Kuhn等人， LungCancer 44 :167，2004)。曾报导抗-FGF2mAb 3H3 抑制 U87MG 和 T98G 神经胶质瘤以及 HeLa细胞异种移植物的生长(Takahashi等人，FEBS Let. 288 :65，1991)，并且抑制小鼠内 K1000FGF2 转染的 3T3 细胞系的生长(Hori 等人，Cancer Res. 51 :6180,1991)。本文所描述的GAL-F2抗_FGF2mAb在AACR 2009年会上于海报#1236中述及，其 为了所有目的整体并入本文。发明简述
在一个实施方案中，本发明提供了人碱性成纤维细胞生长因子(FGM)的中和 性mAb。该mAb抑制FGF2的至少一种、优选几种或所有生物学活性，包括与4种FGF受体 FGFR1-4中的一种或多种的结合；诱导成纤维细胞、内皮细胞、Mv ILu貂肺上皮细胞和/或 各种人肿瘤细胞的增殖；和诱导血管生成。该抗_FGF2mAb当被用作单一活性剂时可以抑 制此类活性。优选的抗_FGF2mAb抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。优选地，本发明的 mAb被遗传工程化，例如嵌合、人源化或人mAb。示例性抗体是GAL-F2及其嵌合形式和人源 化形式，以及与GAL-F2具有相同表位或与GAL-F2发生竞争结合的mAb。还提供了产生此类 抗体的细胞系。在另一个实施方案中，提供了含有中和性抗-FGF2抗体例如嵌合或人源化 GAL-F2的药物组合物。在第三实施方案中，将药物组合物施用于患者以治疗癌症或其它疾 病。附图简述图 1. GAL-F2 与对照小鼠 mAb (mlgG)和人 FGF2 (hFGF2)与小鼠 FGM9 (mFGF2)的结 合ELISA。图 2. FGFR-Fc/FGF2-Flag 结合 ELISA 显示，GAL-F2 而非对照小鼠 mAb 5G8 对 4 种 FGF受体FGFR1-4中的每种具有抑制作用。
图3.生物素化GAL F2与各种抗_FGF2mAb对人FGF2的竞争结合测定试验。图4. GAL-F2或对照mAb 5G8对FGF2诱导的BaF3细胞增殖的抑制，所述BaF3细 胞用FGFRl或FGFR2稳定转染。“无(None)，，表示没有FGF2 (或mAb)施用于细胞上。图5. GAL-F2或对照mAb 5G8对TOF2诱导的Mv ILu貂肺上皮细胞增殖的抑制。 “无(None)”表示没有FGF2(或mAb)施用于细胞上。图6.在对照小鼠mAb (mlgG)、GAL-F2或bFM_l抗_FGF2mAb的存在下克隆在软琼 脂中的SMCC-7721细胞的显微照片。图7.从肿瘤接种后5天开始，用GAL-F2 (100 μ g，每周两次)或PBS单独处理的小 鼠中RPMI 4788人结肠瘤异种移植物的生长。图8.从肿瘤接种后6天开始，用GAL-F2或bFM_l抗_FGF2mAb (100 μ g，每周两次) 或PBS单独处理的小鼠中RPMI 4788人结肠瘤异种移植物的生长。图9.用PBS单独、GAL-F2(100yg，每周两次)、顺钼(100 μ g，每周一次)或用 GAL-F2和顺钼处理的小鼠中SMMC-7721人肝瘤异种移植物的生长。每组5只小鼠。
图10.从接种后6天开始，用PBS单独、GAL-F2或M225抗-EGFRmAb (100 μ g，每 周两次)或用GAL-F2和M225处理的小鼠中!fepG2人肝瘤异种移植物的生长。每组6只小鼠°图IlA禾口 11B.显示HuGAL_F2 轻链(A) (SEQ ID NO 2)和重链(B)成熟可变区(SEQ ID NO 5)的氨基酸序列与小鼠GAL-F2(SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 4)及人受体V区(SEQ ID NO :3禾口 SEQ ID NO 6)进行比对。GAL-F2序列中的CDR用下划线标出，HuGAL_F2序列 中用小鼠L2G7氨基酸置换的氨基酸用双下划线标出。对于轻链和重链，均使用1字母氨基 酸代码和Kabat编号系统。图12.如本说明书所述进行的人源化(HuGAL-F2)和嵌合(ChGAL_F2)mAb与对照 人抗体hlgG的竞争结合。图13.完整成熟 HuGAL-F2 抗体轻链(A) (SEQ ID NO 7)和重链(B) (SEQ ID NO 8)的氨基酸序列。对每行上的第1个氨基酸编号；编号是连续的。在轻链中，Ck区域的第 1个氨基酸用下划线标出，而在重链中，CH 1区、铰链区、CH2和CH3区的第1个氨基酸用下 划线标出。