专利名称：基因重组Exendin-4的表达和制备新方法
技术领域：
本发明是关于基因重组制备Exendin-4的工艺，重点是经优化后的工程菌构建、 发酵表达、纯化的工艺。
背景技术：
近二十年来，随着人们生活方式的改变，糖尿病患病率急剧升高。全球糖尿病患者 已近2. 5亿，并且以10%以上的速度递增。目前我国糖尿病患者已逾7000万，并且糖尿病 患者增长率是欧美国家的2倍。胰高血糖素样肽-Kglucagon-like peptide-1 receptor, GLP-1)受体激动剂为II型糖尿病的治疗提供了新的思路。此类药物促胰岛素分泌作用呈 明显的血糖依赖性，低血糖发生几率低；同时改善胰岛0细胞功能并促进0细胞增殖，并 且可以减轻体重，降低血压，在II型糖尿病治疗领域具有独特优势，成为近来糖尿病治疗 领域的研究热点。人体内源性激动剂GLP-1在可以被DPPIV和中性肽链内切酶24. 11迅速降解，体 内半衰期仅l-2min。Exendin-4是从希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中分离得到的，其具有 GLP-1相同的调控血糖功能，并且这一天然化合物对DPPIV具有很高的耐受性，在体内的稳 定性远高于GLP-1，体内半衰期达2-4小时。Exendin-4的临床实验效果充分体现了 GLP-1 受体激动剂的优势，每天注射两次，控制血糖、降低体重的效果良好。并且其优势还在于不 需要根据糖化血红蛋白(HbAlc)或血糖水平来调整剂量，在早餐和晚餐前给予固定剂量即 可，从而减少监测血糖的不便。该药物已由美国Amylin和礼来合作开发上市，最初批准和 二甲双胍、磺脲类药物联合使用治疗使用口服降糖药未能取得良好效果的II型糖尿病患 者。2009年10月，FDA批准扩大Byetta的适应症，可用于单一疗法，结合饮食和锻炼控制 血糖。Exendin-4多肽的制备方法有化学合成法和基因重组法，目前用化学合成法的比 较多，已上市的Byetta是化学合成的。但是合成仪器昂贵、成本较高，过程涉及有害化学物 质。基因重组法易于规模放大，对环境影响小，制备成本低。研究内容本发明提供的Exendin-4生产方法，采用基因重组法，步骤简捷，安全高效，周期 短，易于规模放大。研究内容包括表达工程菌的构建、工程菌发酵表达、目的蛋白的纯化工艺和活性 理化性质分析鉴定。1.工程菌的构建内容包括根据密码子偏爱性设计序列、合成全基因序列、酶切连接转导，构建了 以大肠杆菌BL21 (DE3)plysS为宿主菌、以pET32a(+)为表达载体的Exendin-4融合表达 系统。全基因序列中包括构建克隆所需的BglII、XhoI酶切位点、肠激酶酶切位点，序列 如“序列表”所述。基因全序列的合成、BL21(DE3)plysS宿主菌都购自invitrogen公司；pET32a(+)表达载体购自Novagen公司，是基因重组表达的常用菌株，融合蛋白表达量高、 可溶性高、便于捕获纯化。工程菌构建完成后，经目的片段测序鉴定，结果表明工程菌构建正确。2.工程菌发酵表达本发明的工程菌发酵采用乳糖诱导法。以葡萄糖、乳糖为碳源，在优先利用葡萄 糖后，添加乳糖为碳源，同时诱导融合蛋白表达。而常用的诱导剂IPTG，对人体有潜在的毒 性，价格也比较昂贵；乳糖诱导则兼备提供碳源、无毒、价格低，也可获得诱导产生相同量的 表达蛋白。如果试验设计合理，还可减少了补加诱导剂步骤，操作简便，减少污染机会。确立了工程菌株后，通过对种子培养基、接种浓度、发酵培养基、发酵过程参数的 摸索，确定工艺步骤如下(1)将冻存种子按1 100接种于含50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基，在 37°C、180rpm下摇瓶培养约8_12小时，为一级种子液；(2)将一级种子液按适当比例接种于含适量抗生素的LB培养基，在37°C、200rpm 下摇瓶培养约6-8小时，0D_ = 2. 