专利名称：一种从茶叶同时制备七种儿茶素单体的方法
技术领域：
本发明属于农产品加工茶叶深加工技术领域，尤其是一种从茶叶同时制备七种儿 茶素单体的方法。
背景技术：
茶叶儿茶素(catechins)化学结构上属于双氢黄酮醇类(黄烷醇)化合物，是茶多酚(Green Tea Polyphenols,GTP)的主要活性成分，约占GTP总质量的60-80%。GTP是 茶叶中儿茶素类、黄酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称，约占茶叶干重的15-30%。目 前，茶多酚已被广泛应用于食品(配料和添加剂)、医药、保健品、日化(牙膏、沐浴露、洗发 精等)、纺织、空调净化。最新研究证明，有可能在更深入和广阔的层面上对人类健康作出贡 献。如儿茶素制造百日咳等疫苗、抗新型流感等。(中央台播报_据日本《朝日新闻》网站 2009年8月1日报道，日本大阪大学和横滨市卫生研究所研究人员日前利用一种绿茶提取 物开发出一种新型抗流感药物。这种药物是把加工后的EGCG混入季节性流感或禽流感病 毒中，再注射入动物的肾脏细胞，研究病毒的感染能力。结构发现，加工后的EGCG抑制病毒 感染的效果可媲美抗流感药物达菲……)。茶叶儿茶素化合物是一类物质的总称，在清除自由基、抗氧化、抗辐射、降血压血 糖血脂、抗菌、预防心脑血管疾病、抗癌等方面是茶多酚中生物活性最强的成分。茶叶中含 量较高、活性较强的儿茶素主要有七种E_C、EGC、D-C、EGCG、ECG、GCG和CG，分子结构式见 附
图1。其中E-C、EGC和D-C为非酯型儿茶素，EGCG、ECG、GCG和CG为酯型儿茶素。分离、制备多种儿茶素单体的重要意义在于(1)茶叶深加工生产茶多酚的研究 单位及工厂均需要检测产品中每种儿茶素的含量，需要大量的标准品对照，而目前国内仅 仅能够制备EGCG等少数单体，且纯度不高，大部分使用者只好购买国外公司产品；(2)新 药、功能性食品研究开发往往需要从化学成分角度来证明其剂量和效果，需要大量的高纯 度儿茶素单体；(3)茶食品、茶饮料最新研究证明，非酯型儿茶素苦味小而酯型儿茶素苦味 较重，本发明技术使用后可以任意调节各种儿茶素的比例；(4)人体代谢研究证明，复杂儿 茶素(一般为酯型)经代谢成简单儿茶素(一般为非酯型)后更容易消化吸收，因此在开 发针对不同目的用途的产品时需要不同的儿茶素配伍。目前，茶多酚、儿茶素的研究已经成为茶叶加工、医药、保健品、日化等领域的热电 之一，有关它们的提取、分离、纯化有不少文献报道。但工艺技术及实现手段(装备)较落 后，以传统方法居多，大都用到毒害性有机溶剂，造成溶剂残留、能耗高、产品质量差；儿茶 素分离纯化大都针对EGCG —种化合物进行，而且大都从茶多酚产品出发，用到价格昂贵的 进口分离材料S印hadeX-LH20。“一种从茶多酚或儿茶素混合体系中分离制备多种儿茶素 单体的方法”(申请号CN200910042834.8)公开了一种从茶多酚或儿茶素混合体系中分离 制备多种儿茶素单体的方法。该方法将茶多酚或儿茶素混合体系样品经预处理、液相色谱 分离、馏分截取、闪式蒸发浓缩、干燥结晶，即制备出儿茶素单体，茶多酚或儿茶素混合体系 样品的预处为质量浓度为0. 4 1. 2mg/ml，调pH值至3. 5 5. 5，然后采用大孔吸附树脂层析柱除咖啡因；采用液相色谱分离纯化，色谱系统固定相为C18柱内径50 100mm，填料 粒径20 60 μ m，流动相为12% 18%低碳醇+0. 5 3%弱酸+水87. 5-79. 0% (ν/ν), 10 60p a柱压下用所述流动相淋洗色谱柱；所述的闪式蒸发浓缩过程为将馏分液注入 闪式蒸发器，在维持收集液温度35-65°C的条件下进行蒸发浓缩，得到4种儿茶素单体。与 本发明的原料及主体技术特征完全不同。我国是茶叶生产大国，茶叶(干品)年产量已达到140万吨，其中低档茶、碎茶占 到20%以上。每年尚有更大量的夏秋茶叶没有采收利用。因此本发明将对人类健康及茶叶 的深度加工及增产增收具有重要意义
