基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用的制作方法
基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到基因重组人胶原蛋白融合肽段。
技术背景
胶原蛋白(colhgen)是广泛分布于动物结缔组织的一组蛋白质家族，也是体内含 量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25-33%，其对维护细胞、组织、器官的正常生 理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无 法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用在医药、化妆品等工业中，它能保持 血管壁弹性、防止栓塞、提高软骨以及韧带的润滑、减轻关节僵硬等，其在治疗真皮损 伤或缺陷、美容整形、改善睡眠、增强机体免疫力等方面的作用已获得共识，同时它们 含有大量极性基团，和甘氨酸等天然保湿因子，且有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素 的作用，故胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用。另外，胶原蛋白也在食 品、保健品和饲料添加剂等行业得到应用。
胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，由3条α肽链组成，每一条胶原链 都是左手螺旋构型，3条左手螺旋链相互缠绕成右手螺旋结构，形成胶原蛋白独特的三重 螺旋结构，使其分子结构相对稳定。一级结构分析表明，其多肽链主要由“Gly-x-y”氨 基酸序列重复而成。其中甘氨酸占总氨基酸的27%，X通常是Pro(脯氨酸)，Y通常是 不由DNA碱基密码子编码的羟基脯氨酸(Hyp)，它是在蛋白质一级结构序列形成之后由 特定的酶-脯氨酸-4-羟化酶(prolyl-4-hydroxylase，P4H)作用于序列中的Pro形成的， Hyp羟基通过分子间氢键对稳定胶原螺旋结构起着非常重要的作用。
胶原蛋白是一个庞大的家族，种类繁多，现已至少发现了 30余种胶原蛋白链的 编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子，根据它们在体内的分布和功能特点，目 前将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原。间质型胶原蛋白分子占整个机体 胶原的绝大部分，包括I、II、III型胶原蛋白分子，主要分布于皮肤、肌腱等组织，其中 II型胶原蛋白由软骨细胞产生。
胶原作为医用生物材料和化妆品原料，最重要的特点在于其低免疫原性。胶原 有三种类型的抗原分子，第一类是胶原肽链非螺旋的端肽，第二类是胶原的三股螺旋的 构象，第三类是α-链螺旋区的氨基酸顺序。其中第二类抗原因子仅存在于天然胶原分 子中，第三类只出现在变性胶原中，而第一类抗原因子在天然和变性胶原中均存在。
生物相容性是指胶原与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。无论是在被吸收 前作为新组织的骨架，还是被吸收同化进入宿主成为宿主的一部分，都与细胞周围的基 质有着良好的相互作用，表现出相互影响的协调性，并成为细胞与组织正常生理功能整 体的一部分。
胶原能被特定的蛋白酶降解，即生物降解性。因胶原具有紧密牢固的螺旋结 构，所以绝大多数蛋白酶只能切断其侧链，只有特定的蛋白酶在特定的条件下才能降解 胶原蛋白，胶原肽键才会断裂。胶原的肽键一旦断裂，其螺旋结构随即被破坏，断裂的胶原多肽就被蛋白酶彻底水解。
生产胶原蛋白传统的也是目前最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的
组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼等)，从中提取胶原蛋白，另外还有酶解法提取胶 原蛋白，这些方法具有较高的回收率，但是这些方法制取的胶原蛋白均为长度不等的混 合胶原蛋白肽段，各肽段水溶性不一、难以分离到单独的肽段纯品，同时由于均为异源 性胶原蛋白，在临床上表现出排异反应，使其作为生物医学材料或药物载体等方面的应 用受到了很大限制。随着现代生物技术的发展，利用转基因技术和基因重组技术，可以 在动物、植物和微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传统提取方法存在的病毒 隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等。国内外一些研究机构及 生物公司相继投入研发开发重组胶原蛋白，如利用转基因的方法，培育含类人胶原蛋白 的小白鼠、通过转基因微量注射得到含重组类人胶原奶汁的哺乳动物，但通过哺乳类或 昆虫细胞株生产的成本极高、生产周期长。我国西北大学的范代娣等采用PCR扩增得到 数段人胶原蛋白基因片段，接着进行拼接重复，转化大肠杆菌，并通过高密度发酵培养 生产人源性胶原蛋白，得到高表达的重组胶原蛋白。2004年，东京农业科技大学的Yao J等对胶原蛋白细胞附着作用和自身交联螺旋相关序列作了研究，设计了长度为240个氨 基酸的类胶原蛋白，并在大肠杆菌中得到了表达。但是细菌表达产生的致热原致使表达 产物难以应用于临床，目的蛋白常以包涵体形式表达，致使产物纯化困难，另外原核表 达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等缺点也制约其发展。
近年来，利用毕赤酵母真核表达系统大规模生产重组蛋白越来越受到科研工作 者的青睐，它与传统的大肠杆菌表达体系相比具有经下优点(1)表达产率高，由于表 达载体利用醇氧化酶基因启动子很强，细胞生长速度快，所以该表达系统表达的外源蛋 白产量很高，其表达量比其它系统高10倍甚至100倍，这在表达量方面是一大突破。(2) 产物具有天然结构和生物活性，无需变性和复性。(3)培养基采用无机盐，配制简单、价 格低廉。(4)高稳定。由于该系统的表达载体不是以自方复制的质粒存在，而是整合在 宿主菌的染色体上，所以构建的菌株十分稳定。姚菊明等，杨树林等利用这种高表达、 高稳定、高分泌的真核表达系统表达重组类人胶原蛋白均获得高表达，但未见到其大规 模生产的报道。
目前市场销售的胶原蛋白均是从动物皮肤、肌腱等组织用酸碱水解提取的胶原 蛋白混合肽段，这些肽段的氨基酸序列与人体不完全相同，因此其生物安全性和生物相 容性在医用材料研发方面受到限制。发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述人源性胶原蛋白及其制备方法的 缺点，提供一种与人胶原蛋白对应肽段氨基酸序列完全相同的基因重组人胶原蛋白融合 肽段。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种快速、简便的基因重组人胶原 蛋白融合肽段的制备方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为基因重组人胶原蛋白融合肽段提供 一种新用途。
解决上述技术问题采用的技术方案是基因重组人胶原蛋白融合肽段的全长为 839个氨基酸，其氮端为III型人胶原蛋白908-1137位肽段共2 个氨基酸，碳端为I型 人胶原蛋白497-1104位肽段共608个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接；该 基因重组人胶原蛋白融合肽段的氨基酸序列如下
AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG
LAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTA100
GEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGP
AGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKG200
HRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPKGPAGERGSPG
PAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300
GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGE
AGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPG400
DLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAP
GAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGL500
TGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEPGPPGPAGFAG
PPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600
GSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGP
AGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPG700
QRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGRE
GAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAGKSGD800
RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD- 839
上述的基因重组人胶原蛋白融合肽段的制备方法由下述步骤组成
1、克隆I型即COL1禾Π III型即COL3人胶原蛋白基因的cDNA
从新鲜人胎盘组织中提取总RNA，以总RNA为模板，反转录得cDNA，设计 COLl禾口 COL3弓丨物，COLl弓丨物序列为
F = CTGGCGCAGATGGTGTTG
R = CCACGGTGACCCTTTATGC
产物长度为1849bp ；
COL3引物序列为
F = GAATCTGTGAATCATGCCCTAC
R = GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT
产物长度为3295bp ；
以cDNA为模板，进行PCR扩增，提取特异性DNA扩增条带，得COLl和 COL3 ；将COLl和COL3连接于pGM_T载体，转化感受态E.coli DH 5 α，涂布平板， 经蓝白斑筛选，挑选阳性pGMT-COLl和pGMT-COL3克隆，分别接种于LB培养基中， 37°C振荡过夜培养，提取这两种质粒，为下一步做好准备。
2、毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-COL3al_COLlal的构建
引物设计COL3al上游引物设计两条，引入pPIC9K自身信号肽序列 GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,进行两次扩增，各引物序列如下
COLlal引物序列为
F = GC GAATTCGGCGCAGATGGTGTTGC,酶切位点 EcoRI
R = TG GAATTCTTAGTCGCCCTGTCGCCTG,酶切位点 EcoRI
产物长度1843bp。
COL3al引物序列为
Fl = AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG
F2 = TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,酶切位点 XhoI
R TTGAATTCTGCAGGTCCTGG,酶切位点 EcoRI
产物长度722bp。
pPIC9k-COLl鉴定引物序列为
F = GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCA
R = TCGCTCTCCAGCCTTGCCG
产物长度1155bp。
分别以pGMT-COLl和pGMT_COL3质粒为模板，进行PCR扩增，提取产物， 得C03al和COlal，双酶切C03al和pPIC9K，以T4联接酶处理，得pPIC9K_C03al ； 单酶切 COlal 和 pPIC9K-C03al，以 T4 联接酶处理，得 pPIC9K-C03al_C01al ；转化感受态E.C0liDH5ci，涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，接种于LB培养基中， 37°C振荡过夜培养，提取质粒，为下一步做好准备。
3、基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌 SMDl 168-COL3al-COLlal 的构建
抽提pPIC9K-COL3al_COLlal质粒并线性化，制备毕赤酵母SMDl 168感受态 细胞，电击转化，以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，得基因重组人胶原蛋白融合肽段 毕赤酵母基因工程菌SMDl 168-COL3al_COLlal，其目标蛋白的基因序列如下
1 CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTGCGGGT AACACTGGTG CTCCTGGCAG CCCTGGAGTG
61 TCTGGACCAA AAGGTGATGC TGGCCAACCA GGAGAGAAGG GATCGCCTGG TGCCCAGGGC
121 CCACCAGGAG CTCCAGGCCC ACTTGGGATT GCTGGGATCA CTGGAGCACG GGGTCTTGCA
181 GGACCACCAG GCATGCCAGG TCCTAGGGGA AGCCCTGGCC CTCAGGGTGT CAAGGGTGAA
241 AGTGGGAAAC CAGGAGCTAA CGGTCTCAGT GGAGAACGTG GTCCCCCTGG ACCCCAGGGT
301 CTTCCTGGTC TGGCTGGTAC AGCTGGTGAA CCTGGAAGAG ATGGAAACCC TGGATCAGAT
361 GGTCTTCCAG GCCGAGATGG ATCTCCTGGT GGCAAGGGTG ATCGTGGTGA AAATGGCTCT
421 CCTGGTGCCC CTGGCGCTCC TGGTCATCCA GGCCCACCTG GTCCTGTCGG TCCAGCTGGA
481 AAGAGTGGTG ACAGAGGAGA AAGTGGCCCT GCTGGCCCTG CTGGTGCTCC CGGTCCTGCT
541 GGTTCCCGAG GTGCTCCTGG TCCTCAAGGC CCACGTGGTG ACAAAGGTGA AACAGGTGAA
601 CGTGGAGCTG CTGGCATCAA AGGACATCGA GGATTCCCTG GTAATCCAGG TGCCCCAGGT
661 TCTCCAGGCC CTGCTGGTCA GCAGGGTGCA ATCGGCAGTC CAGGACCTGC AGAATTCGGC
721 GCAGATGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT
781 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC
841 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT
901 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT
961 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG
1021 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA
1081 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT
1141 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA
1201 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC
1261 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA
1321 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT
1381 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT
1441 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT
1501 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC
1561 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT
1621 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTGCTGGCTTTGC TGGCCCCCCT
1681 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT
1741 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT
1801 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT
1861 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT
1921 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA
1981 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT
2041 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG
2101 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC
2161 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT
2221 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT
2281 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT
2341 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC GTGGTGCCCC TGGCCCCGTT
2401 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT
2461 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT
2521 GAGACAGGCG AACAGGGCGA CTAAGAATTC
4、制备基因重组人胶原蛋白融合肽段
(1)发酵
以步骤(3)构建的基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌 SMD1168-COL3al-COLlal为原始菌种，涂布YPD平板获得单菌落，扩繁单菌落分装为 甘油菌种保存；每次取甘油菌种，接种于5mL种子YPD培养基中，30°C振荡培养20 M小时，转接于400ml BMGY培养基中，30°C振荡培养至OD600达10 12，作为一级种 子；将一级种子接入装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，30°C、pH值为5.0、DO 20% 30%,培养16-20小时，作为二级种子；将二级种子转接入装有30L FBS培养基的50L发 酵罐中；生长培养18 20小时，30°C、pH值为5.0、DO 20% 30%，补加甘油至发酵液内的菌体湿重达到150mg，饥饿1-2小时；驯化培养9小时，每三小时为一个驯化时 间段，30°C、pH值为5.0、DO 20% 30%，第一段每5分钟补加甲醇lmL，第二段每5 分钟补加甲醇2mL，第三段每5分钟补加甲醇3mL;诱导培养72小时，30°C、pH值为 5.0、DO 20% 30%，视DO值提高甲醇流加速率并维持补料速度在5_10.9ml/L/h进行 发酵，至DO值浮动缩小至5% 8%，发酵结束。
(2)纯化
取发酵液离心除去酵母细胞，得发酵上清液；用截留量为20000的聚砜中空纤 维超滤浓缩发酵上清液至原发酵上清液体积的20%，得超滤浓缩液；用凝胶过滤法脱除 超滤浓缩液中的无机盐，得脱盐液；用DAEA阴离子交换柱处理脱盐液，以0.02M()L NaCI水溶液为平衡液，样品溶液PH为8-9，洗脱液PH5-6，NaCIO,5MOL ；分段收集洗 脱液，电泳，色谱法检测纯度，得纯度为85%以上的溶液；用截留量为20000的聚砜中 空纤维超滤浓缩至质量浓度为1% 5%。
(3)制备基因重组人胶原蛋白融合肽段
冷冻干燥，得基因重组人胶原蛋白融合肽段。
基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途。其使用方法如下
基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途，所制备的化妆品由下述 质量配比的原料制成
基因重组人胶原蛋白融合肽段8 12g
透明质酸0.3 0.6g
甘油20 30g
去离子水1000g。
所制备的化妆品由下述最佳质量配比的原料制成
基因重组人胶原蛋白融合肽段IOg
透明质酸0.5g
甘油25g
去离子水1000g。
采用本发明方法所制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段，与动物来源的胶原蛋 白相比较，其生物相容性和生物安全性均佳。基因重组人胶原蛋白融合肽段经致敏性试 验，所试验的基因重组人胶原蛋白融合肽段无致敏性。以基因重组人胶原蛋白融合肽段 为原料制备的化妆品，在未开封的情况下存放于4度冰箱，半年内不变质，开封后每天 取适量使用，一周内不变质，具有良好的保湿作用。基因重组人胶原蛋白融合肽段可作 为美容化妆品使用，根据需要配制成不同浓度的化妆品。


图1是实施例lcol3和coll基因的PCR产物电泳图。
图2是实施例1重组质粒pGM-T-COLl和pGM-T_COL3的PCR鉴定结果。
图3是实施例lpGM-T_COL3的5’端部分测序图谱。
图4是实施例lpGM-T-COLl的3’端部分测序图谱。
图5是实施例1重组表达载体pPIC9K-COL3al_COLlal的构建策略路线图。
图6是实施例ICOLlal和COL3al序列的PCR产物电泳结果图。
图7是实施例lpPIC9K-COL3al_COLlal质粒的PCR鉴定电泳图。
图8是实施例lpPIC9K-COL3al_COLlal质粒的酶切鉴定电泳图。
图9是实施例lpPIC9K-COL3al_COLlal重组质粒5’端测序结果图谱。
图10是实施例lpPIC9K-COL3al_COLlal重组质粒3’端测序结果图谱。
图11是实施例ISMDl 168-COL3al_COLlal重组子的PCR鉴定电泳图。
图12是实施例1基因重组人蛋白质融合肽段的SDS-PAGE分析图。
图13是实施例1方法制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段的电泳检测图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施 例。
实施例1
基因重组人胶原蛋白融合肽段的全长为839个氨基酸，其氮端为III型人胶原蛋 白908-1137位肽段共2 个氨基酸，碳端为I型人胶原蛋白497-1104位肽段共608个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接； 序列如下该基因重组人胶原蛋白融合肽段的氨基酸
AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARG
LAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTA100
GEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGP
AGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKG200
HRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPKGPAGERGSPG
PAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300
GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGE350
AGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPG400
DLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAP
GAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGL500
TGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEPGPPGPAGFAG
PPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600
GSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGP
AGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPG700
QRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGRE
GAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAGKSGD800
RGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGD-839
上述的基因重组人胶原蛋白融合肽段的制备方法如下
1、克隆I型(COLl)和III型(COL3)人胶原蛋白基因的cDNA
1. IRNA 提取
(1)取新鲜人胎盘在液氮中研磨，将研碎的组织放入盛ImLTrizol的离心管中， 上下振荡5η ι，将样品在15-30°C放置15η ι，使核酸蛋白复合物分离。
(2)在高速冷冻离心机中4°C 10,OOOXg离心ΙΟη ι，吸取上清液。
(3)加0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3η ι。
10,000\§离心151^11。样品分为黄色有机相、中间层和无色水相三层， RNA主要在水相中，将水相转移到新管中。
(5)加入0.5mL异丙醇，混勻，室温放置ΙΟη ι。
(6)4°〇10,000\§离心101^11，弃上清，离心后在管侧和管底可见RNA胶状沉 淀；
(7)加ImL体积浓度为75%乙醇(用0.1 % DEPC处理水配制)洗涤沉淀。
(8)4°C 7500Xg 离心 5min，弃上清液。
(9)室温放置晾干，按RNA提取量的多少，力卩20-100 μ L无RNase的DEPC处 理水，室温溶解后，-70°C保存。
(IO)RNA提取完成后，于1 %的琼脂糖凝胶上进行检测。
IJcDNA的反转录
以上述所得总RNA为模板，按下述方法进行反转录，得cDNA。
取溶解于DEPC 水中的总 RNA 5 μ L，0.2 μ g/μ L Random hexamers primer IuL, DEPC水6yL，70 °C,孵育5η ι，置冰上冷却后加入下列试剂5XBuffer 4 μ L，10mmol/L dNTP Mixture 2 μ L，20u/ μ L RNA inhibitor 1 μ L, 25°C，孵育 5η ι， 200u/ μ L 反转录酶 1 μ L，总体积 20 μ L。在 PTC-100 Thermal Cycler (BIO-RAD) PCR 仪 中，25°C，IOmin, 42°C反应，60η ι，70°C, ΙΟη ι 终止反应，冰上冷却。
1.3引物的设计
根据GenBank已发表的人胶原蛋白I型和III型基因序列，按照引物设计原则， 利用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件，设计COLl和COL3基因PCR扩增引物。引 物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。其序列见表1。
表ICOLl和COL3的PCR引物参数
基因名称PCR引物序列PCR产物长度COLlF:CTGGCGCAGATGGTGTTG1849bpR:CCACGGTGACCCTTTATGCC0L3F:GAATCTGTGAATCATGCCCTAC3295bpR:GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT禾口 COL3的基因
1.4.1COL1 和 COL3 的 PCR 扩增
25 μ L 反应体系中含有13.3 μ L 灭菌的二 蒸水、2.5 μ L 10XPCR buffer, 3.5 μ L 2m mol/L dNTP Mix, 2.5 μ L Mg2+，1 μ L 10 μ mol/L Primer I，1 μ L 10 μ mol/ L Primer II，0.2 μ L 0.5U/ μ L Taq 酶，IyL cDNA 模板。反应条件为95 °C 5min, 94°C 30s, 610C 30s, 72°C 2.5min, 30 个循环，72°C ΙΟη η，4°C ΙΟη η。利用 PTC-100 Thermal Cycler (BIO-RAD) PCR 仪进行扩增。
COLl和COL3的PCR扩增结果见图1。
1.4.2COL1和COL3的扩增片段的分离和克隆
利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶 上回收特异性条带，回收产物连接于pGM-T载体，转化感受态E.coli DH 5 α，涂布平 板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆接种于IOmL LB培养基中，37°C振荡过夜培养。用质 粒微量提取试剂盒抽提质粒DNA(碱裂解法)，得pGM-T-COLl和pGM-T_COL3两个 重组质粒。两个重组质粒的PCR扩增鉴定结果见图2。
1.4.3 重组质粒 pGM-T-COLl 和 pGM-T_COL3 的测序鉴定
委托测序公司对两个重组质粒进行基因测序，测序结果与GenBank中的已知人I 型和III型胶原蛋白序列作同源性比较，同源性均为100%。测序结果见图3和图4。
2、毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-COL3al_COLlal的构建
2.1重组表达载体的构建策略路线图见图5
2.2引物设计
根据引物设计的策略，利用DNAMAN和Primer 5.0软件设计COLlal和COL3al 基因，同时为了后期蛋白序列的切割，COL3al上游引物设计两条，弓丨入pPIC9K自身信 号肽序列GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，进行两次扩增，为了证明基因插入的正确 性，设计了特异性鉴定引物，9k_COLl。各序列见表2。
表2COLlal 和 COL3al 的 PCR 引物参数
基因名称PCR引物序列酶切位点PCR产物长度COLlalF GC 6WmiGCGCAGATGGTGTTGC R TG6^77CTTAGTCGCCCTGTCGCCTGEcoR I EcoR I1843bpCOUalFlAGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG F2TCTtTO^AAAAGAGAGGCTGAAGCT R: TTi^TTCTGCAGGTCCTGGXhol EcoR I722bp9k-COLlFGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCA RTCGCTCTCCAGCCTTGCCG 、无1155bp16
2.3PCR 扩增 COLlal 和 COL3al 序列
分别以pGM-T-COLl和pGM-T_COL3质粒为模板，进行PCR扩增
ddH2013.3 μ L
10 X Reaction Buffer 2.5 μ L
dNTP Mixture (2.5mM each) 3.5 μ L
pGMT-C01/pGMT-C030.1 μ L


Primer F (20 μ Μ) Primer R (20 μ Μ) Taq酶总体系25 μ L 反应条件分别为 colal 95 °C 5min 94°C 30S1 μ L 1 μ L 0.2 μ L61°C 30 S 72°C 2. 5min 72 °C IOmin}co3al95 °C 5min 94°C 30S30 cycles60 0C 30 S 72 0C 40S30 cycles
72 °C IOmin72 °C IOmin
COLlal和COL3al序列的PCR产物电泳结果见图6。
由图可见，分别在1843bp和722bp处有一条特异DNA条带，与预期大小一致。 利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶上回收特 异性条带，得COLlal和COL3al序列，-20°C保存待用。