0 3. 0时为二级种子；菌体此时处于对数生长期初期， 生长旺盛，更容易适应新的生长环境；(3) 二级种子液接种比例为1 10接种入发酵起始培养基；发酵过程培养温度 控制在37°C，氨水调节pH至7. 00 士 0. 2，溶氧率通过搅拌速度和通气量维持在30 %以上，用 20 %的泡敌溶液做消泡剂，根据发酵过程各培养阶段工程菌生长补料。工程菌生长达合适密度时，开始乳糖诱导。诱导培养要保证适合浓度的乳糖碳源 和氮源，维持溶氧率在20%以上，诱导表达3. 5小时终止发酵离心收菌。乳糖诱导发酵可选 择①批式培养初始培养基含有葡萄糖(5-10g/L)和乳糖(5g/L)，大肠杆菌在优先利用葡 萄糖后，用自行启动乳糖做碳源，既可促进菌体生长，又可促进蛋白表达。但是若乳糖浓度 过高，则会产生抑制作用。批式培养适合摇瓶培养摸索乳糖浓度和小试规模。②乳糖诱导 液补料培养在M9发酵培养基加葡萄糖培养工程菌至合适密度时，开始流加乳糖和酵母提 取物的诱导培养液。此种方式，适合于中试及以上规模，乳糖浓度相对恒定，诱导培养时间 容易掌握。3.目的蛋白的纯化工艺研究内容包括融合蛋白的捕获、肠激酶酶切融合蛋白、酶切混合物的纯化。其中第 三步，与以往的二次M柱收集流穿的粗分离，结合SOURCE反相、离子交换的精细纯化相比， 本发明提供的C4反相工艺实现了一步纯化得99%以上纯品的目标。该工艺简化了流程，节 省时间、空间、试剂耗材，易于规模放大。具体步骤如下(1) :Ni-Sepharose 6FF 亲和层析法捕获带 His-S-Trx 标签的 Exendin-4 融合蛋 白；(2)适宜浓度的肠激酶酶切融合蛋白，得到标签蛋白与目的多肽的混合液；(3):制备级HPLC的C4反相柱纯化，得到高纯度的目的多肽；后续可通过 Superdex30或S印hadexG-25将目的多肽置换到制剂溶液中。4.活性理化性质分析鉴定经SDS-PAGE电泳、HPLC、质谱、相应的细胞活性检测分析鉴定，获得的目的多肽与设计的完全一致。
具体实施例方式实施例一摇瓶批式发酵，摸索乳糖诱导浓度(1)将冻存种子按1 100接种于含50 u g/mL Amp的20mL/瓶LB培养基1瓶， 在37°C、180rpm下摇瓶过夜培养；(2)将上述种子液按1 100接种于含50 u g/mLAmp的200mL/瓶LB培养基7瓶， 在37°C、200rpm下培养；约2小时后，OD600 = 0 . 6时，开始诱导，分别加入Og/L乳糖、3g/L 乳糖、6g/L乳糖、9g/L乳糖、12g/L乳糖、15g/L乳糖、0. 4mMIPTG。37 °C继续培养4h，收菌。(3)取相同重量的每份菌产物，稀释为相同浓度，超声破碎，取上清，观察蛋白表达 量(见图2)。实施例二乳糖诱导液补料发酵培养(1)将冻存种子按1 100接种于含50 u g/mL Amp的20mL/瓶LB培养基1瓶， 在37°C、180rpm下摇瓶培养约12小时，为一级种子液；(2)将一级种子液按1 100接种于含50 u g/mLAmp的200mL/瓶LB培养基5瓶， 在36°C、200rpm下摇瓶培养约8小时，为二级种子；(3) 二级种子液接种比例为1 10接种入9L基础培养基(培养基成分g/ L :glucose 2. 5, tryptone 10, yeast extract 5, KH2P042, K2HP044, NaH2P04 12H20 7, (NH4)2S041. 2,NH4C10. 2,MgS04 '7H20 0.2，NaCI 1)的发酵罐；温度控制在 37°C，氨水调节 pH 至7. 0士0. 