针对梭菌的具有新酶活性的酶的制作方法

专利名称：针对梭菌的具有新酶活性的酶的制作方法
针对梭菌的具有新酶活性的酶本发明涉及具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的多肽，及其变体或片段。本 发明还涉及编码所述多肽的核酸。本发明还涉及所述多肽或其片段作为治疗或诊断物质的 用途以及用于食物和饲料的污染的用途。梭菌(Clostridium)是一类异质性(heterogenic)的细菌，包括超过150种 已得到翔实描述的(validly described)物种。有几种梭菌能够产生毒素，其中一些 是已知的最强的自然毒素。肉毒中毒(botulism)、破伤风(tetanus)、肠源性毒血症
(enterotoxemic infection) if ^ $α ^ ^ (necrotizing soft tissue infection)是由该属细菌造成的人类疾病的突出实例。除了对农场和家养的动物具有不良 影响外，一些梭菌可导致奶酪熟化过程中产生缺陷，影响乳加工业。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是革兰氏阳性、厌氧、产孢子的细菌， 广泛分布于土壤、沉积物、食物和人及动物的胃肠道中。人和家畜中有很大一系列疾病与产 气荚膜梭菌相关，包括食物中毒、气性坏疽(梭菌性肌坏死(clostridial myonecrosis)), 坏死性肠炎(enteritis necroticans)和非食物传播的胃肠道感染。产气荚膜梭菌细菌噬 菌体编码细胞内溶素，其导致其宿主细胞释放病毒粒体，可能可以用于针对这些病原菌的 特异性检测和控制。该物种产生至少12种胞外毒素。其中一些被认为是主要的致死性毒素。根据其 产生毒素α、β、ε和t的能力，菌株可分为A-E五个类型。编码产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)的α cpe基因可位于质粒上，也可位于染色体上。 致食物中毒性的A型菌株携带cpe的染色体变体，而非致食物中毒性的A型菌株则由质粒 编码它。将α cpe携带在质粒上的菌株似乎是导致CPE相关的胃肠疾病——它是非食物传 播的胃肠道感染——的原因。产生β毒素的C型产气荚膜梭菌可导致另一种不相关的，并且很少报道的疾病， 通常称作“pigbel”(在新几内亚发生)或“Darmbrand”(火肠病(“fire-bowels”))(二战之 后一段时期内在德国出现的疾病)。这种节段坏死性肠炎综合征(segmental necrotizing enteritis syndrome)影响小肠，其相关的死亡率为35-40%。A型致食物中毒性产气荚膜梭菌菌株可见于土壤、水、食物、尘埃、香料和人及动物 的肠道。这些菌株已经以IO3 to 104CFU/g的水平见于几乎所有土壤样品，而B、C、D和E型 菌株并不存在于土壤中，而是专性的寄生物，常常见于家畜。对热敏感的A型CPE是食物介导的病症的原因。其分子量为35kDa，等电点为4. 3。 CPE的产生与孢子形成的晚期密切相关，且该毒素与内生孢子在宿主细胞裂解时一同释出。 促进细胞形成孢子的条件亦可促进CPE的产生。气性坏疽是一种侵袭性的(aggressive)坏死性软组织感染，大约80%的气性 坏疽是由产气荚膜梭菌造成的。该疾病定义为对健康的活肌肉(之前未受创伤或缺血) 的急性侵袭。产气荚膜梭菌A型α毒素是导致该病发病的因素，产气荚膜梭菌细胞溶素 (perfringolysin)O(0毒素)也是该病的致病因素，但较前者为次要。在大多数情况下，创 伤性气性坏疽在破坏血液供应的深穿透伤之后发生。产气荚膜梭菌的组织毒性可能导致广泛的伤害，且如果不加以治疗，其可发展为全身性休克、多器官衰竭和死亡。产气荚膜梭菌还导致多种兽类疾病，影响农场和家养动物。该细菌可能是羊羔 (lambs)和绵羊(sheep)、牛犊(calves)和牛(cattle)、山羊、猪、马驹(fouls)和成年马、 家鸡、某些笼养的野生鸟类物种及兔的数种肠疾病的致病原。产气荚膜梭菌在动物肠道中的存在可导致例如坏死性肠炎、食物中毒和生长迟 缓。