专利名称：：一种促性腺激素的纯化方法
技术领域：
：本发明涉及一种促性腺激素的纯化方法，特别是涉及一种从绝经妇女的尿液中提取的促性腺激素的纯化方法。
背景技术：
：促性腺激素(gonadotropin,gonadotropichormone)是指能够促进雌雄两种性腺的发育，增加性激素分泌的一类激素，如脑垂体前叶分泌的黄体生成激素(LH)和卵泡剌激素(FSH)，人胎盘绒毛膜分泌的绒毛膜促性腺激素(HCG)。其中，FSH和LH的主要作用是促进卵巢或睾丸生成和分泌甾体性激素，它们与HCG合用，可治疗性腺激素分泌不足所致的原发性或继发性闭经，无排卵性稀发月经所致的不孕症等。绝经期妇女由于雌性激素和孕激素缺乏，从而反馈调节垂体，分泌大量FSH和LH，由尿中排出。因此，目前以FSH和LH为主要成分的促性腺激素生产方法多以绝经期妇女的尿液作为原料，经过高岭土吸附、酒精抽提得到〉3iu/mg的尿促性腺激素粗品。国内目前常用的纯化方法收率偏低(一般小于50%)，成品效价在100iu/mg左右。
发明内容本发明的目的在于提供一种从绝经妇女的尿液中提取的促性腺激素的纯化方法。与已有的促性腺激素的提取分离方法相比，本发明的纯化方法获得的以FSH和LH为主要成分的促性腺激素产品具有更高的效价(效价>150iu/mg)，收率也更高(>75%)。本发明提出的从绝经妇女的尿液中提取的促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤(1)将尿促性腺激素粗品以溶液A溶解后加入硅酸铝粉末进行吸附，离心得沉淀以溶液A洗涤；再以溶液B洗脱沉淀，洗脱液过滤后加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀得中间体I;(2)将中间体I以溶液C溶解，将得到的溶液经阴离子交换树脂进行层析，以溶液D洗脱，洗脱液中加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀得中间体II;(3)将中间体II以溶液B溶解，先后加入溶液E和溶液F除热原，再加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀，分装得成品。其中，所述溶液A可以为0.05-0.08mol/L醋酸钠缓冲液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5;溶液B可以为含有8-12重量％乙酸铵的20-60体积％乙醇水溶液；溶液C可以为0.05-0.07mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，以盐酸调节pH至6-8;溶液D可以为0.2-0.3mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，以盐酸调节pH至6-8;溶液E可以为0.1-0.3mol/L磷酸钠溶液；溶液F可以为0.2-0.4mol/L的醋酸钙溶液。例如，在本发明的一种优选的实施方式中，所述溶液A为0.05mol/L醋酸钠缓冲液，以冰醋酸调节pH至5.0;溶液B为含有10%乙酸铵的40%乙醇溶液；溶液C为0.05mo1/3L的Tris-HCl缓冲液，以2mol/L盐酸调节pH至7.0;溶液D为0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，以2mol/L盐酸调节pH至7.0;溶液E为0.2mol/L磷酸钠溶液；溶液F为0.3mol/L的醋酸钙溶液。下面，对步骤(1)中的操作进行详细的说明所述洗脱液的过滤方式可以为各种常规的过滤方式，优选采用抽滤，进一步优选先抽滤后再用1万分子量的膜超滤；所述沉淀用乙醇可以为浓度为75-100体积％的乙醇，优选使用95体积％的药用级乙醇；优选情况下，为了节约干燥时间，可以在沉淀干燥前用先无水乙醇进行脱水；干燥操作优选采用真空干燥，进一步优选采用在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。下面对步骤(2)中的操作进行详细的说明所述阴离子交换树脂优选为DE-23阴离子交换树脂和/或DEAE阴离子交换树脂；优选情况下，在层析时先用溶液C洗涤完毕后再用溶液D进行洗脱；所述沉淀用乙醇可以为浓度为75-100体积％的乙醇，优选使用95体积％的药用级乙醇；优选情况下，为了节约干燥时间，可以在沉淀干燥前用先无水乙醇进行脱水；干燥操作优选采用真空干燥，进一步优选在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。