专利名称：一种中国家蝇抗菌肽1及其分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物抗菌肽领域，尤其涉及一种中国家蝇抗菌肽1及其分离纯化方法。
背景技术：
抗生素的广泛应用，耐药菌株和多重耐药菌株日益增加，临床抗感染治疗已面临 严峻挑战，寻找广谱高效的抗细菌、抗病毒药物，仍然是一个十分艰巨的任务。蝇主要生长 在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中，其体表带有许多病原菌，能传播多种疾 病。但其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡，这说明蝇应该对病原微生物有强大的免 疫力，并能产生强效抗菌物质。生物抗菌肽具有广谱抗菌活性，对G+、C'细菌及真菌都有抗菌活性，特别是对多重 耐药菌也有抗菌活性。另外还具有抗肿瘤细胞的作用，与传统抗生素相比，还有促进伤口愈 合和免疫调节等作用，是一类具有发展潜力的新型抗菌药。该领域目前国际上研究较为活跃，找到并能纯化出抗菌谱宽、抗菌活性强的抗菌 肽将会有广阔的开发应用前景。不同抗菌肽分子大小，生物学特征有一定差别，目前肽类的纯化技术较复杂，要分 离纯化单一肽类技术难度较大。在抗菌肽的研究中，抗菌肽分离纯化方法的建立是个技术 难点，要建立一个结果稳定可靠、操作简单的方法，需要大量工作，反复试验。
发明内容
为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种中国家蝇抗菌肽1，该抗菌肽具 有广谱、高效的抗菌活性。本发明的第二目的在于提供一种从中国家蝇体内分离纯化中国家蝇抗菌肽1的 方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种中国家蝇抗菌肽1，包括5个肽段，所述5个肽段的氨基酸序列分别如SEQID NO :1 至 SEQ ID NO 5 所示。一种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法，包括以下步骤1)对家蝇进行免疫诱导，使家蝇产生抗菌肽；2)将免疫诱导后的家蝇进行组织勻浆，取含有抗菌肽的样品溶液；3)将含有抗菌肽的样品溶液进行透析浓缩，得到浓缩的样品；4)将浓缩的样品进行3TGC00超滤柱进行超速离心过滤，得到半纯品抗菌肽；5)将半纯品抗菌肽进行HPLC分离纯化，得到色谱纯中国家蝇抗菌肽1。所述步骤1)具体为先使家蝇麻醉，然后带有细菌悬液的不锈钢针刺透体壁，再 使其复苏，刺伤后在温度28 30°C饲养24h，通过损伤感染免疫诱导，使家蝇产生抗菌肽。所述细菌悬液为大肠埃希氏菌悬液、铜绿假单胞菌悬液或金黄色葡萄球菌悬液。
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所述步骤3)具体为首先将含有抗菌肽的样品溶液4°C下60000g离心60min，除 去沉淀和上层漂浮的脂肪层；再取上清液装入分子量截留值为1500U的透析袋内，包埋于 聚乙二醇中，在4°C下透析过液。所述步骤4)具体为透析浓缩的样品60000g离心30min，取上清用UFC3TGC00超 滤柱，以60000g离心超滤。所述步骤5)具体为样品超滤液采用RT-HPLC半制备柱纯化，半制备柱上样量为 1. Oml 2. 0ml，流速为1. Oml/min，在214nm检测波长下，当开始出峰时，进行样品的部分收 集。保留时间为18. OOSmin时的收集品为色谱纯中国家蝇抗菌肽1用上述方法制备的中国家蝇抗菌肽1。本发明所述中国家蝇抗菌肽1是最新发现的一种小分子肽，抗菌肽的活性较强， 能非特异性地抗细菌，是一类具有发展潜力的，对多重耐药菌有抵抗作用的新型抗菌药。本发明所述中国家蝇抗菌肽1分离纯化方法，具有简便易行，稳定性、重复性好等 优点，不同批次纯化的抗菌活性用Lowry法测定多肽含量，其蛋白质浓度范围为0. 20g 0. 25g/L，是一种有实用价值的全新的抗菌肽分离纯化技术。说明书附1是3TGC00超滤柱进行超速离心过滤，得到半纯品的中国家蝇抗菌活性组分的 RP-HPLC色谱图；图2是纯化中国家蝇抗菌肽1的RP-HPLC分析柱分析色谱图；图3是Si^phadex G50层析收集的中国家蝇抗菌肽1对铜绿假单胞菌的抗菌活性 试验结果图，15(80min 85min)、16(85min 90min)、17(90min 95min)为不同保留时间 收集的样本，加样量20yg蛋白质/纸片；图4是中国家蝇抗菌肽1胰蛋白酶水解的肽段1的质谱图；图5是中国家蝇抗菌肽1胰蛋白酶水解的肽段2的质谱图；图6是中国家蝇抗菌肽ITricine SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
