人c组轮状病毒样颗粒的表达和组装及其应用的制作方法

专利名称：人c组轮状病毒样颗粒的表达和组装及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及C组轮状病毒(group C rotaviruses, GpC RV)和轮状病毒样颗粒 (rotavirus-lik印articles)，生产免疫原性(immunogenic)轮状病毒样颗粒的方法，包括 轮状病毒样颗粒的免疫原性组合物(immunogenic compositions)和使用包括轮状病毒样 颗粒的免疫原性组合物激发免疫反应的方法，以及产生形成用于轮状病毒感染的诊断。
背景技术：
轮状病毒(Rotaviruses)是基于内源衣壳蛋白VP6的截然不同的特征分为A至G 组的各种病原体的组合。其中，GpC RV已被确定为人类的病原体并导致全世界小于3岁的 儿童(8，13，15，25，26，四，30)、青少年和成人(2，15，20，21，25，26，30，32)中胃肠炎的暴发 和散发病例。虽然一些研究已经报道在腹泻儿童中的低检出率(1，2，4，26，四)，血清流行病 学(seroprevalence studies)研究表明GpC RV是在成人中具有高得多的发生率的普通病 原体(4，6，10，20，27，31)。低GpC RV检测的一个可能的原因是无法获得足够的诊断工具。虽然PCR是一种 经常采用的技术，但是由于其衣壳蛋白的不稳定性和其RNA基因组的降解，用于诊断GpC RV它往往是不敏感的。对于许多涉及诊断来自肠胃炎的患者样本的检验科来说，它也不是 一种容易采用的技术。如果可以得到一种更加实用经济的工具，像GpC RV特异性酶免疫分 析(GpCRV-specific enzyme immunoassay, EIA)，就能够进行大量样本的检测以更好地评 估GpC RV疾病负担。Cowden病毒株(Cowden strain)，一种原始猪GpC RV,的繁殖已经成 功，并且针对该病毒的抗体已经用于GpC RV诊断(13，观，30，33，34)。然而，它们对人GpC RV的特异性和敏感性是有问题的。在研发一种用于人GpC RV的敏感的和特异的EIA中的 进展受阻于其在培养基中不易生长。为了规避GpC RV不易生长问题的现有技术问题，使用 杆状病毒系统将来自人GpC RV的VP6表达在昆虫细胞中，对该重组蛋白的抗体用于血清流 行病学研究(6，11，31)。据我们所知，这些试剂还没有用于人类样本的病毒检测，它们对于 GpC RV的特异性仍然是有问题的。GpC RV是儿童和成人中急性肠胃炎的导致原因，与A组RV截然不同。人A组RV 检测方法已经很好地确定并广泛可用的，而C组RV诊断只在少数参考实验室是可用的。由 于天然的人GpC RV是不稳定的，不能在细胞培养基中生长，已经使用来自动物的C组RV的 试剂用于诊断。然而，这些诊断工具对于人类病毒株可能是不足够敏感的或特异的。因此，用于人C组RV的敏感的和特异的检测方法不是现成可用的。因此，GpC RV疾病负担还没
有清楚确定。因此，存在对人特异性C组轮状病毒诊断的需要。还存在对使用在这样的诊断中 和作为疫苗激发免疫反应的人C组RV样颗粒的需要。

发明内容
根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，包括 人轮状病毒C组VP6蛋白和人轮状病毒C组VP7蛋白。在进一步的具体实施例中，提供了分 离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，包括人轮状病毒C组VP6蛋白、人轮状病毒C组VP7 蛋白和人轮状病毒C组VP2蛋白。根据某些具体实施例，本发明的分离的重组人轮状病毒C 组病毒样颗粒是没有其它人轮状病毒C组蛋白例如VP1、VP3、VP4、NSP1、NSP2、NPS3、NSP4、 NSP5、NSP6 禾口 NSP7。根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包 括包含SEQ ID No. 32的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP6蛋白。根据本发明的具体实施 例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包括包含SEQ ID No. 34的氨基酸序 列的人轮状病毒C组VP7蛋白。在特定具体实施例中，根据本发明的具体实施例，提供了分 离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包括包含SEQ ID No. 32的氨基酸序列的人轮状病 毒C组VP6蛋白和包含SEQ ID No. 34的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP7蛋白。根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包 括包含SEQ ID No. 1的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP2蛋白。在进一步的具体实施例中， 根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包括包含SEQ ID No. 32的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP6蛋白、包含SEQ ID No. 34的氨基酸序列的人 轮状病毒C组VP7蛋白和包含SEQ ID No. 1的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP2蛋白。根据本发明的具体实施例，提供了用于检测生物样本中人轮状病毒C组抗体的方 法，其包括用许多分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒接触第一生物样本，和检测在存 在第一生物样本中的抗人轮状病毒C组抗体和许多分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒 之间的复合物的形成，以获得指示抗人轮状病毒C组抗体存在的第一信号。根据本发明的具体实施例，提供了抗人轮状病毒C组疫苗，其包括和药学上可接 受的载体混合的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒。根据本发明的具体实施例，提供了输送货物部分至细胞的方法，其包括将货物部 分导入由分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒限定的内部空间中和将分离的重组人轮 状病毒C组病毒样颗粒和细胞接触。示例性的货物部分是标记、抗原、编码蛋白或肽的核酸序列和治疗剂。根据本发明的具体实施例，提供了抗人轮状病毒C组抗体检测试剂盒，其包括分 离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒和至少一种辅助试剂。可选地，病毒样颗粒附着至固 体基质。根据本发明的具体实施例，提供了免疫原性组合物，其包括这里描述的分离的重 组人轮状病毒C组病毒样颗粒和药学上可接受的载体。可选地，发明的免疫原性组合物包 括免疫佐剂。
根据本发明的具体实施例，提供了在人体中产生免疫反应的方法，包括对人施用 包含发明的人轮状病毒C组病毒样颗粒的免疫原性组合物。可选地，发明的方法包括施用 免疫原性组合物至粘膜表面。根据本发明的具体实施例，提供了分离的多肽，包括下列一种氨基酸序列a)具 有与SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少98%—致性的氨基 酸序列；b)具有与SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少99% 一致性的氨基酸序列；c) SEQ ID NO :1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)；或 d)SEQ IDNO :32中所示的氨基酸序列(Si VP6氨基酸序列)。根据本发明的具体实施例，提 供了分离的核酸分子，包括编码分离的多肽的核苷酸序列，分离的多肽包括下列一种氨基 酸序列a)具有与SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少98% 一致性的氨基酸序列；b)具有与SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序 列)至少99%—致性的氨基酸序列；c) SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基 酸序列)；或d)SEQ ID NO 32中所示的氨基酸序列(Si VP6氨基酸序列)。根据本发明的具体实施例，提供了免疫原性组合物，其包括包含SEQ ID NOS :1-13 的至少一种氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列是由抗体识别的抗原表位。可选地，这 种免疫原性组合物还包括在这里描述的病毒样颗粒。根据本发明的具体实施例，提供了对C组轮状病毒是特异的且不识别A组轮状病 毒的抗体。在特定的具体实施例中，根据本发明的具体实施例的抗体对SEQ ID NOS 3-13 的任意一种氨基酸序列是特异的且不识别A组轮状病毒。根据本发明的具体实施例，提供了分离的多肽，其包括SEQ ID NO :3或8的至少一 种氨基酸序列。根据本发明的具体实施例，提供了分离的核酸分子，包括编码分离的多肽的 核苷酸序列，分离的多肽包括SEQ ID NO :3或8的至少一种氨基酸序列。根据本发明的具体实施例，提供了包括分离的核酸分子的载体，核酸分子包括编 码分离的多肽的核苷酸序列，分离的多肽包括SEQ ID NO :3或8的至少一种氨基酸序列。 根据特定的具体实施例，提供了包括本发明的载体的分离的宿主细胞。根据本发明的具体实施例，提供了用于形成人C组轮状病毒样颗粒的方法，包括 构建包含核酸分子的第一载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP6衣壳蛋白的序列， 其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；构建包含核酸分子的第二载 体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP7衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋 白在昆虫细胞中表达的启动子；在促进VP6衣壳蛋白和VP7衣壳蛋白表达并结合以形成人 C组轮状病毒样颗粒的条件下，用所述第一和第二杆状病毒载体感染昆虫细胞培养物。在进 一步的具体实施例中，用于形成人C组轮状病毒样颗粒的方法包括构建包含核酸分子的第 三载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP2核心蛋白的序列，可操作地连接至启动所述 蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；和在促进VP6衣壳蛋白、VP7衣壳蛋白和VP2核心蛋白表 达的条件下，用所述第一杆状病毒载体、第二杆状病毒载体和第三杆状病毒载体感染昆虫 细胞培养物。