特别地，产气荚膜梭菌在家禽(特别是焙烤用小鸡)肠道中的存在与多种病状有联系， 如肠创伤(gut lesion)和坏死性肠炎，且可导致家禽生长的显著减缓。此外，人们推测抗 生素出于促进生长和预防疾病的目的在动物饲料中的广泛使用导致了对一系列治疗用抗 微生物剂(如四环素、杆菌肽、红霉素或头孢菌素)的获得抗性。腹泻伴随腹部剧烈疼痛是食物传播的感染的最常见临床症状。有时会发生 恶心，较少有发热和呕吐，而罕有死亡，但在虚弱的(debilitated)或医疗机构收容的 (institutionalized)人，尤其可影响老年人。在摄食之后的潜伏期(incubation time)为 6- 小时。也报道了一些在摄食后仅2小时就出现症状的案例。推测预先形成的毒素或食 用(consumption)已经形成孢子的细胞可导致在摄食后短时间内出现症状。正常情况下， 该病症的持续时间较短，症状在一日以内消失。年老或虚弱者有时需要更长时间来康复。在过高温度储藏的肉或肉制品为产气荚膜梭菌食物中毒的最常见来源。烹制不足 (insufficient cooking)也是很多爆发的原因。海鲜、奶制品、水果和蔬菜有时也介导产气 荚膜梭菌食物中毒，但全部爆发的大约75%是由肉或肉制品导致的。肉类的产气荚膜梭菌 污染直接来源于被屠宰的动物或来源于后续的来自容器、尘埃或操作者的污染。推测食物 介导的产生肠毒素的产气荚膜梭菌的感染剂量非常之高。引起人体腹泻症状似乎需要大约 108个营养细胞。细菌孢子能够在烹制温度下存活，而且在加热过程之后与之竞争的菌群被 消除。在食物冷却至能够发生孢子萌发(spore germination)和营养细胞生长的温度时， 它们能够迅速分裂。绝大多数爆发发生在餐馆和共餐(catering)中。仅有3%记录在案的 产气荚膜梭菌相关食物中毒发生在私人家庭中，但是考虑到该疾病病程相对较为温和，认 为未报道的病例数的推定数会更高。极少有爆发牵涉到商业加工的食物；HatheWay，1990， Clin. Microbiol. Rev. 3/1,66-98 ；Rood & Cole,1991，Microbiol. Rev. 55/4,621-648 ； Songer,1996，Clin.Microbiol. Rev. 9/2，216-234。使用细胞内溶素诊断和杀灭食物中的污染细菌最早公开于GB 2，255，651。最早在 体内使用小鼠模型系统的治疗性和预防性应用由Nelson & Fischetti描述Q001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98^4107-4112 ；Loeffler et al，2001，Science Μ，2170-2172)。对 于使用噬菌体的水解酶控制病原菌的综述见于Fischetti，2006，BMC Oral Health 6, 16-19。最早来自产气荚膜梭菌细菌噬菌体的细胞溶素(lysine)，即phi3626，公开于WO 03/066845。然而，对于作为针对产气荚膜梭菌的新抗微生物剂的物质，以及新的产气荚膜梭 菌诊断方法仍有极大需求。权利要求中公开的主题解决了该问题。为了说明本发明的一些方面，列出了下述附图，其并非意为以任何方式限制本发明。

图1显示根据本发明细胞溶素plyS9的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。
图2显示根据本发明编码细胞溶素plyS9的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)。图3是经考马斯染色的SDS-PAGE，显示对plyS9表达和纯化的分析结果。泳道1 和11为由其左侧数字所示的分子量标记。泳道2、3、4和5为分别在0、1、2和4小时后所 需蛋白质的表达。泳道6、7、8和9分别为在纯化过程中加载于柱的粗提取物、流过物、洗涤 级分和洗脱物。泳道10为在500mM NaCl和50%甘油存在下纯化并浓缩的蛋白质。右侧的 箭头标示纯化的plyS9的位置。