发明内容
本发明的目的是提供一种从茶叶中同时提取七种儿茶素单体的制备方法，从以低 档次茶叶或夏秋茶的鲜叶或干叶的利用加工为出发点，原料经过热水连续逆流提取、超滤 膜技术分离大分子物质如多糖、蛋白，再经反渗透膜技术浓缩到固形物含量达较高水平，浓 缩液直接上国产聚酰胺柱层析使咖啡因、酯型儿茶素及非酯型儿茶素得到初步分离成三个 流份，分别收集后浓缩，酯型和非酯型儿茶素流份分别经制备型高速逆流色谱分离，得到 E-C、EGC、D-C、EGCG, ECG、GCG 禾口 CG 七种儿茶素单体。经 HPLC, UV、IR、LC-MS, NMR 等技术 分析检验和结构鉴定，证明七种儿茶素单体的纯度均达到质量分数98%以上。该发明技术 是节能、低成本、绿色、高效的工业化生产的方法。本发明的技术方案一种从茶叶同时制备七种儿茶素单体的方法，包括如下步 骤(1)提取采用茶叶加工的下脚料碎茶片、低档茶干品或夏秋茶的鲜叶或干叶为 原料。采用经净化处理的纯水为溶媒液，料液比W/W= 1 6-20，以逆流连续提取装置一次 性提取。得到固形物含量为1.5-5%的茶水提取液。(2)过滤和超滤将上述茶水提取液先用振动筛式过滤器连续过滤除去大的碎茶 片、泥沙等物理杂质；再用超滤膜装置分离大分子多糖、蛋白、鞣质。得到超滤透过液和截留 液。(3)反渗透浓缩将上述超滤透过液经反渗透装置循环浓缩，至固形物含量为 8-20%，得浓缩液。(4)聚酰胺柱层析将浓缩液加入预装好的高度/内径=5-20 1聚酰胺层析柱， 依次用纯水以及容量百分比为1-45%、46-85%和86-99%的乙醇水溶液作为洗脱剂进行 洗脱，分部收集不同乙醇浓度洗脱物，分别得到收集液K、D、E和F。分别将上述收集液D、E 和F经反渗透装置循环浓缩或减压浓缩，至固形物含量为10-20%，得收集浓缩液D'、E' 和F'，F'主要含有咖啡因，经进一步浓缩、结晶、干燥后可以得到纯度50 98%的咖啡 因。(5)高速逆流色谱纯化分离经HPLC分析检测，收集浓缩液D'主要含有非酯型儿 茶素E-C、EGC和D-C。收集浓缩液E'主要含有酯型儿茶素EGCG、ECG、GCG和CG。分别将 D'、E'用高速逆流色谱纯化分离，从收集浓缩液D'中分离出非酯型儿茶素，从收集浓缩 液E'中分离出酯型儿茶素，分别收集对应的流出液。(6)浓缩、干燥将步骤(5)得到的不同组分的收集流出液分别真空浓缩至接近干燥并回收溶剂，回收的溶剂经蒸馏、精馏分离后和循环使用。经浓缩后的各种浓缩物经真空 或真空冷冻干燥后得到E-C、EGC、D-C、EGCG, ECG、GCG和CG七种儿茶素单体产品。(7)结构鉴定将上述得到的七种儿茶素单体经HPLC外标法和内标法定性和定量 分析，以及采用uv、IR、H-NMR及ESI-MS四谱分析，结果表明它们的四谱分析数据和标准光 谱图数据一致，与相应的儿茶素结构相吻合。步骤(1)提取的特点是可以采用夏秋茶的鲜叶或干叶为原料。采用经净化处理的 纯水为溶媒，料液比(w/w) =1 6-20，以逆流连续提取装置一次性提取，得到固形物含量 为1.5-5%的茶水提取液。步骤(2)过滤和超滤的特点是先用分级振动筛式过滤器连续过滤除去大的碎茶 片、泥沙等物理杂质。分级振动筛是一个密闭不锈钢设备中有5层筛网，从上至下分别为20 目、30目、60目、80目、100目或120目。超滤膜装置采用陶瓷膜，截留分子量为5000 lOOOODalton，用于分离大分子多