发明详述本发明提供了中和性抗-FGF2单克隆抗体、含有它们的药物组合物以及使用它们 治疗疾病的方法。1.抗体抗体是非常大的复杂分子(分子量为 150，000或约1320个氨基酸)，具有复 杂的内部结构。天然抗体分子含有相同的两对多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。每 个轻链和重链又由两个区域构成参与结合靶抗原的可变区(“V")，和与免疫系统的其 它组分相互作用的恒定区(“C")。轻链和重链可变区在3维空间中靠在一起，形成与抗 原(例如在细胞表面上的受体)结合的可变区。在每个轻链或重链可变区内，有3个短片 段(长度平均为10个氨基酸)，被称为互补决定区(“CDR")。抗体可变结构域中的6 个CDR(3个来自轻链，3个来自重链)在3-D空间中折叠在一起，形成了锁定在靶抗原上的 实际抗体结合位点。⑶R的位置和长度已由Kabat，E.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫学重要的蛋白质的序列)，U. S. D印artment of Health and Human krvices，1983，1987精确地确定。未包含在⑶R中的可变区部分被称为构架，其形 成了 CDR的环境。Chothia等人，J. Mol. Biol. 196 =901,1987已定义了由结构决定的超变区 或环的相关概念。人源化抗体是遗传工程化抗体，其中来自小鼠抗体(“供体抗体"，也可以是大 鼠、仓鼠或其它非人物种)的CDR被移植到人抗体(“受体抗体")上。受体抗体的序列 可以是例如，成熟人抗体序列、人抗体序列的共有序列或种系序列。因此，人源化抗体是具 有来自供体抗体的CDR和来自人抗体的可变区构架和恒定区的抗体。此外，为了保留高的 结合亲和性，可以使用两个额外的结构要素中的至少一个。参考美国专利号5，530，101和 5，585，089(并入本文作为参考)，其提供了构建人源化抗体的详细说明。人源化抗体通常 具有人源化重链和人源化轻链。通常，人源化重链的重链可变区构架和人源化轻链的轻链 可变区构架不包括超过10或12个置换，所述置换产生不存在于受体人重链或轻链可变区 构架(包括人共有可变区构架和复合人可变区构架)中的残基。尽管人源化抗体通常掺入小鼠抗体的所有6个完整⑶R(如Kabat所定义)，但是 它们也可用少于小鼠抗体的全部CDR来制备(例如Pascalis等人，J. Immunol. 169 :3076, 2002)。在科学文献中已记载过很多抗体，其中对于结合，可以省却1个或2个⑶R。Padlan 等人，FASEB Journal9 :133-139(1995) ；Vajdos 等人，Journal of Molecular Biology, 320 :415-428(2002) ；Iwahashi 等人，Mol. Immunol. 36 :1079-1091, (1999) ；Tamura 等人， Journal of Immunology, 164 :1432-1441 (2000)。类似地，仅掺入 CDRs 的一部分，即结合所 需的CDR残基子集(称作SDR)，到人源化抗体中可能是必要的。可以基于先前的研究(例如⑶RH2中的残基H60-H65通常是不需要的)，通过 分子建模和/或根据经验，或如Gonzales等人，Mol. Immunol. 41 :863，2004所述，从位于 Chothia超变环之外的Kabat⑶R区域中鉴定不接触抗原且不在SDR中的⑶R残基。如果 省略CDR或其残基，那么其通常用在人受体序列中占据相应位置的氨基酸置换，从而供给可变区构架序列。待包括的此类置换的数目反映竞争考虑的平衡。此类置换对减少人源化 抗体中的小鼠氨基酸的数目以及由此减少潜在的免疫原性，可能是有益的。然而，置换也可 能引起亲和性的变化，优选避免亲和性的显著减少。也可根据经验选择CDR中置换的位置 以及待置换的氨基酸。在上文提及的用于在人源化抗体中保留高结合亲和性的第一结构要素中，通过在 很多已知的人抗体中适当地选择受体抗体，选择人源化抗体的重链可变区的构架，使得与 供体抗体的重链可变区的构架具有最高序列同一性(65% 95% )。在第二结构要素中，在 构建人源化抗体时，依照规定的规则，将人受体抗体的构架中的选定氨基酸(CDR之外)用 来自供体抗体的相应氨基酸取代。具体来说，选择构架中待取代的氨基酸是以其与CDR相 互作用的能力为基础的。例如，如在3维空间中测量，被取代的氨基酸可以在供体抗体序列 中与⑶R邻近，或在人源化抗体中位于⑶R的4-6埃内。嵌合抗体是其中小鼠(或其它啮齿类动物)抗体的可变区与人抗体的恒定区组合 的抗体；通过遗传工程的方法构建它们是众所周知的。