图4是在优化条件(6 μ g plyS9 ；柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH 6. 5，含300mM氯 化钠)下plyS9针对产气荚膜梭菌底物细胞的溶胞曲线(lysis curve)的图示。“A”表示 0D_，而“B”表示时间[s]。将曲线对起始0D_= 1标准化。正方形代表对照，三角形代表 plyS9溶胞曲线。图5. plyS9的相对酶活性(A)依赖于pH(B)和缓冲物质(黑条为柠檬酸/磷酸缓 冲液而白条为Tris/磷酸缓冲液)的图示。缓冲液组成为25mM柠檬酸盐或Tris，25mM磷 酸，120mM NaCl ；蛋白质浓度为 0. 5 μ g plyS9。图6.plyS9的酶比活性(A)依赖于氯化钠浓度(B)的图像表示。缓冲液组成为 20mM MOPS pH 7. 0和多种浓度的NaCl [mM]；蛋白质浓度为0. 5 μ g plyS9。图7. 二价金属离子对plyS9活性的影响(20mM MOPS缓冲液pH 7. 0,300mM NaCl ； 0.5yg plyS9)的图示。“Α”代表相对酶活性，“0”意为不含任何金属例子。点填充的条代 表IOmM的金属离子浓度，线填充的条代表ImM的金属离子浓度。图8为plyS9和CBD区域特定长度变体的概略表示，数字代表SEQ ID NO=I中所
示的氨基酸序列中的氨基酸残基。本文中使用的术语“细胞内溶素”(endolysin)指适于水解细菌细胞壁的酶。来自 感染革兰氏阳性菌的细菌噬菌体的细胞内溶素呈现模块化的构造。大多数情况下，N-端域 为酶活性域(enzymatically active domain，EAD)，C_端域，其命名为细胞壁结合域(cell wall binding domain, CBD)，负责底物识别。两个域由一段短的接头肽连接。细胞内溶素 包含至少一个选自下组内肽酶的EAD =N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶、N-乙酰基-胞 壁酰胺酶和N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶。本文中使用的术语“域”指细胞内溶素的被赋予特定功能的亚基，且也可与结 构域一致(coincide with) 0优先用术语“域”来描述EAD和CBD域之间的拮抗作用 (antagoni sm)，前者由多于一个的模块组成。本文中使用的术语“CBD”指细胞内溶素的细胞壁结合域，其通常存在于该蛋白质 的C-端。CBD域不具有水解细胞壁方面的酶活性，但通常可介导细胞内溶素与细菌细胞壁 的结合。本文中使用的术语“EAD”指细胞内溶素的酶活性域，其负责水解细菌肽聚糖。其包 含至少一种选自下组的细胞内溶素的酶活性N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶、N-乙 酰-胞壁酰胺酶和N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶。本发明的一个方面涉及包含SEQ ID NO :1序列的多肽，以及其变体。所述多肽及 其变体被视为根据本发明的多肽。所有这些均具有下述共同特征，即具有细胞内溶素活性， 并因此能够溶解产气荚膜梭菌。所述对产气荚膜梭菌的特异性可通过多种本领域已知的方 法加以测试，例如，通过将所述多肽添加至包含一种或多种所述产气荚膜梭菌的样品，并确定在添加所述多肽之后其浊度的变化。在一个优选实施方案中，根据本发明的多肽描述于 SEQ ID NO 1。在一个优选实施方案中，根据本发明的多肽的变体显示相对于SEQ ID NO 1的一 个或多个取代。本发明的另一个方面涉及根据本发明的多肽的片段。本发明的发明人发现plyS9 的特定C-端片段可结合产气荚膜梭菌。因此，本发明的一个更优选实施方案涉及plyS9的 CBD0 plyS9优选的片段包含根据SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的氨基酸残基170-342、 181-342、192-342或203-342。