专利名称：真菌环氧二烯烟酸衍生物4-ndm及其合成方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌环氧二烯烟酸衍生物，尤其是涉及一种真菌环氧二烯烟酸衍 生物4-NDM及其合成方法与用途。
背景技术：
细胞凋亡是多细胞生物保证个体正常生长发育和细胞新陈代谢、维持机体稳定及 体内平衡的重要生物学功能之一，其功能异常与肿瘤等疾病的发生有关。真菌环氧二烯 (Mycoepoxydiene)可以通过作用于Hsp90，进而引起其客户蛋白质的降解，诱导肿瘤细胞 凋亡，从而在制备抗肿瘤等药物中具有重要价值。Mycoepoxydiene是一种利用新分离获得的菜豆间座壳菌HLY2代谢产生的化合物 乙酸2-(8_甲基-9-氧杂双环[4. 2. 1]九-2，4-二烯-7-基]-6-氧-3，6-二氢-2H-吡
喃-3-基酯])，其结构式为
O研究表明，Myco印oxydiene具有抗肿瘤活性，其对人口腔皮样癌KB细胞IC5tl < 6. 25μ g/mL，对人骨肉瘤MG63细胞IC5tl = 34. 6 μ g/mL(参见公开号为CN101024647的 发明专利申请)。鉴于Myco印oxydiene在引起肿瘤细胞凋亡等生物学过程中发挥着重要的作用， 且其作用机制的独特性，因而真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM具有抗肿瘤功能的开发价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结构新颖的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM及其合 成方法与用途。本发明所述真菌环氧二烯烟酸衍生物4-冊11为6-[(11 ，65，71 ，85)-8-甲基_9_氧 杂双环[4. 2. 1]九-2，4-二烯-7-基]-5-(卩比啶-4-氧基)-5，6-二氢-2H-吡喃_2_酮， 简称为4-NDM，其分子式为C19H19NO4，结构式为<formula>formula see original document page 4</formula>4-NDM化合物为白色针状晶体，易溶于甲醇、丙酮、二甲基亚砜等有机溶剂中。本发明所述真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的合成路线为
<formula>formula see original document page 4</formula>
其具体步骤为将DAM (南强菌素)和烟酸溶解在二氯甲烷中，在冰浴条件下，加入脱水剂和催化 齐 ，混合后，撤去冰浴，再搅拌反应后，反应产物过滤，将滤液减压浓缩至干，柱层析分离得 到反应产物真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM。所述DAM是一种可以从海洋微生物分离到的已知的Myco印oxydiene的衍生物，其 结构式见上述真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的化学合成路线。所述DAM和烟酸的用量可相同；所述脱水剂可采用N，N: 二环己基碳化二亚胺 (DCC)，所述催化剂可采用4-二甲氨基吡啶(DMAP)；所述脱水剂的加入量可与DAM相同；所 述催化剂的加入量可为DAM的0. 01% 5% ；所述混合后，撤去冰浴，最好是混合30min后 撤去冰浴；所述再搅拌反应，可在室温下搅拌反应4 8h。反应产物的结构式和分子量可分别通过核磁共振(NMR)分析和质谱(MS)分析予
以鉴定。本发明所述真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM合成路线简单，得率高，实验证实 4-NDM具有很强的抗肿瘤活性，对HeLa细胞的IC5tl为4. 71 μ mol/L ；能产生诱导肿瘤细胞凋 亡的效应，抗肿瘤作用靶点明确，可用于制备治疗癌症的药物。
图1为真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM对HeLa细胞的抑制效果。在图1中，横坐 标为浓度(μ mol/L)，纵坐标为抑制率；由图1表明，4-NDM对HeLa细胞的生长具有很强的 抑制作用。图2显示化合物4-NDM对HeLa细胞存活的影响。在图2中，横坐标为浓度(ymol/ L)，纵坐标为Pl阴性细胞数(％ )。