具体实施例方式实施例1 一种中国家蝇抗菌肽1中国家蝇抗菌肽1经胰蛋白酶水解后得到5个酶解片段，酶解片段用 Nano-ESI-MS/MS技术进行质谱分析，测定出的质谱信息借助Micromass的专用软件MasSeq 进行序列分析，得到5个肽段的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 1-5所示(1)YDNVNLDELLNSDR(T0F MSMS 840. 47ES+, Query 4)Tyr-Asp-Asn-Val-Asn-Leu-Asp-Glu-Leu-Leu-Asn-Ser-Asp-Arg(2)YDLLNVDEEVRFR(T0F MSMS 826. 95ES+, Query 5)Tyr-Asp-Leu-Leu-Asn-Val-Asp-Glu-Leu-Val-Arg-Phe-Arg(3)QPNLYYNK(T0F MSMS 520. 30ES+, Query 2)Gln-Pro-Asn-Leu-Tyr-Tyr-Asn-Lys(4)PNNVYYTK(T0F MSMS 499. 76ES+, Query 1)Pro-Asn-Asn-Val-Tyr-Tyr-Thr-Lys(5)DYPNNVYYTK(T0F MSMS 639. 34ES+, Query 3)
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Asp-Tyr-Pro-Asn-Asn-Val-Tyr-Tyr-Thr-Lys质谱图经Micromass的专用软件MaxEnt3处理后，借助Micromass的专用软件 MasSeq直接推导出肽段序列。用Spectrum List通过Mascot查询NCBInr数据库，经检索 未发现有与之序列相匹配的蛋白质，可以证明本发明分离纯化到的家蝇抗菌肽是一个新的 抗菌肽，命名为家蚬抗菌肽 1 (Musca domestica antibacterial peptide l,MdAPl)。肽段 1的质谱图见图4，肽段2的质谱图见图5。实施例2 —种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法包括以下步骤1.免疫诱导把家蝇分为试验组和对照组，对照组不进行损伤诱导处理。试验组把盛有乙醚的 培养皿放在蝇笼内，使蝇麻醉，然后用沾有细菌悬液的不锈钢针刺透体壁，立即放入另一笼 内使其复苏。刺伤后在温度28 30°C饲养24h。通过损伤感染免疫诱导，使家蝇产生抗菌 肽。细菌为大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌，2.组织勻浆家蝇1. Og加液氮7g的比例混合，迅速用研钵研磨，或幼虫放-80°C冷冻过夜， 取出放研钵内在冰浴下研磨成细沫状，加少量4°C buffer A(含尿素2. 0mol/L,0. 2mol/L pH6. 8Tris-HCl)继续研磨成糊状，以Ig组织加IOml bufferA的比例混勻，4°C下60000g离 心60min，取上清液_80°C保存备用。3.透析浓缩将_80°C贮存的样品溶液取出，室温下融化，4°C下60000g离心60min，除去沉淀和 上层漂浮的脂肪层，取上清液装入分子量截留值为1500U的透析袋内，包埋于聚乙二醇中， 在4 °C下透析过液。4.透析浓缩的样品60000g离心30min，再用UFC 3TGC00超滤柱，以60000g离心超滤。5. HPLC分离纯化5. 1色谱柱装上预柱，接入1100系列高效液相色谱仪的管道系统，在连接时主机 应在开启状态，流动相流速设置为0. 3ml/min,以免空气进入柱内，两端管道应连接紧密以 防漏液。5. 2色谱柱平衡，色谱柱以100%甲醇为保养液，用时100%甲醇为流动相冲洗， 214nm波长下监测至基线呈平稳状态，同时甲醇浓度由100 %逐步降低至0 %，双蒸水冲 洗至基线平稳时，PROTEIN PAR 300 色谱柱改用 buffer B(0. 