专利名称：抗虫融合基因、融合蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种获得高杀虫能力的抗虫融合基因的方法和一种高杀虫能力的抗 虫融合基因和融合蛋白、以及该融合蛋白的具体应用。
背景技术：
害虫给全球农业生产带来每年约80亿美元的损失。害虫的防治目前主要依靠使 用化学农药，但是农药残留会对人体健康带来危害。因此，人们成功的选择了利用杀虫毒素 转基因作物进行抗虫，目前转基因抗虫玉米和棉花已经大量种植。
转基因作物抗虫的关键技术是获得性能优良的杀虫蛋白质，杀虫蛋白质有多种。 比较常用的是Bt晶体蛋白质，例如CrylAb，CrylC等，它们已被大量运用于转基因抗虫作 物。但是单个杀虫毒素往往杀虫谱都比较窄，杀虫活性比较低。同时长期大量使用单一的 杀虫蛋白质还可能引起害虫抗性的发展。因此，获得高杀虫活性的新型蛋白质杀虫毒素，对 提高杀虫能力和减缓害虫抗性的发生具有重要应用价值。
参考文献如下
(1)、Crickmore, N. , Zeigler, D. R. , Feitelson, J. , Schnepf, Ε. , Van Rie, J., Lereclus, D. ，Baum, J. &Dean, D. H. (1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62,807-813. (芽孢杆菌及杀虫晶体蛋白)
(2)、Ferre, J. &Van Rie, J. (2002) Annu. Rev. Entomo 1. 47，501-533.(抗苏云金芽 孢杆菌昆虫的生物化学和遗传学)
(3) >Estruch, J. J. , Warren, G. W. ,Mullins,M. A. ,Nye,G. J. ,Craig, J. A. &Koziel, M. G. (1996) Proc. Natl. . Acad. Sci. USA 93,5389-5394.(一种对鳞翅目昆虫具有光谱杀虫 活性的苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白——VIP3A)发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种获得高杀虫能力的抗虫融合基因的方法；同 时提供高杀虫能力的融合抗虫基因，相应的融合蛋白及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗虫融合基因，该基因包括从5’ -3’依 次为含有编码BT晶体毒素Cryl的核苷酸序列和编码Cry9Aa毒素的核苷酸序列；且上述2 个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内；Cryl晶体毒素为C端切除的活性毒素。
作为本发明的抗虫融合基因的一步改进Cryl晶体毒素为CrylAb、CrylAc， CrylAa0
作为本发明的抗虫融合基因的进一步改进当Cryl晶体毒素为CrylAb时，融合基 因的核苷酸序列为SEQ ID NO :1 ；当Cryl晶体毒素为CrylAc时，融合基因的核苷酸序列为 SEQID NO :2。
本发明还提供了上述抗虫融合基因编码的融合蛋白，该融合蛋白从N端至C端依 次为Cryl晶体毒素和Cry9Aa毒素。
作为本发明的融合蛋白的一种改进当Cryl晶体毒素为CrylAb时，融合蛋白的氨 基酸序列为SEQ ID NO 3 ；当Cryl晶体毒素为CrylAc时，融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO :4。
本发明还提供了上述融合蛋白在转基因抗虫作物和转基因杀虫微生物方面的应用。
本行业的技术人员均知道以下理论
1、二个Cry杀虫基因的融合并不是都能够增强杀虫能力的。例如CrylAb和CrylCa 的融合蛋白质的杀虫能力比相同重量的单独CrylAb和CrylCa的混合物的杀虫能力还要 低。
2、即使两个单独蛋白质组合使用具有增效作用，但也并不能得出它们的融合蛋白 具有高效杀虫能力；这是因为在蛋白质生物化学上，两个单独蛋白质的物理混和与融合 是不同的，不能根据物理混和所具有的增效作用来肯定融合后所获得的增效作用；且在不 同位置融合所得的融合蛋白的活性是大相径庭的。
本发明所设计的用一个Cryl晶体毒素与Cry9Aa毒素融合成的人工蛋白质分子， 与原先的Cryl和Cry9Aa晶体毒素物理混合相比，具有如下优点杀虫活性提高了 10倍以 上，杀虫谱更广。本发明的杀虫蛋白质可以杀灭粘虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉 米和棉花的主要鳞翅目害虫。此外，本发明发现的融合蛋白质还可以有效的减缓害虫抗性 的发生。
具体实施方式
本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在 Ausubel 编写的 John Wiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology，禾口 J. Sambrook 等编写 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺 Molecular Cloning =ALabortory Manual, 3rd ED.等文献均有详细的说明。
实施例1、CrylAb_Cry9A和CrylAc_Cry9A融合基因的构建
编码Cry9Aa、CryIAb、CryIAcJP CrylCa的杀虫蛋白的基因均由上海生工合成，其 DNA 序列分别为 SEQ ID N0:5，SEQ ID N0:6，SEQ ID NO :7 禾口 SEQ ID NO :8。这些基因分别 被克隆到载体pET28a表达载体中限制性内切酶BamHI和^cI的位点之间，得到的载体分 别命名为 pET-9Aa、pET-lAb、pET-lAc 和 pET-lCa。
