专利名称：：一种酪氨酸磷酸化肽的纯化方法
技术领域：
：本发明是一种基于β-消除和Michael亲核加成反应的酪氨酸磷酸化肽的纯化方法，是β-消除和Michael亲核加成方法在磷酸化蛋白质组中的应用，β-消除和Michael亲核加成反应方法对酪氨酸磷酸化肽段显示出高的特异性，高的选择性和高的灵敏度。β-消除和Michael亲核加成反应可以实现对酪氨酸磷酸肽的纯化，使其能够应用于蛋白质翻译后修饰的磷酸化蛋白质组中。通过β-消除和Michael亲核加成反应方法消除丝氨酸和苏氨酸上的磷酸基团，进而利用磷酸肽富集材料从复杂蛋白酶解样品中纯化出酪氨酸磷酸化肽段，结合生物质谱进行大规模酪氨酸磷酸化蛋白质的鉴定和酪氨酸磷酸化位点的确定。
背景技术：
：蛋白质的翻译后修饰是蛋白质组中研究的热点课题。蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质的翻译后修饰方式，是目前已知的信号的主要传递方式。蛋白质的磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。蛋白质酪氨酸磷酸化在细胞的信号传导中起着非常重要的作用。酪氨酸激酶的异常激活可以产生异常的细胞增殖和存活信号进而导致形成肿瘤或癌症。因此，对于酪氨酸磷酸化的分析十分重要。由于酪氨酸磷酸化的含量相对于丝氨酸和苏氨酸磷酸化的含量低很多，常用的磷酸化富集方法不能有效地对磷酸化的酪氨酸进行选择性富集。目前，利用抗体免疫亲和富集是酪氨酸磷酸化分析的首选。在蛋白质水平上，酪氨酸的抗体很多，富集的效果并不是十分理想；在肽段水平上，抗体P-Tyr-IOO富集P-Tyr磷酸肽在大规模分析中得到了广泛的应用。虽然在肽水平上富集P-Tyr磷酸肽效率很高，但是较低的序列覆盖率导致蛋白质鉴定困难，溶剂和温度要求苛刻以及昂贵的试剂价格限制了它的广泛应用。而将消除和Michael亲核加成反应方法应用于纯化酪氨酸磷酸化肽未见报道，与常规商品化的P-Tyr-IOO免疫亲和方法富集方法相比，β-消除和Michael亲核加成反应方法显示出同样高的特异性，选择性和灵敏度。下列非专利文献(文献1.0da，Y.等，“Enrichmentanalysisofphosphorylatedproteinsasatoolforprobingthephosphoproteome，，，((NatureBiotechnology)),P379-382(2001^)2.Kinoshita,E.^,"Phosphate-bindingtag,anewtooltovisualizephosphorylatedproteins，，，((Molecular&CellularProteomics)),P749-757(2006^).文3.He,T.^,"Quantitationofphosphopeptidesusingaffinitychromatographyandstableisotopelabeling,((JournaloftheAmericanSocietyForMassSpectrometry》，P363-373(2004年)；文献4.VanderVeken等，"Developmentofanovelchemicalprobefortheselectiveenrichmentofphosphorylatedserine-andthreonine-containingpeptides.”，((Chembiochem)),P2271-2280(2005年)；文献5.Thaler，F.等，"Anewapproachtophosphoserineand3phosphothreonineanalysisinpeptidesandproteins:chemicalmodification,enrichmentviasolid—phasereversiblebinding,andanalysisbymassspectrometry",((AnalyticalandBioanalyticalChemistry)),P366-373(2003年)；文献6.Stevens,S.Μ.等，"Enhancementofphosphoproteinanalysisusingafluorescentaffinitytagandmassspectrometry",((RapidCommunicationsinMassSpectrometry)),P2157-2162(2005年))中记载将β_消除和Michael亲核加成反应用于丝氨酸和苏氨酸磷酸肽或蛋白的分离和纯化。而β-消除和Michael亲核加成反应用于酪氨酸磷酸肽的富集和纯化，上述非专利文献中未作任何记载，也未作任何启示。
发明内容为解决上述课题，发明人经研究发现β-消除和Michael亲核加成反应能够对非酪氨酸磷酸肽进行消除反应，而酪氨酸磷酸肽则不发生消除反应，进而可以被磷酸肽富集材料纯化出来，该方法的流程图如图1所示。本发明是基于β-消除和Michael亲核加成反应不能消除酪氨酸磷酸肽上的磷酸基团的性质进而将其纯化。本发明的目的在于提供一种高选择性、高特异性的分离和富集酪氨酸磷酸肽的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种酪氨酸磷酸化肽的纯化方法，基于β-消除和Michael亲核加成反应不能将酪氨酸磷酸化肽中的磷酸基团消除的特性；具体是利用β-消除和Michael亲核加成反应消除掉蛋白酶解液中非酪氨酸磷酸肽上的磷酸修饰基团，然后再用磷酸肽富集材料富集未发生消除反应的酪氨酸磷酸化肽。