2.4COLlal和COL3al序列的酶切及回收 单酶切COLlal序列双酶切COL3al序列ddH20 135 μ LddH20130 μ LIOXbufferH 20 μ LIOXbufferH 20 μ LCOLlal (150ng/μ L) 40 μ L EcoRI 5yLEcoRICOL3al(150ng/yL) 40 μ L 5 μ L
总体系200 PL

总体系200 μ LXhoI5 μ L
上述试剂加好后，混勻，37°C水浴消化1.5h_2.0h，终止反应前先取出5μ L以 0.7%琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说 明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶上回收特异性条带，-20°C保存待用。
2.5质粒pPIC9K的转化及提取
(1)取冷冻的DH5a感受态细胞一管，放于冰上解冻，立即加入质粒 pPIC9K(<50ng),手指轻弹使其混合，在冰中放置30分钟。
(2) 42 V水浴热激恰好90秒，不要摇动试管。
(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。
(4)加入800 μ L无抗生素的LB液体培养基，混勻，37°C温育50分钟。
(5)吸取100-200 μ L菌液，涂于含有卡那霉素(50ug/mL)的固体LB板上。
(6)将平板置于室温待液体被吸收后，倒置于37°C培养箱中，培养12-18小时。
(7)挑选单菌落接种于含有卡那霉素(50ug/mL)的液体LB培养基中，摇床培 养，37°C过夜。
(8)利用质粒提取试剂盒操作说明提取pPIC9K质粒。
2.6pPIC9K质粒的Xho I和EcoR I双酶切及回收
ddH2064 μ L
IOXbufferH20 μ L
pPIC9K (200ng/ μ L) 35 μ L
Xho I5 μ L
EcoR I5 μ L
利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶 上回收特异性条带，-20°C保存待用。
2.7pPIC9K 与 COL3al 的连接
COL3al (lOOng/ μ L) IlyL
pPIC9K (200ng/ μ L) 5 μ L
buffer2 μ L
T4DNA 连接酶2 μ L
上述连接体系充分混勻后，于16°C连接2小时。得pPIC9K_COL3al，其转化和 提取方法同上述2.5项所述。
pPIC9K-co3al质粒的酶切鉴定
总体系200 μ L
总体系20 μ L
ddH20
IOXbufferH9μ L 1.5μ L
pPIC9K-co3al
XhoI
EcoR I
_
.总体系15 μ L2.5 μ L 1 μ L 1 μ L
以上酶切体系在37°C水浴中反应2小时后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定连 接正确的质粒pPIC9K-co3al。
2.8pPIC9K-co3al 质粒的 EcoR I 单酶切
对双酶切鉴定为连接正解的质粒进行大量提取，并进行EcoRI单酶切。
上述试剂加好后，混勻，37°C水浴消化Zh，终止反应前先取出5μ L以0.7%琼 脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全，之后进行单酶切后的pPIC9K-C03al的回收。
2.9pPIC9K-co3al 的去磷酸反应
为了防止pPIC9K-C03al质粒单酶切后的自连，必须对其进行脱磷反应。
(1)在微量离心管中配制下列反应液，全量定容到50 μ L。
_
pPIC9K-co3al20 μ 1
10 X Alkaline Phosphatase Buffer 5 μ 1
CIAP (10 30U/ U 1)2 μ 1
dH20 23 μ 1
(2)37°〇或50°〇反应30分钟。
(3)苯酚/氯仿/异戊醇05 24 1)抽提2次。
(4)氯仿/异戊醇04 1)抽提1次。
(5)添加 5 μ 1 的 3M NaOAC。
(6)添加125 μ 1的倍量)冷乙醇，在_20°C下保冷30 60分钟。
(7)离心分离回收沉淀，用200 μ 1的70%冷乙醇洗净后，减压干燥。
(8)用20 μ 1以下的TE Buffer溶解沉淀。
2.10pPIC9K-co3al 与 COLlal 的连接
COLlal5μ L
pPIC9K-COL3al (50ng/ μ L) IlyL
buffer2 μ L
T4DNA 连接酶2 μ L
ddH20
IOXbufferH
pPIC9K-co3al
EcoRI
_
‘总体系200 μ L145 μ L 20 μ L 30 μ L 5 μ L
总体系20 μ L
上述连接体系充分混勻后，于16°C连接2小时。得pPIC9K-COL3al_COLlal， 其转化和提取方法同上述2.5项所述。
2.11pPIC9K-COL3al-COLlal 质粒的鉴定
2.11.1pPIC9K-COL3al-COLlal 质粒的 PCR 鉴定
鉴定pPIC9K-COL3al_COLlal质粒构建是否正确，设计上游引物源自pPIC9K 载体信号肽部分5’ -GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCA-3‘，下游引物源自COLlal 序列中的一段5’ -TCGCTCTCCAGCCTTGCCG-3，，如果连接正确，即可扩增出一条 长约1155bp的片段。其鉴定结果见图7。
从图7可见，1、3、5、6、8、11号质粒在1155bp左右扩增出一条特异DNA条带，达到预期目的。
2.11.2pPIC9K-COL3al-COLIal 质粒的酶切鉴定
根据pPIC9K-COL3al_COLlal重组质粒的酶切位点分析，对初步筛选出的重组 菌落经小量提取质粒DNA后，选用EcoR I、BamH I进行酶切鉴定，如果连接正确，用 EcoRI即可切出一条长度约1800bp左右的片段，而用BamHI即可切出一条2000bp左右 的片段。
ddH2010 μ LddH2010 μ L
IOXbufferH 1.5 μ LIOXbufferH1.5 μ L
质粒(150ng/yL)2.5yL 质粒(150ng/yL) 2.5 μ L
EcoRI 1 μ L BamHI1 μ L
以上两个酶切体系在37°C水浴中反应2小时后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，其 结果见图8。由图8可见连接正确。
2.11.3pPIC9K-COL3al-COLIal质粒的目标基因测序鉴定
经PCR和酶切鉴定后，对确定连接正确的pPIC9K-COL3al_COLlal重组质粒送 往上海生工生物技术有限公司进行序列测定。测序结果见图9、10。
测序结果显示，COL3al_COLlal基因序列插入正确，未出现移码突变。
3、基因重组人胶原蛋白融合肽段比赤酵母基因工程菌 (SMD1168-COL3al-COLlal)的构建
3.1pPIC9K-COL3al-COLlal 质粒的线性化
ddH201275 μ L
10 X buffer H160 μ L
pPIC9K-co3al-colal (200ng/ μ L) 150 μ L
Sail15 μ L
上述试剂加好后，混勻，37°C水浴消化5h，终止反应前先取出5μ L以0.7%琼 脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全。之后，用质粒提取试剂盒对线性化质粒进行质粒大
总体系 15 μ L总体系15 μ L
总体系1500 μ L提。
3.2毕赤酵母感受态细胞的制备
(1)挑取酵母单菌落，接种至含有5mL YPD培养基试管中，30°C、250-300rpm培养过夜。
(2)取50μ L的培养物接种至含有50mL新鲜培养基的300mL三角瓶中， 28-300C > 250-300rpm 培养过夜，至 OD600 值达到 1.1-1.3。
(3)将细胞培养物于4°C，1500g离心5η ι，用50mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。
(4)按步骤( 离心，用25mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。
(5)按步骤(3)离心，用20mL的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重 ；塁、ο
