专利名称：碱性富含脯氨酸泪基因产物如opiorphin作为生物标志的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及碱性富含脯氨酸泪蛋白(Basic Prolin-rich Lacrimal Protein, BPLP)基因的产物如Opiorphin，更具体地是涉及BPLP基因产物作为生物标志用于对象中病理状态或治疗效果的预测、诊断或监测的用途，以及相关的使用方法。现有技术简述从综合性后基因组、生物化学和药理学方法所获得的汇总数据提供了 NEP(中性内肽酶，中性溶酶)和AP-N(氨肽酶-N)外脑啡肽酶的生理学拮抗剂在哺乳动物中存在的证据。该抑制剂首先在大鼠中被鉴定(QHNPR-肽)并被命名为Sialorphin(如W090/03981、 W098/00956、W001/00221、W002/041434中所述)，并且最近在人类中被鉴定OlRFSR肽)且被称为 Opiorphin (如 W005/090386 中所述)。Sialorphin是外分泌和内分泌肽信号。其是痛觉抑制剂，并且通过增强内源性和δ-阿片样物质受体依赖性脑啡肽能途径而起作用。其表达受激活性雄激素调节(activational androgenic regulation)并且其分泌在雄性大鼠中受到针对环境应激的肾上腺素能介导的应答的诱发(Rougeot et al. , 1997, Am. J. Physiol. 273 (4pt2), R1309-1320)。Sialorphin识别深入参与矿物离子浓度的器官中的特异性靶位点，并因而可以在与矿物离子失衡相关的代谢病症中具有治疗作用，例如主要由体液或组织中的矿物离子失衡所引起的骨、牙齿、肾、肾小肠(kidney intestine)、胰、胃黏膜或甲状旁腺的病症。因此， Sialorphin可用于预防或治疗疾病如甲状旁腺功能亢进或甲状旁腺功能减退、骨质疏松、 胰腺炎、下颂下腺结石、肾结石或骨营养不良(W098/37100)。Sialorphin也可通过提供改善的对环境的意识和警觉性、改善的对环境的适应性和持续专注的能力、以及提高的对环境的兴趣和觉醒的能力且进攻性不增加，而被用于治 ^f DSM^fSE (JAL" Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders" (DSM), American Psychiatric Assoc.，特别是 DSM-III (1980)，DSM-III-R(1987)，DSM-IV(1994) 和DSM-IV-TR (2000))，如人际交往和行为障碍的病症，包括性病症如男性勃起功能障碍(Μ. E. D.)和性欲减退病症(hypoactive sexual desire disorder, H. S. D. D.) (W001/00221)。Sialorphin作为膜金属肽酶如NEP和APN的天然调节剂特别是作为抑制剂而起作用。因此，Sialorphin可用于预防或治疗疾病如动脉硬化、疼痛、肿瘤、癌症和感染等 (W002/051435)。Opiorphin被认为是Sialorphin的功能性人同源物。其源于BPLP蛋白(“碱性富含脯氨酸泪蛋白”)(W005/090386，Rougeot et al.)。BPLP基因主要是在人泪腺和下颂下腺表达。Opiorphin是QRFSR肽，其抑制两种脑啡肽分解代谢外酶，人中性外-内肽酶 (ecto-endopeptidase)hNEP (EC3. 4. 24. 11)禾口人夕卜一氛月太醇(ecto—aminop印tidase)hAP-N(EC 3.4.11.2)。Opiorphin在化学和机械疼痛模型中通过激活内源阿片样物质依赖性传递而展现出强力的镇痛活性。在急性机械疼痛的行为大鼠模型即刺痛测试 (pin-pain test)中，Opiorphin的疼痛抑制效力与吗啡一样有效。Opiorphin参与内源阿片样物质依赖性途径与脑啡肽相关的激活，其与情绪相关状态和痛觉的调节有关。此外，由于其在体内的性质，Opiorphin可能具有作为分子途径的潜在起始物的治疗应用， 可以用来开发用于疼痛缓解的临床处理和缓解情绪病症的新候选药物(Wisner et al., PNAS 103(47) :17979-17984(2006)) Opiorphin也可用于预防或治疗任何水-矿物质失衡(hydro-mineral imbalance)，包括病症如骨骼、牙齿、肾、甲状旁腺、胰、小肠、胃黏膜和唾液腺病症。该病症可以是甲状旁腺功能亢进或甲状旁腺功能减退、骨质疏松、胰腺炎、下颂下腺结石、肾结石或骨营养不良(W005/090386)。为了对病理状态进行预测、诊断或评价病理状态的演变包括在对象中的治疗效率，现有技术中需要用于病理状态如疼痛综合征、水-矿物质失衡和社交病症 (socio-relational disorders)的生物标志。概述本发明提供了 BPLP基因产物在对象中病理状态的预测、诊断或监测中的用途。所述BPLP基因产物可被用作生物标志。本发明涉及使用BPLP基因产物来对对象中的病理状态进行预测、诊断或监测的方法。所述方法包括以下步骤a)测量BPLP基因产物在得自所述对象的生物学样品中的定量水平；b)将步骤a)中测量的BPLP基因产物的定量水平与BPLP基因产物的参考值进行比较；其中与所述参考值相比BPLP基因产物的水平显著较高或较低是用于所述病理状态的预测、诊断或演变的指征。本发明还提供了用于预测、诊断或监测测试的试剂盒。所述试剂盒包含-特异性识别BPLP基因产物的结合剂，-用于对所述结合剂与BPLP基因产物的结合进行检测的试剂，以及-任选存在的，阳性和/或阴性对照样品。附图简述