此类抗体尽管约2/3为人的，但保留 小鼠抗体的结合特异性。存在于小鼠、嵌合和人源化抗体中的非人序列的比例表明，嵌合抗 体的免疫原性介于小鼠与人源化抗体之间。与小鼠抗体相比可以具有降低的免疫原性的其 它遗传工程化抗体类型包括利用噬菌体展示方法(Dower等人，W091/17271 ；McCafferty等 人，W092/001047 ；Winter, W092/20791 ；和 Winter, FEBSLett. 23 :92，1998，其各自并入本文 作为参考)或使用转基因动物(Lonberg等人，W093/12227 ；Kucherlapati W091/10741，其 各自并入本文作为参考)制备的人抗体。如本文所用，术语"人样"抗体指的是1条或2条链的氨基酸序列的相当部分 (例如约50%或以上)源自人免疫球蛋白基因的mAb。因此，人样抗体包括但不限于嵌合、 人源化和人抗体。如本文所用，具有"降低的免疫原性"的mAb是当施用于人患者时预期 具有比小鼠抗体显著更低的免疫原性的mAb。此类抗体包括嵌合、人源化和人mAb以及通 过取代小鼠抗体中可能对B-细胞或T-细胞表位作出贡献的特定氨基酸(例如暴露的残基 (Padlan，Mol. Immunol. 28 :489,1991))而制备的 mAb。如本文所用，"遗传工程化"mAb 是已借助于重组DNA技术将其编码基因构建或放置到非天然环境中(例如小鼠中或噬菌体 上的人基因)的mAb，因而不包括例如用常规杂交瘤技术制备的小鼠mAb。mAb的表位是与mAb结合的抗原的区域。两种抗体如果彼此一个竞争性抑制(阻 断)另一个与抗原的结合，那么它们结合相同的或重叠的表位。也就是说，在竞争结合分 析试验中测量时(参见例如 Junghans 等人，CancerRes. 50 :1495，1990)，lx、5x、10x、20x 或IOOx过量的一种抗体可以抑制另一种抗体的结合达至少50 %，但优选75 %、90 %或甚至 99%。或者，如果两者抗体结合抗原的相同区域，或者如果抗原中导致一种抗体的结合减少 或消除的基本上所有氨基酸突变都可以导致另一种抗体的结合减少或消除，则这两种抗体 具有相同的表位。如果降低或消除了一种抗体的结合的某些氨基酸突变可以降低或消除另 一种抗体的结合，那么这两种抗体具有重叠的表位。2.中和性抗-FGF2抗体对于与FGF2结合的单克隆抗体(mAb)(即抗_FGF2mAb)，如果其结合部分地或完全 地抑制了 FGF2的一种或多种生物学活性(即当mAb作为单一活性剂使用时)，则其被称为 可以中和FGF2，或是中和性的。中和性抗体可以抑制的FGF2生物学活性包括FGF2与4种FGF受体中的一种或多种结合的能力；刺激包括成纤维细胞、内皮细胞、Mv ILu貂肺上皮细 胞和各种人肿瘤细胞在内的某些细胞增殖(即促有丝分裂)的能力；刺激细胞例如内皮细 胞的分化和迁移或刺激血管生成的能力，例如通过刺激人血管内皮细胞(HUVEC)增殖或管 形成、或通过施加于鸡胚尿囊绒膜(CAM)时诱导血管而测量。当通过在实施例中描述的方法或本领域已知的方法进行测定时，浓度为例如 0. 01,0. 1,0. 5、1、2、5、10、20或50 μ g/ml的本发明中和性mAb抑制FGF2的生物学功能约 至少50 %、但优选75 %、更优选90 %或95 %或甚至99 %、最优选约100 % (基本上完全抑 制)。通常，在使用的FGF2的量刚好足以完全刺激生物学活性或者为1、2或5ng/ml或0. 01、 0. 02,0. 05,0. 1,0. 5、1、3或10 μ g/ml时，测量抑制程度。优选地，mAb当作为单一活性剂使 用时是中和性的，即抑制生物学活性，但是任选地可以2种mAb —起使用以产生抑制。最优 选地，mAb中和不仅仅1种而是2种、3种或几种上面列出的生物学活性；对本发明的目的而 言，作为单一活性剂使用时中和FGF2的所有生物学活性的抗-FGF2mAb被称为“完全中和性 的”，这种mAb是最优选的。本发明的mAb优选对FGF2具有特异性，即它们将不结合或仅仅 以小得多的程度(例如小至少10倍)结合与FGF2有关的蛋白质，例如另一种FGF如FGFl， 和血管内皮生长因子(VEGF)。本发明的某些mAb结合人FGF2和小鼠FGF2，或结合人FGF2 以及小鼠、大鼠、兔、鸡、狗和/或猴(例如食蟹猴)FGF2中的1种、2种或更多或所有。其它 mAb对人FGF2具有特异性。本发明的mAb通常对FGF2的结合亲和性(Ka)为至少IO7M.1, 但优选IO8M4或更高，最优选IO9M4或更高或甚至ΚΓΜ—1或更高。