一种用于肝癌血清学诊断的单克隆抗体及其用途的制作方法

文档序号:3568186阅读:205来源:国知局
专利名称:一种用于肝癌血清学诊断的单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域
本发明涉及肿瘤学和医学领域。更具体地,本发明涉及一种用于肝癌血清学诊断的单克隆抗体及其用途。
背景技术
原发性肝细胞肝癌(h印atocellular carcinoma, HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一,占居民肿瘤死亡第二位。肝癌出现症状时多属中晚期,切除后复发、转移率高。因此,肝癌的早期诊断对延长患者的生存时间和降低肝癌死亡率具有重要意义。目前肝癌的诊断主要依靠影像学检查、肝穿刺组织学检查以及实验室检查。影像学诊断在肝癌诊断中起重要的作用,但是在诊断小肝癌及区分良恶性结节中均具有一定的局限性。肝硬化基础上肝内再生结节和发育不良的结节等良性病变较为常见,与肝癌的影像学特征有一定的重叠,放射学检查对肝内小的良恶性病变鉴别仍很困难。与肝脏病理对比,CT诊断肝癌的敏感度59% 80%。有创的组织病理学检查是诊断肝癌的金标准,即使是很好的细针穿刺仍因取材有限而有较高的假阴性率,并且有使肿瘤扩散和针道种植的危险。因此,临床仍需要高度敏感的血清肝癌特异标志物来鉴别肝脏良恶性病变,或在高危人群进行随访提高肝癌的早期诊断率。血清甲胎蛋白(α -fetoprotein, AFP)是目前唯一广泛应用的HCC标志物。但是近年研究报道,以AFP诊断HCC的阳性率仅为50%,在直径< 3cm的小肝癌中敏感性显著降低,其阳性率不足40%,容易造成漏诊;其次在一些良性肝病、生殖性畸胎瘤、肺癌等患者中也可有升高,容易造成误诊。如何运用已知的肿瘤标志物来联合诊断HCC或者探索新的肿瘤分子标志物,以及建立相应的易于推广的检测方法,仍是当今肝癌研究领域的重要课题之一。此外,癌症的血清学检测技术一直是研究的重点。然而,目前现有的针对癌症(如 HCC)标志物的抗体的亲和性和特异性差异很大,大多数难以满足实际应用的需要。例如,以 GPC3为例,国外有报道称,GPC3外周血中含量较低,肝癌患者中GPC3浓度升高幅度较小,不易与正常对照尤其是肝硬化对照区分。由于目前仍然没有检测和或治疗肝癌的有效方法,因此,本领域迫切需要开发高特异性抗人肝癌单克隆抗体,以及相应的检测肝癌的有效方法。

发明内容
本发明的目的提供一种特异性抗人肝癌单克隆抗体。本发明的另一目的是提供一种特异性检测人肝癌的试剂盒。本发明的另一目的是提供一种特异性治疗人肝癌的治疗剂。在本发明的第一方面,提供了一种免疫球蛋白Vh链,它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID N0:6 所示的 CDR1,
SEQ ID N0:8 所示的 CDR2,SEQ ID NO :10 所示的 CDR3。较佳地,所述的免疫球蛋白Vh链具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。在本发明的第二方面,提供了一种免疫球蛋白\链,它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO :12 所示的 CDR1,SEQ ID NO :14 所示的 CDR2,SEQ ID NO :16 所示的 CDR3。较佳地,所述的免疫球蛋白Vj连,它具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。在本发明的第三方面,提供了一种免疫球蛋白,其乂11链和Vj连分别具有SEQID NO 2和SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。较佳地,所述的免疫球蛋白是单克隆抗体。在本发明的第四方面,提供了一种免疫偶联物,该免疫偶联物具有Vh链,该Vh链的 ⑶R具有选自下组的⑶R的氨基酸序列SEQ ID N0:6 所示的 CDR1,SEQ ID NO 8 所示的 CDR2,SEQ ID NO 10 所示的 CDR3,或者,该免疫偶联物具有\链,该\链的⑶R具有选自下组的⑶R的氨基酸序列SEQ ID NO :12 所示的 CDR1,SEQ ID NO 14 所示的 CDR2,SEQ ID NO 16 所示的 CDR3。较佳地,所述的免疫偶联物是免疫毒素。在本发明的第五方面,提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞,它是抗人肝癌杂交瘤 GPC3-7C8,CCTCC No. :C201009。在本发明的第六方面,提供了一种DNA分子,它编码选自下组的蛋白质上述的免疫球蛋白Vh链;上述的免疫球蛋白Vl链;上述的免疫球蛋白。较佳地,所述的DNA分子具有或含有选自下组的核酸序列SEQ ID NO :1、3、5、7、 9、11、13、15。在本发明的第七方面,提供了一种检测肝癌的试剂盒,它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物,或其活性片段。在另一优选例中,所述的检测是血清检测。在另一优选例中,所述的血清检测是ELISA法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法 (TRFIA 法)。在另一优选例中,所述的试剂盒还包括用于检测血清甲胎蛋白(AFP)的试剂(如抗AFP的单体)。在本发明的第八方面,提供了一种药物组合物,它含有上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物,以及药学上可接受的载体。