图IA是显示处于不同培养基中的Sf9细胞中GpC RV VP6和VP7表达动力学的电泳凝胶图像；图IB是显示处于不同培养基中的Hi5(B)细胞中GpC RV VP6和VP7表达动力学 的电泳凝胶图像；图2A是通过在用重组杆状病毒以MOI为1感染的Sf9细胞中表达的重组人轮状 病毒CVP2、VP6和VP7自我组装形成的人GpC RV VLPs的电子显微图像；图2B是通过在用重组杆状病毒以MOI为1. 4感染的Sf9细胞中表达的重组人轮 状病毒CVP6和VP7自我组装形成的人GpC RV VLPs的电子显微图像；图3A是显示来自GpA RV YK-I和人轮状病毒GpC VLPs的主要病毒结构蛋白的考 马斯亮蓝染色的图像；图;3B是显示来自GpA RV YK-I和人轮状病毒GpC VLPs的主要病毒结构蛋白比较 的免疫印迹的图像；图4A是显示用GpC特异性兔超免疫血清免疫染色的人GpC VLPs的免疫电子显微 图像；图4B是显示用GpA特异性兔超免疫血清免疫染色的人GpC VLPs的免疫电子显微 图像；图4C是显示用GpC特异性兔超免疫血清免疫染色的GpA RV的免疫电子显微图 像；图4D是显示用GpA特异性兔超免疫血清免疫染色的GpA RV的免疫电子显微图 像；图5是来自人病毒株ASP88的C组轮状蛋白VP2蛋白(SEQ ID N0:1);来自 “Bristol” 人病毒株的 C 组轮状蛋白 VP2 蛋白(SEQ ID NO 16，Accession CAC 44890)和 来自“Cowden”猪病毒株的C组轮状蛋白VP2蛋白(SEQ ID NO :17，Accession M74217)的 氨基酸序列比较；图6是编码用于发明的病毒株ASP88的人C组VP-2的序列(SEQ ID NO 18)；编 码用于“Cowden”猪病毒株的人C组VP-2的序列(SEQ ID NO 44)和编码用于Bristol的 人C组VP-2的序列(SEQ ID NO 19)的核苷酸序列比较；图7是编码用于发明的病毒株S-I的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO 18)与编码 用于传统的病毒株 Bristol 的人 C 组 VP-6 的序列(SEQ ID NO 25, Accession CAA42504)； 编码用于Jajeri的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO 26, Accession AAK26534)；编码用于 CMH004 的人 C 组 VP-6 的序列(SEQ ID NO :27，Accession ABR31794)；编码用于 V508 (SEQ ID NO 28, Accession AAX13496)的人C组VP-6的序列；编码用于China的人C组VP-6的 序歹丨J (SEQID NO 29, Accession BAB83829)；和编码用于 BCN6 的人 C 组 VP-6 的序列(SEQ ID NO 30, Accession CAJ41549)的核苷酸序列比较；图8是编码用于发明的病毒株S-I的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO 32)与编码 用于传统的病毒株 Bristol 的人 C 组 VP-6 的序列(SEQ ID NO 35, Accession CAA42504)； 编码用于Jajeri的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO :36，Accession AAK26534)；编码用于 CMH004 的人 C组 VP-6 的序列(SEQ ID NO 37, Accession ABR31794)；编码用于 V508 的人 C 组 VP-6 的序歹Ij (SEQ ID NO 38, Accession AAX13496)；编码用于 China 的人 C 组 VP-6 的序 列(SEQ ID NO 39, Accession BAB83829)；和编码用于 BCN6 的人 C 组 VP-6 的序列(SEQIDNO 40, Accession CAJ41549)的氨基酸序列比较；图9是来自S-I病毒株的人轮状病毒VP6蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO 46)，包 括开放读码框、5’和3’非编码序列；和图10是编码用于发明的病毒株S-I的人C组VP-6并包括5’和3’非编码序列的 序列(SEQID NO 46)和编码用于Bristol VP6的人C组VP-6并包括5，和3，非编码序列 的序列(SEQ IDNo. 47)的核苷酸序列比较。
具体实施例方式C组轮状病毒(Group C rotavirus, GpC RV)是儿童和成人中急性肠胃炎的病原 体。GpCRV的鉴定到目前只已经完成能在细胞培养基中生长的猪和牛病毒株。由于人GpC RVs是不稳定的，不能在细胞培养基中进行培养，因此，没有可用的试剂和灵敏的、特异性的 检测方法。因此，还没有清楚确定GpC RV对腹泻疾病的影响。这里证明的是主要的内和外人衣壳GpC蛋白VP6和VP7以及人GpC核心蛋白VP2 的表达和人GpC VP6/7病毒样颗粒(VLPs)或人GpC VP2/6/7VUs的自我组装。针对这些 人GpCRVVLPs的抗体显示与相应的GpC而不是GpARV的高特异的反应性。产生大量人GpC RV抗原材料例如人GpC RV蛋白和VLPs的能力和高质量抗体试 剂的可得性提供了敏感和特异的诊断分析方法和提供了用于研究人体中GpC RV的流行病 学和疾病负担的工具。本发明具有许多用途，包括但不限于检测生物样本中人轮状病毒C抗体、诊断人 轮状病毒C感染、确定以前或现在感染人轮状病毒C的个体、作为抗原用于产生抗体和用于 形成预防或治疗与人轮状病毒C感染有关的疾病的治疗物。依照本发明，可以使用本领域技术人员已知的各种技术和术语包括单不限于 常规分子生物学、微生物学、免疫学和重组DNA技术和术语。这些技术和术语详细描述 和 / 或定义在标准参考文献例如 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press,3rd Ed.,2001 ；F. Μ. Ausubel et al. , Eds. , Short Protocols inMolecular Biology,Current Protocols,Wiley,2002 ； Wild, D., The Immunoassay Handbook,3rd Ed. , Elsevier Science, 2005 ；Gosling, J. P., Immunoassays :A Practical Approach, Practical ApproachSeries, Oxford University Press, 2005 ；禾口 Harlow, E. and Lane, D. , Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 ；F. Breitling and S. Diibel, RecombinantAntibodies, John Wiley & Sons, New York,1999 ；H. Zola, Monoclonal Antibodies Preparation andUse of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Basics From Background toBench, BIOS Scientific Publishers,2000 ；B.K.C. Lo, Antibody Engineering :Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003 ；Crowther, J. R. , The ELISA Guidebook(Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2000 ；和在这里描述的其它参考文献。人轮状病毒C病毒样颗粒根据本发明，提供了人轮状病毒C病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)。术 语“病毒样颗粒”是指限定内部空间的衣壳。由衣壳限定的内部空间是“没有”完整的人轮状病毒C基因组，本发明的人轮状病毒C VLPs因此是不可复制的，并不能够导致人轮状病 毒C相关疾病。根据本发明的具体实施例，人轮状病毒C VUs包括人轮状病毒C VP6和VP7蛋白。 在本发明的进一步的具体实施例中，人轮状病毒C VLPs包括人轮状病毒C VP2、VP6和VP7蛋白。编码人轮状病毒C蛋白VP2、VP6和VP7的基因已被确定和测序。任何人C组RV VP6蛋白可以包括在本发明的人轮状病毒C VUs中。可以包括 在本发明的人轮状病毒C VLPs中的人C组RV VP6蛋白的例子包括来自人C组病毒株 S-1VP6(SEQID NO :32) ；Bristol 病毒株(SEQ ID NO 35,Accession CAA42504) Jajeri 病 毒株(SEQ ID NO 36, Accession AAK26534) ；CMH004 病毒株(SEQ ID NO :37，Accession ABR31794) ； V508 病毒株(SEQ ID NO 38, Accession AAX13496) ；China 病毒株(SEQ ID NO: 39,AccessionBAB83829)；和 BCN6 病毒株(SEQ ID NO :40, Accession CAJ41549)的 VP6 蛋 白。可以包括在人GpC RV VLPs中的人C组RV VP6蛋白包括那些已知为NCBI登录 号(Accession numbers) BAB83829、AAK26535、AAK26534、AAX13496, AAX13492、AAX1349U CAJ4155U CAJ41550、CAJ41549、AAW82662、AAW8266U ABD96606、ABD96605、ABD96604、 AAA47340、AAA47339、CAA42504、AAX08120、ABR31794、YP_392512、P69481、P69483 和 P69482 的蛋白。任何人C组RV VP7蛋白可以包括在本发明的人轮状病毒C VUs中。可以包括 在本发明的人轮状病毒C VLPs中的人C组RV VP7蛋白的例子包括那些已知为NCBI登录 号 BAB83828、AAX16188、AAX16187、AAX16186、CAJ41554、CAJ41553、CAJ41552、AAW82659、 AAD25388、BAA20340、BAA20339、AAQ93808、AAQ93807、AAA47352、BAF73591、BAF73590、 BAF73589、BAF73588、BAF73587、BAD20702, BAD2070U BAD20700, BAD20699、AAK26533、 AAK26530, ABR31795, BAC5388U BAC53880, BAC53879, BAC53878, BAC53877, BAC53876、 BAC53875、BAC53874、ABE01860、ABE01859、ABE01858、AAF33400、AAF33399、AAF33398、 AAF33397, AAF33396, AAF33395, AAF33394, AAF33393, AAF33392, AAF3339U AAF33390, AAF33389、BAA33952、P30216、AB025864 和 2209225A 的蛋白。任何人C组RV VP2蛋白可以包括在本发明的人轮状病毒C VUs中。可以包括 在本发明的人轮状病毒C VUs中的人C组RV VP2蛋白的例子包括人C组病毒株ASP88 VP2 (SEQ IDNO 1)；和 Bristol 病毒株(SEQ ID NO 16，Accession CAB52753)的蛋白。除了这些VP2、VP6和VP7氨基酸序列，术语VP2、VP6或VP7氨基酸序列包括变 体。在特定的具体实施例中，包括在本发明的VLP组合物中的氨基酸序列，VP2，是ASP88 VP2 (SEQ ID No. 1)的变体。在进一步的具体实施例中，包括在本发明的VLP组合物中的氨 基酸序列，VP6，是S-I VP6 (SEQ ID No. 32)的变体。在进一步的具体实施例中，包括在本发 明的VLP组合物的氨基酸序例，VP7，是S-I VP7 (SEQ ID No. 34)的变体。在另一方面，本发明提供了轮状病毒样颗粒，具有病毒株ASP88蛋白(SEQ ID NO 1)或其片段或变体的人C组RV的核心VP2结构蛋白。在另一方面，本发明提供了轮状病毒样颗粒，包括VP6衣壳蛋白和VP7衣壳蛋白， 或它们的片段或变体，条件是所述颗粒不包括(SEQ ID N0:16 ；Bristol)中所示的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供了分离的多肽，包括选自下列氨基酸序列组成的组中的 氨基酸序列a)具有与SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少 98%—致性的氨基酸序列；b)具有与SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基 酸序列)至少99%—致性的氨基酸序列；c) SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2 氨基酸序列)；或d)SEQ ID NO 32中所示的氨基酸序列(Si VP6氨基酸序列)。在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，包括编码在这里描述的发明的多肽 的一种或更多种的核苷酸序列。在某些具体实施例中，本发明提供了编码VP2的分离的核 酸分子，选自由下列核酸分子组成的组a)编码具有与SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列 (ASP88 VP2氨基酸序列)至少98%—致性的发明的多肽的分离的核酸分子；b)编码具有 与SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少99% —致性的发明的 多肽的分离的核酸分子；c)编码SEQ ID N0:1(ASP88 VP2氨基酸序列)中所示的发明的多 肽的分离的核酸分子；或d)编码SEQ ID N0:32(S-1 VP6氨基酸序列)中所示的发明的多 肽的分离的核酸分子。