专利名称：一种获取基因重组包涵体粗蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及一种获取基因重组包涵体粗蛋白的 方法。
背景技术：
包涵体粗蛋白是大肠杆菌在高效表达外源基因时形成的由膜包裹的高密度、不溶 性蛋白质颗粒。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此为了获得 具有生物学活性的蛋白质，应用于生物工程、食品工程等，必须将包涵体溶解，进行分离纯 化，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的形成为分离纯化提供了非常便利 的条件，其纯化步骤一般包括裂解细胞及回收包涵体、包涵体粗提取、溶解包涵体及变性蛋 白质的纯化。在裂解细胞时常由于细胞内各种蛋白酶的释放导致目的蛋白的降解，而降低 目的蛋白的获取效率；包涵体的粗提取尚无规范的操作，粗纯化效率也很低。而目的蛋白的 获取更多依赖于最后的纯化，由于前期的杂蛋白处理较粗糙，大量的杂蛋白与目的蛋白混 杂，使得目的蛋白的纯化难度加大，甚至根本不能得到目标蛋白的纯品。本发明弥补了现有获取基因重组包涵体粗蛋白存在的提纯效率低的问题。
发明内容
本发明是为了解决现有获取基因重组包涵体粗蛋白存在的提纯效率低的问题，而 提供了一种获取基因重组包涵体粗蛋白的方法。本发明一种获取基因重组包涵体粗蛋白的方法，包括以下步骤(1)获取菌体沉淀将大肠杆菌表达外源基因后的培养液在4°C、6000_10000r/ min条件下离心15-30min，弃上清液，即获取含有基因重组包涵体粗蛋白表达菌的菌体沉 淀；(2)超声、裂解缓冲液洗涤将菌体沉淀以体积比为1 8-12重悬于裂解缓冲液 中，所述裂解缓冲液的组分为50mmol/L的Tris-Cl，IOOmmol/L的NaCl，lmmol/L的乙二胺 四乙酸，调裂解缓冲液的PH值为8. 0，然后在冰浴上超声破菌，超声波功率为200-300W， 每次持续时间为l_5s，两次超声间隔时间为l_5s，超声循环100-300次，然后以转速为 10000-12000r/min，离心 8-lOmin，获取沉淀；上述步骤重复1次，获取沉淀；(3)尿素洗涤将上述所得沉淀以体积比为1 8-12重悬于3-5mol/L的尿素液 中，混悬5-10min，10000-12000r/min条件下离心8-lOmin，获取沉淀；上述步骤重复2次，获取沉淀；(4)脱氧胆酸纳洗涤上述获取的沉淀以体积比为1 8-12重悬于3-5%的脱氧 胆酸纳溶液中，混悬5-10min，7000-9000r/min条件下离心4_8min，获取沉淀，即获得包涵 体粗蛋白。本发明利用基因重组包涵体粗蛋白的抗剪切、属于变性蛋白的特性，建立一种获取基因重组包涵体粗蛋白的方法，使用该方法可大量减少其他非目的蛋白的混杂，包涵体 粗蛋白纯度由25%左右升高到80%以上，为进一步目的蛋白的纯化奠定基础；本发明方法 操作简便，成本低。
图1为本发明一种获取基因重组包涵体粗蛋白的方法的操作流程图；图2为Kringle5包涵体粗蛋白(纤溶酶原第五饼环区结构域)经粗纯化后 SDS-PAGE检测效果图；图3为gAd包涵体粗蛋白(脂联素球状结构域)经粗纯化后SDS-PAGE检测效果 图。
具体实施例方式实施例1以pBV220-Kringle5质粒载体(pBV220质粒载体与纤溶酶原第五饼环区结构域基 因体外基因重组获得)在大肠杆菌JM109中表达后，获取Kringle5包涵体粗蛋白的粗纯化 步骤(1)获取菌体沉淀大肠杆菌JM109在42°C表达Kringle5后的培养液在4°C、 10000r/min (也可以为6000r/min、8000r/min)条件下离心20min，弃上清获取菌体沉淀；所得菌体沉淀SDS-PAGE电泳结果如图2的第1泳道所示，Kringle5蛋白占菌体 总蛋白的18.6% ；(2)超声、裂解缓冲液洗涤将菌体沉淀以体积比为1 10(也可以是1 8、 1 12)重悬于裂解缓冲液，裂解缓冲液的组分为50mmol/L的Tris-Cl，100mmol/L的 NaCl，lmmol/L的乙二胺四乙酸，调裂解缓冲液的PH为8. 0，然后在冰浴上超声破菌，功率为 250ff(也可以是200W、300W)，每次持续时间为3s (也可以是ls、5s)，两次超声间隔时间为 3s (也可以是ls、5s)，超声循环200次(也可以是100次、300次)，然后以转速为IOOOOr/ min (也可以是 11000r/min、12000r/min)，离心 IOmin (也可以是 8min、9min)，获取沉淀；上述步骤重复一次，获取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE电泳结果如图2的第2泳道所示，Kringle5蛋白占菌体总蛋 白的24. 3% ；(3)尿素洗涤将上述所得沉淀以体积比为1 10(也可以是1 8、1 12)重 悬于4mol/L (也可以是3mol/L、5mol/L)的尿素液中，混悬8min (也可以是5min、IOmin)， 在 12000r/min (也可以是 10000r/min、11000r/min)条件下离心 8min (也可以是 9min、 IOmin)，获取沉淀；上述步骤重复2次，获取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE电泳结果如图2的第3泳道所示，Kringle5蛋白占菌体总蛋 白的43. 