图1显示了 GPC3-ELISA测定标准曲线。图2显示了 ELISA测定血清GPC3含量。图3显示了 GPC3受试者ROC曲线(ELISA)。图4显示了 GPC3-TRFIA测定标准曲线。图5显示了 CH组和HCC组的血清GPC3-R0C曲线。图6显示了 GPC3和AFP相关性分析。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究,利用人肝癌相关膜分子GPC3(第350-364位) 偶联多肽为免疫原,经多年研究研制成功一种杂交瘤单克隆抗体,即抗人肝癌单抗7C8。此抗体经多年研究证实稳定性好,和肝癌抗原结合的特异性强。在此基础上完成了本发明。本发明的单克隆抗体及其检测方法,对于肝癌高危人群普查、肝癌的早期诊断、肝癌疗效随访、以及预后判断等方面也有广泛的应用价值。本发明成果具有积极的社会效益。抗体及其编码序列本发明的7C8单抗或其片段可用于肝癌的检测(如放射性定位的诊断成像和血清学检测),还可用于免疫治疗,例如通过直接或间接地将7C8单抗或其片段与化学治疗剂、 或放疗剂相连从而使其能直接导向肿瘤细胞。本发明还提供了编码7C8单抗的可变区的轻链和重链的cDNA序列。本发明包括相应的氨基酸序列和具有所述特征的可变区链的单克隆抗体,以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地,本发明包括具有含超变区(互补决定区,CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性,较佳地至少 95%同源性。如本领域技术人员所知,免疫偶联物及融合表达产物包括药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与7C8单抗或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与本发明的7C8单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。如本文所用,“免疫毒素”指对靶细胞有特异性亲和力和杀伤力的物质,例如免疫偶联物及融合表达产物包括药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治疗分子与7C8单抗或其片段结合的而形成的偶联物。具体的例子有例如mI-7C8,MTX-7C8偶联物等。此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion, CDR)特别令人感兴趣,因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此,本发明包括那些具有带 ⑶R的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子,只要其⑶R与此处鉴定的⑶R具有90%以上 (较佳地95%以上)的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab或 (Fab’ )2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体;或人源化抗体。本发明还提供了编码上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。本发明的7C8单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,按本领域技术人员已知的常规方法制备模板,通过扩增而得到有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。此外,还可将轻链和重链的编码序列融合在一起,形成单链抗体。一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、C0S7、293细胞、或 Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理, 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导) 诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
I=I O检测方法利用本发明抗体的特异性强、效价高的GPC3的特点,本发明还提供了检测肝癌的方法,尤其是血清学检测方法。在本发明的一个优选例中,本发明提供一种检测血清GPC3的时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。此外,在本发明方法中,可将单克隆抗体7C8与其他肿瘤标志物(如AFP)联合应用,这样不仅可提高肝癌早期诊断的阳性率,而且可对临床上为数众多的AFP低度或中度