在另一方面，本发明提供了免疫原性组合物，包括含有至少-的多肽LETIIDKEVK ENKDSTKDEK LVVTEESNGD VTA (SEQ ID NO 2),LETIINKEVK ENKDSMKEDK LVVTEESNGD VTT (SEQ ID NO :3)，TENVEEKEIK EAKEQVKDEK QVITEENVDS PKD(SEQ ID NO :4)，KLTEIQESSA KTYNTLFRLF TP(SEQ ID NO :5)，NYRNSRIKCQ TYNKLFRL(SEQ ID NO :6)，LNVLEG MPDYIMLRDM AV(SEQ ID NO :7)，LNVLEE MPDYIMLRDM AV (SEQ ID NO :8)，LNVLDE MPDYVMLRDM AV(SEQ ID NO :9)，AAHLQLE AITVQVESQF LAGISAAAAN EA(SEQ ID NO :10)，LQCKLNH NSffQELVHGR NE(SEQ ID NO :11)，LSACIVMNMH LVG(SEQ ID NO: 12)，禾口IPPDQMYRLR NRLRNIP(SEQ ID NO :13)；其中，所述氨基酸序列是由抗体识别的抗原表位。在另一方面，本发明提供了识别一种下列氨基酸的抗体制剂LETIIDKEVK ENKDSTKDEK LVVTEESNGD VTA(SEQ ID NO :2)，LETIINKEVK ENKDSMKEDK LVVTEESNGD VTT(SEQ ID NO :3)，TENVEEKEIK EAKEQVKDEK QVITEENVDS PKD(SEQ ID NO :4)，KLTEIQESSA KTYNTLFRLF TP(SEQ ID NO :5)，NYRNSRIKCQ TYNKLFRL(SEQ ID NO :6)，LNVLEG MPDYIMLRDM AV(SEQ ID NO :7)，LNVLEE MPDYIMLRDM AV(SEQ ID NO :8)，LNVLDE MPDYVMLRDM AV(SEQ ID NO :9)，AAHLQLE AITVQVESQF LAGISAAAAN EA(SEQ ID NO :10)，
-种下列氨基酸序列
LQCKLNH NSffQELVHGR NE(SEQ ID NO: 11)，LSACIVMNMH LVG(SEQ ID NO: 12)，禾口IPPDQMYRLR NRLRNIP(SEQ ID NO :13).在另一方面，本发明提供了包括在这里描述的发明的核酸分子的载体。在另一方面，本发明提供了包括在这里描述的发明的载体的一种或更多种的分离 的宿主细胞。发明的方法和组合物不限于具有在这里详细描述的氨基酸序列的VP蛋白和多 肽。可以使用合适的变体例如来自其它病毒株或组的类似物。如在这里所使用的，术语“变体”定义为或者是人轮状病毒C病毒的自然发生的遗 传突变体或者是人轮状病毒C病毒的重组制备的变体，与对照人轮状病毒C VP2、VP6或VP7 相比，每一个在其基因组中含有一个或更多个突变。术语“变体”也可指或者是特定肽的自 然发生的变体或者是特定肽或蛋白的重组制备的变体，其中一个或更多个氨基酸残基已经 通过氨基酸替换、增加或删除进行改变。优选的是具有与SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 32 或 SEQ ID No. 34 至少 95%、96%、 97%、98%或99%—致性的人轮状病毒C蛋白。更优选的是具有与SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 32或SEQ ID No. 34 一致性99%或更高的人轮状病毒C蛋白。突变可以通过标准的分子生物学技术例如定点突变和PCR介导的突变引入。本领 域技术人员将认识到可以引入一个或更多个氨基酸突变，而不改变人轮状病毒C VP2、VP6 或VP7蛋白的功能特性。本领域技术人员还认识到VP蛋白和多肽变体包括在这里详细列出的VP蛋白和 多肽的氨基酸序列中保守氨基酸替换。可以在人轮状病毒C VP2、VP6或VP7蛋白中进 行保守氨基酸替换以产生人轮状病毒C VP2、VP6或VP7变体。保守氨基酸替换是本领 域已知的一种氨基酸代替另一种具有相似特性的氨基酸。例如，每种氨基酸可以描述为 具有下列特征的一个或更多个带正电的、带负电的、脂肪族的、芳香族的、极性的、疏水 的和亲水的。保守替换是一种具有特定结构或功能特性的氨基酸替换另一种具有相同 特性的氨基酸。酸性氨基酸包括天门冬氨酸(aspartate)、谷氨酸(glutamate)；碱性氨 基酸包括组氨酸Oiistidine)、赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)；脂肪族氨基酸包括 异亮氨酸(isoleucine)、亮氨酸(leucine)和缬氨酸(valine)；芳香族氨基酸包括苯丙 氛酸(phenylalanine)、甘氛酸(glycine)、酷氛酸(tryosine)禾口色氛酸(tryptophan)； 极性氨基酸包括天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺(asparagine)、谷氨酰胺 (glutamine)、精氨酸、丝氨酸(sercine)、苏氨酸(threonine)和酪氨酸；和疏水氨基酸包 括丙氨酸(alanine)、半胱氨酸(cysteine)、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸 (methionine)、脯氨酸(proline)、缬氨酸和色氨酸；保守氨基酸替换包括在每个组中氨基 酸之间的替换。氨基酸也可用相对大小描述，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、天冬氨 酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸，所有这些氨基酸通常被认为是小的。人轮状病毒C VP2、VP6或VP7变体可以包括合成的氨基酸类似物、氨基酸衍 生物和/或非标准氨基酸，示例性地包括但不限于α-氨基丁酸(alpha-aminobutyric acid)、瓜氨酸(citrulline)、刀豆氨酸(canavanine)、氰丙氨酸(cyanoalanine)、二氨基 丁酸(diaminobutyricacid)、二氨基庚二酸(diaminopimelic acid)、二轻基-苯丙氨酸(dihydroxy—phenylalanine)、今可豆M酸(djenkolic acid) >MffMSt (homoarginine) > 轻脯氨酸(hydroxyproline)、正亮氨酸(norleucine)、正缴氨酸(norvaline)、3_磷酸丝氨 酸(3-phosphoserine)、高丝氨酸(homoserine)、5_ 轻基色氨酸(5-hydroxytryptophan) > 1-甲基组氨酸(l-methylhistidine)、3-甲基组氨酸(3-methylhistidine)和鸟氨酸 (ornithine)。此外，本领域技术人员可理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸将编码相同的蛋 白。因此，编码VP蛋白和多肽的核酸或其变体的核酸不限于在这里详细描述的那些核酸。具有与在这里详细描述的氨基酸序列95 %、96 %、97 %、98 %或99 %同源性的VP 蛋白和多肽变体在所描述的方法和组合物中是可操作的。具有与在这里详细描述的核苷酸 序列95 %、96 %、97 %、98 %或99 %同源性的核酸变体在所描述的方法和组合物中是可操 作的。“同源性(homology)”指在两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个多肽 序列之间的序列相似性(sequence similarity)或，可选择地，序列一致性(sequence identity)。术语“一致性百分率(percentidentity)，，和“ ％—致性(％ identity) ”，如应用 于多核苷酸序列，指的是在使用标准算法比对的至少两个多核苷酸序列之间相同核苷酸匹 配的百分率。这种算法可以以标准化的和可重复的方式在比较的序列中插入间隔(gap)，以 优化两序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。多核苷酸序列之间的一致性百分率可以使用本领域已知的或这里描述的一个或 更多个计算机算法或程序进行确定。例如，一致性百分率可以通过使用如整合进MEGALIGN 版本3. 1 序列对比程序中的CLUSTAL V算法的默认参数进行确定。这个程序是LASERGENE 软件包，一套分子生物学分析程序(DNASTAR，Madison Wis.)，的部分。CLUSTAL V描述在 Higgins, D. G. and P. Μ. Sharp (1989 ； CAB I OS 5:151-153)和 Higgins，D. G. et al. (1992 ； CABI0S8 :189-191)中。对于多核苷酸序列的两两比对，默认的参数设置如下Ktuple = 2， gap penalty = 5, window = 4，禾口 "diagonals saved，，= 4。 “力口权的(weighted) ” 残基量 表选定为默认值。可选择地，可以使用的一套常用的和免费可得的序列比较算法由美国国家生物技 术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)碱基局部对比 检索工具(Basic LocalAlignment Search Tool, BLAST) (Altschul, S. F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410)提供，其可从几种来源得到，包括美国国家生物技术信息中心 (NCBI, Bethesda, Md.)，和在互联网上可得的NCBI万维网站点。BLAST软件套件包括各 种序列分析程序，包括用于对比已知的多核苷酸序列和来自各种数据库的其它多核苷酸 序列的“Blastn，”。还可得到的是用于两个核苷酸序列的直接两两比较的称为“BLAST 2 kquences”的工具。还可以在互联网上通过NCBI万维网站点交互式访问和使用“BLAST 2 Sequences'^ "BLAST 2 kquences” 工具可以用于 blastn 和 blastp (下面讨论)。BLAST 程序通常用设置成默认设置的gap和其它参数进行使用。例如，要比较两个核苷酸序列，人 们可以用设置成默认参数的“BLAST 2 kquences”版本2.0. 12^000年4月21日)使用 blastn。这种默认参数可以是，例如Matrix :BL0SUM62 ；Reward for match :1 ；Penalty for mismatch :_2 ； Open Gap :5 禾口 Extension Gap :2 penalties ； Gap χ drop-off :50 ；Expect 10 ；Word Size :11 ；Filter :on。一致性百分率可以基于例如由特定SEQ ID号限定的整个限定序列的长度进行测 定，或可以基于更短的长度进行测定，例如，基于来自更长的限定的序列的片段的长度，例 如至少20、至少30、至少40、至少50、至少70、至少100或至少200个连续核苷酸的片段。 这样的长度只是示例性的，可理解可以使用在这里，在表格、图或序列表中显示的序列支持 的任何片段长度，以描述一种长度，一致性百分率可以基于该长度进行测定。词语“一致性百分率”和“％—致性”，如应用于多肽序列，指的是在使用标准算 法比对的至少两个多肽序列之间的相同残基匹配的百分率。多肽序列比对的方法是已知 的。一些比对方法考虑保守氨基酸替换。这种保守替换，如在上面更详细解释的，通常在 代替位点保持电荷和疏水性，从而保持多肽的结构(以及因此功能)。词语“相似性百分率 (percent similarity) ”和“ ％相似性(％ similarity) ”，如应用于多肽序列，指的是残基 匹配的百分率，包括在使用标准算法比对的至少两个多肽序列之间的相同残基匹配和保存 替换。相比之下，保守替换没有包括在多肽序列之间一致性百分率的计算中。多肽序列之间一致性百分率可以通过使用如整合进MEGALIGN版本3. 12e序列对 比程序(描述在上面并参考上面)中的CLUSTAL V算法的默认参数进行确定。