蛋白质的重折叠方法

专利名称：蛋白质的重折叠方法
技术领域：
本发明涉及在因为经不溶化处理的或是失去了高级结构而失去了活性和稳定性 的蛋白质中恢复天然状态的高级结构的方法(重折叠方法)。
背景技术：
使用大肠菌等作为生产宿主来生产基因重组蛋白质，得到在水中不溶性变性的蛋 白质。这样的蛋白质也叫做变性蛋白质。因为变性蛋白质失去了活性和稳定性，故在将此 蛋白质作为医药品等使用时，必须进行引导以使其具有天然状态的高级结构。已知蛋白质 的重折叠方法可以作为在此种场合下使用的方法。但是，因为在此重折叠中使用的试剂和操作方法，必须根据蛋白质进行适当地选 择，故对没有重折叠经验的操作人员来说并非可以简单地实施的技术。此外，即使是具有充 足的经验，在蛋白质具有复杂的高级结构，在重折叠过程中易引起缔合·凝集的情况下，也 不能容易地得到天然状态。为了解决这些问题，提出了一系列新的重折叠方法。例如，到目前为止有报告使 用色谱柱来降低缔合凝集风险的柱重折叠法(非专利文献1)；将目的物固定在载体上来抑 制缔合凝集的固定化重折叠法(非专利文献幻；使用酸性和碱性缓冲液来代替变性剂，以 部分变性状态而可溶化的PH提取法(非专利文献幻；和分子伴侣共存的方法(非专利文 献4)；将反胶束以分子伴侣样使用的方法(非专利文献幻；利用表面活性剂的胶束的方法 (非专利文献6)；在超过3000个大气压的超高压下不使用变性剂而进行提取的高压重折叠 法(非专利文献7)；以及这些方法的并用法或变形法。这些方法中最令人注目的技术就是，将变性剂提取后的蛋白质用含有表面活性剂 的缓冲液稀释而抑制缔合凝集并同时部分地恢复结构，在下一步中使用环糊精等的表面活 性剂结合剂强行地使表面活性剂从蛋白质中脱离出来而完成结构形成的多段式重折叠法 的“人工分子伴侣系”。此技术的长处是，基本不必进行试错实验，仅需依照已确定的方法探 索几种条件，在效果上可以抑制作为最深刻的问题的缔合凝集。有使用此技术而成功重折 叠的例子的报告，也对此方法的变法进行了后续的研究(非专利文献8)。但是，随着人工分子伴侣系的适用例的增加，我们知道，将添加的表面活性剂从蛋 白质中脱离并不像报告的那样简单，为了发现适当的操作条件，依然需要繁杂的实验。此 外，也有人诟病，多阶段操作引起步骤的繁杂而在工业生产的利用上引起了限制(非专利 文献9)。这样，即使是评价最高的人工分子伴侣系，对于没有经验的工作人员来说，作为容 易且有效的对蛋白质进行重折叠的方法来说也不是十分合适的。另一方面，已知有使用酰化肌氨酸而使蛋白质重折叠的方法，但酰化肌氨酸唯有 在稀释后才能从蛋白质上脱离，如果不用特殊的方法除去，就不能恢复蛋白质的天然状态 的高级结构(非专利文献10，专利文献1)。已知也有使用强碱调节的含有月桂酰-L-谷 氨酸的表面活性剂溶液来使不溶性牛生长激素可溶化，通过超滤法降低表面活性剂浓度而
4重折叠的方法(专利文献幻，但此种方法难于有效地恢复生长激素以外的蛋白质的天然状 态。此外，使蛋白质和高强度的碱性PH相接触会在蛋白质中引起不能修复的脱酰胺反应等
化学变化。[专利文献 1]EP 0263902 A[专利文献2]US专利6410694[非专利文献 1]A. Jungbauer, W. Kaar, R. Schlegl Current opinion in Biotechnology 15,487-494(2004)[非专利文献 2]M Matsubara, et al. =FEBS LETT.，342，193-196(1994)[非专禾Ij 文献 3] S. M-Singh and Α. K. Panda Journal of Bioscience and Bioengineering 99,303-310(2005)[非专禾Ij 文献 4]D. Rozeman and S. H. Gellman Journal of Biological Chemistry 271,3478-3487(1996)[非专禾Ij 文 M 5] A. J. Hagen, Τ. A. Hatton, and D. I. C. Wang =Biotechnol Bioeng. 35,955-965(1990)[非专利文献 6]G. Zardeneta and P. H. Horowitz :Analytical Biochemistry 223，1-6(1994)[非专利文献 7]Μ. B. Seefeldt, Y. S. Kim, J. Carpenter, T. W. Randolph =Protein Science 14，2258-2266 (2005)[非专利文献 8] S. Machida, S. Ogawa, S. Xiaohua, T. Takaha, K. Fujii，K. Hayashi FEBS Lett. 486,131-135(2000)[非专禾Ij文献 9]H. Lanckriet and Α. P. J. Middelberg biotechnology Progress 20，1861-1867(2004)[非专利文献 10]Richard Burgess =Methods in Enzymology. 273,145-149 (1996)

发明内容
发明所要解决的课题因此，本发明的目的在于提供在平稳地将表面活性剂从蛋白质上脱离的同时，恢 复蛋白质的天然状态的高级结构的简单的重折叠方法。解决课题的手段本发明者们通过深入研究，结果发现只要使用特定的表面活性剂水溶液使变性蛋 白质可溶化，将此可溶化液稀释于含有精氨酸和精氨酸衍生物的缓冲液中，就可以在将特 定的表面活性剂从变性蛋白质上脱离的同时恢复该变性蛋白质的高级结构。S卩，本发明提供了由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质生产恢复了天然 状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序。(1)通过在pH6. 5 9. 