2% ；(4)脱氧胆酸纳洗涤上述获取的沉淀以体积比为1 10(也可以是1 8、 1 12)重悬于3% (也可以是4%、5%)的脱氧胆酸纳溶液中，混悬IOmin (也可以是5min、 8min)，8000r/min(也可以是 7000r/min、9000r/min)条件下离心 6min(也可以是 4min、8min)，获取沉淀，即获得包涵体粗蛋白；所得沉淀SDS-PAGE电泳结果如图2的第4泳道所示，Kringle5蛋白占菌体总蛋 白的81. 1%。实 施例2以pBV220_gAp质粒载体(pBV220质粒载体与脂联素球状结构域基因体外基因重 组获得)在大肠杆菌JM109中获得表达后，制备脂联素球状结构域(gAp)包涵体粗蛋白的 操作步骤(1)获取菌体沉淀大肠杆菌JM109在42°C表达pBV220_gAp后的培养液在4°C、 80000r/min (也可以为6000r/min、10000r/min)条件下离心20min，弃上清获取菌体沉淀；所得菌体沉淀SDS-PAGE电泳结果如图3的第1泳道所示，gAp蛋白占菌体总蛋白 的 15. 3% ；(2)超声、裂解缓冲液洗涤将菌体沉淀以体积比为1 8(也可以是1 10、 1 12)重悬于裂解缓冲液，裂解缓冲液的组分为50mmol/L的TriS-Cl，100mmol/L的 NaCl，lmmol/L的乙二胺四乙酸，调裂解缓冲液的PH为8. 0，然后在冰浴上超声破菌，功率为 200W(也可以是250W、300W)，每次持续时间为5s (也可以是ls、3s)，两次超声间隔时间为 Is (也可以是3s、5s)，超声循环100次(也可以是200次、300次)；然后以转速为IlOOOr/ min (也可以是 10000r/min、12000r/min)，离心 9min (也可以是 8min、IOmin)，获取沉淀；上述步骤重复一次，获取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE电泳结果如图2的第2泳道所示，gAp蛋白占菌体总蛋白的 33. 5% ；(3)尿素洗涤将上述所得沉淀以体积比为1 8(也可以是1 10、1 12)重 悬于5mol/L (也可以是3mol/L、4mol/L)的尿素液中，混悬5min (也可以是8min、IOmin)， 在 11000r/min (也可以是 10000r/min、12000r/min)条件下离心 8min (也可以是 9min、 IOmin)，获取沉淀；上述步骤重复2次，获取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE电泳结果如图2的第3泳道所示，gAp蛋白占菌体总蛋白的 46. 8% ；(4)脱氧胆酸纳洗涤上述获取的沉淀以体积比为1 12也可以是1 8、1 10) 重悬于4% (也可以是3%、5%)的脱氧胆酸纳溶液中，混悬8min (也可以是5min、10min)， 9000r/min (也可以是 7000r/min、8000r/min)条件下离心 6min (也可以是 4min、8min)，获
取沉淀，即获得包涵体粗蛋白；所得沉淀SDS-PAGE电泳结果如图2的第4泳道所示，gAp蛋白占菌体总蛋白的 95. 2%。
权利要求
一种获取基因重组包涵体粗蛋白的方法，其特征是包括以下步骤(1)获取菌体沉淀将大肠杆菌表达外源基因后的培养液在4℃、6000-10000r/min条件下离心15-30min，弃上清液，即获取含有基因重组包涵体粗蛋白表达菌的菌体沉淀；(2)超声、裂解缓冲液洗涤将菌体沉淀以体积比为1∶8-12重悬于裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液的组分为50mmol/L的Tris-Cl，100mmol/L的NaCl，1mmol/L的乙二胺四乙酸，调裂解缓冲液的PH值为8.0，然后在冰浴上超声破菌，超声波功率为200-300W，每次持续时间为1-5s，两次超声间隔时间为1-5s，超声循环100-300次，然后以转速为10000-12000r/min，离心8-10min，获取沉淀；上述步骤重复1次，获取沉淀；(3)尿素洗涤将上述所得沉淀以体积比为1∶8-12重悬于3-5mol/L的尿素液中，混悬5-10min，10000-12000r/min条件下离心8-10min，获取沉淀；上述步骤重复2次，获取沉淀；(4)脱氧胆酸纳洗涤上述获取的沉淀以体积比为1∶8-12重悬于3-5％的脱氧胆酸纳溶液中，混悬5-10min，7000-9000r/min条件下离心4-8min，获取沉淀，即获得包涵体粗蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种获取基因重组包涵体粗蛋白的方法，属于生物化学与分子生物学领域，是为了解决现有包涵体纯化法存在的提纯效率低的问题。包括获取含有基因重组包涵体粗蛋白表达菌的菌体沉淀；超声、裂解缓冲液洗涤；尿素洗涤；脱氧胆酸纳洗涤。本发明利用基因重组包涵体粗蛋白的抗剪切、属于变性蛋白的特性，建立一种获取基因重组包涵体粗蛋白的方法，使用该方法可大量减少其他非目的蛋白的混杂，包涵体粗蛋白纯度由25％左右升高到80％以上，为进一步目的蛋白的纯化奠定基础；本发明方法操作简便，成本低。
文档编号C07K1/14GK101880312SQ20101020220
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者张天光, 牛勃, 解军, 赵荣瑞, 陈显久 申请人:山西医科大学