糖、蛋白、鞣质等。步骤(3)是采用反渗透浓缩取代目前广泛使用的常压或减压蒸发浓缩，至固形物 含量为8-20%，可节省能源(以煤电价格计)成本60 80%。步骤(4)聚酰胺柱层析是采用国产层析用聚酰胺分离材料，粒度为30 200目。 柱子的高度/内径=5-20 1。四种洗脱剂分别为纯水，以及容量百分比浓度1_45%、 46-85%和86-99%乙醇-水溶液。每种洗脱剂的用量为2_5倍柱床体积(BV)。步骤(5)高速逆流色谱纯化分离，色谱条件为PTFE即聚四氟乙烯材质管柱(液体 装载量可以0. 5-500L，一次上样量可达0. 5-1000g)，非酯型儿茶素E_C、EGC和D-C的制备 分离溶剂系统为正丁醇_水(V/V = 1/3-3/1)。酯型儿茶素EGCG、ECG、GCG和CG的制备分 离溶剂系统为乙酸乙酯_水(V/V = 1/3-3/1)。采用上述技术方案的有益效果是本发明采用抵挡次茶叶，加工下脚料碎茶片以及现还很少利用的夏秋茶的鲜叶或 干叶为原料，整个工艺过程没有任何化学反应，不使用乙酸乙酯、氯仿等溶剂，也不使用在 残留成分安全上有争议的大孔树脂，使产品安全性大大提高；同时，采用膜技术过滤除杂、 浓缩，比传统的加热蒸发浓缩节能60%以上；不需要将提取物萃取、干燥成茶多酚，而是用 浓缩液直接分离纯化，大大简化了制备工艺，降低了生产成本；可以同时制备7种有价值的 儿茶素单体。
具体实施例方式以下给出实施例，对本发明作进一步说明。实施例1(1)提取取绿茶加工的下脚料碎茶片lOOOg，用SOOOg经净化处理的纯水为溶媒， 以柱式逆流连续提取装置一次性提取。得到固形物含量为4. 3%的茶水提取液7000g。(2)过滤和超滤将上述茶水提取液先用振动筛式过滤器连续过滤除去大的碎茶 片、泥沙等物理杂质；再用超滤膜装置分离大分子多糖、蛋白、鞣质等。得到6300g超滤透过 液A和700g截留液B。(3)反渗透浓缩将上述超滤透过液A经反渗透装置循环浓缩，至固形物含量为20%, m 1250g 浓缩液 C。(4)聚酰胺柱层析将IOOg浓缩液C加入预装好的高度/内径=10 1聚酰胺层 析柱，聚酰胺颗粒度为150目，床体积为1000mL。依次用纯水体积分数为15%、50%和90% 的乙醇水溶液作为洗脱剂进行洗脱，每种洗脱剂用量为3BV。分部收集不同乙醇浓度洗脱 物，分别得到收集液K、D、E和F。K中主要含有多糖、蛋白等水溶性杂质，弃去。分别将上述 上述收集液D经反渗透装置循环浓缩，E和F经减压浓缩，真空度为0. 06-0. 02MPa至固形 物含量为20%，回收溶剂，得浓缩液D'、E'和F'。F'主要含有咖啡因，经进一步浓缩、 乙醇结晶、80干燥后得到纯度95%的咖啡因。(5)高速逆流色谱纯化分离将D'用高速逆流色谱纯化分离，色谱条件为 PTFE(聚四氟乙烯)材质管柱(02. 5 X 300 mm,—次上样量可达5g)，制备分离溶剂系 统为正丁醇-水(v/v =1 1.5)。分别收集对应的非酯型儿茶素E-C、EGC、D-C3个峰流 出液。E'用高速逆流色谱纯化分离，色谱条件为PTFE(聚四氟乙烯)材质管柱 (02. 5 X 300 mm，一次上样量可达5g)，制备分离溶剂系统为乙酸乙酯-水(ν/ν = 1.5 1)0分别收集酯型儿茶素EGCG、ECG、GCG和CG对应的四个峰的流出液。(6)浓缩、干燥将(5)得到的不同组分的收集液分别真空浓缩至近乎干燥 并回收溶剂，回收的溶剂经蒸馏、精馏分离后和循环使用。各种浓缩物经55°C真空 (0. 