0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触选 自具有C8 C16酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三 甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.05 1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物 的pH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0. 02 0. 5%的工序，(3)回收恢复了天然状态的高级结构的蛋白质的工序。此外，本发明提供了使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状 态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序，(1)通过在pH6. 5 9. 0下，使经不溶化处理或失去了高级结构的蛋白质接触选自 具有C8 C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三 甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0. 05 1. 2M的精氨酸或精氨酸衍生物 的pH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0. 02 0. 5%的工序。此外，本发明提供了由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质得到恢复其天 然状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序(1)通过在pH6. 5 9. 0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月 桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶 化液的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0. 1 1. 2M的精氨酸或精氨酸衍生物的 PH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚 氨二醋酸的浓度降低至0. 02 0. 275%的工序。此外，本发明提供了使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状 态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序，(1)通过在pH6. 5 9. 0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月 桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶 化液的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0. 1 1. 2M的精氨酸或精氨酸衍生物的 PH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚 氨二醋酸的浓度降低至0. 02 0. 275%的工序。发明的效果依照本发明，不需重折叠的经验和特殊的装置，能够简单且有效地重折叠蛋白质。 此外，依照本发明，能够在蛋白质恢复天然状态的高级结构的过程中抑制引起的蛋白质的 缔合·凝集。虽然并不拘泥于任一理论，但通常情况下，在表面活性剂从蛋白质上脱离的同时 蛋白质会缔合 凝集，不过依照本发明，使用特定的表面活性剂生成变性蛋白质后，稀释，并 在此稀释液中加入精氨酸或精氨酸衍生物，从而在将本发明中使用的特定的表面活性剂从 蛋白质上脱离的同时，精氨酸或精氨酸衍生物能抑制蛋白质的缔合·凝集性。发明的最佳实施方式[蛋白质]本发明中使用的蛋白质为经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质。不能明确 地区分经不溶化处理的蛋白质和失去了高级结构的蛋白质，只要是其高级结构和天然状态 的不一样的蛋白质均可用于本发明中。适用于2级结构主要是α-螺旋组成的蛋白质(例如IL-6)、β -片层组成的蛋白质(例如scFv和Fab)、或是两者组成的蛋白质(例如转谷 氨酰胺酶)。可以适用于单体蛋白(IL-6等)，也可适用于多聚体蛋白(Fab等)。可以适用 于分子内或分子间没有二硫键结合的蛋白质(例如转谷氨酰胺酶)，也可适用于具有该键 的蛋白质(例如IL-6、scFv、Fab)。例如，将大肠杆菌等微生物置于生产宿主中配制的不溶性基因重组蛋白质通常在 IOOg水中的溶解度为0. OOlg以下(25°C )，可以用于本发明中。可以是受到任何压力而从 可溶性状态变为不溶化的蛋白质。对于蛋白质的形态并无特殊限制，例如颗粒状、粉末状、 纤维状均可。对于蛋白质的一级结构和二级结构的特征并无特殊限制。和单体或低聚物结 构也无关系。即使是蛋白质的片段也可以使用。例如，重均分子量(室温条件下，使用超离 心分析法和静态光散射分析法来测定)从5000道尔顿至150000道尔顿均可使用与本发明 中。具体而言，可列举人白细胞介素-6那样的细胞因子；生长因子、各种激素、分化诱 导因子等获得特定的高级结构而发挥机能的蛋白质性配体；转谷氨酰胺酶等的酶；蛋白质 性酶阻断剂；以及含有免疫球蛋白结构的抗体相关分子。作为抗体相关分子，可列举抗体可变区(Fv、fragment of variable region)、 单链抗体可变区(scFv、single chain Fv)、抗原结合部位(Fab、fragment of antigen binding)、抗原结合部位(Fab' )、2价的抗原结合部位(F(ab’ )2)等的抗体片段；显示双 特异性的单链抗体可变区(bispecific single chain Fv)或双链抗体(Diabody)、抗体 可变区和抗体Fc区的一部分融合而2聚体化的人工小型抗体(Minibody)等的人工抗体； 构成抗原结合部位或抗体可变区的区域中的轻链来源或重链来源的单独的区域组成的单 域抗体(single-domain antibody)、将蛋白质和肽融合于抗体Fc区的Fc融合蛋白质(Fe Fusion Protein)等。