图1描述了用于对人Opiorphin进行定量的竞争性ELISA免疫测定法。图2描述了代表性的Opiorphin-ELISA剂量-应答曲线。(X轴对数尺度的QRFSR 肽浓度；Y轴在标准肽存在时的特异性结合(B)/在标准肽不存在时的特异性结合(BO)的百分比。图3描述了与Sialorphin (菱形)相比较的Opiorphin (方块)的免疫测定的特异性。图4描述了来自健康人志愿者的唾液中的代表性Opiorphin-ELISA应答曲线(黑色方块标准QRFSR肽(Opiorphin)；菱形唾液提取物n° Iajav(基础分泌)；圆圈唾液提取物n° la-2ap (经刺激的分泌))。图5描述了男性的唾液中的Opiorphin的定量(第1道，基础分泌；第2道经刺激的分泌；两组之间的差异P < 0. 001 ,Mann-Whitney检验)和女性的唾液中的Opiorphin 的定量(第3道，基础分泌；第4道经刺激的分泌。经Kruskal-Walli检验(KWT)方差分析检验进行的各组间的统计分析P < 0. 0001)。在经刺激的唾液分泌条件下男性和女性的各唾液组之间的差异均为P < 0. 005，Mann-Whitney检验。每个方框代表数值的全分布， 而内部线条表示中位值。图6描述了在男性和女性的唾液中Opiorphin的定量，其中与图5中的统计学分析相比，一个女性唾液样品被排除在统计学检验之外。(第1道基础条件-男性；第 2道经刺激的条件-男性；第3道基础条件-女性；第4道经刺激的条件-女性)。 经Kruskal-Wallis检验(KWT)方差分析检验进行的各组间统计分析P < 0. 0001。以 Mann-Whitney检验进行的两组间统计分析,P < 0. 01 ；***P < 0. 001。图7描述了两种人血浆提取物n° Ia-Il和la-12的HPLC层析洗脱谱和 Opiorphin-ELISA 分析。图8描述了来自人志愿者的精液中Opiorphin的定量与提取条件的函数关系不存在或存在0. IN HCl或ImM EDTA加0. IN HCl。(经KWT分析组之间的方差P = 0. 0004 ； 经Mann-Whitney U-检验两组之间的差异,P < 0. 01)。图9描述了来自人志愿者的精液中Opiorphin的定量。(第1道健康志愿者；第 2道先天性双侧发育不全的志愿者)。图10描述了两种人精液提取物n° 3a-13 (健康)和北_02 (发育不全)的HPLC 层析洗脱谱和Opiorphin-ELISA分析图11描述了来自健康人志愿者的尿中的代表性Opiorphin-ELISA应答曲线(方块标准QRFSR肽(Opiorphin)；菱形尿提取物n° la-14 ；圆圈尿提取物n° lb-15)。图12描述了来自人健康志愿者的眼泪中的代表性Opiorphin-ELISA应答曲线(方块标准QRFSR肽(Opiorphin)；菱形眼泪提取物η ° la-ΙΟ ；圆圈眼泪提取物 n° lb-15)ο图13描述了来自人志愿者的眼泪中Opiorphin的定量。(第1道女性；第2道 男性)。以Mann-Whitney U-检验两组间的差异:**P < 0.01o发明详述内源性阿片样物质神经肽，即脑啡肽，在伤害感受传递的负反向控制(negative retro-control)中，以及在控制注意力、动机与情感状态适应性平衡的大脑结构的活性调节中起关键作用。本发明的发明人出人意料地发现碱性富含脯氨酸泪蛋白(BPLP)基因产物(如Opiorphin)可用于保护这些内源性阿片样物质神经肽免于被脑啡肽酶所失活。因此，从生理学角度来看，BPLP基因产物(如Opiorphin)可有利地用作人类中脑啡肽酶活性的生理学调节物。更具体地，BPLP基因产物(如Opiorphin)可进一步有利地用作控制疼觉、情绪平衡和社交行为的途径的新调节物。BPLP基因产物(如Opiorphin)作为NEP抑制剂也可用作控制水矿物质平衡的途径的新调节物。本发明的发明人有利地发现，从病理生理学的角度来看，BPLP基因产物具有特定的应用，用于病理状态或治疗效力的预测、诊断或监测，以及可用作在各种病理情况中具有潜在的预测、诊断或监测价值的生物标志。