图3显示化合物4-NDM对HeLa细胞的形态的影响。在图3中，标尺为100 μ m ；用不同浓度(0，2，5，10 μ mol/L)的4-NDM作用于HeLa细胞12，36h后普通光学显微镜直接观 察细胞的形态变化。图4为4-NDM对HeLa细胞的细胞核的影响。在图4中，用不同浓度(0，5，10μπιο1/ L)的4-NDM作用于HeLa细胞24h后对细胞进行DAPI染色，并进行荧光显微观察，箭头所示 为HeLa细胞发生核固缩的凋亡细胞核；由图4表明，4-NDM可以诱导HeLa细胞发生凋亡。图5为4-NDM对HeLa细胞周期分布的影响。在图5中，横坐标为DNA含量，纵坐标 为细胞数；图5给出用不同浓度(0，5，10 μ mol/L)的4-NDM作用HeLa细胞12h、36h和72h 后用流式细胞仪分析细胞周期的变化；由图5表明，随着浓度和作用时间的延长，HeLa细胞 周期分布发生明显的变化，表现在DNA含量和相对细胞数的变化。图6为4-NDM诱导HeLa细胞凋亡峰的百分含量对比。在图6中，横坐标为作用时间 (h)，纵坐标为亚二倍体峰(简写为SubGl)；由图6表明，4-NDM作用浓度越高(如15ymol/ L)，作用时间越长(如72h)，引起HeLa细胞凋亡的凋亡峰的百分含量越高(接近75%)。图7为4-NDM对Hsp90客户蛋白质降解作用。在图7中，显示4-NDM作用HeLa细 胞24h后相关蛋白质表达的Western blot分析结果；由图7表明，随着4-NDM浓度(0.5， 10，15，2015 μ mol/L)的增加，Hsp90的客户蛋白(简写为Akt，Raf-1，IKKβ，磷酸化的Akt) 表达量下调，而Hsp70的表达量显著上调，即4-NDM对Hsp90客户蛋白质具有降解作用；GA 为阳性对照。图8为化合物4-NDM对凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达的影响。由图8表明，随着 4-NDM浓度的升高，Bcl-2的表达水平降低；4-NDM对凋亡抑制蛋白(简写为Bcl_2)的表达 具有抑制作用；GA为阳性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但这些实施例仅用于说明本发明，而不 用于限制本发明的范围。实施例1、体外抗肿瘤活性检测在实施例1中，采用MTT (Methyl Thiazolyltetrazolium)法检测化合物在体外对 肿瘤细胞的抑制效果。试验方法收集对数生长期的HeLa细胞制成单细胞悬液，以6X IO4个/mL接种于96孔板 中，每孔80yL.另设3孔无细胞的空白对照孔(仅含DMEM完全培养基).置37°C，5%C02 的培养箱中培养24h，然后加入20 μ L用DMEM完全培养基稀释好的样品，等量DMSO作为 阴性对照组，继续培养72h.每孔加IOyL浓度为5mg/mL MTT溶液，37°C反应3h，每孔加 100 μ L终止液(10% SDS,0.01mol/L HCl)过夜，酶标仪比色测定(测定波长595nm，参考 波长655nm).对肿瘤细胞生长的抑制率按下式计算抑制率=(阴性对照组OD值-实验组 OD值)/ (阴性对照组OD值-空白组OD值)X 100 %，实验重复3次，取平均值。IC50为抑制率为50%时的样品浓度。试验结果化合物4-NDM对宫颈癌细胞HeLa具有很强的抑制活性，IC5tl为4. 71 μ mol/L (参见图1)。实施例2、细胞凋亡分析在实施例2中，采用DAPI染色及流式细胞仪测定法检测化合物诱导肿瘤细胞凋亡 的效果。试验方法
1)细胞存活率测定取对数生长期的细胞，均以个1. 5 2X IO5个/mL密度接种于6孔细胞培养板上 或者是以0. 5 1 X IO5个/mL密度接种于24孔细胞培养板上。培养过夜后，用相应药物 处理细胞，同时以未经处理细胞为阴性对照。消化收集药物处理了 一定时间的细胞，包括培养液中悬浮的死细胞，SOOrpm离 心5min，去上清，加ImL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心去上清，最后重悬细胞于含5 μ g/ mL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)的 PBS 缓冲液中(PI buffer :3. 