更具体而言，可列举像HyHEL-10 scFv那样的单链抗体可变区(scFv)，例如培克 珠单抗(Pexelizumab) (scFv)、作为抗原结合部位(Fab)的阿昔单抗(Abciximab)(商品 名，ReoPro)、雷珠单抗(ranibizumab)(商品名，LUCENTIS)或培舍珠单抗(Certolizumab) (商品名，Cimzia)、抗荧光素scFv Fc融合体那样的Fc融合蛋白质(Fe Fusion Protein)、 例如罗米司亭(romiplostim)(商品名，Nplate)、利洛西普(riIona(^pt)(商品名， ARCALYST)、阿巴西普(abatacept)(商品名，0RENCIA)或阿来西普(alefacept)(商品名， AMEVIVE)等经不溶化处理的或失去了高级结构的。尤其优选抗体片段。这些抗体相关分 子的结构在公知的论文例如 Holliger P. and Hudson PJ. Nature Biotechnology 23(9)， 1126-1136(2005)中有详细的描述。免疫球蛋白结构以外的，例如以锚蛋白重复序列和纤连蛋白III型区域和脂笼蛋 白等为支架结构制作的人工的亲和性分子也可以使用于本发明中。前述经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质，优选在区域中具有免疫球蛋白 结构的蛋白质。前述在区域中具有免疫球蛋白结构的蛋白质，进一步优选具有一部分抗体区域的 抗体片段，双链抗体或小型抗体的人工抗体或Fc融合蛋白质。前述具有一部分抗体区域的抗体片段，优选scFv、Fab、Fab'或(F(ab' )2)。前述Fc融合蛋白质，优选在抗体Fc区域融合有细胞因子、受体细胞外区域或肽的蛋白质。[工序⑴用表面活性剂引起的变性蛋白质的可溶化]■表面活性剂的种类在本发明中，具有C8 Cni的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸(月桂酰肌氨酸、月桂 酰-Sar)、癸酰丙氨酸(月桂酰丙氨酸、月桂酰-Ala)、癸酸或者它们的盐(例如钠盐、钾 盐)、氯化月桂基三甲基铵(LTAC)及它们的混合物作为能够使经不溶化处理的或失去了高 级结构的成为非天然形状的蛋白质溶解于水中的表面活性剂(可溶化剂)而发挥功能。前述表面活性剂优选具有C8 的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸或者 它们的盐。进一步优选具有C8 C16的酰基的二羧酸或其盐。具有前述C8 C16的酰基的 二羧酸更优选月桂酰谷氨酸(月桂酰-GlU)、月桂酰天冬氨酸(月桂酰-Asp)或月桂酰亚氨 二醋酸。本发明中使用的月桂酰-Glu、月桂酰-Asp、月桂酰-Sar、月桂酰-Ala可以为D型、 L型、DL型的中任一种。在经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质为IL-6等细胞因 子和转谷氨酰胺酶等的酶的情况下，优选月桂酰-Glu、月桂酰-Asp、月桂酰亚氨二醋酸或 它们的盐，或它们的混合物。作为表面活性剂，因为月桂酰-L-Glu对所有的不溶性蛋白质 的可溶化力均优秀，在稀释时不持续与蛋白质结合而容易除去，因而添加，且高纯度的月桂 酰-L-Glu试剂能便宜地购买到，故尤为优选。■表面活性剂的浓度月桂酰-Glu、月桂酰-Asp、月桂酰亚氨二醋酸、月桂酰-Sar、月桂酰-Ala、癸酸或 LTAC为1 3 %，优选1. 5 2. 8 %，更优选1. 75 2. 5 %的水溶液。在这样的浓度范围内， 蛋白质的可溶化效率非常高，且在随后操作的稀释倍率上可以维持在适度的水平。■ pH和变性蛋白质的性质契合，该水溶液的25°C的pH可以选择pH6. 5 9. 0，优选 PH7. 0 8. 5的温和的条件。需要说明的是，在本发明中，pH可以使用装有pH电极的pH计 进行测定。PH的调节可以使用氢氧化钠等碱来进行。作为该水溶液，也可以使用缓冲液。■接触温度及时间将这样配制的表面活性剂水溶液和变性蛋白质相接触，得到蛋白质的可溶化液。 可以在表面活性剂水溶液中加入变性蛋白质，也可在变性蛋白质中加入表面活性剂水溶 液。接触通常可以在5 40°C下，优选在15 40°C下放置而进行。在这样的范围内，化学 反应导致的断裂和氧化等的修饰被抑制在最低限度，故而优选。放置时间通常为0. 1 3. 0 小时，优选0. 5 1. 0小时。在这样的范围内，化学反应导致的断裂和氧化等的修饰被抑制 在最低限度，故而优选。接触中可以搅拌。变性蛋白质或可溶化水溶液的量调节为经可溶化的蛋白质浓度为1 20mg/ml， 即使是在后续的稀释过程中出现极端情况蛋白质浓度也不降低，故而优选。蛋白质是否可溶化了，可以经例如通过目视进行浊度判定，或在^Onm下的紫外 线吸收光谱法等进行确认。[工序O)使用添加剂溶液进行稀释]■稀释倍率随后，将此可溶化液以10 数10倍程度的稀释倍率稀释于含有作为添加剂的精氨酸或精氨酸衍生物的缓冲液中，维持此状态，直至蛋白质恢复天然状态的高级结构。进 行稀释，以使稀释后的表面活性剂的浓度为0. 02 0. 5%，优选0. 04 0. 35%，更优选 0.05 0.30%。表面活性剂通过此稀释而直接从蛋白质上脱离，蛋白质形成高级结构。稀 释可以通过适宜选择1阶段、多阶段(步骤梯度)或线性梯度而进行。在前述蛋白质为IL-6等细胞因子和转谷氨酰胺酶等的酶的情况下，优选进行 稀释以使稀释后的表面活性剂的浓度为0. 02 0. 275%，优选0. 04 0. 125%，更优选 0. 05 0. 10%。在前述蛋白质为抗体片段其中的scFv的情况下，和上述细胞因子和酶的情况相 比较，稀释倍率可以较小。具体而言，进行稀释，以使稀释后的表面活性剂的浓度为0. 02 0. 5%，优选0. 05 0. 4%，更优选0. 1 0. 3%。即使在稀释浓度比所述浓度低的情况下， 只要是在本发明中规定的范围内，也可以恢复蛋白质的天然状态的高级结构。在前述抗体片段中的Fab、Fab'及F(ab，)2的情况下，可以一阶段稀释，也可 以两阶段以上的多阶段稀释，但多阶段稀释的重折叠率更高，故而优选。在一阶段稀释的 情况下，优选进行稀释，以使稀释后的表面活性剂的浓度为0. 02 0. 08%，优选0. 