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更具体地，本发明人意外的发现，在各种生物学液体中的Opiorphin分泌水平可以很容易地被检测和定量，并且Opiorphin水平根据对象的生理学状态和/或状况而显著变化，例如基础vs.经刺激的，或者男性vs.女性。具体而言，统计分析表明，与基础条件相比，在口腔黏膜被柠檬酸刺激的条件下在健康对象中Opiorphin的唾液分泌显著增加。此外，在唾液(salica)分泌经刺激的条件下，男性的唾液中Opiorphin水平显著高于同年龄女性。Opiorphin分泌水平的这些差异足以被检测到。进一步发现Opiorphin水平在给定的群体(例如具有给定的年龄、性别和生理学状态)中是均一的。此外，Opiorphin分泌水平不仅可在唾液中检测到，而且还可在各种其他生物学液体中检测到。因此，Opiorphin水平的测量可以例如用于鉴别对象的病理状态是否与 Opiorphin循环水平的Opiorphin中的变化有关联，和/或用于设计对患者的治疗方案。I-BPLP基因产物及其用途因此，本发明的一个方面提供了碱性富含脯氨酸泪蛋白(BPLP)基因产物，其在例如对象的病理状态或治疗效力的预测、诊断或监测中被用作生物标志。在具体实施方案中，本发明目的在于确定和/或确认对象中的病理状态是与BPLP 基因产物如Opiorphin相关联的(即该病理状态是由所述BPLP基因产物的异常产生和/ 或分泌所引起的，和/或所述BPLP基因产物的异常产生和/或分泌是该病理状态的结果)。 事实上，许多病理状态可以由潜在参与所述病理状态的多种因素和/或缺陷所引起。因此， 需要诊断该病理状态的起因和/或结果。因此，确定与正常个体中BPLP基因产物水平的代表性参照值相比，来自所述对象的生物学样品中BPLP基因产物的水平显著较高或较低，这使得可以诊断出该对象患有与所述BPLP基因产物相关的病理状态。换言之，本发明的方法和用途使得可以确定所述病理状态是否与所述BPLP基因产物的产生和/或分泌水平的变化相关，更具体地，是否与所述BPLP基因产物的分泌水平的变化相关。了解到BPLP基因产物如Opiorphin在脑啡肽介导的途径中起作用，则本发明的方法和用途进一步使得可以诊断出所述病理状态是否与脑啡肽介导途径中的缺陷相关。因此，本发明的一个方面提供了碱性富含脯氨酸泪蛋白(BPLP)基因产物，其例如被用作生物标志用于确定和/或确认病理状态与对象中的BPLP基因产物相关。应理解本发明所涉及的BPLP基因产物可具有蛋白质或核苷酸形式。在用作生物标志的所涉及的BPLP基因产物具有核苷酸形式的情况中，这种核苷酸形式可以是，但不限于，BPLP mRNA。在用作生物标志的所涉及的BPLP基因产物具有蛋白质形式的情况中，这种蛋白质形式可以是由BPLP蛋白组成的BPLP肽、衍生自BPLP蛋白的肽、BPLP前体蛋白或所述BPLP肽的成熟产物。在优选的实施方案中，本发明的BPLP基因产物是人BPLP蛋白，或由其衍生的肽或成熟产物，或其前体。在最优选的实施方案中，本发明的BPLP基因产物是Opiorphin，即具有氨基酸序 ^lJ QRFSR(SEQ ID NO 3)的五肽。本发明所涉及的BPLP蛋白可以例如是由人BPLP基因所编码。从Dickinson等 (Curr Eye Res. 15 (4)，377-386，1996)克隆和鉴定的 cDNA 预测，人 BPLP 基因编码 201 个氨基酸的多肽序列(具有潜在的分泌信号肽)。BPLP基因在人类泪腺和下颂下腺中表达。 SEQ ID NO. 1显示了编码BPLP蛋白的cDNA序列，而SEQ ID NO. 2显示了 BPLP氨基酸序列。
本发明所涉及的BPLP基因产物可以例如是前体蛋白或BPLP前体蛋白的成熟产物。如本文所用，“BPLP的成熟产物”是指通过BPLP前体的特异性裂解所获得的肽，所述裂解是通过天然成熟酶或转化激素原的酶，或者相关的单个或成对的碱性氨基酸裂解酶如弗林蛋白醇(furin)、PC 转变醇或 PACE4(Seidah et al. , Intramolecular Chaperones and Protein Folding, 1995, 9 181-203) 0激素原转变酶将无活性前体转化成活性肽，并且其包括例如弗林蛋白酶、PC转变酶或PACE 4。成熟共有位点的序列优选遵循以下共有序列[!1/1 /1(]-&-[1 /1(]-[1 /1(]，其中[H/R/K]表示该氨基酸是H，R或K，&代表三个氨基酸的链，而[R/K]表示该氨基酸是R或K。激素原转变酶裂解二元残基[R/K]-[R/K]之间的共有单位。激素原转变酶是本领域技术人员公知的并且由^^!!!!^^! et al.所特别描述 (2006FASEB J 20(12) :1954-63)。本发明所涉及的BPLP的成熟产物之一是Opiorphin，其是具有氨基酸序列QRFSR(SEQ ID NO 3)的五肽。本发明所述的肽可以经常规方式中由液相或固相肽合成来制备，即通过相继偶联而将不同的氨基酸残基掺入(在液相从N-末端到C-末端，或者在固相从C-末端到 N-末端)，其中N-末端和反应性侧链事先用常规基团封闭。对于固相合成，可以特别使用 Merrifield所描述的技术。或者也可以使用Houbenweyl在1974年所描述的技术。更多细节，可参考W098/37100。本发明的肽也可利用遗传工程的方法来获得。2-BPLP基因产物的使用方法根据本发明的另一方面，提供了 BPLP基因产物的使用方法。更具体地来说，本发明的发明人提供了 BPLP基因产物(例如Opiorphin)作为各种生物学液体中的生物标志的用途，所述生物学液体例如但不限于，患有例如口腔灼热综合症(Mouth Burning Syndrome)的患者的唾液，该病是一种病因不明的慢性疼痛综合征；患有例如抑郁症及相关的社交病症或神经性慢性疼痛的患者的血浆和尿液，患有例如勃起功能障碍的患者的精液。