4mmol/L 柠檬酸钠 (Trisodium Citrate) ,9. 65mmol/L NaCl,PI20mg/mL,0. 03% Nonidet P-40，配于 H2O 中)， 避光冰上孵育lOmin，上流式细胞仪(Flow CytoMeter，FCM)测定细胞存活率。2)细胞周期测定细胞的前期接种、药物处理与收集同上。收集的细胞经PBS缓冲液洗一次后，去上 清，将细胞逐滴加入70%预冷的乙醇中，-22°C固定6h以上。之后，离心去上清，重悬细胞 于PBS缓冲液，再次离心，去上清，最后重悬细胞于含lOOimit/mL RNA酶的PBS缓冲液中， 避光37°C处理30min，加2mg/mL PI至终浓度50 μ g/mL,避光孵育lOmin，过滤后上流式细 胞仪分析。3) DAPI染色检测细胞凋亡细胞接种于60mm培养皿中，培养过夜。加药物对细胞处理一定时间后进行染色操 作将细胞消化，并用PBS洗涤后，将细胞置于1.5毫升离心管，加入固定液，放在静音混勻 器上4°C固定30min，PBS洗涤PBS洗2次，每次5min。然后以50 μ g/mL的DAPI (其中含有 100 μ g/mL RNA酶Α)避光染色，PBS洗涤后封片，在荧光显微镜下观察细胞核的形态活的 细胞核染色质在核内分布均勻，凋亡细胞核染色质凝集、边缘化或裂解为小片段。试验结果如下用不同浓度的化合物4-NDM作用于HeLa细胞24h后，以DNA结合型染料PI对细 胞DNA染色，用流式细胞仪测定细胞的存活率。随着4-NDM浓度的增加，细胞的存活率逐渐 下降(参见图2)。可见4-NDM可以诱导HeLa细胞的死亡，在一定时间内，其作用随着浓度 的增加而增强。对经4-NDM作用后的HeLa细胞的形态进行显微观察。HeLa细胞经浓度为2、5和 10 μ mol/L的4-NDM分别处理12和36h。正常的HeLa细胞呈多角形，饱满，细胞边缘较为 圆滑，贴壁牢固；而5 μ mol/L的4-NDM处理12h的HeLa细胞开始皱缩，10 μ mol/L的4-NDM 处理12h的HeLa细胞呈细长的梭形，边缘出现锯齿状，并且有细胞变圆，开始从壁上脱落， 随着作用时间的延长，细胞边缘锯齿化明显，悬浮细胞增多(参见图3)。为了观察4-NDM对细胞核的影响，用浓度分别为5禾Π 10 μ mol/L的4-NDM作用HeLa 细胞24h后，收集细胞进行DAPI染色。结果可以观察到，阴性对照组的细胞核呈完整圆滑 的肾形，染色质均勻分布；而4-NDM作用24h后有些细胞核开始出现固缩，细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩边缘化，甚至出现核裂解(参见图4)，箭头所示为发生核 固缩的细胞核，具有细胞凋亡的典型形态变化。根据DAPI染色结果可知4-NDM可以引起HeLa细胞凋亡，为了进一步验证此结论， 用浓度为5，10和15 μ mol/L的4-NDM作用HeLa细胞12，36和72h，测定细胞周期分布，检 测其是否可以诱导HeLa细胞出现凋亡峰(Sub G1，亚二倍体峰)。从图中可以看出随时间 的延长，浓度的升高，相应的凋亡峰逐渐增加(参见图5)，Sub Gl的百分含量越来越高(参 见图6)。实施例3、4_NDM对HeLa细胞中与Hsp90相关的蛋白的表达水平的影响Western Blot分别用适宜浓度的待测样品处理HeLa细胞，吸去培养液，用PBS漂 洗一次，加入细胞裂解液，4°C裂解lOmin，~快速刮取细胞置于1. 5mL离心管中.冰浴超声 裂解细胞10次，每次ls，得到的细胞裂解液于4°C，13500rpm/min离心15min.取上清用 Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度一致，电泳前加入SDS样品缓冲液，100°C水浴 IOmin后进行SDS-PAGE电泳.再100V电转Ih到预先用甲醇浸润过的硝酸纤维素(PVDF) 膜上.5% BSA室温封闭lh，一抗(体积比1 1000稀释)室温孵育2h或4°C过夜，TBST 洗涤3次，每次IOmin. 二抗(体积比1 5000稀释)室温孵育lh，TBST洗涤后的PVDF膜 用增强型化学发光剂(ECL)溶液浸润，显影观察.试验结果分别用不同浓度的4-NDM处理HeLa细胞24h，随着浓度的升高，Hsp70明显上调，Hsp90的客户蛋白Akt，Raf-I，IKK β呈下调趋势，且Akt变化趋势最显著，ρ-Akt下调明显 (参见图7)，与公认的Hsp90的抑制剂格尔德霉素(GA)对这些蛋白的影响趋势一致，推测 4-NDM可能是Hsp90的抑制剂。此外，4-NDM也能引起凋亡抑制蛋白Bcl_2的下调，进一步揭示，4-NDM能够诱导 HeLa细胞发生凋亡(参见图8)。
