专利名称：人p38α与TAB1新功能表位以及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的功能表位及所述功能表位的用途。具体而言，本发明基于蛋 白-蛋白相互作用的空间结构信息，利用计算机图形学技术，通过分子间相互作用、分子间 氢键形成模式，确定蛋白质间相互识别的功能靶位。具体而言，即利用分子模拟技术构建 ρ38α、TABl空间构象，在分析其理化性质、表面特征的基础上，通过分子对接、常温动力学 模拟技术构建Ρ38 α -TABl相互作用的复合物空间构象。进一步利用计算机图形学技术、距 离几何学等计算生物学手段从理论上确定ρ38 α与TABl相互识别的表位结构，通过生物学 定点突变实验对确定的表位结构进行验证和评价。
背景技术：
ρ38是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族的成员之一，有α，β，Υ，δ四种 同分异构体，广泛分布于体内各类型细胞中。其中Ρ38α被研究的最多，并且被认为 在四种同分异构体中起主要作用。Ρ38在许多胞外信号刺激下被活化，进而在细胞增 殖、凋亡和分化的过程中发挥重要作用，特别是在应激和感染过程中Ρ38分子也能够 被激活[Han J, Lee JD, Bibbs L, et al. A MAP kinasetargeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells.Science,1994,265 (5173) :808-811. Raingeaud J, Gupta S, Rogers JS, et al. Pro-inflammatory cytokines and environmental stress cause p38mitogen-activated protein kinase activation by dual phosphorylation ontyrosine and threonine. J Biol Chem，1995，31，270(13) :7420-7426. ]。p38 在炎 症发生发展中处于至关重要的位置，活化的P38可以直接激活核转录因子，也可以通过 激活下游的蛋白激酶来调节mRNA的稳定性和有效翻译，进而促进许多炎性细胞因子的 表达[Kyriakis JM. Making the connection :coupling ofstress-activated ERK/MAP K(extracellular-signal-regulated kinase/mitogen -activated protein kinase) core signalling modules to extracellular stimuli andbiological responses. Biochem Soc Symp,1999,64 :29-48. Ono K,Han J.The p38signal transduction pathway activation and function. Cell Signal，2000，Jan，12 (1) :1-13.]。正常水平的炎症因 子活化在机体抗感染，组织修复和器官存活中有重要作用，但其大量产生和异常活化则 会破坏机体的免疫平衡，产生多种病理损伤，如败血症休克导致的多器官功能衰竭、类风 湿性关节炎、多发性硬化症等。各大制药公司已开发出众多P38抑制因子及相关的拮抗 剂，并在动物模型中显示出了很好的抗炎效果。现有的P38抑制因子及相关的拮抗剂尽 管与P38结合方式不同，化学结构迥异，但发挥抑制作用的机制均为与ATP竞争结合p38 的ATP结合口袋，都属于ATP竞争因子。由于在整个激酶组中，ATP结合口袋有很高的 结构相似性，因此现有的P38抑制因子特异性不能保证，并因安全问题在临床试验中反 复失败[Lee MR, Dominguez C. MAPkinase p38inhibitors :clinical results and an intimate look at their interactionswith p38alpha protein[J]. Curr Med Chem,2005, 12(25) :2979-2994. BadgerAM, Bradbeer JN, Votta B， et al. Pharmacological profileof SB 203580, aselective inhibitor of cytokine suppressive binding protein/ p38kinase, inanimal models of arthritis, bone resorption, endotoxin shock and immunefunction[J]. J Pharmacol Exp Ther,1996,279 (3) : 1453—1461.]。ATP竞争型的p38a抑制因子在临床上的反复失败提示必须用新的策略设计抑 制因子。靶向P38活化通路的其他相互作用分子或成为可行的方法。p38的经典活化 模式是MAPK家族共有的级联活化模式，主体为MAPI磷酸化并活化MAP2K，MAP2K磷酸 化并活化MAPK。p38的MAPI是MKK3和MKK6，p38的四种同分异构体都可以被MKK3/6 所活化。除了经典的活化途径，ρ38α还可以和接头蛋白TABl特异性相互作用引起 自 ^ W. it [Ge B, Gram H, DiPadova F, et al. MAPKK-independent activation of p38_mediated byTABl-dependent autophosphorylation of p38.Science,2002, 15, 295(5558) : 1249-1250. ]。