专利名称：亲合层析用填充剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及亲合层析用填充剂，尤其是涉及结合有对于抗体纯化有用的特定配体的亲合层析用填充剂。
背景技术：
所谓亲合层析，是将与以分离和纯化作为目的的物质特异性结合的物质(配体) 固定在不溶性载体上，使用填充了这样获得的配体固定化载体的柱的层析，可用于例如，蛋白质、核酸等生物体相关物质的分离和纯化(日本特开平6481638号公报)。作为亲合层析用填充剂，以琼脂糖凝胶为代表的糖链的交联粒子得到广泛使用， 但是它存在着一旦高速流过含有分离和纯化对象分子的溶液，粒子就发生变形，柱压力增高，分离和纯化的时间效率差这样的问题。另一方面，作为能够以较高流速使用的亲合层析用填充剂，有AppliedBiosystems 公司制造的POROS (商品名)。该填充剂使用以疏水性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物作为主要成分的母粒子。该填充剂存在着被认为主要由母粒子引起的发生非特异吸附的情况，而且，如果以高流速使用，就会有结合容量降低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供至今还没有的即使是在高流速下的分离和纯化，也可以维持高配体结合容量的亲合层析用填充剂。本发明的一个方式涉及的亲合层析用填充剂是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，配体与前述多孔性母粒子结合，前述多孔性母粒子具有通过使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而得到的开环环氧基。在上述亲合层析用填充剂中，可以含有取代或非取代的2，3_ 二羟基丙基作为前述开环环氧基。上述亲合层析用填充剂中，前述配体可以是含有蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。此时，前述蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域，可以是选自A结构域、B结构域、C 结构域、D结构域、E结构域、和Z结构域中的至少1种。上述亲合层析用填充剂中，前述配体可以是用下述通式(1)表示的免疫球蛋白结合蛋白质。R-R2.....(1)(式中，R表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有一个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50 500个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端))。此时，上述通式(1)中，R-可以是下述通式(2)表示的基团。
R1T-.....(2)(式中，R1表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 100个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R1中，前述组氨酸连续部位的末端与r结合)，r表示包含TEV结构域的由7 200个氨基酸构成的任意的氨基酸序列)。而且，此时，前述配体是，上述通式(1)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个可以含有结构域t的配体，所述结构域t包含选自赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1种氨基酸且由1 50个氨基酸构成。此外，上述亲合层析用填充剂中，前述配体可以是下述通式C3)表示的免疫球蛋白结合蛋白质。R2-R.....(3)(式中，R表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50 500个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端))。此时，上述通式(3)中，-R可以是下述通式⑷表示的基团。-r-R1.....(4)(式中，R1表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 100个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R1中，前述组氨酸连续的部位的末端与r结合)，r表示包含TEV结构域的由7 200个氨基酸构成的任意的氨基酸序列)。