权利要求
真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM，其特征在于为6-[(1R，6S，7R，8S)-8-甲基-9-氧杂双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基]-5-(吡啶-4-氧基)-5，6-二氢-2H-吡喃-2-酮，简称为4-NDM，其分子式为C19H19NO4，结构式为4-NDM化合物为白色针状晶体，易溶于甲醇、丙酮、二甲基亚砜有机溶剂中。FSA00000069220800011.tif
2.如权利要求1所述的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM，其特征在于其合成路线为<formula>formula see original document page 2</formula>
3.如权利要求1所述的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于其具 体步骤为将DAM和烟酸溶解在二氯甲烷中，在冰浴条件下，加入脱水剂和催化剂，混合后，撤去 冰浴，再搅拌反应后，反应产物过滤，将滤液减压浓缩至干，柱层析分离得到反应产物真菌 环氧二烯烟酸衍生物4-NDM。
4.如权利要求3所述的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 DAM和烟酸的用量相同。
5.如权利要求3所述的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 脱水剂为N，N: 二环己基碳化二亚胺。
6.如权利要求3所述的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 催化剂为4-二甲氨基吡啶。
7.如权利要求3所述的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 脱水剂的加入量与DAM相同。
8.如权利要求3所述的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 催化剂的加入量为DAM的0. 01% 5%。
9.如权利要求3所述的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述混 合后，撤去冰浴，是混合30min后撤去冰浴；所述再搅拌反应，是在室温下搅拌反应4 8h。
10.如权利要求1所述的真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的在制备治疗癌症的药物中 的应用。
全文摘要
真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM及其合成方法与用途，涉及一种真菌环氧二烯烟酸衍生物。所述真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM的分子式为C19H19NO4。合成方法为将DAM和烟酸溶解在二氯甲烷中，在冰浴条件下，加入脱水剂和催化剂，混合后，撤去冰浴，再搅拌反应后，反应产物过滤，将滤液减压浓缩至干，柱层析分离得到反应产物真菌环氧二烯烟酸衍生物4-NDM。合成路线简单，得率高，实验证实4-NDM具有很强的抗肿瘤活性，对HeLa细胞的IC50为4.71μmol/L；能产生诱导肿瘤细胞凋亡的效应，抗肿瘤作用靶点明确，可用于制备治疗癌症的药物。
文档编号C07D493/08GK101805351SQ20101015047
公开日2010年8月18日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者宋思扬, 张伟, 张连茹, 易玉婷, 沈月毛, 胡志钰, 郑忠辉, 黄耀坚 申请人:厦门大学