猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制备与应用的制作方法

专利名称：猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪圆环病毒2型的基因工程疫苗及其制备方法，以及应用截短型 Cap蛋白作为ELISA检测抗原鉴定猪圆环病毒2型感染，特别指猪圆环病毒2型截短型Cap 蛋白疫苗，属基因工程领域。
背景技术：
猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)是目前已知最小的动物病毒。根据PCV 的致病性、抗原性及核苷酸序列，将其分为PCVl (猪圆环病毒1型)和PCV2(猪圆环病毒2 型)两种血清型。PCVl广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系中，经动物感染试验证明PCVl 无致病性。PCV2与猪群中发生的多种疾病相关，如断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病 综合征、猪呼吸道疾病综合征及先天性震颤等，给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2是近年来新发现的猪的重要传染病之一，患病仔猪出现发烧、腹泻、躯体震 颤、渐行性消瘦，直至死亡。繁殖母猪则出现产死胎等繁殖障碍。该病主要导致猪体的免疫 抑制，从而继发或并发其他疾病，使猪群的免疫能力下降。由于PCV2在细胞上的增殖滴度 很低，很难应用传统的灭活疫苗和弱毒疫苗来预防该病，而DNA疫苗这种新型疫苗免疫效 力又不高。因此，开发一种有别于传统疫苗的基因重组疫苗以及PCV2的早期诊断就显得尤 为重要。临床上对于PCV2的诊断，常根据流行病学、临床症状和病理变化作出初步诊断， 但由于PCV2与PRRS、PPV和PRV等疾病引起的临床症状相似，通过临床检查、病例剖检难以 确诊，故该病的诊断还要借助于实验室诊断。PCV2的实验室诊断方法有病原学方法和血清学方法。其中病原学诊断方面以PCR 法最为常见，但PCR法要求苛刻的试验条件，加之费用昂贵，限制了其大规模推广，其可信 性又受到由PCR的高度敏感性带来的假阳性结果的影响。因此，开发操作简单、结果可靠、 敏感性高、特异性好、方便基层应用的可产业化生产的血清抗体检测方法成为预防PCV2传 播的可靠途径之一。Allan等(1998a)用PCVl全病毒为抗原建立了 ELISA方法，但由于PCVl和PCV2 抗原的交叉反应性，该方法不能把PCVl型和PCV2型区分开来。Walker等(2000)应用PCV2 单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法，虽然该方法灵敏性和特异性都很高，但同时存在 操作耗时耗力，不能大量重复生产的缺点。南京农业大学姜平教授采用重组腺病毒基因工程技术研制出一种PCV2的重组腺 病毒及疫苗，但重组腺病毒载体存在对某些细胞感染能力差，转基因表达水平较低，持时较 短等缺点；南京农业大学曹瑞兵采用酵母分泌表达的PCV2 Cap蛋白作为检测抗原，制备了 检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的ELISA试剂盒，但酵母菌表达重组PCV2 Cap蛋白存在 生产周期过长和酵母菌容易污染周围环境的缺点，限制了该方法的推广和应用；哈尔滨兽 医研究所的刘长明研究员利用昆虫杆状病毒表达载体，筛选获得了一株PCV2 Cap蛋白重组 杆状病毒毒株(rBac/PCV2 Cap)，但该方法同样存在生产成本高和生产周期长的特点。
此外，童光志研究员和姜平教授等研究者分别利用大肠杆菌对截短型Cap蛋白 的表达进行了不同的研究。对于PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中的表达，国内外也有相关 文献报道，如Liu等在大肠杆菌中进行了 PCV2 Cap蛋白全基因的表达(Protein Exp. Purif. 21 (2001b)，115-120)，Zhou 等在大肠杆菌中表达了截短型 Cap 蛋白(Journal of Biotechnology 118 (2005) 201-211)，但总的来讲，PCV2 Cap蛋白的表达量很低，分别为 lmg/L和6. 142mg/L，且需要进行蛋白复性及加入价格昂贵的IPTG，二者均限制了大肠杆菌 对PCV2 Cap蛋白表达。综合以上研究结果，目前对于PCV2疫苗的研制及PCV2抗体检测试剂盒的应用，迫 切需要建立一种生产周期短、生产成本低、蛋白产量高、蛋白活性好的PCV2 Cap蛋白的制备 方法。