2，初始搅拌速度为250rpm，通过逐步增加搅拌速度和通气量维持溶氧量在30% 以上。约2 2. 5h后，溶氧急剧上升到80%以上时，按0. 2 0. 3mL/L/min的速度补加 20%葡萄糖溶液(glucose 200g/L, yeast extract 50g/L)，60 120min后停止。此时 0D_ 为11 13，首次快速加入至乳糖终浓度9g/L，之后按0. 15 0. 3mL/L/min的速度补加乳 糖诱导液(Iactose200g/L，yeast extract 50g/L)，诱导5h后收菌。经离心后称重共获得 湿菌400克。取诱导Oh、lh、2h、3h、4h、5h的菌体，相同浓度超声破碎，取上清。经15 % SDS-PAGE 胶检验，分子量约为21KD，目的蛋白表达量约为15 20% (见图3)。实施例三目的多肽的纯化菌体处理取100g湿菌，溶于1. 0L Tris缓冲液(50mM Tris,300mM NaCl)中，超 声破碎，4°C，8000rpm离心20min，取上清，0. 45 u m滤膜过滤。(1)加20mLlM咪唑于细胞裂解液，使上样缓冲液含20mM咪唑；选用含 lOOmLNiSepharose 6FF柱料的柱子，经平衡(20mM咪唑)、上样(20mM咪唑)、清洗(40mM咪 唑)、洗脱(100 150mM咪唑)，收集Exendin-4融合蛋白；(2)用50mMTris溶液将融合蛋白稀释到酶切缓冲液(50mMTris，50mMNaCl, 15 25mM咪唑)，加入合适浓度的肠激酶，30 37度酶切6 12h ；
(3)选用制备级HPLC的C4反相柱(250mmX 10mm)，检测波长为214nm，柱温30°C ； 以H20(0. 1 % TFA)为流动相A，以乙腈(0. 1 % TFA)为流动相B ；上样100mL，流速4. OmL/ min，线性梯度洗脱，收集第11峰，其保留时间为16. 470 (见图4)。经检测，收集的目的多肽组分纯度为99. 8%。后续可用S印hadexG-25将目的多肽置换到制剂缓冲液中。Exendin-4多肽纯化过 程的Tris-Tricine电泳图(见图5)。实施例四部分性质分析鉴定(1)纯度检测选用C4色谱柱(100mmX4. 6mm)，检测波长为214nm，柱温30°C，流 速0. 8mL/min ；以H20(0. 1% TFA)为流动相A，以乙腈(0. 1% TFA)为流动相B ；线性梯度洗 脱从20% B到60% B。结果表明目的多肽纯度为99% (见图6)。(2)分子量检测基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF，ABI-4700 型)进行分子量测定，结果表明所纯化多肽的分子量为4186. 4，与理论值一致(见图7)。(3)细胞体外活性检测选用大鼠胰岛素瘤细胞株RINm_5F，接种处于对数生长期 的细胞1. 0X105个/mL，100 ii L于96孔板一培养2天后，待细胞长至90%覆盖率一换为无 血清1640培养基，饥饿孵育2h —用1640培养基将样品和对照品预稀释到一定浓度，然后 做2倍系列稀释梯度，用此稀释梯度刺激lOmin —去上清，收集细胞，用R&D公司的cAMP酶 免试剂盒检测各样品中的cAMP值。经数据处理分析，用Exendin-4样品浓度的lg值做X轴，cAMP值做Y轴；样品与 参考品的四点直线回归部分R2(参考品)=0.96、铲(样品)=0.95，斜率无显著性差异， 活性与参考品相当(见图8)。