本发明的这个特定方面有利地通过用于对象中病理状态的预测、诊断或监测的方法而实现。预测或者预测测试是指确定或确认对象中发生病理状态的可能性。诊断或者诊断测试是指确定或确认对象中的病理状态。监测测试是指确定或确认对象中病理状态的演变，包括治疗的效率。应理解病理状态、病症、疾病或从病理状态所衍生出来的状况是指相对于健康对象的任何健康变化。在具体实施方案中，本发明的方法目的是确定和/或确认对象中的病理状态与 BPLP基因产物相关。在优选的实施方案中，当本发明方法或用途目的在于性病症的预测、诊断或监测或者在于确定和/或确认对象中的性病症与BPLP基因产物相关时，使用精液。性病症包括， 例如，男性勃起功能障碍、阴茎异常勃起、性欲减退病症或性欲亢进病症。在另外的优选的实施方案中，当本发明方法或用途目的在于受损的人际关系和行为病症的预测、诊断或监测或者在于确定和/或确认对象中受损的人际关系和行为病症与 BPLP基因产物相关时，使用脑脊液。受损的人际关系和行为病症包括，例如，回避行为病症 (avoidance disorder)、意识降低病症(decreased awareness disorder)、孤独症、觉醒病症(arousal disorder)、入院就医癖(hospitalism)、受损的人际功能及与外界的关系、精神分裂样人格病症、精神分裂症、抑郁症、严重抑郁综合征、对环境兴趣降低、与性相关的社会活动受损、性行为受损包括早泄和性亢进、恐慌症(panic disorder)、胸部疼痛和创伤后应激病症、注意力缺陷(在成人和儿童中)、活动过度(在成人和儿童中)、注意力缺陷/活动过度病症(ADHD)、强迫症(OCD)和情绪病症。在另外的优选实施方案中，当本发明方法或用途目的在于口腔灼热综合症或颞下颂疼痛的预测、诊断或监测时，使用唾液。血浆、血清和尿液可用于预测、诊断或监测本文所述的任何病理状态，以及用于确定和/或确认本文所述病理状态与BPLP基因产物相关。如本文所用，患者或对象由脊椎动物组成，例如，哺乳动物，如人，无论他/她的年龄、性别及一般状况。儿童和婴儿也涵盖在内，除非所研究的生物学液体是精液或乳汁。被评估的对象或者测试对象可以是无症状的，可以是被认为可能患有受损疾病或状况，或者可以是具有受损疾病或状况的症状。也可以测试怀疑具有目标疾病的对象或者已经显示出受损疾病或病症或病理状态的症状的对象。根据本发明，对象优选是人。本发明所涉及的方法因此包括以下步骤a)测量得自所述对象的生物学样品中如上所定义的BPLP基因产物的定量水平；b)将步骤a)中所测量的BPLP基因产物的定量水平与BPLP基因产物的参照值进行比较；其中与所述参照值相比BPLP基因产物的水平显著较高或较低是所述病理状态的预测、诊断或演变的指征。本发明方法可进一步包括为所述对象设计治疗方案的步骤。例如，如果在对象中发现显著较高水平的BPLP基因产物，则可以设计基于使用BPLP基因产物抑制剂的治疗。 所述抑制剂可以，例如，抑制BPLP基因产物的分泌和/或产生或者其生物学活性。相反，如果在对象中发现显著较低水平的BPLP基因产物，则可以设计基于使用BPLP基因产物激动剂的治疗。这种激动剂包括，例如，SEQ ID N0:3或4的肽，以及W0/2009/124948中描述的肽、肽衍生物和肽模拟物。对于预测或诊断，所述“参考值”是通过对得自健康对象的代表性组的值所进行的统计学分析而建立的。这可取决于样品的性质、对象的年龄和/或性别、神经内分泌状态等。其可以被预先确定为对象中BPLP基因产物定量水平的测量值。对于监测，所述“参考值”可以如上一段落所述那样来建立，或者另外或额外地得自先前所测试的对象的值。对照对象是健康对象，或者当需要评估对象的病理状态的演变时，所述对象可以是先前所测试的对象。应理解，本文使用的“生物学样品”是指来自对象的流体，包括血清、血浆、血液、脑脊液、尿液、乳汁、眼泪、精液、唾液或组织提取物或者组织或器官活检样品如例如脑、脊髓、 骨组织、肾、前列腺和性腺、胎盘、牙组织、胃的腺黏膜、小肠、唾液腺组织、乳腺。BPLP蛋白成熟产物可以从样品中提取，例如，通过酸-甲醇提取法和/或经 C18-kpPak筒柱(cartridge)提取法来提取。继而可以用反相C18-HPLC层析而将其纯化。 当样品是唾液、精液、眼泪或尿时，BPLP蛋白成熟产物可以例如通过酸-甲醇提取法来提取。当样品是血浆或乳汁时，BPLP蛋白成熟产物优选用CIS-kpPak筒柱来提取。当样品是血浆时，BPLP蛋白成熟产物可以通过反相C18-HPLC层析来纯化。本文中所使用的术语“显著”是指ρ值小于或等于0.05。BPLP基因产物的表达或产生的定量水平可以例如通过测定BPLP mRNA.BPLP前体蛋白或其成熟产物如Opiorphin-五肽而进行确定。这种测定方法包括将生物学样品与结合配偶体(binding partner)接触， 所述结合配偶体能与样品中存在的BPLP基因产物选择性地相互作用。所述结合配偶体可以是抗体(可以是多克隆或单克隆的)或分子探针。生产抗体的方法可以很容易地调适以产生用于本发明的诊断、预测和监测方法的抗体。例如，BPLP基因产物的存在或产生可以通过将生物学样品与特异性识别BPLP基因产物的抗体接触来探测，例如使用标准电泳和液体或固体免疫诊断技术，包括免疫测定法如竞争型、直接反应型或夹心型测定。