所述非酪氨酸磷酸肽是指丝氨酸磷酸肽和/或苏氨酸磷酸肽。具体操作过程为，1)富集蛋白酶解液样品中的磷酸肽，包括丝氨酸磷酸肽、苏氨酸磷酸肽和酪氨酸磷酸肽。2)β-消除和Michael亲核加成反应A.将去离子水、乙醇、DMS0、4-6MNaOH和饱和Ba(OH)2以0.9-1.10.9-1.10.9-1.10.9-1.10.09-0.11体积比例混合，得混合液，然后向混合液中通氩气除去溶液中的氧气；B.按磷酸肽浓度为0.1-100μg/μ1，将磷酸肽溶解于混合液中，继续通氩气，加入β-巯基乙醇，β-巯基乙醇与混合液的体积比例为0.9-1.10.9-1.1；摇勻后放置到80-95°C的水浴中，同时将氩气在液面上吹扫，反应>5小时；C.待反应结束后，将上述溶液用TFA溶液调pH<7，然后向其中加入体系溶液1_5倍体积的ACN混勻，得产物溶液；3)富集产物溶液中未发生β-消除反应的酪氨酸磷酸肽，丝氨酸磷酸肽和/或苏氨酸磷酸肽由于发生β-消除反应丢失磷酸基团而不被富集。本发明为β-消除和Michael亲核加成方法在磷酸化蛋白质组学研究中的应用。蛋白质磷酸化是生物体内最常见、最重要的翻译后修饰之一，是信号传递的主要方式。蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程几乎调节着生命活动的整个过程。质谱技术的快速发展为磷酸4化蛋白质组的分析提供了强有力的工具。蛋白质酪氨酸磷酸化在细胞的信号传导中起着非常重要的作用。酪氨酸激酶的异常激活可以产生异常的细胞增殖和存活信号进而导致形成肿瘤或癌症。因此，对于酪氨酸磷酸化的分析十分重要。由于酪氨酸磷酸化的含量相对于丝氨酸和苏氨酸磷酸化的含量低很多，常用的磷酸化富集方法不能对磷酸化的酪氨酸进行选择性的富集。本专利提供一种利用消除和Michael亲核加成反应高特异性，高选择性的从复杂蛋白酶解样品中纯化酪氨酸磷酸肽的方法。图1为β-消除和Michael亲核加成反应方法的流程图。图2为β-消除和Michael亲核加成反应方法对标准磷酸化蛋白β-casein酶解产物和标准酪氨酸磷酸肽PY以摩尔比为1I(Ipmol)的混合物中的酪氨酸磷酸化肽纯化和富集的MALDI-T0F质谱。(A)为原始样品的混合物，(B)为经过富集材料Ti4+-IMAC处理后的样品混合物，(C)为β-消除和Michael亲核加成反应两个小时后的样品混合物，(D)为β-消除和Michael亲核加成反应过夜后的样品混合物，(E)为再次经过Ti4+-IMAC富集处理后的样品。图3为β-消除和Michael亲核加成反应方法对标准磷酸化蛋白β-casein酶解产物和标准酪氨酸磷酸肽pY以摩尔比为11的情况下，㈧lpmol，(B)IOOfmol,(C)IOfmol的混合物中酪氨酸磷酸化肽纯化和富集的MALDI-T0F质谱。图4为β-消除和Michael亲核加成反应方法对混合的复杂蛋白酶解样品中酪氨酸磷酸化肽段的纯化和富集。(A)pYβ-caseinα-caseinBSA=1101010，(C)pYβ-caseinα-caseinBSA=1100100100为β-消除和Michael亲核加成反应方法对酪氨酸磷酸化肽段纯化和富集前的MALDI-T0F质谱。(B)pYβ-caseinα-caseinBSA=1101010，(D)pYβ-caseinα-caseinBSA=1100100100为β-消除和Michael亲核加成反应方法对酪氨酸磷酸化肽段纯化和富集后的MALDI-T0F质谱。具体实施例方式表.1丝氨酸和酪氨酸磷酸化肽段的氨基酸序列(特征关键词PHOSPHORYLATION)，磷酸酸化位点以及分子量.权利要求1.一种酪氨酸磷酸化肽的纯化方法，其特征在于基于β-消除和Michael亲核加成反应不能将酪氨酸磷酸化肽中的磷酸基团消除的特性；具体是利用β-消除和Michael亲核加成反应消除掉蛋白酶解液中非酪氨酸磷酸肽上的磷酸修饰基团，然后再用磷酸肽富集材料富集未发生消除反应的酪氨酸磷酸化肽。2.按照权利要求1所述的纯化方法，其特征在于所述非酪氨酸磷酸肽是指丝氨酸磷酸肽和/或苏氨酸磷酸肽。3.按照权利要求1所述的纯化方法，其特征在于具体操作过程为，1)富集蛋白酶解液样品中的磷酸肽；2)β-消除和Michael亲核加成反应A.将去离子水、乙醇、DMS0、4-6MNaOH和饱和Ba(OH)2以0.9-1.10.9-1.10.9-1.10.9-1.10.09-0.11体积比例混合，得混合液，然后向混合液中通氩气除去溶液中的氧气；B.按磷酸肽浓度为0.1-100μg/μ1，将磷酸肽溶解于混合液中，继续通氩气，加入β-巯基乙醇，β-巯基乙醇与混合液的体积比例为0.9-1.10.9-1.1；摇勻后放置到80-95°C的水浴中，同时将氩气在液面上吹扫，反应>5小时；C.待反应结束后，将上述溶液用TFA溶液调pH<7，然后向其中加入体系溶液1-5倍体积的ACN混勻，得产物溶液；3)富集产物溶液中的磷酸肽。全文摘要本发明为β-消除和Michael亲核加成方法在磷酸化蛋白质组学研究中的应用。具体地说是一种酪氨酸磷酸化肽的纯化方法，是利用β-消除和Michael亲核加成反应消除掉蛋白酶解液中非酪氨酸磷酸肽上的磷酸修饰基团，然后再用磷酸肽富集材料富集未发生消除反应的酪氨酸磷酸化肽。本发明利用β-消除和Michael亲核加成反应高特异性，高选择性的从复杂蛋白酶解样品中纯化酪氨酸磷酸肽的方法。文档编号C07K1/14GK102199189SQ20101013326公开日2011年9月28日申请日期2010年3月26日优先权日2010年3月26日发明者叶明亮,王春丽,邹汉法,韩广辉申请人:中国科学院大连化学物理研究所