发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制 备方法，包括如下步骤(1)克隆猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因到表达载体质粒pKK233_2中，获得 重组表达载体pKK233-2-Cap，其中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白为去除N端41个氨基酸 残基的截短型Cap蛋白；(2)所述重组表达载体pKK233-2-Cap转化大肠杆菌，获得基因工程菌；(3)所述基因工程菌进行发酵培养，表达猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白；(4)回收基因工程菌菌体破碎后的上清液，分离纯化猪圆环病毒2型截短型Cap蛋 白。优选地，本发明所述大肠杆菌为DH5 α。优选地，本发明所述重组基因工程菌为DH5 α /pKK233-2-Cap。优选地，本发明所述转基因工程菌组成型表达Cap蛋白，为组成型表达，不需要添 加诱导物。本发明的另一方面为使用本发明所述方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。本发明的另一方面为使用本发明所述方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。本发明的另一方面为上述猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗的制备方法由本 发明所述方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白中，加入佐剂，获得猪圆环病毒2型截 短型Cap蛋白疫苗。本发明的另一方面为使用本发明所述方法制备的基因工程菌，可表达猪圆环病毒 2型截短型Cap蛋白。本发明的又一方面为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白在制备诊断试剂中的应用。 优选地，使用本发明所述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白做为酶联免疫吸附试验的抗原， 使用酶联免疫吸附试验检验被试样品。技术效果本发明选用了质粒PKK233-2为表达载体构建的基因工程菌，能稳定可靠的表达PCV2截短型Cap蛋白，其表达量显著高于现有技术描述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白
表达量。首先，本发明基因工程菌为组成型(渗漏)表达，其原因在于本发明实施例中构 建的pKK-233-2-Cap的重组表达质粒中所含的强启动子trc具有组成型(渗漏)表达的 特点，重组Cap蛋白是随着工程菌的生长而持续不断表达，特别是在不含变异基因IacItl的 宿主菌DH5ci中，trc启动的组成型表达量非常高。因此，本发明构建的工程菌株DH5 α / pKK-233-2-Cap，不需要添加诱导剂IPTG，解决了 IPTG对动物存在毒性的问题以及高成本 问题。其次，由于trc启动的组成型表达量非常高的特点，在优化的培养条件下，本发明 方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的表达量最高可达到150mg/L，远高于目前现有 技术报道的PCV2 Cap蛋白的lmg/L和6. 142mg/L的表达量水平。最后，本发明的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白保留了 PCV2 Cap蛋白羧基端区段， 使其依然具有天然Cap蛋白的抗原活性，同时经该方法获得的截短型Cap蛋白为可溶性表 达蛋白，其具有天然Cap蛋白的抗原活性，节省了大肠杆菌表达外源蛋白往往存在的包涵 体复性的繁琐步骤，简化了蛋白表达后期纯化的步骤，从而以较低的成本得到了大量的具 有生物活性的Cap蛋白。因此，该基因工程菌可用于PCV2疫苗及PCV2诊断试剂等的生产中，生产成本较 低，纯化方法简单，疫苗防治效果好，在工业上大规模生产猪圆环病毒2型的疫苗及诊断试 剂上具有良好的应用前景。


图1为重组质粒pMD 18-T-Cap双酶切电泳图。图2为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白鉴定电泳图。图3为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白柱层析纯化后电泳图。图4为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白经摇瓶培养优化后鉴定图。图5为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白Western blot鉴定图。