对于使用 CLUSTALV进行的多肽序列的两两比对，默认的参数设置如下Ktuple = 1，gap penalty = 3，window = 5，和 “diagonals saved” = 5。PAM250 矩阵选定为默认残基量表。可选择地，可以使用NCBI BLAST软件套件，例如，对于两个多肽序列的两两比较， 人们可以用设置成默认参数的“BLAST 2 kquences”工具版本2.0. 12Q000年4月21日) 使用 blastp。这种默认参数可以是，例如:Matrix :BL0SUM62 ；Open Gap :11 和 Extension Gap :lpenalties ；Gap χ drop-off :50 ；Expect :10 ；Word Size :3 ；Filter :on。一致性百分率可以基于例如由特定SEQ ID号限定的整个限定多肽序列的长度进 行测定，或可以基于更短的长度进行测定，例如，基于来自更长的限定的多肽序列的片段的 长度，例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片 段。这样的长度只是示例性的，可理解可以使用在这里，在表格、图或序列表中显示的序列 支持的任何片段长度，以描述一种长度，一致性百分率可以基于该长度进行测定。此外，蛋白和多肽和它们的变体的片段可以包括在本发明的方法和组合物中，只 要该片段在影响相关的普通技术人员理解的生物活性方面是可操作的。因此，例如，片段包 括VP2蛋白和多肽的片段；当在昆虫细胞培养物中和V6和VP7蛋白或多肽、或它们的变体 或片段一起表达时，片段包含在病毒样颗粒中。因此，例如，片段包括VP6蛋白和多肽的片 段；当在昆虫细胞培养物中和VP7蛋白或多肽、或其变体或片段一起表达时，片段包含在病 毒样颗粒中。因此，例如，片段包括VP7蛋白和多肽的片段；当在昆虫细胞培养物中和VP6 蛋白或多肽、或其变体或片段一起表达时，片段包含在病毒样颗粒中。片段还包括影响在这 里描述的用于VP蛋白、多肽或变体的免疫应答的片段。用于制备VLPs的方法描述在在这里描述的组合物和方法中的VP2核心蛋白和VP6和VP7衣壳蛋白和多 肽(VP蛋白和多肽)可以通过重组方法如这里描述的发明方法或在适当情况下通过本领域 技术人员已知的适当的表达方法产生。编码VP蛋白和多肽的核酸序列是分离的，如通过在 这里描述的核酸序列举例说明的。
根据本发明的具体实施例，采用重组核酸技术制备VLPs。VUs产生包括将包括编 码人轮状病毒C VP2、VP6和/或VP7的DNA序列的重组表达载体导入宿主细胞。导入宿主细胞以产生人轮状病毒C VLPs的编码人轮状病毒C VP2、VP6或VP7的 具体核酸序列是可理解，由于遗传密码的简并性，可选择的核酸序列编码人轮状病毒C VP2、VP6或 VP7及其变体，而且这种可选择的核酸可以包括在表达载体中并表达以产生本发明的人轮 状病毒C VLPs。在本发明的具体实施例中，核酸序列，其与编码人轮状病毒C VP6的SEQ ID No. 3USEQID NO 46或SEQ ID No. 48是基本相同的，包含在表达载体中并表达以产生本发 明的人轮状病毒C VLPs0在本发明的进一步的具体实施例中，核酸序列，其与编码人轮状 病毒C VP7的SEQ ID No. 33是基本相同的，包含在表达载体中并表达以产生本发明的人轮 状病毒CVLPs。在本发明的进一步的具体实施例中，核酸序列，其与编码人轮状病毒C VP2 的SEQ IDNo. 18、SEQ ID No. 42或SEQ ID No. 43是基本相同的，包含在表达载体中并表达 以产生本发明的人轮状病毒C VLPs0与SEQ ID No. 31或SEQ ID NO :46基本相同的核酸序列的特点是具有能够在高严 谨杂交条件下与SEQ ID No. 31、SEQ ID NO 46或SEQ ID No. 48杂交的互补核酸序列。同 样，与 SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 42 或 SEQ ID No. 43 基本相同的核酸序列 的特点是具有能够在高严谨杂交条件下与SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 42或 SEQ IDNo. 43分别杂交的互补核酸序列。术语“核酸”是指处于包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸的任何形式的具有两 个以上核苷酸的RNA或DNA分子。术语“核苷酸序列“是指在寡核苷酸或多核苷酸中处于 核酸单链形式的核苷酸顺序。所谓“互补“是指核苷酸之间沃森-克里克碱基配对，特别是指核苷酸氢键通过胸 腺嘧啶或尿嘧啶残基经两个氢键连接至腺嘌呤残基以及胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢 键连接而相互连接。通常，核酸序列包括描述为具有与特定的第二核苷酸序列“互补百分 率(percentcomplementarity) ”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以具有与特定的第二 核苷酸序列80%、90%或100%互补性，表明序列的10个核苷酸的8个、9个或10个与特定 的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3' -TCGA-5'是与序列5' -AGCT-3' 100%互 补的。此外，核苷酸序列3' -TCGA-是与核苷酸序列5' -TTAGCTGG-3'的一个区域100% 互补。术语“杂交(hybridization)”和“杂交(hybridizes) ”是指互补核酸的配对和 结合。杂交在两核酸之间发生不同程度依赖于因素，例如，如本领域已知的核酸的互补 程度、核酸的变性温度Tm和杂交条件的严谨性。术语“杂交条件的严谨性(stringency of hybridizationconditions)”是指温度、离子强度和关于特定的共同添加剂例如甲酰 胺和Denhardt’ s溶液的杂交介质组成的条件。与特定核酸有关的特定杂交条件的的 确定是常规的，是本领域已知的，例如，如在J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press ；3rd Ed. ,2001 ； 禾口 F. Μ· Ausubel, Ed. , Short Protocols in MolecularBiology, Current Protocols ；5th Ed.，2002中所描述的。高严谨杂交条件是那些只允许基本互补核酸杂交的条件。通常，具有大约85-100%互补性的核酸被认为是高度互补的，在高严谨条件下杂交。中度严谨条件 通过具有中等互补性约50-84%互补性的核酸和那些具有高程度互补性的核酸杂交的条件 进行举例说明。相比之下，低严谨杂交条件是那些具有低程度互补性的核酸杂交的条件。术语“特异性杂交(specifichybridization) ” 和“特异地杂交(specifically hybridizes) ”是指特定核酸与靶标核酸的杂交，而不是基本杂交至除靶标核酸之外的核 酸。杂交和洗涤条件的严谨性取决于几个因素，包括探针和靶标的Tm值和杂交和洗 涤条件的离子强度，如本领域技术人员熟知的。实现期望的杂交严谨性的杂交和条件描 述在，例如，&imbrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 ；禾口 Ausubel, F. et al., (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology，Wiley，2002 中。高严谨杂交条件的例子是长度超过大约100个核苷酸的核酸在含有6X SSC、 SXDenhardt' s溶液、30%甲酰胺和100微克/毫升变性鲑鱼精的溶液中在37°C过夜杂交， 然后在0. IX SSC和0. SDS的溶液中60°C洗涤15分钟。SSC是0. 15M NaCl/0. 015M柠 檬酸钠。Denhardt，s溶液是0.02%牛血清/0.02% FIC0LL/0. 02%聚乙烯吡咯烷酮。在高 严谨条件下，SEQID No. 31、SEQ ID No. 33和SEQ ID No. 18将杂交至基本相同靶标的互补 链，而不是无关的序列。术语“表达载体”是指将编码一个或更多个人轮状病毒C蛋白的DNA序列导入在 其中DNA序列表达以产生该一个或更多个人轮状病毒C蛋白的宿主细胞的重组载体。在特定的具体实施例中，编码一个或更多个人轮状病毒C蛋白的DNA序列包括编 码该一个或更多个人轮状病毒C蛋白的开放读码框。在进一步的具体实施例中，除了编码该一个或更多个人轮状病毒C蛋白的开放阅 读框外，还存在5'非编码序列和/或3'非编码序列。优选地，其中存在5'非编码序列和 /或3'非编码序列，与编码该一个或更多个人轮状病毒C蛋白的开放阅读框相连接，5'非 编码序列，如果有的话，位于起始密码子的上游(5' )，3'非编码序列，如果有的话，位于 终止密码子的下游(3 ‘)。在特定的具体实施例中，包括SEQ ID No. 42或基本相同的核酸序列的表达载体表 达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP2和自我组装的VLPs。SEQ ID No. 42 包括编码来自病毒株Asp88的人轮状病毒C VP2的开放阅读框。可选地，来自病毒株Asp88 的人轮状病毒C VP2的5'非编码序列和/或3'非编码序列包括在表达载体中。例如，可 以包含5'非编码序列的1-36个核苷酸，与编码来自病毒株Asp88的人轮状病毒C VP2的 核苷酸序列的5’端相连。在特定的具体实施例中，包括SEQ ID No. 18或基本相同的核酸序 列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP2和自我组装的VLPs。 在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No. 43或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在 含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP2和自我组装的VLPs。在另外的具体实施例中，包括SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48或基本 相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6和自我 组装的VUs。在另外的具体实施例中，包括SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 45或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP7和自我组装的VLPs。在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48或基 本相同的核酸序列和SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 45或基本相同的核酸序列的表达载体表达 以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6、人轮状病毒C VP7和自我组装的VLPs。在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48 或 基本相同的核酸序列和SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 45或基本相同的核酸序列和SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 43或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达 载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6、人轮状病毒C VP7、人轮状病毒C VP2和自我组装的 VLPs0在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48或基 本相同的核酸序列的第一表达载体和包括SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 45或基本相同的核酸 序列的第二表达载体均表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6、人轮状病 毒CVP7和自我组装的VLPs。在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48或基 本相同的核酸序列的第一表达载体和包括SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 45或基本相同的核酸 序列第二表达载体和包括SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 43或基本相同的核酸 序列的第三表达载体均表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6、人轮状病 毒CVP7、人轮状病毒C VP2和自我组装的VLPs。除了编码人轮状病毒C的一个或更多个DNA序列外，编码其它蛋白的一个或更多 个DNA序列可以包括在表达载体中。例如，这些其它的蛋白包括非人轮状病毒C蛋白例如报 告蛋白，包括但不限于半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和抗生素抗性报告蛋白；以及抗原。