01-0. 005MPa)干燥得到E_C、EGC、D_C、EGCG、ECG、GCG和CG七种儿茶素单体产品。总 收得率为75-80% (以茶叶原料中初始含量计算)。(7)结构鉴定将上述得到的七种儿茶素单体经HPLC外标法和内标法定性和定量 分析，以及采用uv、IR、H-NMR及ESI-MS四谱分析，结果表明它们的四谱分析数据和标准光 谱图数据一致，与相应的儿茶素结构相吻合。纯度均大于98. 0%。实施例2(1)提取取8月份的鲜绿茶叶2000g(相当于干叶500g左右)，切碎，用IOOOOg 经净化处理的纯水为溶媒，以环式逆流连续提取装置一次性提取。得到固形物含量为1. 5% 的茶水提取液10000g。(2)过滤和超滤将上述茶水提取液先用振动筛式过滤器连续过滤除去大的碎茶 片、泥沙等物理杂质；再用超滤膜装置分离大分子多糖、蛋白、鞣质等。得到9500g超滤透过 液A和截留液B。(3)反渗透浓缩将上述超滤透过液A经反渗透装置循环浓缩，至固形物含量为 20%，得625g浓缩液C。(4)聚酰胺柱层析将IOOg浓缩液C加入预装好的高度/内径=15 1聚酰胺层析柱，聚酰胺颗粒度为120目，床体积为1000mL。依次用体积分数为0、10%、55%和95%乙 醇水溶液作为洗脱剂进行洗脱，每种洗脱剂用量为2. 5BV。分部收集不同乙醇浓度洗脱物， 分别得到收集液K、D、E和F。K中主要含有多糖、蛋白等水溶性杂质，弃去。分别将上述上 述收集液D经反渗透装置循环浓缩，E和F经减压浓缩，真空度为0. 07-0. OlMPa至固形物 含量为20%，回收溶剂，得浓缩液D'、E'和F'。F'主要含有咖啡因，经进一步浓缩、乙 醇结晶、80干燥后可以得到纯度95%的咖啡因。(5)高速逆流色谱纯化分离将D'用高速逆流色谱纯化分离，色谱条件为PTFE(聚四氟乙烯)材质管柱(03. 0X450 mm，一次上样量可达log)，制备分离溶剂 系统为正丁醇-水(V/V= 1.5 1.0)。分别收集对应的非酯型儿茶素E-C、EGC、D-C3个 峰流出液。E'用高速逆流色谱纯化分离，色谱条件为PTFE(聚四氟乙烯)材质管柱 (03. 0X450 mm，一次上样量可达log)，制备分离溶剂系统为乙酸乙酯-水(ν/ν = 2.0 1)。分别收集酯型儿茶素EGCG、ECG、GCG和CG对应的四个峰的流出液。(6)浓缩、干燥将(5)得到的不同组分的收集液分别真空浓缩至近乎干 燥并回收 溶剂，回收的溶剂经蒸馏、精馏分离后和循环使用。各种浓缩物经真空(0. 001-0. 005MPa) 冷冻干燥(-30—20°C )得到E-C、EGC、D_C、EGCG, ECG、GCG和CG七种儿茶素单体产品。总 收得率为75-80% (以茶叶原料中初始含量计算)。(7)结构鉴定将上述得到的七种儿茶素单体经HPLC外标法和内标法定性和定量 分析，以及采用uv、IR、H-NMR及ESI-MS四谱分析，结果表明它们的四谱分析数据和标准光 谱图数据一致，与相应的儿茶素结构相吻合。纯度均大于98. 0%。
权利要求
一种从茶叶同时制备七种儿茶素单体的方法，其特征是它采用下述几个步骤提取采用茶叶加工的下脚料碎茶片、低档茶叶或夏秋茶的鲜叶或干叶为原料，采用经净化处理的纯水为溶媒液，料液比W/W＝1∶6-20，以逆流连续提取装置一次性提取，得到固形物含量为1.5-5％的茶水提取液；过滤和超滤将上述茶水提取液先用振动筛式过滤器连续过滤除去较大的碎茶片、泥沙等杂质；再用超滤膜装置分离去除大分子多糖、蛋白、鞣质，得到超滤透过液和截留液；反渗透浓缩将上述超滤透过液经反渗透装置循环浓缩，至固形物含量为8-20％，得浓缩液；聚酰胺柱层析