6增高患者的良恶性病变进行鉴别诊断。检测试剂盒本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒,它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物,或其活性片段。一种人肝癌诊断试剂盒,已完成临床实验207例,检测阳性率高达41%, 与AFP联合应用检测阳性率可进一步提高至75%。药物组合物本发明还提供了一种药物组合物,它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中PH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括 (但并不限于)腹膜内、静脉内、或局部给药。本发明的药物组合物可直接用于肝癌的治疗。此外,还可同时使用其他治疗剂,如 IFN-α、IFN-β、TNF-α 等。本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时,是将安全有效量的7C8免疫偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明具有广泛的应用,其中包括(但并不限于)1.与影像学检查和AFP检测等结合应用于肝癌的诊断。2.应用于甲胎蛋白增高肝病的良恶性鉴别诊断。3.应用于治疗前GPC3阳性肝癌的预后监测指标。4.应用于肝癌高危人群的筛查。5.应用于肝癌相关的基础研究。本发明的主要优点包括(a)本发明单抗7C8仅以针对GPC3蛋白中段的15肽350-364位多肽所制备,其特异性识别GPC3蛋白的能力较强。(b)本发明单抗7C8具有高亲和力,并且抗体的氨基酸序列组成(尤其是CDR区) 不同于现有技术。(c)本发明首次将ELISA和TRFIA同时应用于GPC3的检测。TRFIA与ELISA方法相比,最低检测浓度并未见提高,但前者阴性标本的本底较易控制,因而出现假阳性的机会较少,且重复性好,批内和批间变异系数均能够控制在13%以内。全自动测定仪的使用,也极大地提高了检验效率,同时降低了人为误差,使结果更为可靠。两种方法的联合使用,使得GPC3检测敏感性和特异性更为提高。下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例17C8单抗的制备和纯化(1).多肽合成对全长GPC3蛋白抗原性进行分析,基于蛋白的抗原性和可及性,最终选择多肽抗原GPC3350-364位氨基酸作为免疫原,该短肽被命名为GPC3_Ag2。采用人工合成方法制备短肽 GPC3-Ag2,其序列为 AHSQQRQYRSAYYPE(SEQ ID NO :17)。表 权利要求
1.一种免疫球蛋白Vh链,其特征在于,它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO 6 所示的 CDRl, SEQ ID NO 8 所示的 CDR2, SEQ ID NO 10 所示的 CDR3。
2.如权利要求1所述的免疫球蛋白Vh链,其特征在于,它具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
3.一种免疫球蛋白\链,其特征在于,它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO 12 所示的 CDRl, SEQ ID NO 14 所示的 CDR2, SEQ ID NO 16 所示的 CDR3。
4.如权利要求2所述的免疫球蛋白\链,其特征在于,它具有SEQID NO :4所示的氨基酸序列。
5.一种免疫球蛋白,其特征在于,其Vh链和Vl链分别具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的免疫球蛋白,其特征在于,它是单克隆抗体。
7.一种免疫偶联物,其特征在于,该免疫偶联物具有Vh链,该Vh链的CDR具有选自下组的⑶R的氨基酸序列SEQ ID NO 6 所示的 CDRl, SEQ ID NO 8 所示的 CDR2, SEQ ID NO :10 所示的 CDR3,或者,该免疫偶联物具有\链,该\链的CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列 SEQ ID NO 12 所示的 CDRl, SEQ ID NO 14 所示的 CDR2, SEQ ID NO 16 所示的 CDR3。
8.—种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞,其特征在于,它是抗人肝癌杂交瘤GPC3-7C8, CCTCC No. :C201009。
9.一种DNA分子,其特征在于,它编码选自下组的蛋白质 权利要求1所述的免疫球蛋白Vh链;权利要求3所述的免疫球蛋白\链;或权利要求5所述的免疫球蛋白。
10.一种检测肝癌的试剂盒,其特征在于,它含有权利要求5所述的免疫球蛋白或权利要求7所述的免疫偶联物;更佳地,所述的试剂盒还包括用于检测血清甲胎蛋白(AFP)的试剂。
全文摘要
本发明涉及一种用于肝癌血清学诊断的单克隆抗体及其用途。具体地,本发明提供了一种抗人肝癌的特异性单克隆抗体7C8。该单克隆抗体具有稳定性好和与肝癌抗原结合的特异性强的特点。本发明还提供了7C8免疫球蛋白、及其片段和免疫偶联物以及含有上述免疫球蛋白、片段或免疫偶联物的药物组合物。本发明还提供了一种检测肝癌的检测试剂盒。
文档编号C07K16/18GK102276721SQ20101020088
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者屠红, 张菁, 陈敏 申请人:上海市肿瘤研究所
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