而且，此时，前述配体可以是，上述通式(3)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个含有结构域t的配体，所述结构域t包含选自赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1种氨基酸且由1 50个氨基酸构成。本发明中，所谓“蛋白质”，是指具有肽结构单元的所有分子，它是包括了，例如，对天然型蛋白质的部分片段或天然型蛋白质的氨基酸序列进行了人工改变后的变异体的概念。而且，所谓“免疫球蛋白结合结构域”表示单独具有免疫球蛋白结合活性的多肽的功能单元，所谓“免疫球蛋白结合蛋白质”表示与免疫球蛋白具有特异的亲和性，且含有“免疫球蛋白结合结构域”的蛋白质。而且，本发明中，所谓“TEV结构域”，是指被TEV(烟草蚀刻病毒，Tobacco Etch Virus)蛋白酶识别的切断部位。根据上述亲合层析用填充剂，其是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，配体与前述多孔性母粒子结合，前述多孔性母粒子具有通过使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而得到的开环环氧基，因此在亲合层析中，即使在高流速下的分离和纯化中，也可以维持高配体结合容量，而这在以前是无法实现的。
[图1]图1是表示本发明的合成例1中制备的免疫球蛋白结合蛋白质(SPAK、 SPAC, SPAKK, SPATK)的氨基酸序列的图。[图2]图2是表示本发明的合成例1中制备的免疫球蛋白结合蛋白质(SPAI、 SPA3K、SPA-His-C, SPA-His-Ν)的氨基酸序列的图。
[图3]图3是说明分别插入于3种表达载体(pETM-11、pETM-10和pET29)中的编码本发明的合成例1中涉及的免疫球蛋白结合蛋白质的DNA片段的构成的图。
具体实施例方式本发明的一个实施方式涉及的亲合层析用填充剂是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，配体与多孔性母粒子结合，多孔性母粒子具有通过使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而得到的开环环氧基。1.亲合层析用填充剂1. 1.多孔性母粒子1. 1. 1.构成本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂(多孔性母粒子)优选主要由含有交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物构成。作为上述交联性乙烯基单体，合适的是芳香族聚乙烯基单体、脂肪族聚乙烯基单体，作为芳香族聚乙烯基单体，优选二乙烯基苯，并且作为脂肪族聚乙烯基单体，优选多元 (甲基)丙烯酸酯化合物。作为多元(甲基)丙烯酸酯化合物，可以列举乙二醇二(甲基) 丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4_ 丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6_己二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯等，特别优选三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯。上述含环氧基的乙烯基单体是分子中含有环氧基的乙烯基单体，可以列举，例如， (甲基)丙烯酸缩水甘油酯、α-(甲基)丙烯基-ω-缩水甘油基聚乙二醇等(甲基)丙烯酸酯类；乙烯基苄基缩水甘油醚等芳香族乙烯基化合物等，特别优选甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙烯基苄基缩水甘油醚。作为本实施方式涉及的亲合层析用填充剂，优选使用含有优选20 50重量％的交联性乙烯基单体与50 80重量％的含环氧基的乙烯基单体的共聚物的多孔质有机聚合物粒子。在此，交联性乙烯基单体如果不到单体总量的20重量％，填充剂的强度就差，因此会存在高流速下，填充剂被破坏，柱压力上升的情况，另一方面，交联性乙烯基单体如果超过单体总量的50重量％，就会存在难以控制细孔径，结合容量降低的情况。本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂也可以含有其它乙烯基单体作为共聚物成分，其它乙烯基单体的含量优选是0 30重量％。本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂优选具有20 80 μ m,更优选具有30 60 μ m的粒径(体积平均粒子径)。粒径如果不到20 μ m，在高流速下柱压力变高，不耐用。 如果粒径超过80 μ m,结合容量就差。而且，本发明中所谓“粒径”，是用激光衍射/散射粒度分布测定装置获得的体积平均粒径。