专利名称：：一种从黄芪废渣中提取、分离和纯化芒柄花素和毛蕊异黄酮的方法
技术领域：
：本发明涉及一种从黄芪废渣中提取、分离和纯化功能性有效成分黄芪异黄酮的方法，具体是从生产加工黄芪注射液的黄芪废渣中提取、分离和纯化芒柄花素和毛蕊异黄酮的方法。
背景技术：
：黄芪首载于我国古代第一部本草著作《神农本草经》，为豆科多年生草本植物蒙古黄甚Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bungevar.mongholicus(Bunge)Hsiao或膜英黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge的干燥根。据药典记载有黄芪味甘，性微温，具有增强机体非特异性、改善心功能、扩张冠状动脉、利尿消肿、益卫固表、托疮生肌、抗菌、抗病毒、抗疲劳、抗衰老、促进造血功能、保护肝脏等功效。常用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久泄脱肛、便血崩漏、表虚自汗、气虚水肿、久溃不敛、慢性肾炎、蛋白尿、糖尿病等症。黄芪是名贵中药材，主要含有皂苷、异黄酮、多糖等多种主要活性成分。目前，我国对黄芪的需求量呈逐年上升趋势，年产量约为50万吨左右，年需量约为100万吨以上，早已显现出供不应求的情况。而被广泛应用的黄芪注射液即以黄芪为原料，采用水煎煮的方法提取黄芪皂苷等有效成分。在生产黄芪注射液过程中，大量的异黄酮类成分未能被提取出来，极大地浪费了黄芪资源。已有相关研究报道，黄芪异黄酮是黄芪的次生代谢产物，芒柄花素和毛蕊异黄酮是黄芪异黄酮的主要成分。现代药理学研究表明黄芪异黄酮类成分具有抗菌消炎、抗病毒、抗癌、降血脂和具有卵泡激素等作用，因此，提取、分离和纯化异黄酮类成分已经成为当今黄芪研究的热点。为了实现高效利用黄芪资源的目的，本发明以工业生产过程产生的黄芪废渣为原料，探索了一条经济、有效的提取、分离和纯化黄芪异黄酮类成分的方法，不仅达到了高效利用黄芪资源，促进了我国黄芪资源深度开发和利用，而且为黄芪异黄酮的研究提供了科学依据。本发明旨在提供一种简单、快速、高效、低成本、高回收率、高资源利用度、适合于工业化生产的提取、分离和纯化芒柄花素和毛蕊异黄酮的熟化路线。
发明内容为了实现本发明的目的，本发明以黄芪废渣为原料，通过独创性的匀浆萃取_混合酶诱导生物转化技术、负压空化提取技术、液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列具有自主知识产权的高效提取、分离和纯化技术手段，从而保证了在较低成本和较高收率的情况下，简单、快速、高效地获得高纯度、高回收率的芒柄花素和毛蕊异黄酮。包括以下具体步骤(1)匀浆萃取-混合酶诱导生物转化将黄芪废渣和配制好的酶溶液按固液比1:1050(g:mL)混合，连续萃取15次，每次0.52min。将匀浆液放入摇床中恒4温酶解，2550。C酶解624h，转速100150rpm。(2)负压空化提取将酶解液抽滤后，滤渣加入6090%乙醇溶液，压力为0.020.09Mpa，固液比为1:1050(g:mL)，室温提取15次，每次30120min。(3)液液萃取将得到的黄芪黄酮提取液合并，减压浓縮后，以体积比1:11:5的乙酸乙酯作为萃取溶剂进行萃取，萃取15次，减压浓縮至干得到固形物。(4)大孔吸附树脂富集精制合并乙酸乙酯萃取液，浓縮至干，得到精制的富含异黄酮类活性成分的黄芪提取物。大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将液液萃取所得到的固形物用蒸馏水溶解后，通过大孔吸附树脂柱进行吸附，上样体积为1IOBV，流速为0.52BV/h。吸附后用2050%乙醇溶液1IOBV洗脱杂质，然后用6080%乙醇溶液120BV洗脱目标物质。收集洗脱液，得到目标化合物的富集液。