具体实施例方式本发明实施例克隆猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的基因，构建了表达载体 pKK233-2-Cap，转化大肠杆菌，得到了克隆有猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因的基因工 程菌。通过该基因工程菌的大规模培养，经分离纯化得到可溶性的截短型Cap蛋白。加适 合的佐剂，制备为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。该蛋白还可用于制备猪圆环病毒 2型引起的相关疾病的诊断试剂。本发明试验了使用PKK233-2表达载体构建基因工程菌，其他含有Iac启动子或 其杂合启动子但不含IacItl基因的表达载体，也可用于替代本发明使用的PKK233-2表达载 体。本发明实施例优选PKK233-2表达载体，其蛋白表达量高，且为组成型表达，不需要添加 诱导剂如IPTG等，解决了 IPTG对动物存在毒性的问题以及高成本问题。编码病毒的主要结构蛋白-核衣壳蛋白(Capsid，Cap)，其氨基端含有一个由41 个氨基酸残基组成的核定位信号(Nuclear location signal，NLS)，与PCV2的细胞核内定位相关。有研究表明，核定位信号(NLS)影响0RF2全基因在大肠杆菌中的表达，造成重组 PCV2 Cap蛋白的表达量极少。PCV2 Cap蛋白羧基端含有较多的转角结构，该区域抗原指数 较高，其亲水性指数和呈现在蛋白表面的可能性也较大，该区段的抗原表位是优势抗原表 位所在，因此本发明的实施例中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白保留了 PCV2 Cap蛋白羧基 端区段，使其依然具有天然PCV2 Cap蛋白的抗原活性。同时经该方法获得的截短型PCV2 Cap蛋白为可溶性表达蛋白，其具有天然PCV2 Cap蛋白的抗原活性，节省了大肠杆菌表达 外源蛋白往往存在的包涵体复性的繁琐步骤，简化了蛋白表达后期纯化的步骤，从而以较 低的成本得到了大量的具有生物活性的PCV2 Cap蛋白。本发明实施例中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的分离与纯化，采用硫酸铵沉淀 与柱层析的纯化方法，其他常用的蛋白质纯化手段，也可应用于本发明蛋白的纯化与分离。本发明实施例中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的表达为组成型表达，主要分布 于菌体裂解液的上清液中，对菌体进行破碎分离可以获得菌体内部的猪圆环病毒2型截短 型Cap蛋白。本发明实施例中使用了油性佐剂与乳化剂制备疫苗，本领域疫苗制备中其他的佐 剂与添加剂也可以应用于本发明疫苗的制备中。本发明实施例中所述的Cap蛋白为去除N端41个氨基酸残基的截短型Cap蛋白。 本发明实施例中所述截短型Cap蛋白为可溶性表达，不需要进行蛋白的变性和复性。使用 本发明之方法，通过摇瓶优化试验，Cap蛋白的表达量可达到100mg/L。本发明实施例中所 述截短型Cap蛋白经发酵优化培养后，Cap蛋白的表达量可达到150mg/L。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1 猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗的制备方法1、克隆猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因到表达载体，获得重组表达载体。①引物的设计以 PCV2-SH 毒株核酸序列为参考(GenBank: AY686763)，应用 01igo6. O 引物设计软件设计猪圆环病毒2型截短型Cap基因特异引物，上游引物酶切 位点 NcoI 5 ‘ -CATGCCATGGTGAATGGCATCTTC-3 ‘；下游引物酶切位点 HindIII 5 ‘ -CCCAAGCTTTTAAGGGTTAAGT-3 ‘，PCR 扩增目的基因长度为 585bp。②PCV2病毒核酸的提取Iml DNAzol Reagent (Invitrogen )加入 0. Iml 的保藏号 CGMCCNo. 2389 的 PCV2-SH病毒株样品，将离心管上下颠倒摇勻；室温下静置5min ；4°C离心(10，OOOr/min、 IOmin)后，将上清液移至新离心管；向其中加入0. 5ml无水乙醇，上下颠倒混勻后室温下静 置5min，4°C离心(4000r/min,2min)后，静置lmin，然后吸去管内液体；向试管中加入Iml 75%乙醇，上下颠倒混勻3-6次后，静置lmin，吸去乙醇，此步骤至少重复两次后，让样品在 空气中自然干燥(5min)；于离心管中缓慢加入30 μ 1 8mmol/L NaOH溶解DNA，然后在_20°C 下贮存备用。③PCV2Cap蛋白基因的PCR扩增并连接载体pMD 18-T。以PCV2 DNA为模板，用设计的引物将目的基因进行PCR扩增。将PCV2 Cap蛋白基因连接到pMD 18-T载体中，命名为pMD 18-T-Cap质粒。以NcoI与HindIII双酶切鉴定 及M13引物进行测序，鉴定PCR扩增基因的正确性。