2mol/L pH6. 8PBS, PMSF 0. 2mmol/L, EDTA 0. 05mol/L)作流动相，Lichrospher C-18 色谱柱用 buffer C(0. 2mol/L pH6. 8PBS)作流动相，浓度从30%逐渐递增至100%，至基线平稳时上样。5. 3上样及洗脱，将S印hadex G50层析收集的半纯品抗菌活性组分用半制备柱进 一步分离纯化。收集的纯化抗菌活性组分再用分析柱分析。根据色谱柱型号不同决定上样 量和流速，分析柱一般为 ομ 1 100 μ 1，流速为0. 5ml/min ；半制备柱为1. Oml 2. Oml, 流速为1. Oml/min，检测波长为214nm。5. 4样品收集，根据色谱曲线中的色谱峰，分步收集各峰的样品，并记录时间。5. 5样品浓缩将分步收集的样品进行真空冷冻干燥，以冷冻干燥前样品体积的
51/10的比例加双蒸水溶解，用Lowry法进行蛋白定量后，供抗菌活性测定用。6.样品浓缩干燥将收集到的样品真空冷冻干燥，浓缩后加双蒸水溶解，使体积为原体积的1/10 1/20，做抗菌活性检测，相同浓缩倍数的流动相作试剂对照。家蝇组织提取液经超滤，所得到的抗菌活性成份，经RT-HPLC半制备柱纯化，各个 成分分离效果良好。对各峰收集品进行抗菌活性试验，结果保留时间为18. OOSmin时的收 集品有明显的抗菌活性(
图1)。该组分再用RT-HPLC分析柱分析，色谱图中只有一个吸收 峰，保留时间为36. 140min，达到了色谱纯(图2)。将经过上述纯化方法得到的中国家蝇抗菌肽1冷冻干燥后按体积比100 1重 溶，取15 μ 1进行Tricine SDS-PAGE电泳，该抗菌肽分子量为9. OkU，结果见图6。实施例3中国家蝇抗菌肽1分子结构测定(一 )将中国家蝇抗菌肽1进行Tricine SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续体系，分离胶浓度18%，夹层胶浓度8%，浓缩胶浓度4%，电压1. 5伏 /cm,电泳80min后，改变电压为10伏/cm再电泳120min。用0. 2%的R-250考马斯亮蓝 的甲醇_乙醇混合液(50%甲醇+10%乙醇)染色，脱色液为甲醇-乙醇混合液(50%甲醇 +10%乙醇)。( 二 )氨基酸测序抗菌肽的PAGE胶块脱色后置于真空干燥器中干燥20min，然后加入5 1010mg/L 的胰蛋白酶液，4°C冰箱中放置40min后，加10 μ 1 25mmol/L碳酸氢铵缓冲液，于37°C温育 过夜。用5%三氟乙酸(TFA)于40°C提取酶切肽段；再用同体积的丙烯腈(ACN)-TFA溶液 于30°C提取；最后用ACN超声提取一次；合并3次提取液，真空干燥器干燥。干燥后的样品 用TFA溶液溶解。用配备有毛细管液相色谱和纳升喷雾源的纳升电喷雾-四极杆-飞行时 间串联质谱(Nano-ESI-Q-T0F2-MS/MS)技术测定肽段的质谱图，确定家蝇抗菌肽的氨基酸 序列。(三)检索数据库所测定得的质谱图用Micromass的专用软件MasSeq直接推导出肽段序列，根据肽 段的氨基酸序列用Spectrum List通过Mascot查询NCBI数据库，确立其一级结构。实验例1中国家蝇抗菌肽1抗菌活性测定采用平板法，参照全国临床检验操作规程，采用LB培养基，将菌株接种于LB培养 基，35°C培养至对数生长期，用无菌生理盐水稀释至相当于0.5麦氏标准单位(Mc Farland standard unit，相当于1. 5X 108CFU/ml)，S印halexG50色谱法和高效液相色谱法(HPLC) 分离的各成分用纸片琼脂扩散法即K-B法(Kirby-Bauer method)检测有抗菌活性的成 分，再用微量稀释法(microdilution test)测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)，氨苄青霉素作对照。通过测定抑菌圈直径定性检测抑菌活力。实验结果显示，分离到的家蝇抗菌肽具有明显的广谱抗菌活性，对革兰阴性杆菌、 革兰阳性球菌和真菌均有抑制作用。该中国家蝇抗菌肽1对11种临床分离菌株的最小抑菌 浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)在 2· 22 μ mol/L ~ 13. 33 μ mol/L (20 μ g/ ml 120 μ g/ml)之间。家蝇抗菌肽对大肠杆菌的抗菌活性相对较强，而对阳性球菌和其他 肠杆菌的抗菌活性相对较弱，对白假丝酵母菌的抗菌活性最弱。