更优选的是plyS9的从170-203的范围内的氨基酸残基起 始，到氨基酸残基342结束的片段，其中氨基酸残基的位置参照SEQ ID NO :1。在一个更优选的实施方案中，plyS9的变体包含附加的标志物部分(marker moiety)，如生物素，或标签，如HA—标签、His-标签、Strep-标签、Myc-标签、GST-标签、 JS-标签或其他本领域已知的标签。应理解上述说明的plyS9变体不可以视为严格区分的实施方案，而是可以组合 的。举例而言，根据本发明的plyS9变体可包含一种或多种如上所述的氨基酸残基取代，以 及JS-标签，只要这样的重组的细胞内溶素仍对产气荚膜梭菌具有特异性即可。本领域技 术人员会容易地理解所述变体中何者适合其目的，而且总是可以通过本领域常规方法测试 这些变体针对产气荚膜梭菌的活性，例如通过测定其细胞溶解活性对含产气荚膜梭菌溶液 的光密度(optical density)的作用。JS-标签来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)草酰乙酸脱羧酶α亚 基的生物素受体域，并包含共同序列MKM(K可以是生物素化的)，使得所述多肽可在体内在 生物素连接酶(biotin ligase)的作用下生物素化。JS-标签是肺炎克雷伯氏菌草酰乙酸 脱羧酶全α亚基的大小减小而成的片段。JS-标签合适的最小序列包含66个氨基酸残基， 如SEQ ID Ν0:14所示。然而，该66氨基酸残基长的JS-标签的衍生物也是合适的，包括与 SEQ ID而14至少80、90、95或98%同源的序列。优选地，所述衍生物长度最多可至80个 氨基酸残基，且与SEQ ID NO :14在66个氨基酸残基的氨基酸序列段内至少有80、90、95或 98%同源。本发明的另一个方面涉及利用根据本发明的多肽、其变体或片段在食物、医学或 兽医样品(例如，死动物的组织，以及动物饲料和人类食物)中检测产气荚膜梭菌的方法。所述多肽或其变体可用于在测定法中在检测前溶解产气荚膜梭菌。一些测定法的 共同特征是需要从所述细菌细胞释出核酸(DNA或RNA)或生物化学组分(例如，ATP或胞 内酶活性)以对其加以确定。然而，现有技术所提供的核酸分子分离具有显著的不利之处，而使用根据本发明 的多肽或变体可以克服这些不利之处。优选地，所述多肽或其变体在核酸检测测定法(如PCR)或其他检测测定法过程中 或之前使用。例如，在核酸分子检测方法(如PCR)过程中或之前使用根据本发明的多肽或 其变体迅速地溶解产气荚膜梭菌细胞，由此释出基因组DNA或RNA。一旦所述细胞被溶解， 就无需分离和/或纯化DNA或RNA以供扩增反应。在本发明的另一个方面，所述酶活性域被替换成作为标志物的多肽。例如，多肽 PlyS9的细胞壁结合域或其片段被偶合于标志物部分，如生物素、Str印-Tag、荧光蛋白(如
6绿色荧光蛋白)或其他本领域已知的标志物。所述偶合于标志物部分的CBD可以在迅速检 测(例如在食物中)产气荚膜梭菌的方法中使用。因此，本发明还提供了使用根据本发明的多肽、或其变体或CBD检测样品中的梭 菌，优选产气荚膜梭菌的方法。在另一个方面，本发明涉及包含编码本发明的多肽及其变体和片段的序列的核酸 分子。本领域技术人员容易想到，有许多方式来构建编码根据本发明的多肽及其变体或片 段的核酸分子，例如通过考虑简并的遗传密码。本领域技术人员在得知了本领域所述的多 肽及其变体或片段的氨基酸序列的基础上能够选取最适于其目的的符合要求的核苷酸序 列，例如其密码子用法已经过调适而符合其期望的表达宿主的密码子用法的序列。包含编 码本发明的多肽及其变体或片段的序列的核酸分子被视为本发明的核酸分子，所述序列被 视为本发明的核酸序列。在一个优选实施方案中，所述核酸分子编码根据本发明如SEQ ID NO 1所示的多 肽。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO :2所示的核酸序列。在一个优选实施方案中，所述核酸分子编码根据本发明如SEQ ID NO :10-13所示 的片段。优选地，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO :11所示的多肽片段的核酸序列。