本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂优选具有50 150m2/g，更优选80 120m2/g的比表面积。在此，比表面积如果不到50m2/g，就会有结合容量差的情况，另一方面，如果超过150m2/g，填充剂强度就差，因此会存在高流速下填充剂被破坏，柱压力上升的情况。本发明中所谓“比表面积”，是将通过水银孔隙率计获得的细孔径为10 5000nm的细孔所具有的表面积除以粒子的干燥重量所得的值。本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂优选具有100 400nm，更优选200 300nm的体积平均细孔径。在此，体积平均细孔径如果不到lOOnm，就会存在高流速下结合容量显著降低的情况，另一方面，如果超过400nm，就会存在不论流速如何，结合容量有可能降低的情况。本发明中所谓“体积平均细孔径”，是通过水银孔隙率计获得的细孔径为10 5000nm的细孔的体积平均细孔径。在满足上述范围的粒径、比表面积、和细孔径分布时，成为纯化对象溶液流路的粒子间的间隙和粒子内的较大的细孔径，与纯化对象分子的结合表面积的平衡达到最佳化， 高流速下的结合容量维持在高水平。本实施方式中涉及的作为亲合层析用填充剂使用的多孔性母粒子的一个具体例， 可以列举例如，含有20 50重量％的交联性乙烯基单体与50 80重量％的含环氧基的乙烯基单体的共聚物，粒径为20 80 μ m,比表面积为50 150m2/g，体积平均细孔径为 100 400nm的多孔性有机聚合物粒子。而且，用水银孔隙率计测定本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂时的细孔径为 10 5000nm的细孔的浸入体积(细孔体积)优选为1. 3 2. 5mL/g。1. 1. 2.制造本实施方式中涉及的作为亲合层析用填充剂使用的多孔性母粒子可以通过例如公知的种子聚合、悬浮聚合等来制造。作为种子聚合法，还可以适当地使用日本特公昭57-24369号公报记载的二段膨胀聚合法。聚合时，除上述单体以外，将水、致孔剂 (Porogen)作为必需成分，根据需要使用聚合引发剂、高分子分散剂、表面活性剂、盐、种子粒子等。作为致孔剂(Porogen)，可以列举脂肪族或芳香族烃类、酯类、酮类、醚类、醇类等有机溶剂。作为这种有机溶剂，可以列举例如，甲苯、乙苯、异丙苯、正丙苯、正丁苯、叔丁苯、 仲丁苯、异丁苯、二甲苯、乙基甲苯、甲基异丙苯、叔丁基甲苯、二异丙苯、均三甲苯、环己烷、 辛烷、异辛烷、乙酸丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、甲乙酮、2-辛酮、3-辛酮、4-辛酮、二异丁基酮、2-壬酮、3-壬酮、4-壬酮、5-壬酮、2-癸酮、3-癸酮、4-癸酮、5-癸酮、2-甲壬酮、3-甲壬酮、4-甲壬酮、5-甲壬酮、6-甲壬酮、佛尔酮、异佛尔酮、苯乙酮、二丁基醚、1-己醇、2-辛醇、癸醇、月桂醇、环己醇等，优选以具有碳原子数为2以上的烷基的芳香族烃类作为主要成分的溶剂、以碳原子数为8以上的酮类作为主要成分的溶剂，最优选以异丙苯和/或二异丁基酮作为主要成分的溶剂。通过根据单体的组成对上述致孔剂(Porogen)的量和种类进行选择，可以获得本实施方式中涉及的填充剂所必需的细孔径分布和比表面积。作为聚合引发剂，优选过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化2-乙基己酸叔丁酯、 3，5，5_三甲基己酰过氧化物等的过氧化物类引发剂、偶氮二异丁腈、偶氮二异戊腈等偶氮类引发剂。将这些聚合引发剂溶解于单体混合物或致孔剂(Porogen)中来供给聚合体系。作为高分子分散剂，可以使用皂化度为80 95%的聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮等水溶性聚合物。作为表面活性剂，可以使用十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯十二烷基醚硫酸酯盐等阴离子性表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚等非离子性表面活性剂等。作为盐，可以适当使用氯化钠、硫酸钠等。作为种子粒子，可以使用分子量为1000 100000左右的聚苯乙烯粒子、聚(甲基)丙烯酸烷基酯粒子等。种子聚合中，通过调整种子粒子的大小和量、单体的量、致孔剂(Porogen)的量，可以获得本发明的填充剂所需要的粒径。悬浮聚合中，通过调整高分子分散剂和表面活性剂的种类和量、搅拌速度、搅拌叶轮和聚合容器的形状和大小，可以获得本发明的填充剂所需要的粒径。