03 0. 07%、更优选0. 04 0. 06%。在多阶段稀释的情况下，第一阶段中的稀释可以以和上述 scFv的情况下同程度的稀释倍率来进行。最后阶段的稀释优选使稀释后的表面活性剂的浓 度为0. 02 0. 08%、优选0. 03 0. 07%、更优选0. 04 0. 06%这样地来稀释。可以逐渐 地稀释，在此情况下，优选使稀释后的最终浓度为0. 02 0. 08%、优选0. 03 0. 07%、更 优选0. 04 0. 06%这样地来稀释。只要在这样的范围内，就能促进天然状态的高级结构恢复，也能确保蛋白质的稳 定性，故而优选。蛋白质是否恢复天然状态的高级结构，可以通过CD光谱和荧光光谱等的 分光测定，或观察HPLC等蛋白质的物理化学的特性的方法，或酶活性等高级结构指标来确 认。■添加剂的种类作为添加剂使用的精氨酸可以为L型，也可以为D型。可以形成盐酸盐等的与无 机酸所成的盐，或者也可以形成醋酸盐等的与有机酸所成的盐。作为精氨酸衍生物，可列举 乙酰精氨酸、N- 丁酰精氨酸等的具有碳原子数1 6的酰基的精氨酸；除去羧基的胍丁胺； 导入羟基来代替α氨基的5-胍基-2羟基-戊酸(7 X 二 >酸)等。作为精氨酸衍生 物，优选酰化精氨酸，更优选N-丁酰精氨酸。作为添加剂，最优选精氨酸盐酸盐。■ ρΗ作为缓冲液，可以使用磷酸钠、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐等。ρΗ只要是 契合恢复天然状态的蛋白质的性质的PH即可，大概为在ρΗ6. 5 9. 0范围内的中性ρΗ。因 此，工序(2)中ρΗ在此范围内即可，也可以和工序(1)中的ρΗ不同。ρΗ的调节可以使用例 如盐酸和氢氧化钠等进行。■添加剂浓度添加剂浓度应根据恢复天然状态的蛋白质的性质进行单独地选择，但应为 0.05 1.211，优选0.06 1.011，更优选0.08 0.811。在这样的范围内，可以促进天然状 态的高级结构恢复，并且不阻碍随后的精制工序，故而优选。在蛋白质为IL-6等的细胞因子和转谷氨酰胺酶等的酶的情况下，添加剂浓度优选0. 1 1. 2M,进一步优选0. 2 1. 0M,更优选0. 4 0. 8M。在前述蛋白质为抗体片段中的scFv的情况下，添加剂浓度优选0. 2 1. 0M，更优 选 0. 4 0. 8M。在前述片段中的Fab,Fab'及F(ab，)2的情况下，添加剂浓度优选0. 05 0. 3M， 更优选0.08 0. 12M。在分二阶段以上稀释的情况下，第一阶段中的稀释可以以与上述 scFv的情况相同程度的稀释倍率来进行。最后阶段中的稀释优选使稀释后的添加剂的浓度 为0. 05 0. 3M、优选0. 06 0. 2M、更优选0. 08 0. 12M这样地来稀释。稀释可以通过适 宜选择1阶段，多阶段(步骤梯度)或线性梯度而进行。■稀释温度·保持时间稀释可以在室温下实施，在目的蛋白质恢复至天然状态时的热稳定性并不是十分 高的情况下可以于5 10°C下实施。例如，在人白细胞介素(rhIL-6)的情况下，使用添加 剂溶液稀释后，可以在室温下维持1分钟的程度。在转谷氨酰胺酶的情况下，可以在室温下 维持2小时以上。在5 10°C下维持的情况下必须维持更长的时间。一般情况下，在高温度下维持则维持时间变短，但在目的蛋白质为抗体相关分子 的情况下，在与IL-6和转谷氨酰胺酶等的细胞因子的情况相比还要低的温度下维持长时 间较好。这样可以提高重折叠率。尤其优选在5 48°C下维持1小时 5日。在抗体相关分子为抗体片段中的scFv的情况下，尤其希望在5°C 15°C下，优选 7°C到13°C下，更优选8°C 12°C下，维持10 M小时，优选12 20小时，更优选15 18小时。可以抑制期间的抗体相关分子的缔合凝集。随后，加热此稀释液，进一步维持数小时至数日。优选希望在15°C 48°C，优选 20 V 46 °C，更优选23 V 45 V下维持1小时 5日，优选1. 5小时 3日，更优选2小 时 24小时。在抗体片段为Fab、Fab ’及F (ab，)2的情况下，在一阶段稀释的情况下优选于5 15°C下维持10 72小时。更优选于7 13°C下维持12 20小时。在多阶段稀释的情况 下，第一阶段中的稀释希望于5°C 15°C，优选7°C到13°C，更优选8°C 12°C下维持10小 时 M小时，优选12小时 20小时，更优选15小时 18小时。可以抑制期间的抗体相 关分子的缔合凝集。而后，加热此稀释液，进一步维持数小时至数日。优选在15°C 48°C，优选20°C 46°C，更优选23°C 45°C下维持1小时 5日，优选1.5小时 3日，更优选2小时 M 小时。温度调节可以通过适宜选择1阶段、多阶段(步骤梯度)或线性梯度而进行。可以逐渐地稀释。在此情况下，优选于5 15°C下稀释10 72小时。在稀释分数阶段进行的情况下，在最后阶段的稀释后例如通过超滤膜浓缩仅抵消 稀释倍率的部分，从而将最终阶段的稀释后的蛋白质浓度保持在0. 05 1.0mg/ml，优选 0. 1 0. 5mg/ml，更优选0. 15 0. 3mg/ml，促进了构成Fab的重链和轻链的二硫键形成。需要说明的是，目前的抗体相关分子的重折叠中，构成分子的各区域的重折叠 速度不规律，故在重折叠中易引起缔合凝集，重折叠率低。为解决此问题，津本等提出 了使用阶段透析法的重折叠方法(The Journal of Biological Chemistry 278(11)， 8979-8987(2003))。此方法通过对变性蛋白质(单链抗体可变区，scFv)溶液中的高浓度 的蛋白质变性剂(盐酸胍)进行6阶段的透析操作，从而慢慢地阶段性地除去，可以防止单纯的稀释法等中频繁地出现的缔合凝集而导致的蛋白质的损失，是一种优秀的方法。但 是，因为此方法进行了 6阶段的透析故重折叠操作时间长，在期间蛋白质受到化学修饰，形 成凝集性高的结构形成中间状态的情况下，也有反而促进缔合凝集的可能。植田等对津 本等的方法进行了部分改良，使抗原结合部位(Fab)的重折叠变得可能(The Journal of Biochemistry 141 (5)，699-707 Q007))，但此场合下因为进行了 4阶段的透析，而需要130 小时的长时间，而重折叠率最高才为对％，不能说是效率高的重折叠方法。但是，如上所述，依照本发明，通过凝胶过滤高效液相色谱和电泳或测定抗体相关 分子的活性，可以根据各抗体相关分子适当地确定抗体相关分子重折叠必须的时间。多数 场合下为40小时的程度，和阶段透析法为代表的以往的抗体相关分子重折叠方法相比也 有大幅缩短。[任意工序(A)使用添加剂溶液进行稀释前的稀释]根据蛋白质的不同，在上述范围内稀释之前，可以通过添加磷酸缓冲溶液等来进 行预稀释。具体而言，在前述工序(1)和工序( 之间，希望以表面活性剂的浓度为0.8 1. 5%，优选1 %的程度进行稀释。稀释后，优选于5 40°C，更优选5 30°C，例如室温下 优选放置0.5小时以上，更能提高蛋白质的高级结构的回复率。只要以与可溶化使用的时 间同等程度以上的时间进行放置，就是足够的。特别优选以表面活性剂的浓度为0. 8