这些测定包括但不限于Western印迹；凝集测试；酶标记和介导的免疫测定法如ELISA ；放射免疫测定，如使用放射性碘化或氚化的BPLP蛋白或其任何成熟产物的那些测定；免疫电泳；免疫沉淀等。这些反应通常包括揭示性标记，如荧光的、化学发光的、放射性的、酶的标记或染料分子，或包括用于检测的抗原和抗体之间或者与其反应的抗体之间的复合物的形成的其他方法。可以在本发明实践中使用的固体支持物，包括这样的支持物，如硝化纤维(例如，膜或者微量滴定孔形式的)；聚氯乙烯(如片层或微量滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(如珠或微量滴定板)；聚偏氟乙烯(polyvinylidine fluoride)；重氮化的纸；尼龙膜；活化的珠，磁性反应珠，等等。因此，在一个特定的实施方案中，被结合的来自生物学样品的BPLP基因产物的存在可以很容易地通过使用包括另一个抗体的第二结合剂由本领域已知的方法而检测，所述第二结合剂可以很容易地缀合可检测的酶标记，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或尿素酶。继而使用适当的酶底物以生成可检测的信号，如例如生色或荧光信号。在其他相关的实施方案中，可以用本领域技术人员已知的方法实行竞争型ELISA技术。为了进行上述免疫测定，上述的测定试剂包括抗体可以在具有适当的说明和其他必要试剂的试剂盒中提供并。根据所使用的特定免疫测定，所述试剂盒还可以包含合适的标记和其他封装的试剂和材料(即洗涤缓冲液等)。标准免疫测定如上述那些，可以利用这些试剂盒来进行。在优选的实施方案中，BPLP基因产物的定量水平用优选包括多克隆抗QRFSR抗体的免疫测定法来测量，如例如竞争型ELISA。进行竞争型ELISA测定的方法是本领域技术人员熟知的。已发现包括如下步骤的方法对检测Opiorphin特别有利和灵敏-用SEQID NO 4的肽包被微量滴定板，其中6_聚乙烯或12-聚乙烯接头已被引入第一个和第二个残基之间(例如40ng所述肽每200 μ 1/孔)；-任选地将所述微量滴定板温育，例如在4°C于轻微振荡下过夜；-任选地洗涤所述微量滴定板，例如2-8次，优选4-5次；-任选地加入饱和缓冲液并洗涤所述微量滴定板，例如2-8次，优选4-5次；-在根据本发明的兔多克隆抗QRFSR抗体存在下(例如在1/80000)加入怀疑含有 Opiorphin的样品(优选预先在4°C温育过夜)；-任选地洗涤所述微量滴定板，例如2-8次，优选4-5次；-以例如1/3000加入经标记的抗兔抗体(例如来自Pierce的IgG-HRP抗体)；-任选地将所述微量滴定板温育，例如在22°C1小时；
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-任选地洗涤所述微量滴定板，例如2-8次，优选4-5次；-加入适合检测所述经标记的抗兔抗体的生色底物(例如来自Pierce的HRP生色底物)；-任选地将所述微量滴定板温育，例如在22°C30分钟；-任选地终止所述反应(例如通过添加4NH2S04)；及-检测由生色底物所发射的信号(例如通过测量450nm波长的光吸收)，由此对所述怀疑含有Opiorphin的样品中的Opiorphin进行检测(和/或定量)。抗QRFSR抗体可以例如通过实施例中所描述的方法而获得。产生特异结合SEQ ID NO 3的QRFSR肽Opiorphin的多克隆抗体的这种方法可以包括如下步骤a)将以共价方式缀合至卵清蛋白-(CO-NH)-分子的SEQ ID NO 4的肽施用于非人动物如兔；以及b)选择特异性结合所述QRFSR肽的多克隆抗体。以共价方式缀合至卵清蛋白-(CO-NH)-分子的SEQ ID NO 4的肽可以例如对应于 SEQ ID NO :5的肽，其中卵清蛋白-(CO-NH)-分子共价结合至SEQ ID NO :4的肽的第一个残基。本发明还涉及可由这种方法获得的特异性结合SEQ ID NO :3的QRFSR肽 Opiorphin的多克隆抗体(例如3RBF-SAB抗体)。本发明的主题还包括获得杂交瘤的方法，所述杂交瘤分泌特异性结合SEQ ID NO 3的QRFSR肽Opiorphin的抗体，该方法包括如下步骤-将以共价方式缀合至卵清蛋白-(CO-NH)-分子的SEQID NO 4的肽施用于非人动物如兔；-从这个动物中取出分泌免疫球蛋白的淋巴细胞；-将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，从而获得至少一种分泌免疫球蛋白的杂交瘤；-选择分泌所述特异性结合SEQID NO 3的QRFSR肽Opiorphin的抗体的杂交瘤； 以及-任选地纯化所述抗体。这些步骤相应于获得杂交瘤的那些常规技术，其原理如Kohler和Milstein所述 (1975 Nature 256 :495-497)。本发明的主题还包括这种杂交瘤及由所述杂交瘤分泌的抗体。BPLP基因产物的定量水平还可以用mRNA来测量。可以使用与BPLP基因所表达的 mRNA特异性杂交的寡核苷酸或其片段。只要知道BPLP基因序列或cDNA序列，本领域技术人员知道如何制备这种寡核苷酸。