(6)按步骤(3)离心，用0.3mL的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重 悬，其终体积约为0.5mL。
(7)分装为 80 μ L —份，-70°C保存。
3.3毕赤酵母的电转化
(1)将浸泡在70%乙醇中的电转化杯取出，用无水乙醇冲洗三遍，于灭过菌的 超净台中晾干残余乙醇。
(2)将电转化杯转至冰中预冷10分钟。
(3)将5-20 μ g的线性化DNA溶解在5_10 μ L灭菌双蒸水中，毕赤酵母感受态 细胞混勻，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。
(4)电击，电压1.5kV;电容25yF;电阻200 Ω;电击时间为4-lOmsec。
(5)电击完毕后，加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体混勻，转至 1.5mL离心管中。
(6)将菌体悬液涂布于MD平板上，每100 μ L-200 μ L涂布一块平板。
3.4多拷贝插入SMD1168-COL3al_COLlal重组子的筛选
(1)在生长有转化子的MD平板表面加入2mL灭菌双蒸水，然后用无菌三角涂布 器在His+转化子表面轻轻涂刮，并转移到50mL离心管中。
(2)加入20mL灭菌双蒸水稀释，混勻后测定其OD600值(1 OD6OO = 5X107cells/mL)。
(3)取IO5个细胞涂布于含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，倒置，30°C培养 72h-96ho
(4)在无菌96孔板中每孔加入200 μ LYPD液体培养基。
(5)用接菌牙签往步骤(4)分别接入在含有0.5mg/mL G418的YPD平板上获得 的转化子，混勻，于30°C培养48h。
(6)4Sh后，取一块新的无菌96孔板，每孔加入190 μ L YPD液体培养基。在相 应孔中加入 ο μ L第一块96孔板所得的培养物，于30°C培养24h。
(7)24h后，再取一块新的无菌96孔板，每孔加入190 μ L YPD液体培养基。在 相应孔中加入 ο μ L第二块96孔板所得的培养物，于30°C培养24h。
(8) 24h后，分别从第三块96孔板中取出1 μ L分别点在含有1 .Omg/mL和4.0mg/mLG418的YPD平板上，于30°C继续培养％h-120h。酵母SMDl 168转化子若 能在含高浓度G418的培养基上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因，即有多个 pPIC9K-COL3al-COLlal片断转化进了酵母SMD1168并同源重组插入了酵母SMD1168 的染色体上。经过这一步筛选得到的高拷贝的重组酵母SMD1168-COL3al-COLlal将更 有可能实现目的蛋白的高效表达。
3.4SMD1168-COL3al-COLlal 重组子的 PCR 鉴定
挑取待测酵母转化子，按下述方法进行PCR模板的预制。
(1)挑取高拷贝转化子的单菌落，置于装有200uL去离子水的1.5mL离心管中， 2000g离心5η ι，弃上清。
(2)将装有菌体的离心管置于微波炉加热2η ι。
(3)转移到 _80°C冰冻 5η ι。
(4)再置于微波炉中档加热2η ι。
(5)重复在_80°C冰冻Smin和微波炉中档加热2η ι。
(6)加入30gL去离子水，于IOOOOg离心Ιη ι，吸取上清作为PCR反应的模板。
(7)使用9k_coll鉴定引物，进行PCR扩增。
(S)PCR结束后，进行琼脂糖电泳检测，在1155bp左右出现条带的，可以初步 确定为阳性转化子。其结果见图11。
经过G418不同浓度的反复筛选，最终在高浓度4mg/mL条件下筛选到9个高拷 贝重组子，并对其进行菌落PCR鉴定，结果显示，9个重组子都能扩增出约1155bp左右 的片段，说明重组子筛选结果正确。
3.5 重组酵母 SMD1168-COL3al_COLlal 的诱导表达
(1)分别挑选单菌落，置于装有30mL BMGY培养基的150mL三角瓶中，于 28-30 °C、250-300rpm 培养至 OD600 为 2-6。
(2)室温下1500-3000g离心5η ι，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600为1.0左右。
(3)将所得的菌液置于500mL的三角瓶中，用四层纱布封口，于28_30°C、 250-300rpm的摇床上继续生长。
(4)每24h向培养基中添加无水甲醇至终体积浓度为1 %。
(5)按时间点分别取菌液样品，取样量为IOmL,置于50mL离心管中，常温， 12000rpm离心5η ι，收集上清，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一 般取12h、24h、36h、48h、60h 和 72h。
(6)待检测样品于-70°C保存备用。
3.6基因重组人蛋白质融合肽段的SDS-PAGE分析
(1)玻璃板清洗、晾干后安装。
(2)灌注分离胶，在一干净小烧杯中依次加入灭菌水l.lmL，1.5mol/L Tris · Cl(pH8.8)1.3mL, 10% SDS 50 μ L, 10% 过硫酸铵 50 μ L，30% 丙烯酰胺溶液 2.5mL，TEMED 2 μ L，混勻后立即灌注于玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间 (梳子的齿长再加1cm)，小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层灭菌水。
(3)分离胶聚合完全后(30min-60min)，倾出覆盖液体，用滤纸吸净残留液体。22
(4)灌注5%的浓缩胶，在一干净小烧杯中依次加入灭菌水1.4mL，1.0mol/L Tris · Cl (pH6.8)250yL, 10% SDS 20 μ L, 10% 过硫酸铵 20 μ L，30% 丙烯酰胺溶液 330 μ L，TEMED 2 μ L，混勻后立即在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，小心插入梳子， 避免产生气泡。再加入浓缩胶以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
(5)样品的处理，取蛋白样品加入等体积的含DTT的2X SDS凝胶加样缓冲液， 在100°C加热IOmin以使蛋白质变性。
(6)浓缩胶完全聚合后(30min)，小心移出梳子，立即用灭菌水洗涤加样槽以除 去未聚合的丙烯酰胺。必要时，用注射器针头把浓缩胶上加样槽之间的齿弄直。把凝胶 固定于电泳装置上，槽内外各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
(7)按预定顺序加样，每样品加15 μ L-20 μ L。
(8)将电泳装置与电源相连，凝胶上所加电压为100V。当染料前沿进入分离胶 后，把电压提高到150V，继续电泳直到嗅酚蓝到达分离胶底部，然后关闭电源。
(9)从电泳装置上卸下玻璃板，取出凝胶。
(10)用至少5倍体积的染色液浸泡凝胶，平缓摇动于室温染色1小时以上。
(11)脱色，把胶用去离子水冲洗3遍，然后置微波炉上加热5分钟。
(12)取出凝胶，使用凝胶成像仪进行图像捕捉和分析。结果见图12:
4、制备基因重组人胶原蛋白融合肽段
4.1 发酵
以基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌 SMD1168-COL3al-COLlal为原始菌种，涂布YPD平板获得单菌落，扩繁单菌落分装为 甘油菌种保存；每次取甘油菌种，接种于5mL种子YPD培养基中，30°C振荡培养20 M小时，转接于400ml BMGY培养基中，30°C振荡培养至OD600达10 12，作为一级种 子；将一级种子接入装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，30°C、pH值为5.0、DO 20% 30%,培养16-20小时，作为二级种子；将二级种子转接入装有30L FBS培养基的50L发 酵罐中；生长培养18 20小时，30°C、pH值为5.0、DO 20% 30%，补加甘油至发 酵液内的菌体湿重达到150mg，饥饿1-2小时；驯化培养9小时，每三小时为一个驯化时 间段，30°C、pH值为5.0、DO 20% 30%，第一段每5分钟补加甲醇lmL，第二段每5 分钟补加甲醇2mL，第三段每5分钟补加甲醇3mL;诱导培养72小时，30°C、pH值为 5.0、DO 20% 30%，视DO值提高甲醇流加速率并维持补料速度在5_10.9ml/L/h进行 发酵，至DO值浮动缩小至5% 8%，发酵结束。