聚合结束后，通过用种子粒子和/或致孔剂(Porogen)的良溶剂进行清洗，而获得所希望的细孔径分布的多孔性母粒子。1.1.3.与配体的结合配体结合在本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂上。作为配体的结合方法，可以列举，例如，⑴利用多孔性母粒子所含的环氧基直接作为配体的结合位点的方法(例如日本特表2006-511935号中记载的方法)；(2)用甲苯磺酰基等对将多孔性母粒子中所含的环氧基开环而生成的醇羟基进行活化之后，结合配体的方法；用氧化剂对该醇羟基进行氧化开裂，然后结合配体的方法(例如日本特开 2007-211076号、日本特开2008-032411号中记载的方法)；(；3)从多孔性母粒子中所含的环氧基或由该环氧基开环而生成的基团进一步延伸连接子，配体通过该连接子与多孔性母粒子结合的方法(例如特开2008-032411号、特开平10-195099号、特开2004-331953号中记载的方法)。在任意一种结合法中，在作为亲合层析用填充剂使用前，表面的环氧基实质上开环。也就是说，本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂具有开环环氧基。该开环环氧基如上所述，通过在配体与多孔性母粒子结合之前或之后，使多孔性母粒子中所含的环氧基开环而获得。本发明中所谓“开环环氧基”是指使环氧基开环所得的基团，更具体的是指，例如通过使氢氧化物离子、氯化物离子、具有巯基或氨基等的亲核性化合物等与环氧基反应， 使环氧基开环所得的基团。环氧基开环而生成的醇羟基起着使共聚物表面亲水化，防止蛋白质等的非特异吸附，并且使水中的粒子的韧性提高，防止高流速下的粒子被破坏的作用。作为多孔性母粒子中环氧基的开环方法，可以列举，例如，在水溶剂中，用酸或碱，加热或室温下搅拌的方法。 此外，还可以用巯基乙醇等具有巯基的阻断剂或单乙醇胺等具有氨基的阻断剂，使环氧基开环。如上述(1) (3)中说明的那样，开环环氧基，可以是例如，使环氧基开环而生成的基团、使配体结合在该开环而生成的基团上的基团、和通过连接子使配体结合在该开环而生成的基团上的基团中的任意一种，优选它们中的至少1种。此时，从可以使共聚物表面亲水化，更有效地防止蛋白质等的非特异吸附这一点上考虑，优选多孔性母粒子含有取代或非取代的2，3_ 二羟基丙基来作为开环环氧基。非取代的2，3_ 二羟基丙基可以通过例如， 使缩水甘油基通过水解来开环的方式获得。取代的2，3_ 二羟基丙基可以通过例如，把缩水甘油基用巯基乙醇等具有巯基的阻断剂或单乙醇胺等具有氨基的阻断剂进行开环而获得。1. 2.配体作为配体，如果是对目标物具有亲合性的物质，其种类就没有特别限制，可以使用例如，蛋白质A、蛋白质G、抗生物素蛋白等蛋白质；胰岛素等肽；单克隆抗体等抗体；酶；激素；DNA ；RNA ；肝素、路易斯X(LewisX)、神经节苷脂等糖类；亚氨基二乙酸、合成色素、2-氨基苯硼酸、4-氨基苄脒、谷胱甘肽、生物素以及它们的衍生物这样的低分子化合物。上述例示的配体可以使用它们的整体，但也可以使用通过重组、酶法等获得的它们的片段。此外， 还可以是人工合成的肽或肽衍生物。作为适于抗体纯化的配体，是蛋白质A和蛋白质G，更优选是蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域，最优选是在蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域末端上添加了含有4个以上连续的组氨酸单元的肽的蛋白质，作为这种蛋白质，可以列举，例如，后述通式(1)或(3)表示的免疫球蛋白结合蛋白质。1. 2. 1.免疫球蛋白结合蛋白质作为优选的配体的一个例子的免疫球蛋白结合蛋白质(以下，也称为“蛋白质 1”)。由下述通式⑴表示。R-R2.....(1)(式中，R表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50 500个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端))。上述通式(1)中，R表示的氨基酸序列中所含的氨基酸的数目优选为8 100个， R中所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数目优选是4 8个。此外，上述通式(1)中，R2表示的氨基酸序列中所含的氨基酸数目优选为120 480个。此外，上述通式(1)中，R-优选是下述通式(2)表示的基团。R1T-.....(2)(式中，R1表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 100个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R1中，前述组氨酸连续的部位的末端与r结合)，r表示含有TEV结构域的由7 200个氨基酸构成的任意氨基酸序列)。