例如，杂交可以用如下溶液获得，所述溶液含有0. 5M磷酸钠，pH7. 2 ；7%十二烷基硫酸钠(SDS) ；ImM EDTA ；牛血清白蛋白；以及经超声处理的鲑鱼精液 DNA :100mg/mL (US6, 916，607，Rosinski-Chupin 等)。首先，BPLP基因产物的水平在健康对象的代表性组中测量，或者在其病理状态的演变经监测的对象中测量，以获得BPLP基因产物的“参照值”。其次，在对象中测量BPLP基因产物水平。第三，比较所述水平。如何它们显著不同(p ( 0. 05)，较低或较高，其可以用于特定病理状态的预测、诊断或监测。如实施例中所述，在由柠檬酸刺激口腔黏膜的条件下，Opiorphin的唾液分泌显著增加，在男性中738士 146，相比于基础分泌的59士 17ng/ml，p < 0. 001，η = 6-10 ；而在女性中:247士68vs 基础 61 士23ng/ml，ρ < 0. 01，η = 10-13。在患有病理状态的对象中，例如但不限于水矿物质失衡、痛觉过敏或痛觉低下综合征、抑郁状态和社交行为失衡，BPLP基因产物水平与对照对象中不同，并且将会是该病理状态的指征。可以在本发明框架内预测、诊断或监测的病理状态将在下文进一步描述。BPLP基因产物的使用方法可以用作标记用于评估治疗效力。为了确定状况的演变和/或确定治疗效率，可以非常有用的是测试对象中BPLP基因产物的表达，并通过例如几天后、几周后或几个月后第二次测试对象而监测药物的作用或所述状况扩散。在该情况中，第二次测试的结果可以与第一次测试的结果进行比较，并且通常也与用“健康”对象所获得的结果进行比较。由此所述“对照对象”是指同一测试对象或者“健康对象”。还提供了用BPLP基因产物作为生物标志的用于预测、诊断或监测测试的试剂盒。 所述试剂盒可包括特异性识别BPLP基因产物的结合剂(例如抗体或分子探针)、以及检测所述结合剂与BPLP基因产物的结合的试剂。也可以包括对照样品(阳性和/或阴性)。3-病理状态调节膜金属外肽酶如NEP和APN的活性的BPLP基因产物，可用于预测、诊断或监测许多种病理状态。例如，PCT/IB2005/000700教导了 BPLP基因产物起作用的数种疾病。因此，本发明方法和用途可用于预测、诊断或监测疼痛，尤其是急性和慢性疼痛、 内脏炎性和神经性疼痛。具体而言，本发明的方法和用途可用于预测、诊断或监测痛觉过敏，包括纤维肌痛、慢性背痛、颞下颂疼痛病症、口痛和内脏痛超敏反应。对任何水矿物质失衡的预测、诊断或监测也是本发明的目的。在目标病症中，可提及的是由水矿物质失衡所引起的的骨、牙齿、肾、甲状旁腺、胰、小肠、胃黏膜、前列腺和唾液腺病症。具体而言，所述病症可以选自由以下组成的组甲状旁腺功能亢进症或甲状旁腺功能减退、骨质疏松症、骨质减少、低血磷症(hypophosphatemia)、胰腺炎、下颂下腺结石、肾结石和骨营养不良。进一步感兴趣的是受损的人际和行为病症的预测、诊断或监测。各种这类精神病症在W002/051434中有描述。具体而言，本发明涉及选自由如下组成的组的任何病理状态， 回避行为病症、意识降低病症、孤独症、注意力缺陷、活动过度症、觉醒病症、入院就医癖、受损的人际功能及与外界的关系、精神分裂样人格病症、精神分裂症、抑郁症、严重抑郁综合征、对环境兴趣降低、与性相关的社会活动受损、性行为受损包括早泄和性亢进、恐慌症、胸部疼痛和创伤后应激病症。本发明的病理状态还包括神经变性疾病。术语“神经变性疾病”指的是神经系统特别是涉及脑部的疾病或病症，其表现的症状特点是脑部或神经功能障碍，例如，短期或长期记忆退步(lapse)或缺陷、痴呆、认知缺陷、平衡和协调问题、以及情绪和行为缺陷。本发明更具体涉及的是与淀粉样变性(amyloidosis)相关的神经变性疾病。当来自证实这种症状的对象的脑组织的组织病理(活检)样品显示出淀粉样斑(amyloid plaque)形成时，此类疾病“与淀粉样变性相关”。由于从活的对象中获得大脑特别是人大脑的活检样品非常困难，或者可能根本无法获得，通常神经变性疾病的一或多种症状与淀粉样变性的相关性是基于其它标准，而非活检样品中出现淀粉样沉积(cbposit)如斑或小纤维(fibril)。在具体的实施方案中，根据本发明，神经变性疾病是阿尔茨海默病(AD)。本领域已知的并且在本发明范围内的其他此类疾病包括但不限于，偶发性大脑淀粉样血管病、遗传性大脑淀粉样血管病、唐氏综合征、Guam氏帕金森痴呆(Parkinson-Dementia of Guam)、以及年龄相关的无症状淀粉样血管病。此外，PCT/EP2009/056390教导了 opiorphin 具有精神兴奋剂(psychostimulant) 的活性。因此，本发明的方法和用途可用于预测、诊断或监测选自由如下组成的组的病理状态发作性睡病、睡眠过度、警觉下降(vigilance drop)、注意力缺陷(在成人和儿童中)、 活动过度(在成人和儿童中)、注意力缺陷/活动过度病症(ADHD)、强迫症(0CD)、和情绪病症如抑郁状况和抑郁症(“严重抑郁病症”)，后者包括原发性抑郁症(primary depression) (“严重抑郁病症，单次发作”)和难治性抑郁(resistant depression)( “严重抑郁障碍， 复发”)、双极症(bipolar disease) ( I型和/或II型的)、心境恶劣病症和循环性情感病症。本发明将通过下述实施例而更容易理解。这些实施例是例证本发明的广泛用途而不是要限制其范围。在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以在其中进行修饰和改变。 尽管任何类似于或等价于本文所述的方法和材料都可以用于本发明测试的实施，但在此描述的是优选的方法和材料。