表达载体在本领域是已知的，包括质粒和病毒，例如，表达载体含有包括编码感兴 趣多肽的片段的DNA分子，其中片段可操作地连接至一个或更多个提供用于编码感兴趣的 蛋白的片段的转录的调控元件。这些调控元件包括单不限于启动子、终止子、增强子、复制 子(origins of replication)禾口多聚腺苷酸信号(polyadenyIation signals)。在特定的具体实施例中，重组表达载体编码SEQ ID No. 1的人轮状病毒C VP2、与 SEQID No. 1具有至少95% —致性的蛋白、SEQ ID No. 42编码的蛋白或由与SEQ ID No. 42 基本相同的核酸序列编码的蛋白。在特定的具体实施例中，重组表达载体编码SEQ ID No. 32的人轮状病毒C VP6、与 SEQID No. 32具有至少95% —致性的蛋白、SEQ ID No. 31编码的蛋白或由与SEQ ID No. 31 基本相同的核酸序列编码的蛋白。在特定的具体实施例中，重组表达载体编码SEQ ID No. 34的人轮状病毒C VP7、 与SEQID No. 34具有至少95% —致性的蛋白、SEQ ID No. 33或SEQ ID No. 45编码的蛋白 或由与SEQ ID No. 33或SEQ ID No. 45基本相同的核酸序列编码的蛋白。在进一步的具体实施例中，重组表达载体编码SEQ ID No. 32的人轮状病毒C VP6、 与SEQ ID No. 32具有至少95% —致性的蛋白、SEQ ID No. 31编码的蛋白或由与SEQ ID No. 31基本相同的核酸序列编码的蛋白；和SEQ ID No. 34的人轮状病毒C VP7、与SEQ ID No. ；34具有至少95% —致性的蛋白、SEQ ID No. 33或SEQ ID No. 45编码的蛋白或由与SEQ ID No. 33或SEQ ID No. 45基本相同的核酸序列编码的蛋白。
本发明的优选的表达载体是杆状病毒。由重组表达载体编码的人轮状病毒C VP2、VP6和/或VP7的表达是通过将表达 载体导入真核或原核宿主细胞表达系统如昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或 本领域知道的其它单或多细胞生物实现的。在优选的具体实施例中，使用了真核宿主细胞。 宿主细胞可选地是原代细胞或永生化衍生细胞。永生化细胞是那些可以在体外保持至少5 次复制传代的细胞。含有重组表达载体的宿主细胞在人轮状病毒C蛋白产生的条件下维持。人轮状病 毒C蛋白自我结合以在宿主细胞中产生本发明的VLPs。本发明提供了含有根据本发明的核酸序列的宿主细胞。宿主细胞可以使用已知 的例如描述在 Celis，Julio，ed.，1994，Cell Biology Laboratory Handbook，Academic Press, N. Y.中的细胞培养技术进行培养和维持。可以由本领域技术人员选择和优化用于 这些细胞的各种培养条件，包括关于特定营养物、氧气、张力、二氧化碳和减少的血清水平 的培养基制剂。本发明的优选细胞系是真核细胞系，优选是瞬时或稳定表达一个或更多个完整长 度或部分人轮状病毒C蛋白的昆虫细胞系，如Sf9或Hi5。这种细胞可以通过转染(蛋白或 核酸载体)、感染(病毒载体)或转导(病毒载体)形成。在本发明中使用的细胞系使用本 领域技术人员熟知的已知的细胞培养技术进行克隆。这些细胞通过使用市售可得的培养基 在适于增殖细胞的已知条件下进行培养和从单个细胞进行扩增。 在优选的具体实施例中，人轮状病毒C VLPs通过用编码人轮状病毒C蛋白的至少 一个重组杆状病毒感染宿主细胞而产生。可理解，单个杆状病毒可以编码或者单个人轮状病毒C蛋白或者多个人轮状病毒 C蛋白。然后由此产生的感染细胞在来自各自的重组杆状病毒的编码的人轮状病毒C蛋白 产生和自我组装以形成衣壳的条件下进行培养。然后由此产生的人轮状病毒C VUs可选 地和优选地得到分离。在进一步的优选具体实施例中，重组杆状病毒编码至少SEQ ID No. 32的人轮状病 毒CVP6、与SEQ ID No. 32具有至少95% —致性的蛋白、SEQ ID No. 31编码的蛋白或由与 SEQID No. 3USEQ ID NO 46或SEQ ID No. 48基本相同的核酸序列编码的蛋白；和SEQ ID No. 34的人轮状病毒C VP7、与SEQ ID No. 34具有至少95% —致性的蛋白、SEQ ID No. 33 或SEQ ID No. 45编码的蛋白或由与SEQ ID No. 33或SEQ ID No. 45基本相同的核酸序列 编码的蛋白。在进一步的可选择方案中，重组杆状病毒编码SEQ ID No. 1的人轮状病毒C VP2、 与SEQID No. 1具有至少95% —致性的蛋白、SEQ ID No. 42编码的蛋白或由与SEQ ID No. 42 基本相同的核酸序列编码的蛋白。本领域已知的任何合适的杆状病毒在本发明方法中都是可操作的。优选地，杆状 ^1 '!!!! ! ^^^^! (Autographa California nuclear polyhedrosis virus)ο用于采用杆状病毒感染细胞的方法是本领域已知的。宿主细胞感染之后，本发明 方法在条件下培养宿主细胞以便产生的蛋白自我组装形成VLPs。本发明的VLP可选地包括接触或结合至人轮状病毒C蛋白VP2、VP6或VP7的至少一个的非人轮状病毒C蛋白或肽。非人轮状病毒C蛋白或肽的结合通过例如包括编码VP2、 VP6或VP7和非人轮状病毒C蛋白或肽的核酸序列的融合构建体的表达实现。因此，非人轮 状病毒C蛋白或肽可选地是融合蛋白或肽，其中非人轮状病毒C蛋白是作为单个多肽链和 人轮状病毒C结构蛋白一起合成的。非人轮状病毒C蛋白可选地与谷胱甘肽硫转移酶(glutathione-S-transferase， GST)融合用于快速分离。人轮状病毒C蛋白也可选地与GST融合。化学结合方法可选地用于结合VLP和非人轮状病毒C蛋白或肽，示例性地包括使 用交联剂如碳二亚胺(carbodiimide)或戊二醛(glutaraldehyde)的反应。在特定的具体实施例中，包括在VLP中的非人轮状病毒C蛋白或肽包括一个或更 多个抗原表位，以便VLP用于提供一个或更多个抗原表位给对象的免疫系统以诱导抗体产 生。在进一步的可选择方案中，非人轮状病毒C蛋白或肽是靶标部分例如受体配体或 受体。靶标部分包含在VLP中以将VLP导向靶标，例如特定的细胞类型。在宿主细胞中产生的人轮状病毒C VUs可选地是分离的。涉及人轮状病毒C VLPs 的术语“分离的(isolated)”描述了人轮状病毒C VLP，其是从产生人轮状病毒C VLP的细 胞分离的，并基本上没有不打算与人轮状病毒C VLP连接的宿主细胞组分。通常，人轮状病 毒CVUs从宿主细胞的整个细胞抽提物中分离。分离VLPs的许多方法是本领域已知的，并 可应用于人轮状病毒C VLPs的分离，示例性地包括连续和不连续蔗糖梯度、氯化铯单和多 密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法(size-exclusion chromatography)、抗原捕获层析、亲 和层析或其它本领域已知的合适的方法。用于分离本发明的人轮状病毒C VLPs的示例性 的方法描述在 Gillock，ET. et al, 1997. J. Virol. ,71 :2857-2865 中。具有不同组合物的人轮状病毒C VLPs，也就是说，人轮状病毒C VLPs的不同类型 可选地存在本发明的组合物中。例如，包括人轮状病毒C VP2的人轮状病毒C VUs可选地 包含在带有包括非人轮状病毒C蛋白或肽和/或含有货物部分的人轮状病毒C VLPs的抗 原呈现人轮状病毒C VLPs的组合物中。在一方面，本发明提供了制备人C组轮状病毒样颗粒的方法，包括构建包括核酸 分子的第一杆状病毒载体，核酸分子包括编码人C组RV VP6衣壳蛋白的序列，其可操作地 连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的杆状病毒启动子；构建包括核酸分子的第二杆状 病毒载体，核酸分子包括编码人C组RV VP7衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述 蛋白在昆虫细胞中表达的杆状病毒启动子；和用所述第一和第二杆状病毒载体在促进VP6 和VP7衣壳蛋白表达的条件下感染昆虫细胞培养物。在本发明的具体实施例中，该方法还包括构建包括核酸分子的第三杆状病毒载 体，核酸分子包括编码人C组RV VP2衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在 昆虫细胞中表达的杆状病毒启动子；和用所述第一、第二和第三杆状病毒载体在促进VP6、 VP7和VP2衣壳蛋白表达的条件下感染昆虫细胞培养物。在另一方面，本发明提供了由这里描述的发明方法制备的轮状病毒样颗粒。含有在这里描述的VP蛋白的片段的病毒样颗粒可以由任何上面描述的用于制备 人C组轮状病毒样颗粒的方法形成，并还包括构建包括核酸分子的第三杆状病毒载体，核 酸分子包括编码核心蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的杆状病毒启动子；用所述第一、第二和第三杆状病毒载体在促进VP6和VP7衣壳蛋白和VP2核 心蛋白表达的条件下感染昆虫细胞培养物。在本发明的具体实施例中，核心蛋白是ASP 88病毒株的C组VP2蛋白。通常从细胞培养物上清获得轮状病毒颗粒，用于包括在含有疫苗组分的免疫原性 组合物。轮状病毒颗粒可以例如通过过滤和/或离心从细胞培养物上清分离。分离的轮状 病毒颗粒可选择地进行冻干，例如用于以后在药学上可接受的载体中重悬浮。药物组合物和方法药物组合物和方法根据本发明，提供了疫苗及用于它们的在对象中诱导主动免疫和保护免得人轮状 病毒诱导的疾病的用途的方法。在特定的具体实施例中，人轮状病毒C VUs作为抗原进行施用用于预防或治疗人 轮状病毒C感染，例如通过作为活性疫苗成分，或通过在宿主生物体中引发免疫反应。疫苗 输送可以发生在人轮状病毒C感染宿主生物体或病人之前或之后。疫苗可选地包含一种或 更多种佐剂、防腐剂或其它药学上可接受的载体。在特定的具体实施例中，疫苗组合物包括与药学上可接受的载体混合的一种或更 多种人轮状病毒C VLP。术语“药学上可接受的载体”是指对对象基本无毒并对包括在疫苗组合物中的人 轮状病毒C VUs基本惰性的载体。药学上可接受的载体形态上是固体的、液体的或凝胶的 并通常是无菌和无热原的。本发明的免疫原性组合物可以是适于施用至对象的任何形式。免疫原性组合物通过任何合适的施用途径包括口服和非肠道例如静脉的、皮内 的、肌肉的、腹腔的、黏膜的、鼻的或皮下的施用途径进行施用。例如，用于非肠道施用的免疫原性组合物可以制成包括轮状病毒和药学上可接受 的载体的可注射液体制剂。合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇例如丙二 醇、聚乙二醇、甘油醇等等、它们的合适的混合物；植物油如橄榄油；以及可注射的有机脂 例如油酸二酯。例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过分散液情况下保持期望的颗粒大小，和/ 或通过使用表面活性剂，如十二烷基硫酸钠，可以保持适当的流动性。可选地包括稳定剂， 例如，EDTA, EGTA和抗氧化剂。用于施用或用于在施用前悬浮在液体中的固体制剂示例性地包括胶囊、片剂、粉 剂和颗粒剂。