PCR结果见图1，其中Ml为DNA Marker DL2000 ；M2为DNA Marker DL15000 ；泳道1为pMD18_T_Cap质粒双酶切后产物。由电泳图 谱与测序结果可知，重组连接载体中PCV2截短型Cap蛋白基因含序列表中的SEQ ID NOl 序列。④构建含猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因的表达载体pKK233-2-Cap和基因 工程菌。用NcoI与HindIII双酶切pMD18-T-Cap质粒，用胶回收试剂盒回收猪圆环病毒2 型截短型Cap蛋白基因片段。与同样经过NcoI与HindIII双酶切pKK233-2质粒(购自 Pharmacia公司)的胶回收目的片段进行连接，构建表达载体pKK233-2-Cap。用NcoI与 HindIII双酶切及测序鉴定。2、重组表达载体pKK233-2-Cap转化大肠杆菌DH5 α，获得基因工程菌DH5 α / pKK233-2-Cap。将鉴定后的阳性重组表达质粒pKK-233-2-Cap转化大肠杆菌DH5 α，筛选阳性基 因工程菌DH5 α /pKK-233-2-Cap,并用15%甘油进行菌种保存。3、重组表达载体pKK233-2-Cap在发酵罐中的优化培养，表达截短型Cap蛋白。①基因工程菌的活化及猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的鉴定将基因工程菌DH5 α /pKK233-2"Cap挑取单菌落，接入3ml的含氨苄青霉素 (50yg/ml)的LB培养基中，于37°C培养过夜。取50 μ 1过夜培养液接入5ml含氨苄青霉 素(SOyg/ml)的LB培养基中，于30°C培养18h。取Iml培养液，室温12，OOOr/min离心 lmin，沉淀重新悬于100 μ 1的IXSDS凝胶上样缓冲液，于100°C加热3min，室温12，OOOr/ min离心lmin，取40 μ 1的悬液上样于12%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行鉴定。电泳完 毕后考马斯亮蓝染色观察表达产物条带。电泳图谱见图2。其中，1为空宿主菌；2和3为 DH5a/pKK233-2-Cap 蛋白；M 为蛋白质 Marker。由图可知，DH5 α/pKK233_2_Cap 蛋白大小 与预测蛋白一致。经测序可知，重组猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白序列含序列表中的SEQ ID N02序列。②基因工程菌的摇瓶培养试验参考对重组基因工程菌DH5 α /pKK-233-2-Cap在摇瓶中培养条件的优化，进一步 扩大到对发酵罐中培养条件的优化。在摇瓶中首先进行培养基的初步筛选，主要对培养基 中的碳源、氮源和无机磷酸盐的选择进行比较，最后利用正交试验，获得这几种元素的最佳 配比量。培养基配方为葡萄糖1 %，乙酸钠1 %，蛋白胨2 %，酵母膏1 %，硫酸按0. 5 %，磷 酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钠0.2%，磷酸氢二钾0.1%。按上述培养基配方，对培养温度、PH值、装样量进行了细致优化。其中分别选定 培养温度为25，28，30，33，37°C ；所取ρΗ值分别为6.4,6.8,7.2,7.6,8.0 ；分别采取10%, 20%，30%，40%禾口 50% 的装样量以及 120r/min, 150r/min, 180r/min 和 210r/min 的转速 对工程菌进行培养；分别在培养10h，12h，14h，16h，18h和20h取样进行SDS-PAGE。电泳结 果显示在最佳培养条件下，即培养温度37°C，pH值7. 2，20%装样量，转速为120r/min时， 猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的表达量可达到100mg/L。电泳结果见图4。其中，1为DH5 α /pKK-233-2-Cap蛋白优化后样品；2为DH5 α /ρΚΚ_233_2阴性对照样品；M为蛋白质 Marker0③发酵罐培养试验在基本确定摇瓶培养条件后，将该优化后条件扩大到发酵罐中进行发酵罐条件的 进一步优化。在IOL生物反应器中加入7L培养基，121 °C灭菌，接种量10%，通气量3L/min。 通过流加1. 5mol/L NaOH和1. Omol/L HCl控制发酵液中的pH为7. 0。通过调节搅拌转速 为400-500r/min，使溶解氧浓度保持在30%以上。培养12h后，流加补料培养基，配方为 甘油1%，乙酸钠1%，蛋白胨5%，酵母膏2.5%，硫酸铵1%。培养18h，猪圆环病毒2型截 短型Cap蛋白的表达量最高可达到150mg/L。4、分离纯化截短型Cap蛋白。本发明实施例中步骤猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的具体纯化方法如下收集发酵表达的DH5 α /pKK-233"2-Cap菌体及发酵液上清，4 °C条件下以 12，000r/min, 15min离心菌体沉淀。