本发明的mAb包括天然四聚体形式的抗-FGF2抗体Q条轻链和2条重链)，可以 是任何已知的同种型IgG, IgA, IgM, IgD和IgE及它们的亚型，即人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 和小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3。本发明的mAb也意在包括抗体片段，例如Fv、Fab和 F(ab' )2 ；双功能杂交抗体(例如 Lanzavecchia 等人，Eur. J. Immunol. 17 105，1987)、单 链抗体(Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879,1988 ；Bird 等人，Science 242 423,1988)；单臂抗体(Nguyen等人，Cancer基因Ther. 10 =840,2003)；和恒定区改变的抗 体(例如美国专利号5，624，821)。mAb可以是动物来源(例如小鼠、大鼠、仓鼠或鸡)，或者 它们可以被遗传工程化。啮齿动物mAb可以通过本领域众所周知的标准方法来制备，包括 用适当佐剂中的FGF2通过腹膜内、静脉内或脚垫内进行多次免疫，然后提取脾脏或淋巴结 细胞，并与适合的永生化细胞系融合，然后筛选产生结合FGF2的抗体的杂交瘤，例如参见 下面实施例。通过上面述及的本领域已知方法制备的嵌合和人源化mAb是本发明的优选实 施方案。人抗体，例如通过噬菌体展示或转基因小鼠方法制备的人抗体，也是优选的(参见 例如 Dower 等人，McCafferty 等人，Winter, Lonberg 等人，Kucherlapati，同上)。下文所述的中和性抗_FGF2mAb GAL-F2是本发明的实施例。一旦具有本文所述的 中和FGF2的期望性质的单个原型抗-人_FGF2mAb例如GAL-F2已被分离，那么通过使用本 领域已知方法产生具有类似性质的其它mAb是简单的。例如，可以如上所述用FGF2免疫小 鼠，产生杂交瘤，并且对所得mAb与原型mAb竞争结合FGF2的能力进行筛选。也可以用含 有与GAL-F2结合的表位的更小FGF2片段，免疫小鼠。可以通过例如筛选与跨FGF2的一系 列重叠肽的结合来定位该表位。或者，Jespers等人，Biotechnology 12 :899，1994(其并 入本文作为参考)的方法可以用于指导选择与原型mAb例如GAL-F2具有相同表位因而具 有类似性质的mAb。采用噬菌体展示法，首先将原型抗体的重链与一个(优选人)轻链库进行配对来选择FGF2-结合性mAb，然后将新轻链与一个(优选人)重链库进行配对来选择与 原型mAb具有相同表位的(优选人)FGF2-结合性mAb。或者GAL-F2的变体可以通过对得 自杂交瘤的编码GAL-F2的重链和轻链的cDNA进行诱变而获得。与GAL-F2具有相同或重叠表位的中和性mAb (例如与GAL-F2竞争结合FGF2的中 和性mAb)提供了其它实施例。GAL-F2的嵌合或人源化形式是特别优选的实施方案。本发 明还包括在重链和/或轻链可变区的氨基酸序列上与GAL-F^O %、95 %或99 %相同且保持 其功能性质的mAb、和/或与GAL-F2相差少数个功能上不重要的氨基酸置换(例如保守性 置换)、缺失或插入的mAb。还包括具有与GAL-F2的相应⑶R 90%、95%或99%或100%相 同的至少1个⑶R、优选所有6个⑶R的mAb。在这里以及在本申请的其它地方，序列同一 性百分比用通过Kabat编号规则进行最大比对的抗体序列来确定。在比对后，如果主题抗 体区域(例如重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域正被相比，那么主题 与参考抗体区域之间的序列同一性百分比是在主题与参考抗体区域两者中被相同氨基酸 占据的位置的数目除以两个区域的比对位置的总数(不算空位)，再乘以100转化为百分 比。可以由杂交瘤生产本发明的天然mAb。遗传工程化mAb例如嵌合或人源化mAb可 以通过多种本领域已知的方法来表达。例如，编码其轻链和重链V区的基因可以由重叠寡 核苷酸合成，并与可得C区一起插入到表达载体(例如，可从^witrogen商购)中，所述表 达载体提供必要的调控区例如启动子、增强子、PlyA位点等。优选使用CMV启动子-增强 子。然后使用各种众所周知的方法例如脂转染或电穿孔，将表达载体转染到各种哺乳动物 细胞系例如CHO或非生产性骨髓瘤(包括Sp2/0和NS0)中，并且通过适合的抗生素筛选来 选择表达抗体的细胞。参见例如，美国专利号5，530，101。