下面对步骤(3)中的操作进行详细的说明除热原操作可以为在中速搅拌下，缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，用5-10mol/L氢氧化钠调pH至7.5_8.0，搅拌后离心，上清液再缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，搅拌后用5-10mol/L氢氧化钠调pH至7.5-8.O，离心后上清液用冰醋酸调整pH至6.5-7.5;例如，在本发明的一种优选的实施方式中，除热原操作为在中速搅拌下，缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH至8，搅拌后离心，上清液再缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，搅拌后用10mol/L氢氧化钠溶液调pH至8，离心后上清液用冰醋酸调整pH至7.0;所述沉淀用乙醇可以为浓度为75-100体积％的乙醇，优选使用95体积％的药用级乙醇；优选情况下，为了节约干燥时间，可以在沉淀干燥前先用无水乙醇进行脱水；干燥操作优选采用真空干燥，进一步优选在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。优选地，所述除热原，分装操作均在十万级洁净区域内进行。本发明提供的纯化方法获得的以FSH和LH为主要成分的促性腺激素产品具有更高的效价，收率也更高。结合以下附图来详细说明具体实施例方式图1本发明提供的从绝经妇女的尿液中提取的促性腺激素的纯化工艺流程图。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例—、工艺操作过程实施例使用的纯化工艺流程图如图1所示，具体的操作方法如下1溶解、吸附、洗涤、洗脱、沉淀、干燥1.l溶解4在1kg托盘天平上精确称取尿促性腺激素粗品300g，放入40L不锈钢桶内，加入30L的0-15t:溶液A，置于防爆搅拌机上，用不锈钢搅拌棒搅拌，速度为200-400转/分，控制温度o-i5t:搅拌溶解。1.2吸附在搅拌下(转速200-400转/分)向上述溶解液中缓慢加入3公斤硅酸铝粉末，继续搅拌2小时，控制温度o-i5t:，得吸附液，移入离心机房。1.3洗涤将上述吸附液倒入洁净塑料广口离心杯内，在事先经校准后的1kg托盘天平上平衡，放入离心机内在4°C，4000转/分的条件下离心10分钟。倾去上清液，向沉淀加入0_15°C的溶液A，在离心杯内用塑料棒手动搅拌均匀后，再在天平上平衡，然后在4°C，4000转/分的条件下离心10分钟。再倾去上清液，反复操作直至离心上清液在280nm处OD值小于0.3，得沉淀物，整个操作共使用70-100L溶液A，操作时间约3.5_4小时，离心机46台。1.4洗脱、沉淀沉淀物转入40L不锈钢桶内，加入24L溶液B，置于防爆搅拌机上，以不锈钢搅拌棒在200-400转/分钟，0-15t:的条件下搅拌2小时。然后使用15L抽滤瓶、430公分的不锈钢漏斗、300目尼龙布袋(或30公分A-II型澄清板)抽滤至干，收集滤液，5000ml烧杯量取其体积并记录。滤渣置于上述40L不锈钢桶内，加入10-20L的溶液B，以上述条件搅拌2小时，抽滤，滤液量取体积。将合并的滤液在1万分子量的膜超滤下浓縮至体积为4-5L，在280nm处测其OD值并记录。将上述滤液转入两只80L不锈钢桶内，在塑料棒手动搅拌下，缓慢加入4倍量O-l(TC的95体积％的药用级乙醇，继续搅拌至沉淀物出现，混合液移入冷库O-l(TC高位存放过夜。1.5干燥次日在冷库内虹吸去除上清液，沉淀部分合并置于40L不锈钢桶内，推入离心房，用广口离心杯在天平上平衡后，在4°C、4000转/分的条件下离心10分钟，上清液倾入规定收集桶内(回收)。沉淀加入4-8倍量的-l(TC的AR级无水乙醇，用油画毛笔充分搅碎搅匀、洗涤、脱水后，再在天平上平衡，在4°C、4000转/分的条件下离心10分钟，反复三次，离心后的沉淀物合并于4-6只离心杯内，离心弃去上清液。将沉淀所在离心杯用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内室温减压真空干燥(在不锈钢盘内放有五氧化二磷的条件下)，真空度控制在-0.1Mpa，干燥时间24小时，其间更换5次五氧化二磷，得中间体I，在0.25kg托盘天平上称重后，保存于洁净的玻璃药瓶内，4t:冰箱内保存，并取样100mg置于洁净10ml管制抗生素瓶内，加盖后贴上标签，取样测定FSH效价。2溶解、层析、洗脱、沉淀、干燥2.1溶解在lkg托盘天平上，精确称取中间体I200g(约400万单位)置于5L不锈钢桶内，加入3-4L溶液C后置于台式无级调速搅拌机上，用不锈钢搅拌棒中速搅拌至完全溶解。将混和溶解液倒入洁净塑料广口离心杯内，在事先经校准后的lkg托盘天平上平衡，放入离心机内，在4°C、4000转/分的条件下离心30-45分钟，弃渣，上清液倒入30L不锈钢桶内，补加溶液C至20L，待上样。2.2层析将上样液放置高位，温度O-l(TC，流入二根DE-23阴离子交换树脂柱，柱高lm，直径15cm，体积10-12L，流速40-50ml/分钟，上样完毕(约4-5小时)，用溶液C洗涤(流速40-50ml/分钟)至流出液在280nm处的0D值小于0.1，同步观察色带是否均衡、平整，洗涤体积约2-3柱体积，操作时间约7-8小时。2.3洗脱洗涤完毕即用溶液D进行洗脱，流速60-70ml/分，用广口离心杯分部收集色带位置，有活力的部分(紫外分光度计测定OD值，当OD值明显下移即停止收集)，收集液合并量其体积，测定其总OD值并作记录，得洗脱液，操作过程约4-5小时。