将收集到的菌体用PBS缓冲液(pH7. 4)洗涤沉淀，按 1/10体积用PBS重新悬浮进行超声裂解(200W、工作5sec、间隔5sec)，超声裂解结束后用 12，000r/min离心30min收获菌体裂解上清中的可溶性蛋白。向菌体裂解上清中依次加入 不同体积的饱和硫酸铵溶液，于4°C条件下过夜沉淀。4°C条件下以12，000r/min, IOmin离 心过夜沉淀的蛋白。将离心后的沉淀用一定体积的PBS缓冲液(pH7.4)重新溶解，用PBS 透析3天，取出-20°C保存。经硫酸铵沉淀后的蛋白中含有少量杂蛋白，因此采用葡聚糖凝 胶层析(S印hadex G-100，SIGMA)对目的蛋白进行更进一步的纯化。具体方法如下将注 射器装满结合Buffer，将层析柱与注射器连接，用IOml结合Buffer平衡层析柱。用注射 器将样品以0. 5ml/min的流速加入柱中，用20ml结合Buffer洗柱，流速为1. 5ml/min，直 到没有任何样品流出。用5ml洗涤Buffer以lml/min洗柱，洗下溶液分别测OD26tl和OD28tl, 计算纯化蛋白浓度。取部分样品重新悬于100μ 1的IXSDS凝胶上样缓冲液，于100°C加 热3min，室温12，000r/min离心lmin，取40ul的悬液上样于12%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺 凝胶进行鉴定。电泳完毕后考马斯亮蓝染色观察表达产物条带，结果见图3。其中，1-3为 DH5 α /pKK-233-2-Cap蛋白过柱子后样品；M为蛋白质Marker。5、加入佐剂，制备猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。将分离纯化后的去NLS Cap蛋白溶液，按照一份蛋白溶液加2份油乳剂的比例，分 散制成油乳剂疫苗。其中，油乳剂为白油、司本和硬脂酸铝，其比例是94 4.5 1.5。油 化剂和蛋白抗原按照2 1比例混合后，使用乳化机15，500r/min乳化5min。实施例2 猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗的效力与生物学检验将实施例1中制备的油乳剂疫苗按照兽用生物制品规程要求进行成品疫苗的检 验，主要对成品疫苗进行性状检验、安全检验、效力检验、甲醛及硫柳汞残留量测定。结果显 示抽检样品外观均一，无霉菌生长；安全检验和效力检验均符合要求；甲醛及硫柳汞残留 量也符合要求。用检验合格的制品进行临床试验——仔猪攻毒试验。①安全性试验用PCV2Cap疫苗2倍剂量(4ml/头)肌肉接种25日龄仔猪5头(由江苏某猪场 提供)，临床观察28天无异常反应，证明该疫苗制品对本动物是安全的。②仔猪攻毒试验
分别采用0. 5ml、1. 0ml,2. Oml和4. Oml四种免疫剂量免疫25日龄PCV2抗体阴性 仔猪(由江苏某猪场提供)，每组5头，同时设未接种疫苗对照猪3头。在疫苗免疫后28 天，所有免疫过的猪只抗体检测全部阳性(待检血清OD45tl值/阴性血清OD45tl值> 2. 1为阳 性)。首免后第5周用强毒(PCV2-SH强毒106_°TCID5(l/ml)攻击，每头猪滴鼻lml，肌肉注射 2ml。试验结果表明:1.0ml,2. Oml和4. Oml免疫组均可获得5/5保护，0. 5ml免疫组的保护 率为4/5。实施例3猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的免疫原性鉴定及在制备PCV2的检测 试剂中的应用① Western-blot 试验将纯化后的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白进行Western-blot鉴定。截短型 PCV2 Cap蛋白的分子量约为22. 5Ku，与猪圆环病毒2型阳性血清反应呈阳性结果；与阴性 血清反应呈阴性结果；与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪肺疫、猪伪狂犬、猪细小病毒病阳性 血清无反应，结果见图5。其中，1-6分别猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白与猪瘟、猪繁殖与 呼吸综合征、猪肺疫、猪伪狂犬、猪细小病毒病阳性血清以及猪圆环病毒2型阴性血清反应 结果；7为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；M为蛋白 质 Marker。②检测猪圆环病毒2型抗体间接ELISA的建立及其标准化经方阵试验确定纯化后猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白，标准阳性血清以及标准 阴性血清的最佳包被浓度。