(5)正相硅胶中压柱层析所用样品为树脂富集后所得粗目标产物，所用硅胶为300400目。称取质量为样品量515倍的硅胶湿法装柱，所用溶剂包括石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇。将样品用少量有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为1:1.21:3(w/w)的硅胶拌匀，水浴锅上炒干，装入已装好的硅胶柱中。用三氯甲烷(乙酸乙酯)、三氯甲烷(乙酸乙酯)_甲醇、甲醇连续中压洗脱1040BV，用硅胶薄层层析检测洗脱液成分，展开剂为三氯甲烷(乙酸乙酯)甲醇=10:12:i。(6)低温析晶和重结晶重结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇，重结晶所用溶剂比例为三氯甲烷(二氯甲烷、乙酸乙酯)甲醇=20:ii:i，低温析晶温度为-io25t:。上述的黄芪中芒柄花素和毛蕊异黄酮的提取、分离和纯化方法所用的混合酶为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、P-葡萄糖苷酶、蛋白酶、漆酶、淀粉酶、木聚糖酶等。上述的黄芪中芒柄花素和毛蕊异黄酮的提取、分离和纯化方法所用的大孔吸附树脂分别为D101、DM130、NKA-9、AB-8、AL-2、ADS-5、ADS-7、ADS-8、ADS-11、ADS-17、ADS-21、ADS-31、D3520、FL_1、FL_2、FL_3、HPD450、HPD500、HPD600和HPD700等大孔吸附树脂。传统的提取方法如煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取、超声提取和索式提取过程都是在完整植物细胞的情况下，通过浸润与渗透、使溶剂进入组织细胞、溶解细胞内物质并使其扩散至溶剂主体，这使溶剂提取细胞内生物活性成分成为可能。但由于细胞壁的屏障作用，决定了中药材有效成分的提取效率有一定限度，所以传统提取方法存在提取温度过高，提取时间过长，提取率低，成本高，不安全等问题。酶诱导是在提取的基础上，利用混合酶将细胞壁的成分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬或胶溶于提取溶剂中，加速有效成分的释放，从而提高提取效率。所谓空化(cavitation)，一般是指液体内部局部压力降低时，液体内部或液固交界面上蒸汽或气体的空穴(空泡)的形成、发展和溃灭的过程。当溃灭发生在固体表面附近时，由于空泡瞬间(微秒级)溃灭产生极高的瞬时压强，极高压强的反复作用，从而破坏固体表面。因此，负压空化提取技术是利用负压空化气泡产生强烈的空化效应、湍流效应和机械振动，造成样品颗粒细胞壁快速破裂，加速了胞内物质向介质释放、扩散和溶解，从而促进提取。本发明的优点51.本发明所用原料为工业生产中的黄芪废渣，工艺简单易行，且对环境污染小，可以高效合理的利用黄芪资源，具有很好的应用价值。2.本发明采用匀浆萃取_混合酶诱导生物转化技术、负压空化提取技术、液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列具有自主知识产权的技术手段，可以高效的提取、分离和纯化芒柄花素和毛蕊异黄酮，且纯度均可达95%以上，收率为80-95%。3.与传统提取、分离和纯化方法相比，该方法操作条件温和，提取周期短，耗能低，生产成本低，可实现芒柄花素和毛蕊异黄酮大规模的工业化生产。图1为芒柄花素和毛蕊异黄酮的结构(A)芒柄花素；(B)毛蕊异黄酮图2为芒柄花素和毛蕊异黄酮的HPLC色谱图(A)标准品HPLC色谱图；(B)提取样品HPLC色谱图具体实施方案实施例1精密称取黄芪废渣1000g，取0.1%固形物质量的混合酶(纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、木聚糖酶)溶解于10倍体积温水中，连续匀浆萃取3次，每次2min。