进行稀释，将得到的稀释液于5 40°C下维持30分钟以上。尤其是当目的蛋白质为抗体相关分子，在该抗体相关分子为抗体片段中scFv的 情况下，可以在5°C 15°C，优选7°C到13°C，更优选8°C 12°C下维持10小时 M小时， 优选12小时 20小时，更优选15小时 18小时。在维持期间，抗体相关分子不缔合凝集， 接近天然状态。在抗体片段为Fab、Fab'及F(ab’ )2的情况下，使用含有作为添加剂的精氨酸或 精氨酸衍生物的缓冲液来稀释，调节月桂酰-Glu浓度为0. 05 0. 5%，优选0. 08 0. 4%， 更优选0. 1 0.3%，精氨酸浓度为0.6 1.2M，优选0. 7 1. 1M，更优选0. 8 1. 0M。此时得到的稀释液的25°C下的pH在pH6. 5 9.0的范围内，即使和工序(1)中的 PH不同也可。pH调节可以使用例如盐酸和氢氧化钠等来进行。通过此稀释高级结构得到恢复的蛋白质的浓度，和稀释使用的蛋白质的量和性 质、稀释的倍率有关，可达到0. 02 lmg/ml。[任意工序⑶二硫键的形成]根据蛋白质的不同，在单一的分子内，多聚体蛋白质的情况下在分子键具有二硫 键。使蛋白质发生氧化还原反应促进这些二硫键结合的形成，可以提高重折叠率故而优选。氧化还原反应促进硫羟· 二硫交换反应，可以使用使分子内和分子间形成二硫键 而用的氧化还原物质(例如，氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)的混合物， 或胱氨酸和半胱氨酸的混合物，或胱胺和半胱胺的混合物、或是氧化型谷胱甘肽或胱氨酸 和巯基乙醇的混合物，等)和，与用于促进空气氧化的铜离子共存而进行，也可通过改变蛋 白质的氧化还原电位进行。优选使用氧化还原物质。氧化还原反应只要在前述工序(1)后任何时间进行均可，例如前述工序O)中将 氧化还原物质作为添加剂加入可溶化液中进行也可，前述工序O)中得到稀释液后在该稀 释液中添加氧化还原物质进行也可。
氧化还原物质和铜离子的浓度应根据恢复天然状态的蛋白质不同来调节适当的 浓度。此处25°C的pH可以在pH6. 5 9.0的范围内。pH调节可以使用例如盐酸和氢氧 化钠等来进行。液温可以和工序(1)中得到的可溶化液的温度同等程度，也可以和工序O)中得 到的可溶化液的温度同等程度。为促进氧化还原反应，优选5 48°C的程度。氧化还原反应后，可以在5 48°C下放置1小时 5日(120小时)的程度。依照本发明，重折叠率至少为30%，多数情况下可达70%。[任意工序(C)精制]恢复了高级结构的蛋白质，可以使用通常的方法，例如超滤、透析、离子交换色谱 法、凝胶过滤色谱法、疏水作用色谱法、反相色谱法、亲和色谱法等进行精制。以下使用实施例对本发明进行具体的说明，但本发明并不仅限于此实施例。
实施例(参考例1)作为蛋白质，使用用基因重组蛋白大肠杆菌配制的人白细胞介素-6 (rhIL-6 ；专 利第3200850号)。该rhIL-6为水不溶性(25°C下IOOg水中的溶解度0. OOlg以下)，其 形态为颗粒状。将该不溶性颗粒分成小份分别注入Eppendorf筒(聚丙烯制；Eppendorf会 社)中，每1根注入^ig的rhIL-6。该不溶性颗粒中含有的rhIL-6的量为已报道(专利第 3200850号)中记载的用反相色谱法得到的预定量。在此，使月桂酰-L-Glu、月桂酰-L-Asp、月桂酰亚氨二醋酸、癸酰Sar、癸酰L_Ala、 癸酸或氯化月桂基三甲基铵的最终浓度为2 %，此外，使rhIL-6提取浓度为％ig/ml，适当添 加预先配制为5%的表面活性剂和纯水(MiIiQ水)，最终配制成1ml，于室温下放置2小时， 从该不溶性颗粒中提取rhIL-6，使rhIL-6可溶化。为了比较，以下使用表面活性剂进行同样的操作。在使用阴离子型表面活性剂的 情况下，使用NaOH调节水溶液的浓度至pH7. 0 (25 °C )。较常用的表面活性剂^一酰L-Glu、十三酰L-Glu、肉豆蔻酰L_Glu、月桂酰 DL-Glu、月桂酰 γ-Glu-Glu、月桂酰 α -Glu-Glu、癸酰-L-Asp、癸酰-DL-Asp、肉豆蔻酰 Sar、 月桂酰L-Ala、肉豆蔻酰L-Ala、月桂酰DL_Ala、月桂酰Gly、月桂酰L-Val、月桂酰L_Leu、 月桂酰L-Ile、月桂酰L-Hie、月桂酰L-Phe、月桂酰L-Tyr、月桂酰L-Met、月桂酰L-Gln、 月桂酰L-PCA、月桂酰L-Pro、月桂酰L-GABA、月桂酰L_Cit、月桂酰琥珀酸(以上均为味 之素(株式会社)生产)、月桂酰-Sar (Nacalai Tesque生产)、POE Q0)失水山梨醇单油 酸酯(Tween-80 ；Nacalai Tesque 生产)、POE (9，10)对-叔辛基苯基醚(Triton X-100 ； Nacalai Tesque生产)、POE Q0)失水山梨醇单棕榈酸酯(Tween-20 ；Bio-Rad生产)、月 桂酰-N-Me-牛磺酸(NikkorLMT ；日光化工生产)、月桂酰-N-Me-β -Ala(川研良好化工生 产)、月桂酰胺丙基甜菜碱(softazoline LPB “ ” Ψ、f 1J > LPB ；川研良好化工生产)、氯 化癸基三甲基铵、氯化肉豆蔻基三甲基铵、氯化硬脂酰基三甲基铵、月桂酸(以上为东京化 成生产、氯化鲸蜡基三甲基铵(和光纯药生产)、SLES (Sodium Iaurylethersulfate (月 桂基醚硫酸钠)，Emal 270D/B ；花王生产)、月桂基胺基甜菜碱(Amphitol 20 AB ；花王生产)、肉豆蔻基胺基甜菜碱(Amphitol 24 AB ；花王生产)、月桂基磺基甜菜碱(SB-12 ； Sigma -Aldrich生产)、3-[ (3-胆酰胺丙基)二甲基铵]丙磺酸(CHAPS ；同仁化学研究 所生产)。