最终确定的最佳抗原工作浓度为30μ g/ml，血清最佳稀释倍数 为1 50。使用最佳包被浓度包被ELISA板37°C作用1小时，4°C过夜。PBST洗涤三次后， 0. 15% BSA封闭，37°C作用2小时。PBST洗涤三次，加入待检样品以及标准阴、阳性血清， 37°C作用1小时。PBST洗涤三次，加入兔抗猪IgG(DAKO)作用1小时。加入OPD显色缓冲 液，显色15分钟，2mol/L硫酸终止反应，测定OD49tl值。最后，运用建立的该方法检测来自河 南、河北，山东等地的276份待检样品，并将检测结果与IFA检测结果进行比较，结果显示两 种方法的符合率可达到97%以上。从而证明，猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白可用于PCV2 临床样品的检测。具体比较结果见表1。表1 Cap-ELISA和IFA检测样品结果比较
权利要求
一种猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)克隆猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因到表达载体质粒pKK233 2中，获得重组表达载体pKK233 2 Cap，其中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白为去除N端41个氨基酸残基的截短型Cap蛋白；(2)所述重组表达载体pKK233 2 Cap转化大肠杆菌，获得基因工程菌；(3)所述基因工程菌进行发酵培养，表达猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白；(4)回收基因工程菌菌体破碎后的上清液，分离纯化猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述大肠杆菌为DH5α。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述重组基因工程菌为DH5α/ pKK233-2-Cap。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述基因工程菌表达猪圆环病毒 2型截短型Cap蛋白为组成型表达。
5.一种猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白，其特征在于，所述蛋白由权利要求1-4任意一 项所述方法制备。
6.如权利要求5所述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白在制备疫苗中的应用。
7.一种猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，由权利要求5所 述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白中，加入佐剂，获得猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫田ο
8.一种根据权利要求7所述的方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。
9.如权利要求5所述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白在制备诊断试剂中的应用。
10.一种猪圆环病毒2型相关疾病诊断试剂的制备方法，其特征在于，使用酶联免疫吸 附试验检验被试样品，其中，酶联免疫吸附试验的抗原为使用权利要求5所述的猪圆环病 毒2型截短型Cap蛋白。
11.一种由权利要求1-4任意一项所述方法构建的基因工程菌，其特征在于，所述基因 工程菌可表达猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗及其制备方法。首先，将猪圆环病毒2型去除N端41个氨基酸残基的Cap蛋白基因克隆入质粒pKK-233-2，获得重组表达质粒pKK-233-2-Cap，重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α，获得重组基因工程菌DH5α/pKK-233-2-Cap。不需要添加IPTG或乳糖诱导，重组基因工程菌组成型表达截短型Cap蛋白，分离纯化截短型Cap蛋白，添加佐剂制成猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗。Cap蛋白还可以用于制备猪圆环病毒2型引起的相关疾病诊断试剂。
文档编号C07K14/01GK101948849SQ201010272950
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年9月2日
发明者乔荣岑, 孙进忠, 张许科 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司