上述通式O)中，R1表示的氨基酸序列所含的氨基酸数目优选为4 25个，R1所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数目优选为4 8个，r表示的氨基酸序列所含的氨基酸的数目优选为10 50个。作为优选的配体的另一个例子的免疫球蛋白结合蛋白质(以下，也称为“蛋白质 2”)。由下述通式(3)表示。R2-R.....(3)(式中，R表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50 500个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端))。上述通式(3)中，R表示的氨基酸序列中所含的氨基酸的数目优选为8 100个， R中所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数目优选是4 8个。此外，上述通式(1)中，R2表示的氨基酸序列中所含的氨基酸数目优选为120 480个。上述通式(3)中，-R优选是下述通式(4)表示的基团。-r-R1.....(4)(式中，R1表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 100个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R1中，前述组氨酸连续的部位的末端与r结合)，r表示含有TEV结构域的由7 200个氨基酸构成的任意氨基酸序列)。上述通式(4)中，R1表示的氨基酸序列所含的氨基酸数目优选为4 25个，r中所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数目优选为4 8个，r表示的氨基酸序列中所含的氨基酸的数目优选为10 50个。上述通式(1)和上述通式(3)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个优选含有包含选自赖氨酸、精氨酸、和半胱氨酸中的1种氨基酸的由1 50个氨基酸构成的结构域t。此时，在上述氨基酸序列中可以含有多个相同或不同的结构域t。此外，如上述通式⑵和上述通式⑷所示，r表示的氨基酸序列中可以含有TEV 结构域。通过使r表示的氨基酸序列中含有TEV结构域，可以通过被TEV蛋白酶切断来进行R与R2的分离，而且TEV结构域是用于实现本发明效果(固定化到载体上的量多，而且提高该载体的免疫球蛋白保持能力)的优选序列。此外，r表示的氨基酸序列中可以含有TEV 结构域的变异体(Mutant)(与能否被该TEV蛋白酶切断无关，与TEV结构域的氨基酸序列具有70%以上，优选90%以上的同源性)。构成本发明蛋白质1或2的氨基酸的总个数通常为70 1000，在与粒子结合的用途中使用时，优选是80 600。1. 2. 1. 1.免疫球蛋白结合结构域蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域优选是选自A结构域、B结构域、C结构域、D 结构域、和E结构域、和Z结构域中的至少一种。A结构域、B结构域、C结构域、D结构域、 和E结构域的结构域氨基酸序列记载于例如，Moks T，Abrahms L，et al. , Staphylococcal protein A consists of fivelgG-binding domains,Eur J Biochem. 1986,156,637-643的图1中。将该文献通过这种参照的方式包含在公开内容中。此外，由与上述文献中记载的各结构域的氨基酸序列具有70%以上(优选90%以上)同源性的氨基酸序列构成的蛋白质也可以作为本发明中蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域来使用。本实施方式中涉及的免疫球蛋白结合蛋白质可以具有多个相同或不同种类的免疫球蛋白结合结构域。例如，蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域可以为(D结构域-A结构域)n(在此，η表示1以上的整数(优选1 6)，D结构域与A结构域之间可以存在任意氨基酸序列)，也就是说，可以为含有包含A结构域和D结构域的重复单元的结构域。此外，蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域可以是天然型的免疫球蛋白结合结构域，或者，也可以是重组型的免疫球蛋白结合结构域。在此，重组型的免疫球蛋白结合结构域在免疫球蛋白结合活性方面可以作为与改变前的免疫球蛋白结合结构域同等的结构域来对待，例如，优选与天然型蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列保持70%以上(优选90%以上)的同源性。