在各提取液中添加还原型谷胱甘肽及氧化性谷胱甘肽，使其最终浓度分别为 10 μ M和2 μ M，于室温下终夜放置形成分子内二硫键。二硫键的形成使用在反相HPLC法 (柱Vydac 214-TP5410 (Separations Group)；洗脱液Α/0· 1% TFA Β/0. 1% TFA+80% 乙 腈；流速lml/min ；洗脱条件从30% B到50% B，1. 0%/min的线性梯度)中的峰保留时间 的变化为指标来确认。在得到的溶液50 μ 1中加入IOmM的磷酸钠水溶液950 μ 1 (pH 7.0, 25 °C )来进行20倍的稀释(最终容量Iml ；最终表面活性剂浓度0. )。和离子交换HPLC中的rhIL-6标准品(专利第3200850号)显示出相同保留时 间的峰则认为是具有天然状态的高级结构的rhIL-6 (Biotechnology and Bioengineering 62，301-310 (1999))，故使用离子交换HPLC求得上述稀释后的水溶液中含有的形成了天然 状态的高级结构的rhIL-6的量(柱SP-NPRCTosoh生产)；洗脱液A/0. OlM乙酸钠、pH5. 0 Β/0. 5Μ乙酸钠、ρΗ5. 5 ；流速:lml/min ；洗脱条件从20% B到70% B, 10% /min的线性梯 度)以使用作为表面活性剂的月桂酰L-Glu进行可溶化的情况下的rhIL-6量为 100%,相对表示使用月桂酰-L-Asp及月桂酰亚氨二醋酸进行可溶化的情况下的rhIL-6量 (

图1)。同样地也相对表示使用比较用表面活性剂进行可溶化的情况下的rhIL-6量(图 1)。由图1可知，在使用月桂酰-Asp或月桂酰亚氨二醋酸使rhIL-6可溶化并恢复了 天然状态的高级结构的情况下的rhIL-6量并不比在使用月桂酰-Glu使rhIL_6可溶化并 恢复了天然状态的高级结构的情况下的rhIL-6量逊色。使用这3种的表面活性剂的情况 下得到的恢复了天然状态的高级结构的rhIL-6量要高于使用比较用表面活性剂的情况下 的 rhIL-6 量。在使用蛋白质的重折叠中以往使用较多的月桂酰-Sar和氯化鲸蜡基三甲基铵 (CTAC)的情况下得到的恢复了天然状态的高级结构的rhIL-6的量分别为5%和21%， 较低。在使用预想富有从含有rhIL-6的不溶性颗粒中提取rhIL-6能力的月桂醚硫酸钠 (SLES)和月桂酸等的阴离子表面活性剂及两性表面活性剂的情况下，得到的恢复了天然状 态的高级结构的rhIL-6量低，均不足20%。因为蛋白质变性效果弱，因此在重折叠中使 用较多的Tween20、Tween80、TrixtonX-100的非离子型表面活性剂从不溶性颗粒中提取 rhIL-6的能力缺乏，基本不能使不溶性颗粒溶解，故恢复了天然状态的高级结构的rhIL-6 量为3 5%，较低。(参考例2)研究了即使是在从提高不溶性颗粒中提取、可溶化时的rhIL-6浓度得到了提高 的情况下，月桂酰-L-Glu、月桂酰-L-Asp及月桂酰亚氨二醋酸对不溶化rhIL-6的天然状态 的高级结构的恢复是否有效。为了比较，使用了参考例1中对月桂酰-L-Glu显示出了 80% 以上的rhIL-6量的氯化月桂基三甲基铵、同样地具有月桂酰基的月桂酰-Sar、为了确认月 桂酰-L-Glu中酰基链长的效果使用的十一酰-Glu、十三酰-Glu及肉豆蔻酰_Glu、为了确 认酰链的影响使用癸酸。
使用和参考例1中使用的一样的rhIL-6的不溶性颗粒，将其分为13mg的小份于 Eppendorf筒中。在Eppendorf筒中加入各表面活性剂，使得最终浓度为2%，得到IOmM磷 酸钠的pH7. O (25°C )的溶液1ml，调节该溶液pH为7. 0，于室温下放置2小时，从而从该不 溶性颗粒中提取rhIL-6，使rhIL-6可溶化。提取浓度调节为13mg/ml。和参考例1 一样地 添加还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽使其最终分别为10 μ M和2 μ M，在室温下终夜放置 形成分子间二硫键。在此25 μ 1中加入IOmM磷酸钠水溶液(pH 7. O (25°C )) 975 μ 1进行40倍稀释 (最终容量Iml ；最终表面活性剂浓度0. 05% )，和参考例1中记载的一样地，使用离子交换 HPLC来求得形成高级结构的rhIL-6量。结果如图2所示。从图2可知，在使用月桂酰-L-Glu的情况下，恢复了天然状态的高级结构的 rhIL-6的浓度最高，在使用月桂酰L-Asp、月桂酰亚氨二醋酸这些分子内具有酰胺键的单 链二亲水型表面活性剂的情况下也显示了高rhIL-6浓度。与使用月桂酰-L-Glu的情况相 比较，若月桂酰-L-Glu的酰基链长缩短为Cll (十一酰)、增长为C13(十三酰)或C14(肉 豆蔻酰)，rhIL-6浓度降低，故酰基链长为C12(月桂酰)是最合适的。在使用仅有酰基链 的癸酸的情况下只能收集到很少量的rhIL-6。对G-CSF(粒细胞集落刺激因子；US专利 5849883)和生长激素(EP 0263902 A)的重折叠有效的月桂酰-Sar与月桂酰-L-Glu相比 明显较差。(参考例3)研究了用于从不溶性颗粒中将rhIL-6提取并可溶化的表面活性剂的浓度。使用和参考例1中所使用的一样的rhIL-6不溶性颗粒，将其分为12.6mg的小 份置于Eppendorf筒中。在Eppendorf筒中加入月桂酰-L-Glu使得最终浓度为1.5%、 1. 75%,2. 00%,2. 25%,2. 50%,3. 00%，得至Ij IOmM 磷酸钠的 pH7. (K25°C )的溶液 3ml。将 该溶液于室温下放置2小时，从该不溶性颗粒中提取rhIL-6，使rhIL-6可溶化。在rhIL_6 完全提取后，调节rhIL-6的提取浓度为4. 3mg/ml。提取后，在上清中加入二硫苏糖醇(017)10!111，调节？!1为8后，于371下加热 30分钟使二硫键还原。