在这种固体制剂中，轮状病毒颗粒混合至少一种载体，示例性地包括缓冲液 例如，举例来说，柠檬酸钠或碱金属磷酸盐示例性地包括磷酸钠、磷酸钾和磷酸钙；填充 物例如，举例来说，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；粘合剂例如，举例来说，羧甲 基纤维素、藻酸盐(alignates)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；保湿剂例如， 举例来说，甘油；崩解剂例如，举例来说，琼脂-琼脂、碳酸钙、植物淀粉如马铃薯或木薯 淀粉、褐藻酸、某些复合硅酸盐，和碳酸钠；溶液阻滞剂例如，举例来说，石蜡；吸收加速剂 例如，举例来说，季铵化合物；润湿剂例如，举例来说，十六醇、甘油单硬脂酸酯和乙二醇； 吸附剂例如，举例来说，高岭土和膨润土；润滑剂例如，举例来说，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸 镁、固体聚乙二醇或十二烷基硫酸钠；防腐剂例如抗细菌剂和抗真菌剂，包括例如硫柳汞 (thimerosal)、山梨酸、庆大霉素和苯酚；以及稳定剂例如，举例来说，EDTA、EGTA和抗氧化剂。固体制剂可选地包含包衣例如肠溶衣。肠溶衣典型地是聚合材料。优选的肠溶衣 材料具有是可生物蚀解的、逐步水解的和/或逐步水溶的聚合物的特征。涂覆到固体制剂 的包衣材料的数量通常决定了摄取和药物释放之间的时间间隔。包衣涂覆成具有一厚度以 便整个包衣不会溶解在与胃酸相关的PH低于3的胃肠液中，然而在小肠环境中在pH3以上 溶解。预计表现出PH依赖的溶解性曲线的任何阴离子聚合物在本发明的实践中是容易使 用作为肠溶衣的，以实现活性剂至下肠胃道的输送。具体的肠溶衣材料的选择取决于性能 如对在胃中对崩解的抗性；在胃中对胃液和活性剂扩散的抗渗性；在目标肠道位置消散的 能力；在存储期间物理和化学的稳定性；无毒性；和容易使用。合适的肠溶衣材料示例性地包括纤维素聚合物如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、偏苯三 甲酸酯醋纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯和羧甲基纤 维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选从丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸铵 盐、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或乙烯形成；乙烯聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷 酮、聚醋酸乙烯酯、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯、醋酸乙烯巴豆酸共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯共 聚物；虫胶(shellac)；及其组合。特定的肠溶衣材料包括描述在例如美国专利US6136345 中的丙烯酸聚合物和共聚物。肠溶衣可选地包含增塑剂以防止允许胃液渗透进固体剂型的孔隙和裂缝形 成。合适的增塑剂示例性地包括柠檬酸三乙酯(triethyl citrate, Citroflex 2)、醋 精(triacetin，三乙酸甘油酯(glyceryl triacetate))、乙酰基柠檬酸三乙酯(acetyl triethyl citrate, Citroflec A2)、Carbowax400 (聚乙二醇 400)、邻苯 二甲酸二乙酯 (diethyl phthalate)、柠檬酸三丁酯、乙酰化单甘酯、甘油、脂肪酸酯、丙二醇和邻苯二甲 酸二丁酯。特别地，由阴离子羧基丙烯酸聚合物组成的包衣通常包含约10%至25%重量 的增塑剂，特别是邻苯二甲酸二丁酯、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯和醋精。包衣还可以包含其 它包衣赋形剂如防粘剂、消泡剂、润滑剂(如硬脂酸镁)和稳定剂(如羟丙基纤维素、酸或 碱)，以溶解或分散包衣材料，并改善包衣性能和包被产品。用于口服施用的液体剂型包括制成乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酏剂(elixir)的 轮状病毒和药学上可接受的载体。本发明的疫苗组合物的液体剂型可以包括润湿剂、乳化 剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂或芳香剂。关于用于制备剂型的惯常的成分、设备和方法的详细信息在!Pharmaceutical Dosage Forms :Tablets，eds. H. A. Lieberman et al.，New York :Marcel Dekker, Inc.， 1989 ；禾口 L V. Allen，Jr. et al.，Ansel’ s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,8th Ed.，Philadelphia，PA :Lippincott，Williams & Wilkins, 2004 ；A. R.Gennaro, Remington :The Science and Practice ofPharmacy，Lippincott Williams & Wilkins, 20th ed.，2003 ；禾口 J. G. Hardman et al.，Goodman feGilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill Professional，10th ed.，2001中 找到。根据本发明的具体实施例，佐剂是可选地包括在病毒组合物中。佐剂是本领域已 知的，示例性地包括弗氏佐剂、氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、皂角甙、右旋糖酐如DEAE-右旋糖酐、植物油如花生油、橄榄油、和/或维生素E醋酸酯(vitamin E acetate)、矿物油、细菌 脂多糖、肽聚糖和蛋白多糖。术语“对象”在这里使用用于指人。在本发明的特定的具体实施例中，术语对象也 指非人类的动物，示例性地包括牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、鸟、家禽和啮齿动物。本发明的疫苗组合物可以是适于施用至对象的任何形式。疫苗组合物通过任何合适的施用途径包括口服和非肠道例如静脉的、皮内的、肌 肉的、腹腔的、黏膜的、鼻的或皮下的施用途径进行施用。词语“治疗有效量”是指有效诱发免疫反应并预防或改善人轮状病毒C-介导的疾 病的迹象或症状的量。在对象中免疫反应的诱导可以由任何本领域已知的各种技术确定， 示例性地包括检测抗人轮状病毒C抗体，测定抗人轮状病毒C抗体滴度和/或淋巴细胞增 殖检测。在对象中，人轮状病毒C介导的疾病的迹象和症状可以进行监控以检测针对本发 明的疫苗组合物的施用的免疫反应的诱导。根据本发明的方法，在特定的具体实施例中，疫苗组合物的施用包括一次施用 一份或更多份剂量的疫苗组合物至对象。可选择地，两份或更多份剂量的疫苗组合物在 周-年的时间间隔进行施用。用于疫苗组合物剂量施用的合适的时刻表依赖于几个因素， 例如，包括对象的年龄和健康状态、使用的疫苗组合物的类型和施用的途径。本领域技术人 员能够容易确定施用至特定对象的剂量和施用时刻表。人轮状病毒C VLPs的免疫原性通过任何本领域已知的各种分析进行测定。在一个 特定的例子中，纯化的人轮状病毒C VUs和佐剂或不和佐剂肌肉施用至小鼠。免疫原性通 过测量在施用后在不同的时间获得的血液样本中免疫球蛋白滴度包括IgM、IgA和/或IgG 进行检测。中和抗体滴度是由本领域已知的中和分析方法测定的，例如那些通常描述在 Kuby, J.，Immunology, 3rd ed. W. H. Freeman and Co.，New York, N. Y.，1997 中的方法。由 于人轮状病毒C不是在培养基中生长，来自用人轮状病毒C VLPs注射的小鼠的血清分别在 相同的孔中2倍连续稀释，并用胰蛋白酶激活的猪轮状病毒C孵育。激活的猪轮状病毒C 或无血清MEM培养基在无小鼠血清存在下进行孵育并分别作为阳性和阴性对照。在补充胰 蛋白酶的MEM培养基中的MA104细胞添加到每个孔中。在37°C孵育18小时后，细胞用福尔 马林固定。在固定MA104细胞中的猪轮状病毒C抗原通过用HRP标记的抗人轮状病毒VLPs 的兔IgG然后用四甲基联苯胺孵育细胞进行检测。血清中中和抗体滴度定义为相对于病毒 对照，吸收值减少70%的最高稀释的倒数。可选地，针对免疫原性人轮状病毒C VUs的抗体施用至对象以预防或治疗有关人 轮状病毒C介导的疾病。可选地与针对免疫原性人轮状病毒C VUs的疫苗组合物或抗体一起施用的其它 治疗物包括抗病毒药物例如金刚烷胺(amantadine)、金刚烷乙胺(rimantadine)、更昔洛韦 (gancyclovir)、阿昔洛韦(acyclovir)、禾丨J 巴韦林(ribavirin)、喷昔洛韦(penciclovir)、 奥塞米韦(oseltamivir)、膦甲酸钠齐多夫定(foscarnet zidovudine，AZT)、去羟肌 苷(didanosine, ddl)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、扎西他宾(zalcitabine, ddC)、司 他夫定(stavudine, d4T)、奈韦拉平(nevirapine)、地拉夫定(delavirdine)、茚地那韦 (indinavir)、利托那韦(ritonavir)、阿糖腺苷(vidarabine)、奈非那韦(nelfinavir)、沙奎那韦(saquinavir)、乐感清(relenza)、达菲(tamiflu)、普拉康纳利(pleconaril)、 干扰素(interferons)；类固酉享(steroids)禾口皮质类固酉享(corticosteroids)如 强的松(prednisone)、可的松(cortisone)、氟替卡松(fluticasone)和糖皮质 激素(glucocorticoid)；抗生素(antibiotics)；止痛药(analgesics)；止 写药 (antidiarrheals)，补液；或其它用于轮状病毒感染的治疗物。本发明还提供了药物试剂盒，包含一个或更多个容器，含有一种或更多种本发明 的药物组合物的成分。可选地，和此类容器一起的可以是采用管理药品或生物制品制造、使 用或销售的政府部门规定的形式的通知书，该通知书反映了管理药品或生物制品制造、使 用或销售的政府部门的批准。在优选的具体实施例中，该试剂盒包含对人轮状病毒C VP2、人轮状病毒C VP6、人 轮状病毒C VP7、SEQ ID NO :1的多肽、抗原表位或其变体、SEQ ID NO :32的多肽、抗原表位 或其变体、SEQ ID NO :34的多肽、抗原表位或其变体、或任何人轮状病毒C抗原表位、本发 明的多肽或蛋白、或本发明的核酸分子具有特异性的抗体，单独或与佐剂、抗病毒药物、抗 生素、止痛药、支气管扩张剂(bronchodilators)或其它药学上可接受的赋形剂联合。本发 明还包括试剂盒，包括含有本发明的药物组合物的容器和使用说明。还提供了用于检测人轮状病毒C感染的诊断试剂盒，其包含人轮状病毒C VLPs作 为用于检测人轮状病毒C抗体的试剂。进一步可理解，诊断试剂盒可选地包括辅助试剂例 如缓冲液、溶剂、可检测标记和其它必要的本领域所知的用于检测生物样本中抗体的试齐U。抗人轮状病毒抗体的检测根据本发明的方法的具体实施例，人轮状病毒C VLPs用于检测生物样品中抗人轮 状病毒C抗体。术语“生物样本”是指从生物有机体、组织、细胞、细胞培养液或任何适于模仿 生物条件的介质，或从环境获得的样本。非限制的例子包括，唾液(saliva)、牙龈分泌物 (gingivalsecretions)、脑脊髓液(cerebrospinal fluid)、胃肠液(gastrointestinal fluid)、粘膜(mucous)、泌尿生殖器分泌物(urogenital secretions)、滑液(synovial fluid)、血液、血清、血浆、尿液、囊液(cystic fluid)、淋巴液(lymph fluid)、腹水 (ascites)、胸腔积液(pleural effusion)、组织间液(interstitial fluid)、细胞内 液(intracellular fluid)、眼液(ocular fluids)、精液(seminalfluid)、乳腺分泌物 (mammary secretions)、玻璃体液(vitreal fluid)、獎便(feces)禾口鼻月空分泌物(nasal secretions) 0可以使用环境样本如污水或水样本。在优选的具体实施例中，样本是血清、 血浆或全血。根据本发明，检测生物样本中抗人轮状病毒C抗体的方法包括用重组人轮状病毒 C VLPs接触生物样本和检测生物样本中存在的抗人轮状病毒C抗体和人轮状病毒C VLPs 之间复合物的形成。生物样本中存在的抗人轮状病毒C抗体和人轮状病毒C VUs之间复合 物的形成表明对象充分接触人轮状病毒C从而激活对象的免疫系统以产生抗人轮状病毒C 抗体。复合物的形成明确表明抗人轮状病毒C抗体的存在，因为其它肠道病毒抗体，尤其是 抗人轮状病毒A抗体，不与人轮状病毒C VLPs形成复合物。在优选的具体实施例中，人轮状病毒C VLPs用于检测生物样品中抗人轮状病毒C 抗体以诊断对象中目前和最近人轮状病毒C的感染。