4.2 纯化
取发酵液离心除去酵母细胞，得发酵上清液；用截留量为20000的聚砜中空纤 维超滤浓缩发酵上清液至原发酵上清液体积的20%，得超滤浓缩液；用凝胶过滤法脱除 超滤浓缩液中的无机盐，得脱盐液；用DAEA阴离子交换柱处理脱盐液，以0.02M()L NaCI水溶液为平衡液，样品溶液PH为8-9，洗脱液PH5-6，NaCIO,5MOL ；分段收集洗 脱液，电泳，色谱法检测纯度，得纯度为85%以上的溶液；用截留量为20000的聚砜中 空纤维超滤浓缩至质量浓度为 5%。电泳检测结果见图13。
4.3制备基因重组人胶原蛋白融合肽段
冷冻干燥，得基因重组人胶原蛋白融合肽段。
实施例2
采用本发明实施例1制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段用于制备化妆品，该 化妆品由下述质量配比的原料制成
基因重组人胶原蛋白融合肽段IOg
其制备方法如下
取干粉状基因重组人胶原蛋白融合肽段，透明质酸，甘油，溶解于去离子水 中，调PH值至6.5 7.5，在无菌环境下用0.22um滤膜过滤，得无色透明的液体，以无 菌操作法封装于5ml的玻璃瓶或塑料瓶中，4°C冰箱储存。
实施例3
采用本发明实施例1制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段用于制备化妆品，该 化妆品由下述质量配比的原料制成
基因重组人胶原蛋白融合肽段8g
透明质酸0.3g
甘油20g
去离子水IOOOg0
其制备方法与实施例2相同。
实施例4
采用本发明实施例1制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段用于制备化妆品，该 化妆品由下述质量配比的原料制成
基因重组人胶原蛋白融合肽段 12g
透明质酸0.6g
甘油30g
去离子水IOOOg0
其制备方法与实施例2相同。
为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的基因重组人胶 原蛋白融合肽段进行了致敏性试验，试验情况如下
试样质量分数为基因重组人胶原蛋白水溶液。
阳性对照质量分数为0.1甲醛水溶液。
阴性对照生理盐水。
实验动物自色豚鼠30只，雌雄各半，体重^0 300g，试验前M小时用电 动蒯须剃须刀将动物脊柱两侧击毛，每侧的去毛面积为3X3cm2。
1、试验方法
动物分组将豚鼠按性别、体重随机分成3组.每组10只.第一组为试验组，第 二组为阳性对照组，第三组为阴性对照组。
致敏接触取1平方厘米纱布块，在试样中侵泡5分钟，作为斑贴物，将其半封 闭固定在动物背侧去毛区，持续六小时，去掉斑贴物，观察记录各组动物激发部位的皮
透明质酸
甘油
去离子水0.5g25gIOOOg0肤有无红斑及水肿等现象，每天一次，连续六天，按标准进行评分，并算出致敏率。
结果判断与评价试验结果以动物皮肤反应强度和致敏阳性率表示。皮肤反应 强度评分按下列两种标准进行。
(1)红斑形成很淡的红斑(勉强可见)为1分；轻度边界清晰的红斑为2分；中 度红斑(鲜红一深红)为3分；重度红斑(深红一紫红，且有焦痂形成)为4分。
(2)水肿形成很轻微的水肿(几乎观察不到)为1分；轻度水肿(边缘明显高出 皮面)为2分；中度水肿(肿胀高出皮面约Imm)为3分·’重度水肿(肿胀高出皮面Imm 以上，范围超过斑贴区)为4分。
总积分等于红斑分与水肿分之和，并依此确定动物有无过敏反应。致敏阳性 率是阳性动物数与合计动物数比值的百分率，根据此百分率对化学物质致敏强度进行分 级。致敏强度分级见表3。
表3致敏强度分级
致敏率(％)等级致敏强度0-8I弱致敏性9-28II轻致敏性28-64III中致敏性64-80IV强致敏性81-100V极强致敏性
试验结果见表4.。
表4致敏性s试验结果表
组别动物数反应 类型观察时间及反应强度评分组内 总积分平均 反应值致敏率致敏强度Id2d3d4d5d6d阳性 组10红斑1/11/32/13/43/43/4400.8100%中致敏性水肿1/21/43/43/43/53/5601.1试验 组10红斑0/00/00/00/00/00/0000无水肿0/00/00/00/00/00/0000无阴性 组10红斑0/00/00/00/00/01/1100无水肿0/00/00/00/00/00/0000无
注1/3 = 1分/3只，即得1分者有3只
从表4可以看出，试验组未出现1例致敏反应的动物，说明所试验的基因重组人 胶原蛋白融合肽段无致敏性，至于阴性组有一例出现弱致敏反应，可能因为其它原因造25成，而非生理盐水有致敏性。
权利要求
1.一种基因重组人胶原蛋白融合肽段，其特征在于它的全长为839个氨基酸， 其氮端为III型人胶原蛋白908-1137位肽段共229个氨基酸，碳端为I型人胶原蛋白 497-1104位肽段共608个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接；该基因重组人 胶原蛋白融合肽段的氨基酸序列如下AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG LAGPPGMPGP RGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100 GEPGRDGNPG SDGLPGRDGS PGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP AGKSGDRGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGP QGPRGDKGET GERGAAGIKG 200 HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FGADGVAGPK GPAGERGSPG PAGPKGSPGE AGRPGEAGLP GAKGLTGSPG SPGPDGKTGP PGPAGQDGRP 300 GPPGPPGARG QAGVMGFPGP KGAAGEPGKA GERGVPGPPG AVGPAGKDGE AGAQGPPGPA GPAGERGEQG PAGSPGFQGL PGPAGPPGEA GKPGEQGVPG 400 DLGAPGPSGA RGERGFPGER GVQGPPGPAG PRGANGAPGN DGAKGDAGAP GAPGSQGAPG LQGMPGERGA AGLPGPKGDR GDAGPKGADG SPGKDGVRGL 500 TGPIGPPGPA GAPGDKGESG PSGPAGPTGA RGAPGDRGEP GPPGPAGFAG PPGADGQPGA KGEPGDAGAK GDAGPPGPAG PAGPPGPIGN VGAPGAKGAR 600 GSAGPPGATG FPGAAGRVGP PGPSGNAGPP GPPGPAGKEG GKGPRGETGP AGRPGEVGPP GPPGPAGEKG SPGADGPAGA PGTPGPQGIA GQRGVVGLPG 700 QRGERGFPGL PGPSGEPGKQ GPSGASGERG PPGPMGPPGL AGPPGESGRE GAPGAEGSPG RDGSPGAKGD RGETGPAGPP GAPGAPGAPG PVGPAGKSGD 800 RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD- 839