实施例材料和方法A.生物学液体的取样、保存和运输方案如下-取得生物学样品(即对象的2_5ml唾液、30ml血液、20ml尿液)并将其收集到预先冷却的聚丙烯试管G、15或50ml)内，其中含有肽酶抑制剂的混合物P6fabloc 0. 4mM, 抑蛋白酶肽(Aprotinin) 1000KIU/ml, EDTA ImM，苯丁抑制素(bestatine) 150 μ M，亮抑酶肽(Ieup印tin) 1 μ Μ，胃蛋白酶抑制剂(ρ印statin) 1 μ M(Rougeot and al. Am J Physiol, on 1997)。对于精液，肽酶限于(根据先前验证测试)不存在抗凝剂(EDTA)的抑蛋白酶肽禾口 Pefabloc0-将它们在4000Xg和4°C离心15分钟并收集上清(即血液的血浆部分)；-将所有样品立即储存在-80°C；及-将它们在干冰容器中运输到实验室。B.用于Opiorphin的定量免疫测定法的开发考虑到Opiorphin的大小较小(650Da)，竞争型免疫测定法适用于对该肽进行定量即，待测量的游离抗原、Opiorphin QRFSR肽(包含在样品中或者在已知浓度的参考肽中)和包被至96孔微量滴定板支持物的抗原(恒定且有限的量)之间对“抗QRFSR肽”抗体(恒定且有限的量)的竞争(图1)。Y代表针对Sialorphin的抗体。另一方面，由于相同原因，多克隆“抗QRFSR”抗体在动物(兔)中的产生需要注射抗原，以改善QRFSR肽的免疫原性，其共价方式缀合于载体分子(通常是来自除人之外的各种物种的蛋白质)。所用免疫原是卵清蛋白_(C0-NH)-YQRFSR(也称为 OVA- (CO-NH)-YQRFSR)(SEQ ID NO :5)。通过使用Pierce供应的通用系统来揭示特定的反应，即缀合于辣根过氧化物酶 (HRP)的抗兔免疫球蛋白(IgG)的纯化的免疫球蛋白抗体(IgG-IgM)随后是生色TMB特异性底物(四甲基联苯胺)的最终加入。B. 1用于0PI0RPHIN的竞争型ELISA免疫测定法的形式-抗YQRFSF抗体和-Y- (PE) 12-QRFSR肽的固定将肽包被至在微量滴定板(96孔ImmunoPlathNunc)的塑料支持物。测试了不同的QRFSR肽衍生物-Y-QRFSR肽(SEQ ID NO 4) :N_末端酪氨酸残基的存在增加了 Opiorphin肽的疏水特征，并由此促进其被动吸附至塑料支持物；-Y-(PE)6-QRFSR 和 Y-(PE)12-QRFSR 肽(SEQ ID NO :6)被引入到酪氨酸残基和 QRFSR肽序列之间的6-聚乙烯或12-聚乙烯接头的存在促进经固定的肽对抗体的可及性，这是通过使其更柔性及远离经包被的支持物以及更疏水而实现的。如所预期的，QRFSR 肽距离支持物越远，越促进抗体对其的识别。选择用于平板包被的Opiorphin衍生物是 Y- (PE) 12-QRFSR 肽。特异性多克隆抗QRFSR抗体是在将0VA-C0-NH-YQRFSR免疫原施用于2只兔以及精确跟踪特异性免疫应答之后而产生的。基于其对Opiorphin的亲和性选择的多克隆抗体被称为3RBF-SAB。经优化的测定条件是包被缓冲液磷酸钾缓冲液，IOOmM, pH7. 1。饱和缓冲液Tris缓冲液 20mM pH7. 5+150mM NaCl+0. 1% Tween20+0. 5% 明胶。第1次温育缓冲液(抗Opiorphin抗体+样品或参照肽)Tris缓冲液200mM且 pH7. 5+150mM NaCl+0. 1% Tween 20+0. 牛血清白蛋白(BSA)。第2次温育缓冲液(缀合至HRP的抗兔IgG抗体)Tris缓冲液20mM且 pH7. 5+150mM NaCl+0. 1% Tween 20+0. 1% BSA。洗涤缓冲液纯水+0. 1% Tween 20。下表1更详细描述了竞争型ELISA免疫测定法的步骤。表 1
1权利要求
1.碱性富含脯氨酸泪蛋白(BPLP)基因产物在用于对象中病理状态的预测、诊断或者监测中的用途，和/或在用于确定和/或确认病理状态与对象中的BPLP基因产物相关中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述BPLP基因产物由mRNA组成。
3.权利要求1的用途，其中所述BPLP基因产物是由BPLP蛋白组成的BPLP肽、衍生自 BPLP蛋白的肽、BPLP前体蛋白或者所述BPLP肽的成熟产物。
4.权利要求3的用途，其中所述BPLP肽的成熟产物是SEQID NO :3的QRFSR肽 Opiorphin0
5.权利要求1或4任一项的用途，其中所述BPLP基因产物用作生物标志。
6.权利要求1-5任一项的用途，其中在对象的生物学液体或者组织中能测量所述BPLP 基因产物的水平。
7.权利要求6的用途，其中所述生物学液体选自由血液、血浆、唾液、脑脊液、尿液、眼泪、精液和乳汁组成的组。