更大量的抗体可以通过在商购的 生物反应器中生长细胞来产生。本发明的mAb或其它抗体一旦被表达，可以根据本领域的标准程序进行纯化，例 如微滤、超滤、蛋白A或G亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色 谱法和/或基于有机染料的其它亲和色谱形式等。对于药物应用来说，具有至少约90或 95%同质性的基本上纯的抗体是优选的，98%或99%或以上的同质性是最优选的。3.治疗方法本发明提供了治疗方法，其中将本发明的mAb (例如抗-FGF2)施用于患有疾病 (治疗疗法)或处于疾病发生或复发的危险中(预防疗法)的患者。术语"患者"包括人 患者；兽患者，例如猫、狗和马；家畜，例如牛、羊和猪；和用于试验目的的实验室动物，例如 小鼠和大鼠。该方法特别适合于治疗人患者。治疗人患者的方法中所用的mAb与人FGF2 蛋白结合，所述人FGF2蛋白的序列由例如Ornitz等人，Genome Biol. 2 :3005. 1,2001或 Okada-Ban等人，Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32 :263,2000 以及Swiss-Prot数据库的 Locus P09038提供。针对人蛋白的mAb还可用于其它物种，其中该物种同源物与该人蛋白具有抗 原交叉反应性。在缺乏这种交叉反应性的物种中，使用对存在于该物种中的物种同源物具 有适当特异性的抗体。然而，在实验室动物的异种移植物实验中，通常使用对由异种移植物 表达的人蛋白具有特异性的mAb。在一个优选的实施方案中，本发明提供了含有本文所述的抗体的药物制剂。该抗 体的药物制剂在生理可接受的载体中含有mAb，任选带有赋形剂或稳定剂，采用冻干形式或9水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受体没有毒性， 并包括PH通常为5. 0 8. 0、最通常为6. 0 7. 0的缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸 盐；造成等渗的盐例如氯化钠、氯化钾等；抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水 性聚合物例如聚山梨醇酯80、氨基酸、碳水化合物、螯合剂、糖类，以及其它本领域技术人员 已知的标准成分(《雷明顿药物科学》(Remington' s Pharmaceutical Science)第16版， Osol，A.编辑· 1980)。mAb通常以l-100mg/ml的浓度存在，例如10mg/ml。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了使用药物制剂中的抗_FGF2mAb治疗 患者疾病的方法。制备成药物制剂的mAb可以通过任何适当的途径、特别是通过静脉内输 注或者肌内或皮下推注的胃肠外途径施用于患者。静脉内输注可以在少至15分钟内给予， 但是更通常进行30分钟，或历经1、2或甚至3小时。mAb也可以被直接注射到疾病部位 (例如肿瘤)中，或包囊在携带剂如脂质体中。给予的剂量足以至少部分减轻所治疗的病 症(“治疗有效剂量")，任选为0. 1 5mg/kg体重，例如1、2、3或％^/1^，但是可以高达 10mg/kg或甚至15、20或30mg/kg。也可以给予固定的单位剂量，例如100、200、500、1000或 2000mg，或剂量也可以基于患者的表面积，例如1000mg/m2。通常施用1 8个剂量(例如 1、2、3、4、5、6、7或8个剂量)来治疗癌症，但是也可以给予10、20个或更多的剂量。mAb可 以根据例如mAb的半衰期，以每天、一周两次、每周、每两周、每月、或某些其它的时间间隔， 施用1周、2周、4周、8周、3-6个月或更长时间、或直到疾病进展。对于长期施用来说，重复 的治疗过程也是可能的。可以有效地至少部分减轻存在于待治疗患者中的疾病的剂量、施用频率和施用途 径的组合，被称作是治疗有效方案。有效地抑制或延缓患者疾病发作的剂量、施用频率和施 用途径的组合，被称作是预防有效方案。对于使用本发明的抗_FGF2mAb治疗特别敏感的疾病包括据认为需要血管生成或 与FGF2水平升高有关或与FGF2表达有关的实体肿瘤。适合于用抗_FGF2mAb治疗的此类 肿瘤包括例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌(小细胞或非小细胞)、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫 内膜癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、或肝癌、头颈部肿瘤、黑素瘤、肉瘤、癌和脑瘤(例如神经 胶质瘤例如胶质母细胞瘤)。