在另一个方面，本发明涉及包含本发明核苷酸序列的载体。优选地，所述载体提供 本发明所述多肽及其变体或片段在合适的宿主细胞中的表达。可以仅由于生物工程学上的 原因来选择宿主细胞，例如，产率、溶解性、成本等，但也可从医疗的角度来选择，例如，非病 原性的细菌或酵母、人类细胞，如果所述细胞将被施用给受试者的话。所述载体可提供根据 本发明所述多肽的组成型或诱导型表达。除了本文中提及的具体核苷酸和氨基酸序列以及可从所述核苷酸序列衍生的氨 基酸序列之外，本发明还涵盖其变体、同源物和衍生物。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。在本文语境下，同源序列被视为包含可 为75%、85%或90%相同，优选地至少95%或98%相同的氨基酸序列和核苷酸序列。具体 地说，通常应参照那些已知对活性不可或缺的序列区域来考虑同源性。尽管同源性也可以 参照相似性(即，具有类似化学性质和/或功能的氨基酸残基)来考虑，在本发明的语境下 优选用序列同一性来表述同源性。在一个优选的方面，所述变体、同源物或衍生物为这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列至少75 %、85 %或90 %相同，优选地为至少95 %或98 %相同。在一个优选的方面，所述变体、同源物或衍生物为这样的核苷酸序列，其与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列至少75%、85%或90%相同，优选地为至少95%或98%相同。在另一个方面，所述变体、同源物或衍生物为这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO 10-13所示的氨基酸序列的细胞壁结合域至少75%、85%或90 %相同，优选地为至少95% 或98%相同。优选地，所述衍生物包含示于SEQ ID NO :11的氨基酸序列。本发明还涉及包含根据本发明的多肽或其变体的药物。本发明还涉及包含根据本 发明的多肽或其变体或片段的药物组合物。在本发明的另一个方面，在治疗或预防受试者中梭菌感染的方法，特别是治疗 或预防产气荚膜梭菌或酪丁酸梭菌(C. tyrobutyricum)引起的感染的方法中使用以上 提及的多肽或其变体或片段。所述受试者可为人类受试者或动物，特别是用于牲畜饲养
7(livestock farming)和/或奶业畜牧(dairy farming)的动物，如猪、牛、绵羊、马、家禽、 山羊、笼养野生鸟类和兔。所述治疗方法涵盖将足够量的本发明所述的多肽给药于感染部 位或需要预防性处理以防止感染的部位。具体而言，所述治疗方法可用于治疗或预防梭菌(特别是产气荚膜梭菌)引起的 对软组织和胃肠道的感染。在一个更优选的实施方案中，根据本发明的多肽用于治疗或预防肌坏死，特别是 供治疗或预防梭菌性肌坏死(气性坏疽)、坏死性肠炎，特别是用于治疗或预防由产气荚膜 梭菌造成的坏死性肠炎(“Pig-bel”或“Darmbrand”)、胃肠道感染，特别是用于治疗或预 防由产气荚膜梭菌造成的婴儿的坏死性小肠结肠炎、肠毒素诱发的腹泻或食物传播的疾病 的方法。在一个更优选的实施方案中，根据本发明的多肽用于在多种动物中治疗或预防梭 菌，优选产气荚膜梭菌感染的方法，特别是治疗或预防绵羊、山羊、牛犊、牛、马和其他动物 物种中的肠源性毒血症的方法。具体而言，本申请的多肽适用于治疗或预防由梭菌特别是 由产气荚膜梭菌造成的羔羊痢疾和肾髓样病或家禽坏死性肠炎的方法。在一个特别优选的实施方案中，在医学治疗中使用本发明的多肽或其变体，如果 待治疗或预防的感染是由抗药性或多重抗药性梭菌属菌株特别是产气荚膜梭菌造成的。此 外，可以在治疗方法中使用本发明的多肽或其变体，将其与常规抗菌剂(如抗生素或其他 细胞内溶素)联合给药。在根据本发明的治疗或预防方法中使用的给药剂量和途径取决于具体的疾病和/ 或待治疗的感染位置。给药途径可例如在具体实施方案中为经口、局部、肠胃外、静脉内、直 肠或任何其他给药途径。