8.用于对象中病理状态的预测、诊断或者监测的方法，其包括如下步骤a)测量得自所述对象的生物学样品中BPLP基因产物的定量水平；b)将在步骤a)中测量的BPLP基因产物的定量水平与所述BPLP基因产物的参照值进行对比；其中与所述参照值相比所述BPLP基因产物的水平显著较高或者较低是用于所述病理状态的预测、诊断或者监测的指征。
9.权利要求8的方法，其中所述诊断包括和/或用于确定和/或确认病理状态与对象中的BPLP基因产物相关。
10.权利要求9的方法，其中与参照值相比所述BPLP基因产物的水平显著较高或者较低是所述病理状态与对象中BPLP基因产物相关的指征。
11.权利要求8-10任一项的方法，进一步包括为所述对象设计治疗方案的步骤。
12.权利要求8-11任一项的方法，其中所述样品得自所述对象的生物学液体或者组
13.权利要求12的方法，其中所述生物学液体选自由血液、血浆、唾液、尿液、脑脊液、 眼泪、精液和乳汁所组成的组。
14.权利要求8-13任一项的方法，其中所述BPLP基因产物是BPLP-蛋白成熟产物。
15.权利要求14的方法，其中所述BPLP-蛋白成熟产物是SEQID NO 3的QRFSR肽 Opiorphin0
16.权利要求14或15的方法，其中所述BPLP-蛋白成熟产物通过酸-甲醇提取法和/ 或通过C18-kpPak筒柱提取法来提取，和/或通过反相C18-HPLC层析来纯化。
17.权利要求14-16任一项的方法，其中所述样品是唾液、精液、眼泪或者尿液，并且所述BPLP-蛋白成熟产物通过酸-甲醇提取法来提取。
18.权利要求14-16任一项的方法，其中所述样品是血浆或者乳汁，并且所述BPLP-蛋白成熟产物通过C18-kpPak筒柱提取法来提取。
19.权利要求14-16任一项的方法，其中所述样品是血浆，并且所述BPLP-蛋白成熟产物通过反相C18-HPLC层析纯化。
20.权利要求17-19任一项的方法，其中所述BPLP-蛋白成熟产物是SEQID NO 3的 QRFSR肽 Opiorphin。
21.权利要求8-20任一项的方法，其中所述BPLP基因产物的定量水平使用免疫测定法来测量。
22.权利要求21的方法，其中所述免疫测定法是竞争型ELISA。
23.权利要求20或21的方法，其中所述免疫测定法包含多克隆抗QRFSR抗体。
24.权利要求23的方法，其中所述多克隆抗QRFSR抗体是权利要求33所述抗体。
25.权利要求8-11任一项的方法，其中所述样品是组织，并且所述BPLP基因产物是 mRNA。
26.用于预测、诊断或者监测测试的试剂盒，其中所述试剂盒包含 -特异性识别BPLP基因产物的结合剂，-检测所述结合剂与BPLP基因产物的结合的试剂，以及 -任选存在的阳性和/或阴性对照样品。
27.权利要求沈的试剂盒，其中所述BPLP基因产物是BPLP蛋白成熟产物。
28.权利要求沈或27的试剂盒，其中所述BPLP蛋白成熟产物是SEQIDNO 3的QRFSR 肽 Opiorphin。
29.权利要求沈-观任一项的试剂盒，其中所述结合剂是抗体或者分子探针。
30.产生特异性结合SEQID NO 3的QRFSR肽Opiorphin的多克隆抗体的方法，包括如下步骤a)将以共价方式缀合至卵清蛋白-(CO-NH)-分子的SEQID NO 4的肽施用于非人动物；b)选择特异性结合所述QRFSR肽的多克隆抗体。
31.用于获得分泌特异性结合SEQID NO 3的QRFSR肽Opiorphin的抗体的杂交瘤的方法，包括如下步骤a)将以共价方式缀合至卵清蛋白-(CO-NH)-分子的SEQID NO :4的肽施用于非人动物；b)从这个动物中取出分泌免疫球蛋白的淋巴细胞；c)将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以获得至少一种分泌免疫球蛋白的杂交瘤；d)选择分泌特异性结合QRFSR肽的抗体的杂交瘤；以及e)任选地分离所述抗体。
32.权利要求30或31的方法，其中所述非人动物是兔。
33.特异性结合SEQID NO :3的QRFSR肽Opiorphin的抗体，其可通过权利要求30-32任一项的方法获得。
34.用于在怀疑含有SEQID NO 3的QRFSR-肽Opiorphin的样品中检测所述 Opiorphin的方法，包括如下步骤；a)用SEQID NO 4的肽包被微量滴定平板，其中已经在所述肽的第一个与第二个残基之间引入6-聚乙烯或者12-聚乙烯接头；b)加入所述样品及权利要求33所述的兔多克隆抗体；c)加入经标记的抗兔抗体；d)加入适于检测所述经标记的抗兔抗体的生色底物；e)检测由所述生色底物所发射的信号，从而在怀疑含有Opiorphin的所述样品中检测Opiorphin。
全文摘要
本发明涉及碱性富含脯氨酸泪蛋白(BPLP)基因产物如Opiorphin在建立对象的病理状态或治疗效率的预测、诊断或监测中的用途，以及相关使用方法。
文档编号C07K16/00GK102265161SQ200980153082
公开日2011年11月30日 申请日期2009年11月27日 优先权日2008年11月28日
发明者C·鲁若, E·迪富尔, M-N·翁格霍伊尔, P·茹阿内, S·维拉尔-索西内 申请人:巴斯德研究院