图1 工程菌的质粒目的序列测序图；图2 批式培养发酵工艺过程，融合蛋白表达图各泳道是不同诱导剂作用下产生的菌体裂解上清，诱导剂分别为1 :0g/L乳糖； 2 :3g/L 乳糖；3 :6g/L 乳糖；4 :9g/L 乳糖；5 :12g/L 乳糖；6 :15g/L 乳糖；7 0. 4mMIPTG ；M Markero图3 乳糖诱导液补料发酵培养过程，融合蛋白表达图各泳道是发酵过程不同时间点样品的裂解上清，分别是1 诱导Oh ；2 诱导lh ；3 诱导 2h ；4 诱导 3h ；5 诱导 4h ；6 诱导 5h ；M :Marker。图4 纯化过程，在线检测图；图5 纯化全程及目的多肽的Tris-Tricine图各泳道分别为1 工程菌发酵诱导前上清；2 工程菌发酵诱导后上清；3 :Ni S印har0Se6FF亲和纯化融合蛋白；4 肠激酶酶切融合蛋白混合物；5 :C4反相柱纯化后原 液的3 ii L上样；M :Marker ；6 :C4反相柱纯化后原液的6 y L上样；7 :C4反相柱纯化后原液 的10 ii L上样；图6 :目的多肽的HPLC纯度分析图；图7 :目的多肽的质谱分析图8 目的多肽的细胞活性检测分析图。
序列表
<110>扬子江药业集团北京海燕药业有限公司
扬子江药业集团
<120>基因重组Exendin-4的表达和制备新方法
<160>1
<170>Patentln 3.3
<210>1
<211>148
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含酶切位点
<400>1
agatctggac gacgacgaca agcatggtga aggtaccttc accagcgatctgtctaagca 60
aatggaagag gaggccgtgc gtctgtttat tgaatggctg aaaaacggtggcccaagctc 120
tggcgcgccg ccaccaagct gactcgag148
菌株构建补充说明
1.基因合成
全基因序列合成可由生物公司协助完成，序列包括构建克隆所需的BglII、XhoI
酶切位点、肠激酶酶切位点，序列如“序列表”所述。2.表达载体构建以购自Novagen公司的pET32a(+)为表达载体，以BglII、XhoI酶切位点将目的序 列片段插入表达载体。3.表达菌株构建选用电转法或热激法，将含有目的片段的表达载体转入BL21 (DE3)plysS感受态 菌株，该菌株购自irwitrogen公司。涂布于LB/Amp+培养基上，挑选单克隆做鉴定。4.筛选与鉴定可通过菌株PCR、提取质粒测序、提取质粒酶切、表达蛋白大小分析等手段检测所 挑选的菌株是否与设计的一致。鉴于此，本发明涉及的菌株可自行构建完成，无需生物材料样品保藏。
权利要求
采用经密码子优化的序列构建工程菌，经过发酵表达、纯化，获得高纯度的目的多肽；多肽经理化活性分析鉴定，与设计的一致。
2.如权利要求1所述，目的多肽的碱基序列如说明书中所述。
3.如权利要求1所述，工程菌的发酵过程采用流加乳糖诱导法。
4.如权利要求2所述，目的多肽的纯化经金属螯合捕获融合蛋白一肠激酶酶切一制备 级HPLC的C4反相柱纯化，一步酶切二步层析法获得高纯度目的蛋白。
全文摘要
本发明是关于基因重组Exendin-4的表达和制备新方法，各个步骤经过优化后，简捷高效，缩小了所需时间空间，选用对环境和人员无害的原材，便于操作和规模放大。优化后的方法流程如下(1)用密码子优化后的碱基序列，构建大肠杆菌工程菌株；(2)工程菌的发酵表达采用乳糖诱导法；(3)纯化工艺中，目的多肽的分离采用制备级C4柱反相纯化；(4)所纯化的多肽经过理化、活性分析鉴定，与设计的一致。
文档编号C07K1/20GK101993851SQ201010513310
公开日2011年3月30日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者丁宇, 干玉, 李光伟, 李国伟, 杨子义, 闫荣 申请人:扬子江药业集团北京海燕药业有限公司;扬子江药业集团有限公司