作为具体例子，除了 Nilsson B.之外，还可以列举蛋白质工程(Protein engineering)，1987 年，第 1 卷，2 号，107-113 页中记载的 Z 结构域、Hober S 等人的美国专利申请2006/0194955A1中记载的具有耐碱性的Z结构域的变异体(mutant)。 将上述文献通过这种参照的方式包含在公开内容中。此外，由与上述文献中记载的各结构域的氨基酸序列具有70%以上(优选90%以上)同源性的氨基酸序列构成的蛋白质也可以作为本发明中蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域来使用。1. 2. 1.2.蛋白质1或2的制造作为用于制造本发明的蛋白质1或2的标准技术，可以利用记载于例如， Frederick Μ· Ausbel 等人的 Current Protocols In Molecular Biology 或 Sambrook等人编辑的《分子克隆》(冷泉港出版社，第3版，2001)等中的公知的基因重组技术。例如，本发明的蛋白质1或2可以使用美国专利第5151350号说明书中记载的基因重组技术来制造。 也就是说，通过将用含有编码作为目标的改变蛋白质(蛋白质1或幻的核酸序列的表达载体转化到大肠杆菌等宿主，并且用适当的液体培养基培养该细胞，可以从培养后的细胞中， 大量且经济地获得本发明的蛋白质1或2。作为优选的表达载体，可以使用可在细菌内复制的已知载体中的任意一种，可以列举，例如，美国专利第5151350号说明书中记载的质粒或 Sambrook等人编辑的《分子克隆》(冷泉港出版社，第3版，2001)等中记载的质粒。此外， 为了通过将核酸导入到细菌中来转化细菌，可以使用本技术领域中已知的任意一种方法， 例如，可以利用Sambrook等人编辑的《分子克隆》(冷泉港出版社，第3版，2001)等中记载的公知方法。培养转化的细菌，回收表达的蛋白质的方法对于本领域技术人员来说是公知的。也就是说，本发明的另一个实施方式中涉及的核酸对免疫球蛋白结合蛋白质(蛋白质1或2)或其等功能变异体进行编码。本发明中，免疫球蛋白结合蛋白质的所谓“等功能变异体(functional variant) ”是指，通过部分氨基酸的添加、删除、取代、氨基酸残基的化学修饰等而被改变的免疫球蛋白结合蛋白质，与改变前的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列保持70%以上，优选90%以上的同源性，而且在免疫球蛋白结合活性方面，可以作为与改变前的免疫球蛋白结合蛋白质同等的蛋白质来对待。具体而言，由于蛋白质A的1个免疫球蛋白结合结构域是由约60个氨基酸构成的小蛋白质，因此可以，例如将编码所希望的氨基酸序列的DNA分割成数十个碱基构成的合成寡核苷酸来进行合成，通过由DNA连接酶进行的连接反应将它们连接起来插入质粒中， 获得作为目标的表达载体。此时，以在大肠杆菌中有效表达该蛋白质为目的，使用采用大肠杆菌的最适密码子的核酸序列，是对于本领域技术人员而言一般进行的方法。此外，如后述的本发明的实施例中所示，可以从金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)的基因组 DNA中，使用PCR (聚合酶链式反应)技术，构建编码所希望的氨基酸序列的DNA序列。而且，如上所述，本发明的蛋白质1或2可以是含有1个以上(优选2 12个，更优选2 5个)的免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。编码这种蛋白质的cDNA，可以通过串联地连接规定个数的编码1个免疫球蛋白结合结构域的cDNA (互补DNA)来容易地制成。通过将这样制成的cDNA插入适当的表达质粒中来利用，可以容易地制造含有1个以上的免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。例如，后述的实施例中所示的具有序列号1 8的氨基酸序列的蛋白质、或由序列号1 8中缺失、取代或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的且具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质，可以作为本发明的免疫球蛋白结合蛋白质来适当使用。1.2. 1.3.作用效果使用本发明的蛋白质1或2作为配体的填充剂与亲合层析中以往的填充剂相比， 免疫球蛋白结合蛋白质的保持量多，而且该蛋白质的保持能力好。因此，由于能够提高目标蛋白质的捕捉量，从而可以增大目标蛋白质(抗体)的结合容量。其结果是，能够有效地以低成本大量地纯化出纯度高的目标蛋白质。2.实施例以下，列举实施例，更具体地说明本实施方式中这种亲合层析用填充剂。而且，以下记载是概括性表示本发明的方式，没有特殊理由，这种记载不限定本发明。