ΤΑΒ1-ρ38 α相互作用见于多种细胞类型和细胞内环境。文 献报道已证实ΤΑΒ1-ρ38α相互作用能够介导缺血性心肌细胞损伤、NO诱导的胰岛β 细胞死亡、胞内感染诱导的巨噬细胞IL-12表达，说明ΤΑΒ1-ρ38α相互作用在炎症调 控中发挥重要作用[Russell RR 3rd, LiJ, Coven DL, et al. AMP-activatedprotein kinase mediates ischemic glucose uptake and prevents postischemic cardiac dysfunction, apoptosis, and injury. J Clin Invest,2004,114 (4) :495-503. Fiedler B, Fei 1 R, Hofmann F, et al. cGMP-dependent ProteinKinase Type IInhibits TABl-p38Mitogen-activated Protein Kinase ApoptosisSignaling in Cardiac Myocytes.J Biol Chem,2006,281 (43) :32831-32840. Tanno M, Bassi R， Gorog DA, et al. Diverse mechanisms of myocardial p38mitogen-activated protein kinase activation :evidence for MKK-independentactivation by a TABl-associated mechanism contributing to injury duringmyocardial ischemia. Circ Res,2003, 93(3) :254-261. Matsuyama W, Faure M, YoshimuraT. Activation of discoidin domain receptor !facilitates thematuration of human monocyte-derived dendritic cells through the TNFreceptor associated factor 6/TGF-beta-activated protein kinase lbindingprotein lbeta/p38alpha mitogen-activated protein kinase signaling cascade. J Immunol, 2003,171 (7) :3520-3532. ] 靴向 MKK3/6 激酶或 ΤΑΒ1_ρ38 α 相互 作用都可以达到部分抑制Ρ38 α的目的，但靶向ΜΚΚ3/6激酶不可避免的会影响ρ38家族 所有成员并难以脱离ATP竞争机制。而ΤΑΒ1-ρ38α相互作用则具有高度特异性，不仅有 独特的相互作用区域，而且尽管Ρ38各同分异构体之间高度同源，但TABl只与ρ38 α结 合而不同其他的同分异构体结合[Zhou H, Zheng Μ, Chen J, et al. Determinants That Control the Specific Interactionsbetween TABland p38[J]. Mol Cell Biol,2006, 26(10) :3824-3834.]。所以，我们提出基于ΤΑΒ1_ρ38 α相互作用作为筛选新型p38抑制 齐U白勺[Zhang J, Shen B, Lin A. Novel strategies for inhibition of the p38MAPK pathway[J]. Trends Pharmacol Sci，2007，28 (6) :286-295.]。本发明即基于上面的研究背景，利用生物信息学、计算生物学相关理论方法构建 ΤΑΒ1-ρ38α相互作用的复合物结构，通过距离几何学等手段对ΤΑΒ1、ρ38 α相互识别的结 构区域进行了判定，通过点突变实验对理论模型进行了验证，确定了 TABl与ρ38α特异性 相互识别的功能表位，为特异性靶向ρ38α的抑制因子设计提供了新的靶点。
发明内容
本发明基于蛋白-蛋白相互作用与计算机辅助分子设计的方式，确认了 ρ38 α与 TABl的新功能表位。本发明所要解决的关键问题在于，为特异性靶向ρ38 α的抑制因子设 计提供了新的靶点，促进了针对Ρ38 α抗炎症药物和抗心肌损伤药物的研制工作。本发明公开了基于计算机同源模拟技术获得的ρ38 α及TABl空间构象，以及通过 分子对接技术获得的Ρ38 α与TABl相互作用的复合物结构。本发明公开了基于理论与实验相互验证确定的TABl特异性靶向ρ38 α的新的功 能表位。本发明公开了基于理论与实验相互验证确定的ρ38 α特异性结合TABl的功能表 位。本发明公开了的ρ38α和TABl结合的靶位，可能用做未来治疗炎症或者心肌损伤 的药物的作用靶点。本发明还公开了基于计算机图形学技术及分子生物学突变技术确定的ρ38 α突 变体。
图1基于ρ38 α胞外区晶体结构(PDB code :1ρ38)，依次选择CVFF、Amber力场， 利用力学优化方法通过分子模拟获得的P38 α理论空间构象飘带结构。图2合理预测的TABl的C-端二级结构。图3利用从头搭建与同源模建相结合获得的TABl空间构象飘带结构。图4利用抗原表位的合理预测获得的ρ38 α的空间表位分布模式。图5利用抗原表位的合理预测获得的TABl的空间表位分布模式。图6基于分子对接、力学优化、动力学模拟获得的ρ38 α与TABl相互作用的复合 物结构。图7利用距离几何学、分子间氢键形成理论确定的TABl特异性识别ρ38 α的功能 表位分布模式。图8ρ38 α突变体，与TABl相互作用的免疫共沉淀实验。图9ρ38α突变体，在TABl诱导下的ρ38 α的自我磷酸化实验。图10ΤΑΒ1突变体，与ρ38 α相互作用的免疫共沉淀实验。图IlTABl突变体，诱导下的ρ38 α的自我磷酸化实验。