将此上清提供给反相HPLC (柱Vydac 214-TP5410 (Separations Group)；洗脱液:A/0. 1% TFA Β/0. 1% TFA+80% 乙腈；流速:lml/min ；洗脱条件从 30% B到50% B，1. 0% /min的线性梯度)，测定从不溶性颗粒中得到的可溶化的rhIL_6量 (Biotechnology and Bioengineering 62,301-3 10(1999))。以月桂酰 L-Glu 的最终浓度 为3. 00%时的rhIL-6量为100%，在各浓度中rhIL_6相对量如图3所示。从图3可明确，在月桂酰-L-Glu浓度为1.50%的情况下，虽然得不到在用3%提 取及可溶化处理情况下的rhIL-6量，但得到其80%弱的提取量。在月桂酰-L-Glu浓度 为1.75%以上的情况下，得到了和在用3%提取及可溶化处理情况下基本相同的提取量。 由此结果可知，若为具有和rhIL-6同程度的疏水性的蛋白质，则可以使用1.50%的月桂 酰-L-Glu浓度进行提取，在3. 00%的月桂酰-L-Glu浓度中可同样地提取。(参考例4)在工序⑵中，研究了稀释使用表面活性剂提取的蛋白质以进行重折叠时的表面 活性剂的最适浓度。因为能够给予很好地反映rhIL-6高级结构的荧光波谱，故通过追踪 各浓度的月桂酰-L-Glu中的rhIL-6的最大荧光强度及其波长，而决定适于重折叠的月桂酰-L-Glu的浓度。将rhIL-6标准品(专利第3200850号)用IOmM的磷酸钠、在pH7. 0中配制为 0. 075mg/ml，于室温下测定激发波长四5歷，荧光波长315 420nm的荧光光谱(FP-6500分 光荧光光度计、JASCO生产)。结果如图4所示。月桂酰-L-Glu浓度在0% 0. 之间，rhIL-6的最大荧光波长和荧光强度均基 本不变化。由此可知，在此浓度范围内，月桂酰-L-Glu的结合基本没有，即使有少量结合， 也不存在rhIL-6结构从天然状态向别的状态的变化。月桂酰-L-Glu浓度在0. 125% 0. 275之间，最大荧光波长渐渐地且连续地移向 紫外一侧。由此可知，在此范围内，月桂酰-L-Glu与rhIL-6结合，向具有一定的最大荧光 强度和此波长的结构状态变化。若月桂酰-L-Glu浓度超过0.967%，则最大荧光波长移向红外一侧。由此可知，在 此浓度范围内，rhIL-6的高级结构进一步打开，即开始失去rhIL-6高级结构。由以上结果可知，若进行稀释而使月桂酰-L-Glu浓度低于0. 1%，蛋白质的高级 结构完全地向天然状态转变，若稀释为0. 125% 0. 275%，则向和天然状态相近的状态转变。(参考例5)在参考例4中判明的月桂酰-L-Glu浓度和rhIL-6高级结构的关系，在以表面活 性剂中溶解的rhIL-6状态为开始点，由此开始阶段性地稀释的过程(重折叠过程)中，同 样地确认了观察结果。将rhIL-6标准品(专利第3200850号)溶解于含有2%的月桂酰-L-Glu的IOmM 磷酸钠(pH7.0(25°C )) Iml中，配制为3mg/ml。将此溶液使用IOmM磷酸钠(pH7.0(25°C )) 进行阶段性稀释，制备出月桂酰-L-Glu浓度为1. 0 %、0. 3 %、0. 1 %、0. 05 %的稀释序列。将 各稀释溶液的rhIL-6浓度调节为0. 075mg/ml后，测定各稀释溶液的荧光光谱，追踪伴随月 桂酰-L-Glu浓度的变化的最大荧光波长的变化。为了比较，使用月桂酰-Sar来代替月桂酰-L-Glu来进行同样的操作。结果如图 5所示。月桂酰-L-Glu浓度为2 0. 3%之间，则最大荧光波长在340nm附近，rhIL-6高 级结构依然是和天然状态不同的状态，但当在0. 1%,0. 05%时到达350nm处，使用此浓度 的月桂酰-L-Glu，则rhIL-6实际上可以恢复天然状态的高级结构，即重折叠。使用为了比 较而进行的月桂酰-Sar，rhIL-6的最大荧光波长在研究的范围内完全没有变化，不能认为 发生了重折叠。(实施例1)[工序(1)使用表面活性剂使变性蛋白质的可溶化]将和参考例1中使用的相同的rhIL-6水不溶性颗粒加入5ml的2. 5 %月桂 酰-L-Glu水溶液(含有IOmM磷酸钠，pH7(25°C ))中，于37°C下放置1小时而从该不溶性 颗粒中提取rhIL-6，使rhIL-6可溶化。得到的可溶化液的rhIL_6浓度为6. 5mg/ml。[工序⑶二硫键的形成]在得到的可溶化液中加入10 μ M还原型谷胱甘肽和2 μ M氧化型谷胱甘肽后，于室 温下放置18小时，形成分子内二硫键。
[工序O)使用添加剂溶液进行稀释]另一方面，在IOmM磷酸钠水溶液中加入作为添加剂的精氨酸盐酸盐，配制成精氨 酸盐酸盐浓度为0. 4M、0. 8M及1. 2M的稀释液(pH7. 0(25°C ))。作为阴性对照，准备除了不 加入添加剂以外，一样地进行配制的稀释液。将放置18小时后的可溶化液0. Iml用这些稀释液进行50倍的稀释，将月桂 酰-L-Glu的浓度调节为0. 05%。和参考例1 一样地，使用离子交换HPLC评价添加剂浓度和rhIL-6的重折叠率之 间的关系。结果如表1所示。(比较例1 2)除了使用蔗糖及甘油来代替精氨酸盐酸盐作为添加剂以外，和实施例一样地使用 离子交换HPLC评价添加剂浓度和rhIL-6的重折叠率之间的关系。结果如表1所示。(比较例3)使用和专利3200850号实施例1中记载的方法相同的方法，进行rhIL_6的重折 叠。具体而言，将和实施例1中使用的相同的rhIL-6的水不溶性颗粒加入5ml的6M盐酸 胍(pH7(25°C ))中，于37°C下放置1小时，从该不溶性颗粒中提取rhIL_6并使rhIL_6可 溶化。得到的可溶化液的rhIL-6浓度为0. 88mg/ml。随后，对于得到的可溶化液，使用葡聚糖凝胶G-25柱进行缓冲液置换为IOmM乙酸 钠、pH5. 0。和实施例1 一样地，使用离子交换HPLC评价rhIL-6的重折叠率。结果如表1 所示。[表1]
权利要求