将匀浆液放入3(TC恒温摇床中恒温酶解12h，酶解液抽滤后，滤渣加入70%乙醇溶液负压空化提取，压力为0.05Mpa，固液比为1:10(g:mL)，室温提取3次，每次45min，将抽滤后的酶解液和负压空化提取液合并，减压浓縮至干后用水溶解，以等体积的乙酸乙酯为萃取溶剂萃取3次，减压浓縮至干得到固形物。固形物用水溶解后，通过ADS-ll大孔吸附树脂柱进行吸附，上样量为2BV，流速为lBV/h。吸附后用30X乙醇溶液3BV洗杂质，然后用60%乙醇溶液10BV解吸。收集解吸液，浓縮至干后用少量甲醇溶解，加入与浸膏质量比为1:1.2(w/w)的目数为300400的层析硅胶炒样。预先称取质量为样品量的515倍的硅胶，用乙酸乙酯湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以TLC监测收集洗脱液，浓縮分别得到芒柄花素和毛蕊异黄酮产品，低温析晶和重结晶后最终得到芒柄花素102.21mg，纯度为95%，收率为85.18%;毛蕊异黄酮90.34mg，纯度为97%，收率为92.18%。实施例2精密称取黄芪废渣1000g，取0.3%固形物质量的混合酶(半纤维素、13-葡萄糖苷酶、漆酶、淀粉酶)溶解于15倍体积温水中，连续匀浆萃取5次，每次lmin。将匀浆液放入3(TC恒温摇床中恒温酶解24h，酶解液抽滤后，滤渣加入90%乙醇溶液负压空化提取，压力为0.06Mpa，固液比为l:15(g:mL)，室温提取5次，每次30min，将抽滤后的酶解液和负压空化提取液合并，减压浓縮至干后用水溶解，以1:1.5(v/v)的乙酸乙酯作为萃取溶剂萃取5次，减压浓縮至干得到固形物。固形物用水溶解后，通过HPD-500大孔吸附树脂柱进行吸附，上样量为4BV，流速为0.5BV/h。吸附后用40%乙醇溶液5BV洗杂质，然后用70%乙醇溶液15BV解吸。收集解吸液，浓縮至干后用少量甲醇溶解，加入与浸膏质量比为1:1.2(w/w)的目数为300400的层析硅胶炒样。预先称取质量为样品量的515倍的硅胶，用乙酸乙酯湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以TLC监测收集洗脱液，浓縮分别得到芒柄花素和毛蕊异黄酮产品，低温析晶和重结晶后最终得到芒柄花素101.85mg，纯度为98%，收率为84.88%;毛蕊异黄酮88.92mg，纯度为96%，收率为90.73%。本发明中，结果定量检测分析采用下表条件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种从黄芪废渣中提取、分离和纯化芒柄花素和毛蕊异黄酮的方法，其特征在于包括如下步骤(1)匀浆萃取-混合酶诱导生物转化将黄芪废渣和配制好的酶溶液混合后，连续匀浆萃取，一定时间后，放入恒温摇床中进行酶解，得到黄芪的酶解液；(2)负压空化提取将酶解液抽滤，滤渣用醇溶液进行负压空化提取，提取结束后抽滤，得黄芪黄酮提取液；(3)液液萃取将得到的黄芪黄酮提取液合并，减压浓缩后，以乙酸乙酯作为萃取溶剂进行萃取，萃取液合并后，减压浓缩至干得到固形物；(4)大孔吸附树脂富集固形物加水溶解后上大孔吸附树脂柱，分别用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集乙醇洗脱部分得到目标化合物的富集液；(5)硅胶柱层析富集液浓缩，用有机溶剂溶解后上硅胶柱，用不同比例的溶剂进行洗脱，收集相应的洗脱部分，得到芒柄花素和毛蕊异黄酮溶液；(6)低温析晶和重结晶芒柄花素和毛蕊异黄酮溶液，经过低温析晶得到最终目标化合物，重结晶后得到纯度均大于95％的芒柄花素和毛蕊异黄酮。2.按照权利要求1所述的匀浆萃取_混合酶诱导生物转化技术，其特征在于匀浆萃取所用的溶剂为配制好的酶溶液，按固液比1:1050(g:mL)混合，连续萃取15次，每次0.52min。