2. 1.评价方法2. 1. 1.粒径用激光衍射/散射粒度分布测定装置(Beckman Coulter公司制造LS13320)，测定粒子的体积平均粒径。2.1.2.比表面积、体积平均细孔径、细孔径众数值使在后述的合成例4 8和比较合成例1中分别制备的亲合层析用填充剂在 40°C下真空干燥M小时而获得干燥粒子，用水银孔隙率计(岛津制作所社制造AutoPore IV9520)求出干燥粒子的比表面积、体积平均细孔径、和细孔径众数值。测定范围在细孔径范围下规定为10 5000nm。2. 1. 3.结合容量2. 1.3. 1.测定法 1使用GEHealthcare Bioscience公司制造的AKTAprime plus，测定线流速 150cm/ hr和500cm/hr、1000cm/hr下人IgG抗体的结合容量。柱容量为lmL，人IgG抗体(Lampire Biological Laboratories公司制)采用用25mM柠檬酸缓冲液(pH6. 0)稀释成lmg/mL的制品，用吸光度监控器，根据洗脱前端浓度突破(breakthrough) 5W/v%时的人IgG抗体吸附量和填充剂体积，求出结合容量。2. 1.3. 2.测定法 2用内径 0. 5cm、高度 5cm 的柱，采用 GE Healthcare Bioscience 公司制 AKTAprime plus，测定线流速300cm/hr下人IgG抗体的结合容量。人IgG抗体(Lampire Biological Laboratories公司制)采用用25mM柠檬酸缓冲液(pH6. 0)稀释到lmg/mL的制品，用吸光度监控器，根据洗脱前端浓度突破10w/V%时的人IgG抗体吸附量和填充剂体积，求出结合容量。2.2.实验例2.2. 1.合成例1(免疫球蛋白结合蛋白质的制备)通过后述的制备例1 4，制备具有图1和图2所示的氨基酸序列的免疫球蛋白结合蛋白质(SPAK(序列号1)、SPAC (序列号2)、SPAKK (序列号3)、SPATK (序列号4)、 SPA2K (序列号 5)、SPA3K (序列号 6)、SPA-His-C (序列号 7)、SPA-His-N (序列号 8))。而且，图1和图2中，R和R2与上述通式⑴或上述通式(2)中的R和R2对应(R1、 R2和r对应于上述通式(2)或上述通式中的R1、R2和r)，r中的下划线表示TEV结构域(TEV蛋白酶(肽键水解合成酶)切断部位)，R2中的下划线表示域间连接子或C末端连接子(结构域t)，参照表2)。通过MALDI-T0F质谱分析，确认了这些蛋白质各个氨基酸序列一致，具有图1和图 2所示的氨基酸序列。2. 2. 1. 1.制备例1 (PCR扩增和限制性内切酶的消化)通过PCR来扩增金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus,ATCC, 10832)来源的蛋白质A(D结构域+A结构域)的cDNA。为了辅助后述的亚克隆，引物(参照表2)被设计成具有对应的限制性内切酶部位。如表1 所示，分别编码 SPAK、SPAC、SPA2K、SPA3K、SPAKK、和 SPATK 的 DNA 片段由限制性内切酶NcoI和Hindi 11 (New-England BioLab制)所消化，并被插入到载体pETM-ll(参照图 3，以馈赠形式从D. Shibly,EMBL Heidelberg，Heidelberg，Germany 获得) 中。而且，如表1所示，编码SPA-His-N的DNA片段由限制性内切酶NcoI和HindIII 所消化，并被插入到载体pETM-10(参照图3，以馈赠形式从D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germany 获得)中。并且，如表1所示，为了形成在C末端上具有组氨酸标签(由组氨酸6残基构成的肽)的免疫球蛋白结合蛋白质的SPA-His-C，使用载体pET29(参照图3，Novagen公司制造)。可以对载体pED9使用的限制性内切酶是NdeI (New-England Bio Lab制造)和 XhoI (New-England Bio Lab 制造)。而且，图3中所示的3种表达载体全都含有卡那霉素抗性基因作为选择性标记。此外，图3所示的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列中，“Tev”表示TEV蛋白酶识别部位(氨基酸序列ENLYFQG)。TEV蛋白酶识别氨基酸序列ENLYFQG，将Q与G之间切断。通过设计基于SPAK插入序列的1对引物，而导入上述限制性内切酶。此外，使用表2所示的引物(序列号9 17)来进行PCR扩增。而且，SPA-His-N的DNA片段还可以通过用限制性内切酶(表1)消化含有SPAK的质粒来直接获得。本合成例中，SPA-His-N的DNA片段通过用限制性内切酶(表1)消化含有SPAK的质粒来直接获得。[表1]