恶性血液病例如白血病和淋巴瘤和多发性骨髓瘤也可对此类 治疗敏感。适合于用本发明的抗-FGF mAb治疗的其它与血管生成有关的疾病包括年龄相 关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、新生血管性青光眼和其它眼睛疾病；银屑病和 其它皮肤疾病；和类风湿性关节炎。在一个优选的实施方案中，抗_FGF2mAb与其它疗法组合(即一起，也就是说，之 前、期间或之后)施用。例如，为治疗癌症，抗_FGF2mAb可以与任何一种或多种已知的化疗 药物一起施用，例如烷化基，例如卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺钼、卡钼、奥沙利钼、丙卡巴胼和 环磷酰胺；抗代谢药例如氟尿嘧啶、氟脲苷、氟达拉滨、吉西他滨、氨甲喋呤和羟基脲；天然 产物，包括植物生物碱和抗生素例如博来霉素、多柔比星、柔红霉素、伊达比星、依托泊苷、 丝裂霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春花新碱和泰素(Taxol，紫杉醇)或相关的化合物例如 Taxotere ;拓扑异构酶1抑制剂伊立替康；特别批准用于脑肿瘤的药剂，包括替莫唑胺 和含有卡莫司汀的Gliadel wafer ；酪氨酸激酶抑制剂例如Gleevec (甲磺酸伊马替 尼)、Sutent (苹果酸舒尼替尼)、Nexavar (索拉非尼)、Tarceva (埃罗替尼) 和Iressa (吉非替尼)；血管生成抑制剂；以及在wo 2005/0i7i07A2(在此并入本文作为参考)中列出的所有被批准的和实验的抗癌药。抗_FGF2mAb可以与用于标准化疗方案的 这些其它药剂中的1、2、3种或更多种组合使用。通常，该其它药剂是早就已知对正在治疗 的特定癌症类型有效的那些药剂。抗_FGF2mAb尤其可以用于克服对化疗药物的耐药性，因 而增加其有效性(参见 Song 等人 Proc. Natl. Acad. Sci USA 97 :8658, 2000)。为治疗癌症可以与抗_FGF2mAb —起施用的其它药剂包括生物药例如单克隆抗 体，包括针对HER2抗原的Here印tin ；针对VEGF的Avastin ;或针对表皮生长因子 (EGF)受体的抗体例如Erbitux (西妥昔单抗)和Vectibix (帕尼单抗)。尤其优 选针对肝细胞生长因子(HGF)的抗体与抗_FGF2mAb —起使用，包括mAb L2G7(Kim等人， Clin Cancer Resl2 =1292,2006和美国专利号7，220，410)、特别是其嵌合和人源化形式例 如 HuL2G7(W0 07115049A2)；在 WO 2005/017107A2 中、特别是在 2. 12. 1 中所述的人抗-HGF mAb ；和在WO 07143090A2或WO 07143098A2中所述的HGF结合蛋白；以及其它与任意前述 mAb竞争结合的中和性抗-HGF mAb。与HGF的cMet受体结合的mAb也是优选的，例如已 被遗传工程化成仅含有一个"臂"，即结合结构域，的抗-cMet mAb0A-5D5 (Martens等人， Clin. Cancer Res. 12 :6144,2006)。而且，抗FGF2mAb可以与任何形式的外科手术和/或放 射疗法，包括外线束放射、调强放射疗法(IMRT)和任何形式的放射外科手术例如伽玛刀， 一起使用。包括抗-FGF2mAb抗体的治疗(例如标准化疗)，与不使用抗_FGF2mAb的同样治疗 (例如化疗)相比，可以通过增加癌症患者的中位无进展存活时间或总存活时间至少30% 或40 %，但是优选50 %、60 %至70 %或甚至100 %或以上来减轻疾病。此外或备选地，包括 抗-FGF2mAb的治疗(例如标准化疗)，与不使用抗_FGF2mAb的同样治疗(例如化疗)相 比，可以增加患有这些肿瘤(例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和胶质母细胞瘤，特别是在 复发或难治疗的时候)的患者的完全应答率、部分应答率或客观应答率(完全+部分)至 少30%或40%，但是优选50%、60%至70%或甚至100%。通常，在临床试验中(例如II期、II/III或III期临床试验)，上面提到的与接受 仅化疗(或加上安慰剂)的患者的对照组相比，用化疗加上抗-FGF2mAb治疗的患者的中位 无进展存活和/或应答率的增加，是有统计学意义的，例如在P = 0. 