在进一步的优选具体实施例中，在人轮状病毒C感染敏感生物体中，特别在人体 对象中，人轮状病毒C VLPs用在评估过去或现在接触人轮状病毒C抗原的个体的免疫状 态。检测生物样本中存在的抗人轮状病毒C抗体和人轮状病毒C VLPs之间复合物的 形成可以通过任何本领域已知的各种方法实现。示例性地包括检测连接至人轮状病毒C VUs或连接至抗人轮状病毒C抗体的标签。术语“标签(label)”或“标记的(labeled) ”是 指可以用于定性或定量检测连接至标签的物质的任何组合物。合适的标签包括荧光基团、 放射性同位素、发色团、生物发光部分、酶、磁粒、电子致密颗粒等等。术语“标签(label)” 或“连接有标签的(labeled)”意图包括通过偶联(即物理连接)可检测的物质至人轮状病 毒C VUs或抗体直接标记人轮状病毒C VUs或抗体，以及通过与另一直接标记的试剂相 互作用间接标记人轮状病毒C VUs或抗体。一抗间接标记的例子包括用荧光标记的二抗 检测一抗。使用在复合物形成检测中的标签依赖于使用的检测方法。这种检测方法结合在特 定分析设计中，示例性地包括ELISA、western blot、免疫沉淀方法、免疫细胞化学方法、免 疫荧光分析方法、液相色谱法、流式细胞仪检测方法、其它本领域已知的检测方法或者它们 的组合。在一具体实施例中，使用ELISA检测生物样品中人轮状病毒C抗体的存在。在用于人轮状病毒C抗体的ELISA的设计中，人轮状病毒C VLPs包被在支持物例 如微量滴定板、珠子、载玻片、硅片或其它固体支持物如硝酸纤维素膜或PVDF膜上。生物 样本和支持物上的人轮状病毒C VLPs 一起孵育，针对人轮状病毒C的抗体和人轮状病毒C VUs之间复合物的存在通过标准ELISA操作程序进行检测。例如，人轮状病毒C VUs和人 轮状病毒C抗体之间的复合物通过标记的二抗和抗人轮状病毒C抗体反应及检测标签进行 检测。用于人轮状病毒C抗体的ELISA的另一例子是夹心ELISA。夹心ELISA的一个具 体实施例包括将结合抗体沉积在固体支持物上。结合抗体可选地是识别人轮状病毒C VLPs 的非竞争抗体。结合抗体与人轮状病毒C VUs孵育。洗涤复合物以去除任何未结合材料， 使用了可检测的标签，例如荧光标记的针对人轮状病毒C VUs的抗体。检出可检测的标签， 如果存在，说明抗人轮状病毒C抗体在生物样本中存在。ELISA分析方法的进一步细节大体上在Crowther，J. R.，The ELISA Guidebook(Methods inMolecular Biology), Humana Press, 2000 ； 禾口 Wild, D. , The Immunoassay Handbook, 3rd Edition, Elsevier Science, 2005 中找至Ij0提供了人轮状病毒C抗体检测试剂盒，包括一种或更多种人轮状病毒C VLPs和辅 助试剂，用于使用在检测生物样本中抗人轮状病毒C抗体中。辅助试剂是任何信号产生系 统材料，用于在任何合适的检测方法例如ELISA、western blot、免疫沉淀方法、免疫细胞化 学方法、免疫荧光分析方法、质谱分析方法或本领域已知的其它检测方法中检测抗人轮状 病毒C抗体和人轮状病毒C VLP之间的复合物。可选地，根据本发明的具体实施例，抗人轮状病毒C抗体检测试剂盒包括附着至 固体基质的人轮状病毒C VLPs0合适的固体基质包括但不限于微量滴定板、芯片、管子、膜 如尼龙膜或硝酸纤维素膜、以及颗粒如珠子。将含有蛋白的物质附着至固体基质是本领域已知的，包括但不限于吸附。在优选的具体实施例中，本发明的人轮状病毒C抗体检测试剂盒示例性地包括一 种或更多种人轮状病毒C VLPs ；和一种或更多种辅助试剂例如高结合微量滴定板或其它支 持物、封闭剂、洗涤缓冲液例如磷酸盐缓冲液、标记的抗免疫球蛋白抗体、以及配套的检测 试剂、棉签或其它样品采集设备、对照试剂例如标记的非竞争或未标记试剂、对照核苷酸序 列和相关的引物和探针、和用于检测的其它材料和试剂。该试剂盒可选地包括印刷的或处 于电子可获取形式的说明书和/或客户支持联系信息。在信号产生系统或其它中的抗免疫球蛋白抗体可选地用荧光、生物素、过氧化物 酶、或其它酶或非酶检测标签进行标记。可理解，信号产生系统可以采用来自相同或不同有 机体的未标记的一抗和标记的二抗。进一步可理解，非抗体信号产生系统同样是可操作的。进一步可理解，试剂盒可选地包括辅助试剂例如缓冲液、溶剂、可检测标签和其它 必要的且本领域知道的用于检测生物样本中抗体的试剂。含有货物的VLPs可选地，VLP在由VLP限定的内部空间中含有货物。在特定的具体实施例中，货物 部分是输送至对象或细胞的物质。示例性的货物部分包括抗原、不是完整人轮状病毒基因 组的核酸和治疗剂。特别提供了输送遗传信息的方法，遗传物质封装在人轮状病毒C衣壳蛋白中，然 后导入宿主细胞中。遗传物质可选地是DNA或RNA，或其修改体。遗传信息可选地来自人轮 状病毒C或其它病毒或非病毒有机体，或者是合成的。通过包括将货物导入宿主细胞以便在货物存在下产生人轮状病毒C VUs从而在 内部空间包括货物的各种方法的任意一种，从而货物纳入到由人轮状病毒C VLP限定的内 部空间中。可替换地或另外地，通过将产生的人轮状病毒C VUs和货物孵育以便货物例如 通过扩散进入内部空间，从而货物纳入到内部空间中。VLP 抗体人轮状病毒C VUs用作抗原用于生产针对人轮状病毒C的单克隆或多克隆抗体， 用于临床使用例如治疗、分析或诊断；或实验室研究。在优选的具体实施例中，在体内(例如，用于保护或治疗目的或用于提供诊断抗 体)和在体外(例如，通过噬菌体展示技术或其它适合用于产生合成抗体的技术)，使用人 轮状病毒C VUs用于激发针对包括在人轮状病毒C VLPs中的VP2、VP6、VP7或任何抗原的 人轮状病毒C特异性抗体或T细胞反应。如在这里所使用的，术语“抗体(antibody)，，和“抗体(antibodies)，，涉及单 克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源性化抗体、嵌合抗体、 camelized抗体、单域抗体、单链Fvs (single-chain Fvs, scFv)、单链抗体、二硫键连接的 Fvs (disulfide-linkedFvs, sdFv)、抗独特型(anti-idiotypic，anti-Id)抗体(包括，例 如，针对本发明的抗体的anti-Id抗体)、以及上述任意的抗原表位结合片段。尤其，抗体 包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免 疫球蛋白分子是任何类型的(例如，IgG, IgE, IgM, IgD, IgA和IgY)、类别的(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚类的。如在这里所使用的，术语“抗体片段”定义为免疫特异结合人轮状病毒C病毒、人轮状病毒C病毒或人轮状病毒C VLP的任何抗原表位的抗体的片段。抗体片段可以通过任 何本领域技术人员已知的技术产生。例如，Fab和F(ab' ) 2片段可以通过用酶如木瓜蛋白 酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab' )2片段)实现免疫球蛋白分子的蛋白 水解断裂而产生。F(ab' )2片段含有完整的轻链，和重链的可变区、CHl区和铰链区。抗 体片段也可以通过重组DNA技术产生。抗体片段可以是抗体的一个或更多个互补决定区 (complementaritydetermining regions，CDRs)0根据本发明，提供了人轮状病毒C特异性抗体，其特异性结合人轮状病毒C且不特 异性结合其它轮状病毒类型例如轮状病毒A、B、D、E、F和G。表达针对本发明的人轮状病毒C VLPs的单克隆抗体的杂交瘤细胞株特异性结合 人轮状病毒C且不特异性结合其它轮状病毒类型例如轮状病毒A、B、D、E、F和G。通过任何本领域已知的方法获得的针对人轮状病毒C VLPs的抗体可选地通过本 领域已知的用于免疫球蛋白分子纯化的任何方法进行纯化，例如，通过离子交换层析法、亲 和层析，特别是通过对特异抗原的亲和力或大小排阻层析；离心法；不同溶解度法；或通过 任何其它用于蛋白纯化的标准技术。同样可理解，发明抗体或其片段可以融合到本领域已 知的异源多肽序列以利于纯化。对于某些用途，包括在人体内使用抗体和体外检测分析，优选使用嵌合、人源化或 人抗体。嵌合抗体是一种其中抗体的不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来自 鼠单克隆抗体的可变区和来自人免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是 本领域已知的(Morrison, 1985，Science, 229 :1202 ；U. S. Pat. Nos. 5，807，715 ；4，816，567 ； 和4，816，397)。人源化抗体是来自非人类物种的抗体分子，其结合具有来自非人类物种的 一个或更多个互补决定区(CDRs)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的期望抗原。通常， 人框架区中的框架残基用来自CDR供体抗体的对应残基取代以改变，优选改善，抗原结合。 这些框架取代由本领域已知的方法确定，如通过对CDR和框架残基之间的相互作用建模以 确定对于抗原结合重要的框架残基以及序列比较以确定在特定位置上的不寻常的框架残 基(U. S. Pat. No. 5，585，089 ；Riechmann et al.，1988，Nature 332 :323)。抗体可以用本 领域已知的各种技术进行人源化，包括，例如，⑶R移植(⑶R-grafting) (PCT公布文本WO 91/09967 ；U. S. Pat. Nos. 5，225，539 ；5，530，101 和 5，585，089)、镶饰或重塑(veneering or resurfacing)(Studnicka et al. ,1994, Protein Engineering 7 (6) 805 814 ；Roguska et al.，1994，PNAS. 91 :969 973)，和链替换(chainshuffling) (U. S. Pat. No. 5，565，332)。完全人抗体对于人类患者的治疗是特别期望的。人抗体可以通过本领域已知的 各种方法制备，包括上面描述的使用来自人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示方法。 (U. S. Pat. Nos. 4，444，887 和 4，716. 111)。人抗体容易通过使用不能表达有功能的内源免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白 基因的转基因小鼠进行制备。发明抗体可选地融合或结合至可用于体外免疫分析与纯化方法例如亲和层析的 异源多月太。(PCT 公布号 WO 93/21232 ；U. S. Pat. No. 5，474，981)。发明抗体可选地附着至固体支持物，这对于本发明的多肽或其片段、衍生物、类似 物或变体、或具有与本发明的多肽相似酶活性的相似分子的免疫分析或纯化是特别有用 的。这种固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。用于人轮状病毒C的分析在本发明的具体实施例中，本发明的抗人轮状病毒C VLP抗体用于检测生物样本 中的人轮状病毒C。本发明的用于生物样本中人轮状病毒C的检测包括用抗人轮状病毒C抗体接触生 物样本和检测在抗人轮状病毒C抗体和在生物样本中的人轮状病毒C之间的复合物的形 成。复合物的形成表明生物样本取自的对象目前由人轮状病毒C感染。复合物的形成特异 性表明人轮状病毒C的存在，因为其它轮状病毒类型例如轮状病毒A、B、D、E、F和G不和本 发明的抗人轮状病毒C抗体形成复合物。在特定的具体实施例中，该方法进一步涉及从对象获得生物样本、将能够检测样 本中人轮状病毒C核酸存在的化合物或试剂接触样本，以确定样本中人轮状病毒C的存在。在进一步的具体实施例中，检测对照样本是否存在人轮状病毒C和/或人轮状病 毒C抗体，结果与测试样本对比以确定人轮状病毒C或抗人轮状病毒C抗体的存在或量上 的差异。在另一方面，本发明提供了用于确定人或动物接触C组轮状病毒的方法包括在 促进所述生物样本中的抗体结合所述轮状病毒样颗粒的条件下将在这里描述的发明的轮 状病毒样颗粒接触所述人或动物的生物样本；并检测生物样本中的抗体与所述轮状病毒样 颗粒的结合。为了确定人或动物接触C组轮状病毒的目的，生物样本通常是血液和/或粪 便；然而，生物样品还包括来自其它组织的样本；如肠道活检。本发明还包括用于检测测试样本中人轮状病毒C存在的试剂盒。