将浓缩液加入预装好的高度/内径＝5-20∶1聚酰胺层析柱，依次用水以及浓度为容量百分比为1-45％、46-85％、86-99％的乙醇水溶液作为洗脱剂进行洗脱，分部收集不同乙醇浓度洗脱物，分别得到收集液K、D、E和F；K中主要含有多糖、蛋白等水溶性杂质，弃去，分别将上述收集液D、E和F经反渗透装置循环浓缩或减压蒸发浓缩，至固形物含量为10-20％，得收集浓缩液D′、E′和F′；收集浓缩液F′主要含有咖啡因，经进一步浓缩、结晶、干燥后得到纯度50-98％的咖啡因；高速逆流色谱纯化分离经HPLC分析检测，收集浓缩液D′主要含有非酯型儿茶素E-C、EGC和D-C，收集浓缩液E′主要含有酯型儿茶素EGCG、ECG、GCG和CG；分别将收集浓缩液D′、E′用高速逆流色谱纯化分离，以浓缩液D′中分离出非酯型儿茶素E-C，EDC和DC，从收集浓缩液E′中分离出酯型儿茶素EGCG、ECG、GCG和CG几种流出液，再分别收集对应的流出液；浓缩、干燥将纯化分离得到的不同组分的再收集的流出液分别真空浓缩至接近干燥并回收溶剂，回收的溶剂经蒸馏、精馏分离后和循环使用，经浓缩后的各种浓缩物再经真空或真空冷冻干燥后得到E-C、EGC、D-C、EGCG、ECG、GCG和CG七种儿茶素单体产品。
2.根据权利要求1所述的一种从茶叶同时制备七种儿茶素单体的方法，其特征是步 骤提取的特点是能采用夏秋茶的鲜叶或干叶为原料。
3.根据权利要求1所述的一种从茶叶同时制备七种儿茶素单体的方法，其特征是过 滤和超滤的特点是先用分级振动筛式过滤器连续过滤除去较大的碎茶片、泥沙等物理杂 质；分级振动筛是一个密闭不锈钢设备，其中有5层筛网，其筛网从上至下分别为20目、30 目、60目、80目、100目或120目；超滤膜装置采用陶瓷膜超滤设备。
4.根据权利要求1所述的一种从茶叶同时制备七种儿茶素单体的方法，其特征是采 用反渗透浓缩取代蒸发浓缩，至固形物含量为8-20%。
5.根据权利要求1所述的一种从茶叶同时制备七种儿茶素单体的方法，其特征是所 述聚酰胺柱层析是采用国产层析用聚酰胺分离材料，粒度为30-200目，柱子的高度/内径 =5-20 1 ；四种洗脱剂分别是纯水，以及浓度容量百分比为1-45%、46-85%和86-99% 的乙醇水溶液；每种洗脱剂的用量为2-5倍柱床体积BV。
6.根据权利要求1所述的一种从茶叶同时制备七种儿茶素单体的方法，其特征是高 速逆流色谱纯化分离，色谱条件为PTFE即聚四氟乙烯材质管柱，非酯型儿茶素E-C、EGC和 D-C的制备分离溶剂系统为正丁醇-水，V/V = 1/3-3/1 ；酯型儿茶素EGCG、ECG、GCG和CG 的制备分离溶剂系统为乙酸乙酯-水V/V= 1/3-3/1。
全文摘要
一种从茶叶同时制备七种儿茶素单体的方法，它采用下述几个步骤提取、过滤、超滤、反渗透浓缩、聚酰胺柱层析、高速逆流色谱纯化分离、浓缩、干燥。本发明采用抵挡次茶叶，加工下脚料碎茶片以及现还很少利用的夏秋茶的鲜叶或干叶为原料，整个工艺过程没有任何化学反应，不使用乙酸乙酯、氯仿等溶剂，也不使用在残留成分安全上有争议的大孔树脂，使产品安全性大大提高；同时，采用膜技术过滤除杂、浓缩，比传统的加热蒸发浓缩节能60％以上；不需要将提取物萃取、干燥成茶多酚，而是用浓缩液直接分离纯化，大大简化了制备工艺，降低了生产成本；可以同时制备七种有价值的儿茶素单体。
文档编号C07D311/62GK101830882SQ20101017081
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者唐弟康, 王洪新 申请人:遵义陆圣康源科技开发有限责任公司