对于将本发明的多肽给药于感染部位或有感染危险的部位，可以将本发明的多肽 以一定的方式配制而保护所述多肽不受环境因素如蛋白酶、氧化作用或免疫应答的影响。因此，可将本发明的多肽配制为胶囊、糖锭剂(dragee)、丸剂、栓剂、可注射的溶液 或其他任何医学上合理的盖仑制剂。在一些实施方案中，这些盖仑制剂可包含合适的载体、 稳定剂、调味剂、缓冲剂或其他合适的试剂。举例而言，对于局部应用，本发明的多肽可通过洗剂或硬膏剂的方式来给药。对于肠道的治疗，举例而言在坏死性小肠结肠炎或肠毒素诱发的腹泻中，可考虑 栓剂制剂。或者，可考虑经口给药。在此情况下，在本发明的多肽在达到感染部位之前必须 保护其不受严酷的消化道环境的影响。这可通过例如使用细菌作为载体来实现，所述细菌 能够耐受胃中的消化起始步骤而存活，随后将本发明的多肽分泌至肠环境中。所有的医疗应用均依赖于本发明的多肽在遇到产气荚膜梭菌时特异性地并即时 地将其溶解的作用。该作用可降低病原菌和细菌负荷，同时释放(relieve)免疫系统，从而 对受治疗的受试者的健康状态产生即时的效应。因此，本领域技术人员所面临的主要任务 是就相应的待治疗疾病精确配制本发明的多肽。为此目的，通常可使用这些应用中的常规 药物的同样的盖仑制剂。在本发明的另一个方面，上面提及的多肽或变体是药物组合物的组分，所述药物 组合物任选地包含载体物质。在又一个方面，所述多肽或变体是化妆品或消毒剂组合物的一部分。如上所述，几种梭菌属物种可对患者身体暴露于环境的部分(如皮肤)造成刺激。为了预防上述刺激或 为了消除所述梭菌属病原菌的表现(manifestations)，可使用专用的(special)化妆品制 备物，其包含足够量的本发明多肽以溶解既存的或新栖(freshly settling)的梭菌。在另一个方面，本发明涉及根据本发明的多肽及其变体作为抗微生物剂在食物 中、食品加工设备上、食品加工工厂中、与食物相接触的表面上(如架子)和食品储藏区域 以及其他一切梭菌可潜在地感染食物材料的场合的用途。所述多肽可单独使用或与其他抗 微生物剂(如抗生素)结合使用。此外，所述多肽可在动物饲料中单独使用或与其他抗微 生物剂结合使用，以供预防疾病，例如在家禽或生猪饲养中。在一个优选实施方案中，根据本发明的多肽用作药物、药物组合物、化妆品、抗微 生物剂等。
实施例所有的克隆方法使用根据 Sambrook 等(Molecular cloning. A laboratory manual ；2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)的标准技术进行。突变禾口 缺失亦使用标准技术引入。实施例1 :phiS9细胞内溶素和CBD的克降和测序使用现有技术纯化产气荚膜梭菌细菌噬菌体phiS9的基因组DNA，并用标准PCR条 件扩增plyS9基因以及CBD片段。对于扩增所述phiS9细胞内溶素，使用序列为5’-CTATCAGGATCCATGCAAAGTAGAAAC AATAATAATTTAAAAG-3，(SEQ ID NO 3)的引物 plyS9_f 和序列为 5，-CTATCAGTCGACTTATATT TTCTTAACAAATTCAGCATTAAC-3，(SEQ ID NO 4)的引物 ply_S9_r。plyS9_f 将 BamHl 限制性 位点和起始密码子，plyS9-i 将MlI限制性位点和终止密码子引入所述序列。将经扩增的 基因通过所述BamHl和Mil限制性位点克隆入pQE质粒Oliagen，包含6x His标记的序 列)。对于扩增所述CBD片段，使用下述正向引物序列为5’-ATCAGAGCTCTCAAATAATTTT ACTTTAGACAATGC-3，(SEQ ID NO :5)的 CBD_S9A-f、序列为 5，_ATCAGAGCTCGATATGMTGAGTTCA CTAATGG-3，(SEQ ID NO :6)的引物CBD_S9B-f、序列为 5，_ATCAGAGCTCGATTCATGGGTTGGATTCC AATATTC-3，(SEQ ID NO :7)的 CBD_S9C-f 和序列为 5，_ATCAGAGCTCGATTCATGGGTTGGATTCCAAT ATTC-3' (SEQ ID NO :8)的CBD_S9D_f。