例如，试剂盒包 括抗人轮状病毒C抗体和可选地包括试剂如标记二抗或能够检测与人轮状病毒C的复合物 中的抗体并在某些具体实施例中用于测定样本中的滴度的试剂。发明组合物和方法的具体实施例阐明在下面的例子中。这些例子提供用于说明目 的，并不认为是对发明组合物和方法的范围的限制。实例1杆状病毒重组体的克隆和构建。来自人C组RV病毒株S-I的片段5，编码VP6，通 过使用 BMJ44(5，-AGC-CAC-ATA-GTT-CAC-ATT-TC-3，)(SEQ ID NO :14)和 BMJ141 (5，-ATC_T CA-TTC-ACA-ATG-GAT-G-3，)(SEQ ID NO 15) (28)用 RT-PCR 进行扩增。来自病毒株 S-1 的 片段 8，编码 VP7，通过使用引物 BMJ13(5，-AGC-CAC-ATG-ATC-TTG-TTT-3，)(SEQ ID NO :20) 和BMJ14(5，-GGC-ATT-TAA-AAA-AGA-AGA-3，)(SEQ ID NO :21) (13,28)用 RT-PCR进行扩增。 来自病毒株 ASP88 的片段 2，编码 VP2，通过使用 BMJ197 (5，-TCG-AGG-ACA-AAT-CGT-CCA-A G-3，)(SEQ ID NO 22)和BMJ180(5，-AGC-CAC-AGA-GTT-TGA-GGT-C_3，)(SEQ ID NO :23)用 RT-PCR进行扩增。表达S-1VP7的重组杆状病毒的克隆和构建先前已经描述(14)。片段2 和5的DNA片段克隆进载体pVL1393并用Bac-N-Blue转染试剂盒(Gibco，Grand Island, NY)进行转染。杆状病毒构建体在草地贪夜蛾9(Spodoptera frugiperda 9，Sf9)细胞培 养物中扩增2代，蚀斑纯化，然后在Sf9细胞中在无血清HyQ SFX-Insect培养基(Hyclone， Logan, UT)中再扩增2代。图5提供了用于来自上面描述的病毒株ASP88的VP2(SEQ ID N0:1);称为 “Bristol ”的人C组VP2病毒株具有的蛋白(SEQ ID NO 16)，其具有NCBI Accession CAC44890, version CAC 44890.1 GI 15027005 ；以及称为 “Cowden” 的猪 VP2 (SEQ ID NO 17)
的氨基酸序列比对。图6是编码用于发明的病毒株ASP88的人C组VP-2的序列(SEQ ID NO 18), Cowden猪病毒株的人C组VP-2的序列(SEQ ID No. 44)和Bristol的人C组VP-2的序列 (SEQ ID NO 19,Accession AJ303139)的核苷酸序列比对。起始密码子和终止密码子下划 线划出。图7是编码用于发明的病毒株S-I的人C组VP-6的序列相对于传统病毒株 Bristol 的序歹Ij (SEQ ID NO :25，Accession CAA42504) Jajeri 的序列(SEQ ID NO :26， AccessionAAK26534) ；CMH004 的序列(SEQ ID NO :27，Accession ABR31794) ；V508 的 序歹丨J (SEQID NO 28, Accession AAX13496) ；China 的序列(SEQ ID NO :29，Accession BAB83829)；和 BCN6 的序列(SEQ ID NO 30, Accession CAJ41549)的核苷酸序列比对。注 意到图7提供了本领域标准格式的序列比较，其中“·(dot) ”表明与参照序列的一致性。在 图 7 中，参照序列是共有序列(consensus sequence) (SEQ ID No. 41)。图8是编码用于发明的病毒株S-I的人C组VP-6 (SEQ ID NO 32)的序列相对于 传统病毒株 Bristol 的序列(SEQ ID NO :34，Accession CAA42504) Jajeri 的序列(SEQ ID NO 35, Accession AAK26534) ；CMH004 的序列(SEQ ID NO :36，Accession ABR31794)； V508 的序列(SEQ ID NO :37，Accession AAX13496) ；China 的序列(SEQ ID NO :38， AccessionBAB83829)；和 BCN6 的序列(SEQ ID NO :39，Accession CAJ41549)的氨基酸序 列比对。注意到图8提供了本领域标准格式的序列比较，其中“·(dot)”表明与参照序列 的一致性。在图8中，参照序列是共有序列(consensus sequence) (SEQ ID No. 24)。表I C组轮状病毒的VP2基因的比较
权利要求
1.一种分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，包括人轮状病毒C组VP6 蛋白和人轮状病毒C组VP7蛋白。
2.根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，还包括 人轮状病毒C组VP2蛋白。
3.根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，其中病 毒样颗粒不含有人轮状病毒C组VP1、VP3、VP4和人轮状病毒C组非结构蛋白NSP1、NSP2、 NPS3、NSP4、NSP5、NSP6 禾口 NSP7。
4.根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，其中人 轮状病毒C组VP6蛋白包括SEQ ID No. 32的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，其中人 轮状病毒C组VP7蛋白包括SEQ ID No. 34的氨基酸序列。
6.根据权利要求2所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，其中人 轮状病毒C组VP2蛋白包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列。
7.一种用于检测生物样本中人轮状病毒C组抗体的方法，其特征在于，包括将许多根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒接触第一生物样本；和检测在存在第一生物样本中的抗人轮状病毒C组抗体和许多分离的重组人轮状病毒C 组病毒样颗粒之间的复合物的形成，以获得表明抗人轮状病毒C组抗体存在的第一信号。
8.一种抗人轮状病毒C疫苗组合物，其特征在于，包括与药学上可接受的载体混合的 根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒。
9.一种输送货物部分至细胞的方法，其特征在于，包括将货物部分导入由根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒限定 的内部空间；和将分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒接触细胞。
10.根据权利要求14所述的输送货物部分的方法，其特征在于，其中货物部分选自由 标签、抗原、编码蛋白或肽的核酸分子和治疗剂组成的组。
11.一种抗人轮状病毒C组抗体检测试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒；和至少一种辅助试剂。
12.根据权利要求11所述的抗人轮状病毒C组抗体检测试剂盒，其特征在于，其中病毒 样颗粒附着至固体基质。
13.一种免疫原性组合物，其特征在于，包括根据权利要求1-6任一所述的分离的重组 人轮状病毒C组病毒样颗粒和药学上可接受的载体。 13.根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其特征在于，还包括免疫佐剂。
14.一种在人中产生免疫反应的方法，其特征在于，包括施用根据权利要求13所述的 免疫原性组合物至人。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，施用免疫原性组合物的步骤是施用至 粘膜表面。
16.一种分离的多肽，其特征在于，包括下列氨基酸序列之一a)与SEQID NO :1所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)具有至少98%—致性 的氨基酸序列；b)与SEQID NO :1所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)具有至少99%—致性 的氨基酸序列；c)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)；d)SEQ ID NO 32所示的氨基酸序列(S_l VP6氨基酸序列)。
17.一种分离的核酸分子，其特征在于，包括编码根据权利要求16所述的分离的多肽 的核苷酸序列。
18.一种免疫原性组合物，其特征在于，包括包含任何SEQ ID NOS :1-13的至少一氨基 酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列是由抗体识别的抗原表位。
19.根据权利要求18所述的免疫原性组合物，其特征在于，其中所述免疫原性组合物 还包括根据权利要求1-6任一所述的病毒样颗粒。
20.一种抗体制剂，其特征在于，识别SEQ ID NOS :1-13的任一氨基酸序列。
21.一种分离的多肽，其特征在于，包括SEQ ID NO :3或8的至少一氨基酸序列。
22.—种分离的核酸分子，其特征在于，包括编码根据权利要求21所述的分离的多肽 的核苷酸序列。
23.—种载体，其特征在于，包括根据权利要求17或22所述的核酸分子。
24.一种分离的宿主细胞，其特征在于，包括根据权利要求23所述的载体。
25.一种用于形成人C组轮状病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括构建包括核酸分子的第一载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP6衣壳蛋白的序 列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；构建包括核酸分子的第二载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP7衣壳蛋白的序 列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；在促进VP6衣壳蛋白和VP7衣壳蛋白表达并结合以形成人C组轮状病毒样颗粒的条件 下，用所述第一和第二杆状病毒载体感染昆虫细胞培养物。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，还包括构建包括核酸分子的第三载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP2核心蛋白的序 列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；和在促进VP6衣壳蛋白、VP7衣壳蛋白和所述VP2核心蛋白表达的条件下，用所述第一杆 状病毒载体、第二杆状病毒载体和第三杆状病毒载体感染昆虫细胞培养物。
27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，还包括确定人C组轮状病毒样颗粒存在 所述培养物中。
28.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，还包括从所述培养物分离人C组轮状病毒样颗粒。
29.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，其中所述第一载体和所述第二载体均 具有杆状病毒启动子。
全文摘要
C组轮状病毒(Group C rotaviruses)是儿童和成人中急性肠胃炎的导致原因，与A组RV截然不同。然而，人C组轮状病毒不能在培养基中生长，导致缺乏用于检测和治疗GrpC RV疾病的工具。因此，GpC RV疾病负担还没有清楚确定。根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，以及除了别的以外，它们的生产方法和在Grp C RV感染检测、诊断分析和免疫原性组合物中的用途。
文档编号C07K14/14GK102105489SQ200980129446
公开日2011年6月22日 申请日期2009年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者蒋鲍明 申请人:美国政府健康与人类服务部秘书处