权利要求
1.亲合层析用填充剂，其是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，配体与所述多孔性母粒子结合，所述多孔性母粒子具有通过使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而获得的开环环氧基。
2.根据权利要求1所述的亲合层析用填充剂，其含有取代或非取代的2，3-二羟基丙基作为所述开环环氧基。
3.根据权利要求1或2所述的亲合层析用填充剂，所述配体是含有蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的亲合层析用填充剂，所述蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域是选自A结构域、B结构域、C结构域、D结构域、E结构域、和Z结构域中的至少1种。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的亲合层析用填充剂，所述配体是下述通式(1) 表示的免疫球蛋白结合蛋白质R-R2.....(1)式中，R表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 300个氨基酸构成的氨基酸序列、R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50 500个氨基酸构成的氨基酸序列，在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端。
6.根据权利要求5所述的亲合层析用填充剂，上述通式⑴中，R-是下述通式(2)表示的基团R1T-.....(2)式中，R1表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 100个氨基酸构成的氨基酸序列，在此，R1中，所述组氨酸连续的部位的末端与r结合、r表示含有TEV结构域的由7 200个氨基酸构成的任意的氨基酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的亲合层析用填充剂，所述配体是所述通式(1)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个含有结构域t的配体，所述结构域t包含选自赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1种氨基酸且由1 50个氨基酸构成。
8.根据权利要求1 4中任一项所述的亲合层析用填充剂，所述配体是下述通式(3) 表示的免疫球蛋白结合蛋白质R2-R.....(3)式中，R表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50 500个氨基酸构成的氨基酸序列，在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端。
9.根据权利要求8所述的亲合层析用填充剂，所述通式(3)中，-R是下述通式(4)表示的基团-r-R1.....(4)式中，R1表示含有4 20个组氨酸连续的部位的由4 100个氨基酸构成的氨基酸序列，在此，R1中，所述组氨酸连续的部位的末端与r结合、r表示含有TEV结构域的由7 200个氨基酸构成的任意的氨基酸序列。
10.根据权利要求8或9所述的亲合层析用填充剂，所述配体是所述通式(3)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个含有结构域t的配体，所述结构域t 包含选自赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1种氨基酸且由1 50个氨基酸构成。
全文摘要
亲合层析用填充剂是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，配体结合在所述多孔性母粒子上，所述多孔性母粒子具有使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而得到的开环环氧基。
文档编号C07K14/31GK102165312SQ200980137428
公开日2011年8月24日 申请日期2009年9月24日 优先权日2008年9月25日
发明者冈野友亮, 安陪毅由, 宫路正昭, 河合孝广, 王勇, 田守功二, 福田哲夫, 籾山昌辉 申请人:Jsr株式会社