所有变体的扩增均使用反向引物ply_S9CBD_r(SEQ ID NO :9)，其序列为 5，-ATCAGTCGACTTATATTTTCTTAACAAATTCAGC-3，并可引入 MlI 限制性位点 和终止密码子。所有正向引物均引入McI限制性位点和起始密码子。将经扩增的基因通过 所述 Mel 和 Mil 限制性位点克隆入质粒 pHGFP ( Lossner 等，2002，Mo 1. Microbiο 1. 44/2， 335-；349)，后者包含克隆入pQE30的BamHHacI位点的gfp_mut2，产生6xHis标记的GFP。 为了验证所需要的序列，对所有得到的质粒进行测序。实施例2 在大肠杆菌(E. coli)中表达plyS9和CBD片段以及纯化重组蛋白在大肠杆菌XL-I Blue MRF’中表达plyS9和CBD片段。在表达plyS9时，共表达质 粒pACYC-IRLlO，其提供tRNAAl:g、tRNAIle和tRNA^的tRNA基因。为了使所述菌株生长较佳， 使用的抗生素浓度仅为50μ g/ml的氨苄青霉素、15μ g/ml的四环素和5μ g/ml的氯霉素。 表达实验如下进行取5ml过夜培养物接种至含有上述抗生素的250ml LB-PE培养基(15g/1胰蛋白胨，8g/l酵母提取物，5g/l NaCl, pH 7. 8)并在IOOOml烧瓶中在37°C (plyS9)或 30°C (CBD片段)通气振荡。当600nm光密度(OD6J为0. 6时，用ImM IPTG诱导培养物， 并继续培育4小时以任其产生蛋白质。在诱导前，以及诱导后1、2和4小时取样以供SDS PAGE分析。在4小时后，通过离心收获细胞(Beckmann J2-21，用JA-10转子，7000rpm，20分 钟，I(TC)；将每250ml生长培养基的离心沉淀悬于8ml缓冲液A (50mM Na-P pH 8. 0，5mM咪 唑，0.1%Tween 20,500mM NaCl)。将细胞通过两次通过 French Pressure Cell Press (SLM Aminco,1260PSI, inset :20k)来使细胞破裂，在此之前进行一轮_20°C的冻融来提高细胞 破裂的效率。对含有所需蛋白质的上清液进行离心(Sigma 1301，用转子19776，20000g， 40分钟，IO0C )和过滤(孔大小0. 2 μ m)来去除细胞碎片。将粗提取物储藏于冰上以供进 一步处理。plyS和CBD片段的纯化使用用缓冲液A平衡的装有Iml Ni-NTA超流(superflow) 树脂(Qiagen)的Micro Bio-Spin色谱柱(Biorad)进行。在粗提取物穿过之后，用缓冲 液 A(5 个柱体积)和 10%缓冲液 B(50mM Na-P pH 8. 0，250mM 咪唑，0. 1% Tween 20,500mM NaCl)和90%缓冲液A (3柱体积)的混合物洗柱。使用100%缓冲液B O柱体积)从柱上 洗脱蛋白质。从粗提取物、用10%缓冲液B的洗涤步骤的流过物、及洗脱物取样进行SDS PAGE分析。通过在4°C在轻柔的搅拌和Ix缓冲液交换下透析(Spectra/Por，Spectrumlabs, MWCO :6000-8000)2小时来去除盐和咪唑。通过透析降低盐浓度导致蛋白质的大量损失，因 此最后使用高盐透析缓冲液(50mM Na-P pH 8.0,0. 1 % Tween 20,500mM NaCl)来仅去除咪 唑。在透析后，对样品进行过滤灭菌(0.2μπι孔径)，并通过离心(Sigma3K30，用19777转 子，8000g，4°C，在来自Vivascience的Vivaspin 4ml浓缩管中进行)来浓缩。将经纯化 的蛋白质在50%甘油中储藏于-20°C。通过在添加酶10分钟之内每15秒测定细胞悬液的0D_(Libra S22光度计， Biochrom)来测定plyS9针对细菌细胞的溶解活性。将6μ g纯化的plyS9置于半微米 (half-micro)比色杯底部，然后用底物细胞悬液填充至Iml总体积。