05或0. 01或甚至0. 001 水平上。完全和部分应答率通过癌症临床试验中常用的客观标准(例如美国国家癌症研究 所和/或美国食品与药品管理局所列出的或接受的客观标准)来确定。4.其它方法本发明的抗_FGF2mAb也在诊断、预后和实验室方法中有用。它们可以用于测量肿 瘤中或肿瘤患者的循环中FGF2的水平，以确定是否该水平是可测量的或甚至升高的，从而 跟踪并指导肿瘤的治疗，这是因为与可测量的或升高的FGF2水平有关的肿瘤将对于使用 抗-FGF2mAb的治疗是最敏感的。例如，与高水平FGF2有关的肿瘤将对于使用抗_FGF2mAb 的治疗特别敏感。在特定的实施方案中，mAb可以用于ELISA或放射性免疫分析，以测量例 如肿瘤活检标本或血清中或FGF2分泌性细胞的细胞培养物的培养基上清液中的FGF2水 平。使用与不同表位结合(即非竞争结合)的两个抗_FGF2mAb将在开发检测FGF2的灵敏 性"三明治"ELISA中特别有用。对于各种分析方法来说，mAb可以用荧光分子、自旋标记 分子、酶或放射性同位素进行标记，并且可以以带有所有进行FGF2分析所必需的试剂的试 剂盒形式供应。在其它应用中，抗_FGF2mAb可以用于例如通过亲和色谱法纯化FGF2。实施例实施例1 试剂和分析试验GST-FGF2、FGF2-Fc 和 FGF2_Flag 的制备。合成人 TOF2 的 cDNA 序列(具有 155 个氨 基酸的前体形式；Sommer等人，1987) (GenScript，he)，进行PCR扩增，并克隆到pDisplay 载体(Invitrogen)的衍生物中。将这些质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，使用ImM IPTG诱导FGF2表达。FGF2表达的水平用FGF2特异性ELISA试剂盒(R&D Systems)来测 定；如所述(Wiedlocha 等人，Mol. Cell Biol. 16 :270，1996)，用肝素 S印haroseCL_6B 珠 (Amersham Biosciences)纯化 FGF2。FGF2 分别与谷氨酰胺合成酶(GST-FGF2)、Flag 肽 (FGF2-Flag)和人IgGlFc结构域(氨基酸216至446 ；FGF2_Fc)的融合蛋白(其用于FGF2/ FGFR结合分析试验以及用于免疫)，用标准分子生物学技术由适当的遗传构建体，类似地 制得。GST-FGF2用抗-GST柱纯化，FGF2_Fc用蛋白A/G柱纯化，而在测定FGF2_Flag浓度 之后使用培养物上清液中的FGF-Flag。此外，购买纯化的人FGF2 (QEDBioscience Inc.)和 鼠 FGF2(ProSpec-Tany Technogene Ltd.)。FGFR-Fc 蛋白的制备。人FGFRl α (IIIc)(被命名为FGFRlc)和人FG FR2C α (IIIc) (被命名为FGFR2c)的胞外结构域(ECD)被表达成免疫粘附素分子。将编码FGFRlc和 FGFR2c的整个E⑶的DNA片段通过多肽接头与人Fc融合。通过转染人细胞、在293 表达培养基(Invitrogen)中在G418 (lmg/ml)的存在下选择稳定的293转染子，表达这些 FGFR-Fc分子。使用蛋白A/G柱纯化由转染细胞分泌的FGFR-Fc。此外，人!7G FR3c_Fc 和人FGFR4-Fc融合物得自R&D Systems。FGF2片段的合成。通过SynBioSci合成了由FGF2的氨基酸残基四_44(肽#1)、 101-118 (肽#3)和137-155 (肽#4)组成的肽。额外的半胱氨酸残基被加至肽#1与#3的 C-末端和肽#4的N-末端。然后将这些肽片段与钥孔慽血兰蛋白(KLH)缀合。FGF2结合性ELISA。在4°C将ELISA孔用50 μ g/ml肝素(Sigma)包被过夜，然后 在室温(RT)与0. 3-1 μ g/ml人或小鼠FGF2孵育1小时，以使肝素能捕获FGF2。在RT用 2% BSA封闭1小时后，在RT加入杂交瘤培养物上清液或纯化过的mAb达1小时。通过在 RT加入HRP-山羊抗-小鼠IgG Fc达1小时、然后洗涤、加入TMB底物(Sigma)并在450nm 读数，检测结合的抗-FGF2抗体。FGFR-Fc/FGF2-Flag 结合性 ELISA。在 FGFR-Fc/FGF2_Flag 结合性 ELISA 中测 定抗-FGF2mAb的阻断活性。在4 V将ELISA孔用2 μ g/ml对人IgG_Fc具有特异性的 山羊抗体包被过夜。