2.4沉淀根据洗脱液体积放置相应不锈钢桶内，用塑料棒边搅拌，边加入5倍量-IO-(TC的95%药用级乙醇，搅拌至沉淀物出现，移入冷库O-l(TC高位存放过夜。2.5干燥在冷库内虹吸去除上清液，沉淀部分连桶移入离心室，用广口离心杯在事先准备好后的lkg托盘天平上平衡后进行离心，在4°C，4000转/分的条件下离心10分钟，离心后将上清液倾入规定收集桶内(回收)。向沉淀加入4-8倍量的-l(TC的AR级无水乙醇，用油画毛笔充分搅碎搅匀、洗涤、脱水后，再在天平上平衡，在4°C，4000转/分的条件下离心10分钟，如此反复三次，离心后的沉淀物合并于4-6只离心杯内，用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内室温减压，真空干燥(盛放有五氧化二磷在不锈钢盘内)，真空度控制在-0.1Mpa，干燥时间约24小时，其间更换5次五氧化二磷，得中间体II。在0.25kg托盘天平上称重后，保存于洁净的玻璃药瓶内，4t:冰箱内保存，并取样150mg置于洁净10ml管制抗生素瓶内，加盖后贴标签、取样测定FSH及LH效价。3溶解、除热原、沉淀、干燥、分装3.1溶解在lkg托盘天平上，精确称取中间体II160g(约500万单位)放入IOL不锈钢桶内，加入5-8L的0-15°C的溶液B，置于台式无级调速搅拌机上，用不锈钢搅拌棒中速搅拌至完全溶解，将溶解液倒入洁净塑料广口离心杯内，在事先经校准后的lkg托盘天平上平衡，放入离心机内，在4°C，4000转/分的条件下离心30-45分钟，弃渣，上清液倒入30L不锈钢桶内，补加溶液B至16L得清液。上述操作时间约1.5-2小时，环境温度l(TC左右。3.2除热原在机械搅拌器中速搅拌下，向上述清液中缓慢加入1600ml溶液E，中速搅拌1小时后再滴加1600ml的溶液F，用1Omol/L氢氧化钠调pH至8(精密试纸)，中速搅拌30分钟，倒入洁净无热原带盖离心杯内，在lkg托盘天平上平衡后离心，在4°C，4000转/分钟的条件下离心1小时，弃渣，清液再缓慢加入1600ml的溶液E，中速搅拌1小时，再滴加1600ml溶液F，中速搅拌30分钟，用1Omol/L氢氧化钠调pH至8(精密试纸)，倒入洁净无热原带盖离心杯内，平衡后离心，在4°C，4000转/分钟的条下离心1小时后弃渣，清液用冰醋酸调整pH至7.0。3.3沉淀根据清液体积放入相应不锈钢桶内，加4倍量的-IO-(TC的95体积％药用级乙醇过夜沉淀。3.4干燥次日倾去上清液，沉淀部分连同不锈钢桶移入离心室，沉淀部分倾入带盖无热原离心杯中，经天平平衡后，放入离心机在4°C、4000转/分的条件下离心10分钟，离心上清液倾入规定收集桶内(回收)，沉淀加入4-8倍量的-l(TC的AR级无水乙醇，用不锈钢药勺搅匀、搅拌研碎。洗涤脱水后再在天平上平衡，在4t:、4000转/分的条件下离心IO分钟，反复三次，离心后的沉淀物合并于6只离心杯内离心，去清液后，沉淀连离心杯用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内室温减压干燥(在不锈钢盘内放有五氧化二磷的条件下)，真空度控制在-0.1Mpa，干燥时间约30小时，其间更换4次五氧化二磷，得无热原干燥品，在0.25kg托盘天平上称重后，保存于洁净的玻璃药瓶内，4t:冰箱内保存，并取样150mg置于洁净10ml管制抗生素瓶内，加盖后贴上标签、取样，测定FSH、LH效价及热原。3.5分装根据已知效价，将无热原块状成品，放入无热原60目不锈钢筛网中，用玻璃研头研碎，放入相应无热原玻璃药瓶中，用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内，室温减压干燥(箱内放有干燥剂五氧化二磷)，真空度控制在-O.1Mpa，干燥时间约10小时，其间更换2次五氧化二磷，抽水份，质检取样测定干燥失重、热原、FSH、LH效价等全项，成品保存于4°C冰箱内，化验合格，办理入库手续。以上除热原，分装操作均在十万级洁净区域内进行。其中在不同的实施例中使用的溶液的配方如表1所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>二、质量标准与检验方法1.质量标准尿促性素粗品每mgFSH效价3.7-5.0单位，干燥失重《10%;成品每mgFSH效价>150单位；粗品一成品收率>75%。2.检验方法a.用溶媒(pH7.0±0.2的每1ml含有lmg牛血清蛋白的生理盐水溶液)将标准品和待测品分别配制成含FSH高、中、低三种浓度的溶液，相邻两个剂量的比值(r)为0.5，所有标准品和待测品溶液的高剂量浓度相同。b.每次实验(同时安排2个标准品和8个待测品进行实验)将41-60g雌性大鼠按体重随机分成31组，每组8只，第1-30组为给药组，按顺序在每日基本相同的时间内，每鼠背部皮下注射FSH溶液0.5ml，连续给药3日，低、中、高剂量组每鼠接受的FSH剂量分别为1.0、2.0、4.OIU，第31组为空白对照组，仅注射溶媒，注射体积与给药组相同。c.第4日上午按上述给药顺序处死动物，称取每鼠体重，解剖，取出卵巢，小心剥离随着的脂肪等组织，用滤纸吸干卵巢周围的水分并立即称重(精确到O.lmg)，计算每只大鼠的卵巢重(mg)与体重(g)的比值。