1.由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质制造恢复了天然状态的高级结构的 蛋白质的方法，所述方法包含下述工序(1)通过在PH6.5 9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触选自具 有C8 C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三甲 基铵及它们的混合物的表面活性剂的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.05 1. 2M的精氨酸或精氨酸衍生物的 pH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0. 02 0. 5%的工序，(3)回收恢复了天然状态的高级结构的蛋白质的工序。
2.权利要求1的制造方法，其中，前述表面活性剂为含有C8 C16的酰基的二羧酸、癸 酰肌氨酸、癸酰丙氨酸或者它们的盐。
3.权利要求1或2的制造方法，其中，前述表面活性剂为具有C8 C16的酰基的二羧酸 或其的盐。
4.权利要求1 3中任一项的制造方法，其中，前述具有C8 C16的酰基的二羧酸为月 桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸。
5.权利要求1 4中任一项的制造方法，其中，在前述工序⑴和前述工序⑵之间， 含有将由前述工序(1)得到的可溶化液稀释，得到前述表面活性剂的浓度为0. 8 1. 5%、 pH为6. 5 9. 0的稀释液，将得到的稀释液于5°C 40°C保持0. 5小时以上的工序㈧。
6.权利要求1 5中任一项的制造方法，其中，在前述工序(2)中，使前述表面活性剂 的浓度及精氨酸或精氨酸衍生物的浓度阶段性地或逐渐地降低，于5 48°C维持1小时 5曰。
7.权利要求1 6中任一项的制造方法，其中，前述精氨酸衍生物选自含有碳原子数 1 6的酰基的精氨酸、精氨酸丁酯、胍丁胺及5-胍基-2羟基-戊酸。
8.权利要求1 7中任一项的制造方法，其中，前述经不溶化处理的或失去了高级结构 的蛋白质为基因重组蛋白质。
9.权利要求1 7中任一项的制造方法，其中，前述经不溶化处理的或失去了高级结构 的蛋白质为在结构域上具有免疫球蛋白结构的蛋白质。
10.权利要求9的方法，其中，前述在结构域上具有免疫球蛋白结构的蛋白质为具有一 部分抗体结构域的抗体片段、双抗体或小型抗体的人工抗体、或者Fc融合蛋白质。
11.权利要求10的方法，其中，前述抗体片段为scFv.Fab.Fab'或(F(ab')2)。
12.权利要求10的方法，其中，前述Fc融合蛋白质为将细胞因子、受体细胞外域或肽融 合于抗体Fc结构域而成的蛋白质。
13.权利要求1 11中任一项的制造方法，其中，在恢复了天然状态的高级结构的蛋白 质为具有二硫键的蛋白质的情况下，进一步含有通过使前述经不溶化处理的或失去了高级 结构的蛋白质发生氧化还原反应而形成分子内或分子间二硫键的工序(B)。
14.权利要求13的制造方法，其中，前述工序(B)中的前述氧化还原反应通过在由前述 工序(1)得到的可溶化液或由前述工序( 得到的缓冲液中加入氧化还原物质或铜离子来 进行。
15.使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序，(1)通过在PH6.5 9. 0下，使经不溶化处理或失去了高级结构的蛋白质接触选自具有 C8 Cni的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三甲基 铵及它们的混合物的表面活性剂的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.05 1. 2M的精氨酸或精氨酸衍生物的 PH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0. 02 0. 5%的工序。
16.由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质得到恢复其天然状态的高级结构的 蛋白质的方法，所述方法包含下述工序(1)通过在PH6.5 9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月桂酰 谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液 的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.1 1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸 的浓度降低至0. 02 0. 275%的工序。
17.使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状态的高级结构的方 法，所述方法包含下述工序(1)通过在PH6.5 9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月桂酰 谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液 的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.1 1. 2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸 的浓度降低至0. 02 0. 275%的工序。
全文摘要
通过本发明，可以提供如下方法通过在pH6.5～9.0下，将失去了高级结构的蛋白质和月桂酰谷氨酸等特定表面活性剂的1～3％水溶液相接触，得到该蛋白质的可溶化液，将得到的可溶化液加入含有0.1～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，通过使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸等特定表面活性剂降低至0.02～0.275％，生产恢复了天然状态的高级结构的蛋白质。通过本发明，可以在将表面活性剂平稳地从蛋白质上脱离的同时，能够简便地恢复蛋白质中的天然状态的高级结构。
文档编号C07K1/113GK102089319SQ20098012782
公开日2011年6月8日 申请日期2009年4月27日 优先权日2008年5月8日
发明者弓冈良辅, 江岛大辅 申请人:味之素株式会社