CrylAb-Cry9Aa 构建过程=CrylAb 片段由 BamHI 和 XmaI 酶切 pET-lAb 获得， Cry9Aa片段由XmaI和SacI酶切pET_9Aa获得。载体pET28a经过BamHI和SacI酶切以后 和CrylAb以及Cry9Aa连接，得到载体PET-CrylAb-Cry9Aa。这个载体包含一个融合基因， CrylAb-Cry9Aa(如SEQ ID NO 1)，其编码一个氨基酸序列为SEQ ID No 3的融合蛋白质。
CrylAc-Cry9Aa 构建过程CrylAc 片段由 BamHI 和)(mal 酶切 pET-lAc 获得， Cry9Aa片段由XmaI和SacI酶切pET_9Aa获得。载体pET28a经过BamHI和SacI酶切以 后和CrylAc以及Cry9Aa连接，得到载体PET-CryAC-Cry9Aa。这个载体包含一个融合基因， CryAc-Cry9Aa(如SEQ ID NO 2)，其编码一个氨基酸序列为SEQ ID No 4的融合蛋白质。
说明SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核酸序列的表达框从第一个起始密码子 (ATG)开始，到最后终止密码子(TAA)前结束，长度均为3933bp，与SEQ ID NO :3和SEQ IDNO 4对应。第一个ATG前的核酸序列GGATCC为BamHl酶切位点，其后的ACC为核糖体结 合位点，最后GAGCTC为Mel酶切位点。
CrylAb-CrylCa 的构建过程CrylAb 片段由 BamHI 和)(mal 酶切 pET-lAb 获得， CrylCa片段由XmaI和&icl酶切ρΕΤ-lCa获得。载体pET28a经过BamHI和&icl酶切以后 和CrylAb以及CrylCa连接，得到载体pET-CrylAb-CrylCa。这个载体包含一个融合基因， CryAb-CrylCa，其核酸序列为 SEQ ID No :9。
实施例2、杀虫蛋白质的制备
包含杀虫基因的载体pET_9Aa、pET-lAb、pET-lAc、pET-lCa、CrylAb-Cry9Aa, CryAc-Cry9Aa 和 CrylAb-CrylCa 分别导入 BL21Star 细胞系(Ε. coli)，在包含 50mg/L 卡那 霉素的LB固体培养基上选取单克隆。单个菌落接种到100毫升LB细菌培养液，在37°C下 震动培养至 OD600 = 0 . 6，然后加 IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactoside)到 0. 5mM,并继 续在同样的条件下培养4小时。培养液经过5000g离心10分钟沉淀大肠杆菌细胞，然后弃 上清收集沉淀。沉淀中加30毫升20mM Tris-HCl缓冲液，超声粉碎。这样获得的重组蛋白 质用来进行杀虫活性的测定。
实施例3、在大肠杆菌中表达的杀虫蛋白的杀虫活性测定
实施例2所获得的杀虫蛋白各100微升单独或者混合涂在0. 5平方厘米昆虫人工 饲料的表面，饲养新生一龄幼虫用来进行杀虫活性测定。阴性对照的准备方法与实施例2 相同，但质粒为不含任何插入DNA的pET28a载体本身。饲养7天以后统计杀虫率，结果如 表1和2所示
表 1、CrylAb_Cry9Aa 的杀虫率
权利要求
1.一种抗虫融合基因，其特征是所述基因包括从5’ -3’依次含有编码BT晶体毒素 Cryl的核苷酸序列和编码Cry9Aa毒素的核苷酸序列；且上述2个核苷酸序列位于同一个 开放阅读框内。
2.根据权利要求1所述的抗虫融合基因，其特征是所述抗虫融合基因包括CrylAa、 CrylAb, CryIAc, CrylAa的修饰基因、CrylAb的修饰基因或CrylAc的修饰基因；所述抗虫 融合基因还包括Cry9Aa或者Cry9Aa经过修饰的基因。
3.根据权利要求1或2的抗虫融合基因，其特征是所述抗虫融合基因的核苷酸序列 为以下任意一种SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、与 SEQ ID NO :3 相比具有彡 90% 的相同性、与 SEQ ID NO: 4相比具有彡90%的相同性。
4.根据权利要求1 3中任意一种抗虫融合基因所编码的融合蛋白，其特征是所述 融合蛋白从N端至C端依次为Cryl晶体毒素和Cry9Aa毒素。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征是所述融合蛋白的氨基酸序列为以下任 意一种SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、与 SEQ ID NO :1 相比具有彡 90% 的相同性、与 SEQ ID NO: 2相比具有彡90%的相同性。
6.如权利要求4或5所述的融合蛋白在转基因抗虫农作物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗虫融合基因，该基因包括从5’-3’依次含有编码BT晶体毒素Cry1的核苷酸序列和编码Cry9Aa毒素的核苷酸序列；且上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内。该抗虫融合基因包括Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Aa的修饰基因、Cry1Ab的修饰基因或Cry1Ac的修饰基因；还包括Cry9Aa或者Cry9Aa经过修饰的基因。本发明还同时公开了上述抗虫融合基因所编码的融合蛋白，该融合蛋白从N端至C端依次为Cry1晶体毒素和Cry9Aa毒素。本发明的融合蛋白能用于制备转基因抗虫农作物。
文档编号C07K19/00GK102031266SQ201010132429
公开日2011年4月27日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者沈志成, 高建华 申请人:浙江大学