阴性对照进行相同的 步骤，但使用高盐透析缓冲液和甘油的灭菌的50 50混合物替代纯化的plyS9溶液。将底物细胞在5-10ml合适的培养基中培育至推定为晚对数期或平台期。将产气 荚膜梭菌菌株在厌氧条件下在液体TYG培养基(30g/l胰蛋白胨，20g/l酵母提取物，5g/l 葡萄糖，0.5g/l L-半胱氨酸，pH 7.2)中在37°C培育大约4小时。酪丁酸梭菌菌株以相同 方式处理。将所有其他革兰氏阳性菌在有氧条件下37°C在TB培养基胰蛋白月示, lg/Ι葡萄糖，5g/l NaCl，0.005硫胺素HCl pH 7.4)生长直至观察到浑浊。需要高CO2气氛 的菌株的培育(鸡胚双歧杆菌(Bifidobacterium gallinarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides))使用(SNb ο χ (02发生器在气密的 室中用来自Biolife 的培养液来进行。通过离心收获细胞，重悬于PBS缓冲液(50mM Na-P pH 8. 0,120mM NaCl)，并以20 μ 1等分试样储藏于-80°C。就在准备所述测定法之前，将所 述等分试样融解并用25mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH 6. 5,120mM NaCl)稀释。该步骤 是必需的，因为在冰上储藏高浓度的活产气荚膜梭菌会导致自溶增强，并因此使得细胞悬 液在15分钟之后的粘度增加，从而导致溶解测定的再现性低。
细胞内名字素plyS9针对测试的所有M个产气荚膜梭菌均显示溶解活性。表 1
权利要求
1.一种多肽，其具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或其片段。
2.权利要求1所述的多肽，其中所述片段具有结合产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)细胞壁的生物活性。
3.权利要求1或2所述的多肽，其中所述片段包含从根据SEQID NO :1所示氨基酸序 列的氨基酸残基170-203范围内的氨基酸残基起、至所述氨基酸序列的氨基酸残基342止 的氨基酸残基。
4.权利要求1-3任一项所述的多肽，其如SEQID NO :10-13所示。
5.前述任一项权利要求所述的多肽，其中所述多肽包含生物素残基、HA-标签、His-标 签、Strep-标签、Myc-标签、Js-标签或GST-标签。
6.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-5任一项所述的多肽的核苷酸序列。
7.一种载体，其包含权利要求6所述的核酸。
8.一种宿主细胞，其由权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的的载体转化。
9.一种组合物，其包含权利要求1-5任一项所述的多肽。
10.权利要求9所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物，且还包含药学上可接受 的稀释剂、赋形剂或载体。
11.权利要求1-5任一项所述的多肽，其用作人或动物药用物质或诊断物质。
12.权利要求1-5任一项所述的多肽，其用于治疗、预防或诊断与病原性梭菌 (Clostridium)菌种，优选与产气荚膜梭菌相关的病症、疾病或病状。
13.权利要求1-5任一项所述的多肽在处理、预防或诊断食物、食品加工设备、食品加 工工厂或与食物相接触的表面的梭菌污染中的用途。
全文摘要
本发明涉及具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的多肽，其变体或片段。本发明还涉及编码所述多肽的核酸。本发明还涉及使用所述多肽或其片段作为治疗或诊断物质以及用于食物或饲料污染的用途。
文档编号C07K14/01GK102076708SQ200980125481
公开日2011年5月25日 申请日期2009年7月7日 优先权日2008年7月7日
发明者弗里茨·艾肯塞赫, 马丁·莱斯纳 申请人:海格罗斯投资有限责任公司