具体实施例方式1) ρ38 α及TABl空间构象模拟；2)ρ38 α与TABl相互作用复合物的结构模拟；3)ρ38 α与TABl相互识别区域的确定；4)利用点突变技术构建ρ38 α突变体及TABl突变体；5)ρ38 α及其突变体，TABl及其突变体的真核表达载体构建和真核表达。6)ρ38α及其突变体与TABl的结合实验，以及TABl诱导ρ38 α及其突变体自我磷酸化的实验。7) TABl及其突变体与ρ38 α的结合实验，以及TABl及其突变体诱导ρ38 α自我磷 酸化的实验。为了更清楚地阐述本发明，具体提供了下述阐述性的实施方案，本领域的技术人 员应该理解，本发明并不仅仅限定于下述实施例，任何与本发明的实施例等同的变体也包 括在本发明中。实施例一 ρ38 α、TABl空间构象的模拟以及相互作用复合物结构的确定1.材料Insightll 2005程序包(MSI分子模拟，San Diego)，该程序包包括Homology同源模建、Discover力学优化、Discover_3常温动力学模拟、Docking分 子对接、Delphi表观静电势能分析。Ludi分子设计程序(1995) ；IBM图形工作站PDB 2008数据库(网络www. rcsb. org下载)；SwissProt数据库(2008，网络下载)。2.方法1) ρ38 α及TABl空间构象模拟基于蛋白质结构数据库PDB提供的ρ38 α晶体结构(PDB code 1ρ38)，在CVFF、 Amber力场下，依次选择最陡下降(收敛判据0. 05kCal/mol，优化步长10000步)、共轭梯 度(收敛判据0.02kCal/mOl，优化步长20000步)，获得ρ38α理论空间构象。在合理确 定TABl的C-端二级结构的基础上，利用从头搭建与同源模建相结合构建TABl的空间结 构，通过合适的力场参数对搭建的三维结构进行能量最小化处理(图1)。借助主链碳原子 均方根位移评判方法，将理论获得的Ρ38 α结构与其晶体结构进行结构叠合，计算获得的 RMSD (RootMean Square Distance，均方根位移)值为0. 016nm，提示优化获得的结构是合理 的。利用GORIV方法对TABl蛋白的C-端二级结构进行合理的预测(图2)。基于TABl 的N-端晶体结构(PDB Code :2j4o)，选择与ρ38 α结构模拟过程中一致的力场参数，对其结 构进行优化处理。利用预测的TABl的C-端二级结构特征，通过从头搭建方法构建TABl的 C-端三维构象。在考虑ΝΗ2-与C00-形成-NH-CO-键长、键角特征，搭建TABl全长结构，并 在合适的力场参数下进行能量最小化处理，获得的TABl稳定空间结构见图3。2)ρ38 α与TABl相互作用复合物的结构模拟在获得ρ38 α及TABl空间构象的基础上，借助计算生物学相关理论对其表位结构 进行合理的分析。在此基础上，利用分子对接及动力学模拟，在考虑溶剂效应的情况下，设 定原子间作用域为8Α，搭建Ρ38 α与TABl相互作用的复合物空间构象(图4，图5)。实施例二 ρ38 α与TABl相互识别靶位的确定及突变体质粒的构建1.实验材料Insightll 2005程序包(MSI分子模拟，San Diego)，该程序包包括Homology同源模建、Discover力学优化、Discover_3常温动力学模拟、Docking 分子对接、Delphi表观静电势能分析。Ludi分子设计程序(1995) ；IBM图形工作站PDB 2008数据库(网络
权利要求
1.人ρ38α的新功能表位，其特征在于，通过计算机辅助分子设计及生物学突变实验， 构建ρ38 α功能表位突变体，确定的ρ38 α功能表位Asp230，Tyr258。
2.权利要求1所述ρ38α功能表位突变体，其特征在于，所述突变体为在功能表位 Asp230, Tyr258相应改变的ρ38 α突变体。
3.根据权利要求1所述的ρ38α功能表位，其特征在于，所述功能表位为用于竞争结合 TABl的关键位点。
4.人TABl的新功能表位，其特征在于，通过计算机辅助分子设计及生物学突变实验， 构建TABl功能表位突变体，确定的TABl功能表位Ser399，Ser401, Asn436，Thr440。
5.权利要求4所述TABl功能表位突变体，其特征在于，所述突变体为在功能表位 Ser399, Ser401, Asn436, Thr440 相应改变的 TABl 突变体。
6.根据权利要求4所述的TABl功能表位，其特征在于，所述功能表位为用于竞争结合 ρ38α的关键位点。
全文摘要
本发明公开了人p38α与TAB1新功能表位以及用途。本发明涉及蛋白质的功能表位，内容包括人p38α与TAB1新功能表位的结构特征，p38α与TAB1突变体的设计以及制备方法。具体而言，通过计算机同源模建、分子对接确定人p38α与TAB1相互作用的复合物构象，利用计算生物学结合生物学点突变实验证实了TAB1特异性识别人p38α的表位结构以及TAB1上对应表位的结构。本发明还公开了所述功能表位在人TAB1-p38α信号通路中发挥重要作用，关系到p38α的自我磷酸化，所述功能表位在研制抗炎症药物和抗心肌损伤药物中具备潜在用途。
文档编号C07K14/47GK102120990SQ20101012350
公开日2011年7月13日 申请日期2010年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者冯健男, 张纪岩, 沈倍奋, 王庆阳, 黎燕 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所