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在氨苄青霉素对照组，氨苄青霉素对10种临床分离菌株的MIC在21. 54 μ mol/ L >86.16ymol/L(8yg/ml >32yg/ml)之间。临床分离菌株伤寒沙门氏菌、福氏痢 疾杆菌敏感，大肠埃希氏菌、异形枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌中敏，铜绿假单胞菌、普通变形杆 菌、肺炎克雷伯氏菌、表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药。抗菌肽1 的抗菌活性结果见图3，抗菌谱结果见表1。表1家蝇抗菌肽对临床分离菌株的MIC
权利要求
一种中国家蝇抗菌肽1，其特征在于，包括5个肽段，所述5个肽段的氨基酸序列分别如SEQ ID NO1至SEQ ID NO5所示。
2.一种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法，包括以下步骤1)对家蝇进行免疫诱导，使家蝇产生抗菌肽；2)将免疫诱导后的家蝇进行组织勻浆，取含有抗菌肽的样品溶液；3)将含有抗菌肽的样品溶液进行透析浓缩，得到浓缩的样品；4)将浓缩的样品进行UFC3TGC00超滤柱超速离心过滤，得到半纯品抗菌肽；5)将半纯品抗菌肽进行HPLC分离纯化，得到色谱纯中国家蝇抗菌肽1。
3.根据权利要求2所述的一种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法，其特征在于，所述步 骤1)具体为先使家蝇麻醉，然后带有细菌悬液的不锈钢针刺透体壁，再使其复苏，刺伤后 在温度28 30°C饲养24h，通过损伤感染免疫诱导，使家蝇产生抗菌肽。
4.根据权利要求3所述的一种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法，其特征在于，所述细 菌悬液为大肠埃希氏菌悬液、铜绿假单胞菌悬液或金黄色葡萄球菌悬液。
5.根据权利要求2所述的一种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法，其特征在于，所述 步骤3)具体为首先将含有抗菌肽的样品溶液4°C下60000g离心60min，除去沉淀和上层 漂浮的脂肪层；再取上清液装入分子量截留值为1500U的透析袋内，包埋于聚乙二醇中，在 4 °C下透析过液。
6.根据权利要求2所述的一种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法，其特征在于，所述步 骤4)具体为采用UFC 3TGC00超滤柱进行超速离心过滤，在214nm检测波长下，当开始出 峰时，进行样品的部分收集。
7.根据权利要求2所述的一种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法，其特征在于，所述 步骤5)具体为采用RT-HPLC半制备柱纯化，半制备柱加样量为1. Oml 2. 0ml，流速为 1. Oml/min，检测波长为214nm，保留时间为18. OOSmin时的收集品为色谱纯中国家蝇抗菌 肽1。
8.用权利要求2-7任意一项所述方法制备的中国家蝇抗菌肽1。
全文摘要
本发明公开了一种中国家蝇抗菌肽1及其分离纯化方法。所述中国家蝇抗菌肽1，包括5个肽段。其分离纯化方法，包括以下步骤1)对家蝇进行免疫诱导；2)将免疫诱导后的家蝇进行组织匀浆，取含有抗菌肽的样品溶液；3)将样品溶液进行透析浓缩，得到浓缩样品；4)将浓缩样品进行超速离心过滤，得到半纯品抗菌肽；5)将半纯品抗菌肽进行HPLC分离纯化，得到色谱纯中国家蝇抗菌肽1。本发明所述中国家蝇抗菌肽1是最新发现的一种小分子肽，抗菌肽的活性较强，是一类具有发展潜力的，对多重耐药菌有抵抗作用的新型抗菌药。
文档编号C07K1/34GK101935344SQ20101024488
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者周义文, 姬尚义, 尹一兵, 涂植光, 申萍 申请人:周义文