在RT用2% BSA封闭1小时后，将各孔用0. Sy g/ml FGFRlc-Fc, FGFR2c-Fc、FGFR3c-Fc或FGFR4_Fc孵育1小时。在洗涤后，在各种浓度的mAb的存在下各 孔用FGF2-Flag(0. 2 μ g/ml)孵育1小时。通过加入HRP-抗-Flag M2抗体(Sigma)来检 测结合的FGF2-Flag。实施例2 单克隆抗体的产生Balb/c小鼠(5-6周龄，雌性)通过下述进行免疫如下表所示，在小鼠后脚垫中， 用重新悬浮于 MPL/TDM(Sigma-Aldrich)中的 GST-FGF2、FGF2_Fc 和 / 或 KLH 缀合的 TOF2 合成肽，按1周的间隔注射14次。最后一次注射后3天，使用标准融合方法用35%聚乙二 醇将腿弯部的淋巴细胞与P3/X63-Ag8Ul小鼠骨髓瘤细胞融合，方法如所述(Chimtharapai等人，Methods Enzymol 288:15,1997)。融合后10天，利用上述的FGF2结合性ELISA对杂 交瘤培养物上清液结合FGF2的能力进行筛选。然后在FGFRl-Fc/FGF-Flag结合性ELISA 中对选择的mAb的阻断活性进行筛选。然后用有限稀释技术，如所述(Harlow等人，1988)， 将所选杂交瘤克隆两次。表免疫方案
权利要求
1.单克隆抗体(HiAb)，其结合并中和人碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)，其中所述mAb 被遗传工程化。
2.权利要求1的mAb，其是嵌合的。
3.权利要求1的mAb，其是人源化的。
4.权利要求1的mAb，其是人的。
5.权利要求1的mAb，其完全抑制FGF2与FGF受体FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4之每 种的结合。
6.权利要求1的mAb，其抑制FGF2诱导的MvILu细胞的增殖。
7.权利要求1的mAb，其抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。
8.权利要求1的mAb，其是Fab或F(ab')2片段或单链抗体。
9.药物组合物，其包含权利要求1的mAb。
10.治疗患者癌症的方法，其包括向所述患者施用包含权利要求1的mAb的药物组合物。
11.单克隆抗体(mAb)，其与杂交瘤PTA-8864产生的抗体竞争结合FGF2且具有降低的 免疫原性。
12.权利要求11的mAb，其抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。
13.权利要求11的mAb，其是人源化的或人的。
14.药物组合物，其包含权利要求11的mAb。
15.治疗患者癌症的方法，其包括向所述患者施用包含权利要求11的mAb的药物组合物。
16.权利要求15的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
17.由PTA-8864杂交瘤产生的mAb的小鼠、嵌合或人源化形式。
18.人源化抗体，其包含人源化轻链和人源化重链，所述人源化轻链含有来自图IlA中 序列(GAL-M) (SEQ ID NO 1)的CDR，所述人源化重链含有来自图IlB中序列(GAL-M) (SEQ ID NO 4)的 CDR。
19.权利要求18的人源化抗体，其中Kabat编号的残基Hl、H27、H30、H48、H67、H71和 H94被占据图IlB中所示重链(GAL-F2) (SEQ IDNO 4)的相应位置的残基占据。
20.权利要求18的人源化抗体，其中轻链可变区与图IlA中所示序列(HuGAL-M)(SEQ ID NO 2)具有至少95%序列同一性，且所述重链与图IlB中所示序列(HuGAL_F2) (SEQ ID NO 5)具有至少95%序列同一性。
21.权利要求18的人源化抗体，其含有图IIA(HUGAL-M)(SEQ IDNO 2)和图 11B(HuGAL-F2) (SEQ ID NO :5)中所示的3个轻链CDR和3个重链CDR。
全文摘要
本发明涉及碱性成纤维细胞生长因子的中和性单克隆抗体、包含它们的药物组合物以及包括向患者施用此类药物组合物的治疗方法。
文档编号C07K16/00GK102046803SQ200980119682
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月28日 优先权日2008年5月29日
发明者H·帕克, K·J·金, L·王, M·瓦斯克兹 申请人:星系生物科技责任有限公司