将匀浆液放入恒温摇床中，在255(TC酶解624h，转速100150rpm。匀浆过程产生的强大剪切力，兼具打破细胞壁、使植物组织细胞与酶充分接触以及瞬时剌激诱发内源性酶活性的作用，使目标化合物从细胞内向溶剂中充分释放，增加目标成分的含量。经过恒温酶解诱导生物转化，利用酶反应的高效性、专一性等特性，将细胞壁的主要成分纤维素、半纤维素和果胶水解或降解，使有效成分充分的暴露出来，溶解、混悬或胶溶于提取液中，从而使细胞内有效成分含量显著提高。此过程所用的混合酶为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、13-葡萄糖苷酶、蛋白酶、漆酶、淀粉酶、木聚糖酶等。3.按照权利要求1所述的负压空化提取技术，其特征在于将酶解液抽滤后，滤渣加入6090%乙醇溶液，压力为0.020.09Mpa，固液比为1:1050(g:mL)，室温提取15次，每次30120min。负压空化提取方法是以负压为动力，利用气泡产生的空化效应、湍流效应而产生的高速传质液固提取技术。4.按照权利要求1所述的液液萃取技术，其特征在于将得到的黄芪黄酮提取液减压浓縮，以体积比l:11:5的乙酸乙酯作为萃取溶剂进行萃取，萃取15次，减压浓縮至干得到固形物。5.按照权利要求1所述的大孔吸附树脂富集技术，其特征在于所用树脂包括DIOI、DM130、NKA-9、AB_8、AL_2、ADS_5、ADS_7、ADS_8、ADS-ll、ADS_17、ADS_21、ADS_31、D3520、FL-l、FL-2、FL-3、HPD450、HPD500、HPD600和HPD700等大孔吸附树脂。该方法中大孔吸附树脂采用湿法装柱，上样体积为1IOBV，流速为0.52BV/h。吸附后用2050%乙醇溶液1IOBV洗脱杂质，然后用6080%乙醇溶液120BV洗脱目标物质。收集洗脱液，得到目标化合物的富集液。6.按照权利要求1所述的正相硅胶中压柱层析技术，其特征在于所用硅胶为300400目，称取质量为样品量515倍的硅胶湿法装柱，所用溶剂包括石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇。将样品用少量有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为1:1.21:3(w/w)的硅胶拌匀，水浴锅上炒干，装入已装好的硅胶柱中。用三氯甲烷(乙酸乙酯)、三氯甲烷(乙酸乙酯)-甲醇、甲醇连续中压洗脱1040BV，用硅胶薄层层析检测洗脱液成分，展开剂为三氯甲烷(乙酸乙酯)甲醇=io:i2:i。7.按照权利要求i所述的低温析晶和重结晶技术，其特征在于重结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇，重结晶所用溶剂比例为三氯甲烷(二氯甲烷、乙酸乙酯)甲醇=20:ii:i，低温析晶温度为-io25°c。全文摘要本发明提供了一种从黄芪废渣中提取、分离和纯化芒柄花素和毛蕊异黄酮的方法，所采取的技术方案是以黄芪注射液生产加工后废渣为原料，采用独创性的匀浆萃取-混合酶诱导生物转化技术、负压空化提取技术、液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列高效提取、分离和纯化技术手段，得到高纯度的芒柄花素和毛蕊异黄酮，其纯度均可达95％以上，收率为80-95％。本发明所用原料为工业生产中的废渣，工艺简单易行，且对环境污染小，所获得的芒柄花素和毛蕊异黄酮具有生产成本低、纯度高、收率高、重复性好、高效利用黄芪资源等特点，适合规模化工业生产。文档编号C07D311/36GK101775418SQ20101010196公开日2010年7月14日申请日期2010年1月28日优先权日2010年1月28日发明者付玉杰,孔羽,祖元刚,罗猛,赵宝山,闫明明,陈彩云,顾成波申请人:东北林业大学;付玉杰