用bs2000生物统计软件中量反应平等线3.3法计算生物效价。参考"尿促性素第三批国家标准品的标定"，中国药品标准，2007年第8巻第4期第50-52页；《中国药典》[S]二部，2005，附录XIIN。三、检验结果检验结果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通过表2中的数据可以看出，本发明提供的促性腺激素的纯化方法收率可以达到75%以上，同时单位效价可以达到150iu/mg以上。权利要求一种从绝经妇女的尿液中提取的促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤(1)将尿促性腺激素粗品以溶液A溶解后加入硅酸铝粉末进行吸附，离心得沉淀以溶液A洗涤；再以溶液B洗脱沉淀，洗脱液过滤后加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀得中间体I；(2)将中间体I以溶液C溶解，将得到的溶液经阴离子交换树脂进行层析，以溶液D洗脱，洗脱液中加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀得中间体II；(3)将中间体II以溶液B溶解，先后加入溶液E和溶液F除热原，再加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀，分装得成品；其中所述溶液A为0.05-0.08mol/L醋酸钠缓冲液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液B为含有8-12重量％乙酸铵的20-60体积％乙醇水溶液；溶液C为0.05-0.07mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，以盐酸调节pH至6-8；溶液D为0.2-0.3mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，以盐酸调节pH至6-8；溶液E为0.1-0.3mol/L磷酸钠溶液；溶液F为0.2-0.4mol/L的醋酸钙溶液。2.根据权利要求l所述的纯化方法，其中，在步骤(1)中，所述洗脱液过滤的方式为抽滤。3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，在步骤(1)中，所述洗脱液过滤的方式为抽滤后用1万分子量的膜超滤。4.根据权利要求l-3中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(2)中，在阴离子交换树脂层析时先用溶液C洗涤完毕后再用溶液D进行洗脱。5.根据权利要求1-4中任一项所述的纯化方法，其中，所述阴离子交换树脂为DE-23阴离子交换树脂和/或DEAE阴离子交换树脂。6.根据权利要求l-5中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(3)中，除热原操作为在中速搅拌下，缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，用5-10mol/L氢氧化钠调pH至7.5-8.0，搅拌后离心，上清液再缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，搅拌后用5-lOmol/L氢氧化钠调pH至7.5-8.0，离心后上清液用冰醋酸调整pH至6.5-7.5。7.根据权利要求l-6中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(3)中，所述除热原，分装操作均在十万级洁净区域内进行。8.根据权利要求l-7中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(1)至(3)中，沉淀用乙醇均为95体积％的药用级乙醇。9.根据权利要求1-8中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(1)至(3)中，沉淀干燥前用无水乙醇进行脱水。10.根据权利要求l-9中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(1)至(3)中，干燥操作均采用真空干燥，优选采用在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。全文摘要本发明提供一种从绝经妇女的尿液中提取的促性腺激素的纯化方法。与已有的促性腺激素的提取分离方法相比，本发明的纯化方法获得的以FSH和LH为主要成分的促性腺激素产品具有更高的效价(＞150iu/mg)，收率也更高，可以达到75％以上。文档编号C07K1/30GK101792482SQ20101013278公开日2010年8月4日申请日期2010年3月12日优先权日2010年3月12日发明者万龙岩,周金申请人:丽珠医药集团股份有限公司;上海丽珠制药有限公司