2.—种权利要求1基因重组人胶原蛋白融合肽段的制备方法，其特正在于该方法由下 述步骤组成(1)克隆I型即COLl和III型即COL3人胶原蛋白基因的cDNA 从新鲜人胎盘组织中提取总RNA，以总RNA为模板，反转录得cDNA，设计COLl 禾口 COL3弓丨物，COLl弓丨物序列为 F = CTGGCGCAGATGGTGTTG R = CCACGGTGACCCTTTATGC 产物长度为1849bp ； COL3引物序列为 F = GAATCTGTGAATCATGCCCTAC R = GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT 产物长度为3295bp ；以cDNA为模板，进行PCR扩增，提取特异性DNA扩增条带，得COLl和COL3 ； 将COLl和COL3连接于pGM-T载体，转化感受态E.coli DH 5 α，涂布平板，经蓝白斑 筛选，挑选阳性pGMT-COLl和pGMT-COL3克隆，分别接种于LB培养基中，37°C振荡 过夜培养，提取这两种质粒，为下一步做好准备；⑵毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-COL3al_COLlal的构建 引物设计COL3al上游引物设计两条，引入pPIC9K自身信号肽序列GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,进行两次扩增，各引物序列如下 COLlal引物序列为F = GC GAATTCGGCGCAGATGGTGTTGC,酶切位点 EcoRI R = TG GAATTCTTAGTCGCCCTGTCGCCTG,酶切位点 EcoRI 产物长度1843bp ； COL3al引物序列为Fl = AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTGF2 = TCT CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,酶切位点 Xho IR TT GAATTCTGCAGGTCCTGG,酶切位点 EcoRI产物长度722bp ；pPIC9k-COLl鉴定引物序列为F = GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAR = TCGCTCTCCAGCCTTGCCG产物长度1155bp ；分别以pGMT-COLl和pGMT-COL3质粒为模板，进行PCR扩增，提取产物，得 C03al和COlal，双酶切C03al和pPIC9K,以T4联接酶处理，得pPIC9K_C03al ；单 酶切COlal和pPIC9K-C03al，以T4联接酶处理，得pPIC9K-C03al_C01al ；转化感受^ E.coli DH 5 α ,涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，接种于LB培养基中，37°C 振荡过夜培养，提取质粒，为下一步做好准备；(3)基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3al_COLlal 的构建抽提pPIC9K-COL3al_COLlal质粒并线性化，制备毕赤酵母SMD1168感受态细 胞，电击转化，以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，得基因重组人胶原蛋白融合肽段毕 赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3al_COLlal，其目标蛋白的基因序列如下·1 CTCGAGAAAA GAGAGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTGGTG CTCCTGGCAG CCCTGGAGTG·61 TCTGGACCAA AAGGTGATGCTGGCCAACCA GGAGAGAAGG GATCGCCTGG TGCCCAGGGC·121 CCACCAGGAG CTCCAGGCCC ACTTGGGATT GCTGGGATCA CTGGAGCACG GGGTCTTGCA·181 GGACCACCAG GCATGCCAGGTCCTAGGGGA AGCCCTGGCC CTCAGGGTGT CAAGGGTGAA·241 AGTGGGAAAC CAGGAGCTAA CGGTCTCAGT GGAGAACGTG GTCCCCCTGG ACCCCAGGGT·301 CTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCTGGTGAA CCTGGAAGAG ATGGAAACCC TGGATCAGAT·361 GGTCTTCCAG GCCGAGATGG ATCTCCTGGT GGCAAGGGTG ATCGTGGTGA AAATGGCTCT·421 CCTGGTGCCC CTGGCGCTCC TGGTCATCCA GGCCCACCTGGTCCTGTCGG TCCAGCTGGA·481 AAGAGTGGTG ACAGAGGAGA AAGTGGCCCT GCTGGCCCTG CTGGTGCTCC CGGTCCTGCT·541 GGTTCCCGAG GTGCTCCTGGTCCTCAAGGC CCACGTGGTG ACAAAGGTGA AACAGGTGAA·601 CGTGGAGCTG CTGGCATCAA AGGACATCGA GGATTCCCTG GTAATCCAGG TGCCCCAGGT·661 TCTCCAGGCC CTGCTGGTCA GCAGGGTGCA ATCGGCAGTC CAGGACCTGC AGAATTCGGC·721 GCAGATGGTGTTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT·781 GGCCCCAAAG GATCTCCTGGTGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC·841 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCCTGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT·901 CCCGCCGGTCAAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT·961 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG·1021 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA·1081 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCCTGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT·1141 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA·1201 CCTGGTGAACAGGGTGTTCCTGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC·1261 GAGAGAGGTTTCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA·1321 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT·1381 CCCGGTAGCCAGGGCGCCCCTGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT·1441 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT·1501 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC·1561 CCTGGTGACA AGGGTGAAAGTGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT·1621 GCCCCCGGAGACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT·1681 GGTGCTGACG GCCAACCTGGTGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT·1741 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT·1801 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGCTCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT·1861 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT·1921 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA·1981 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT·2041 GGTGCTGATG GTCCTGCTGGTGCTCCTGGTACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG·2101 CGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC·2161 CCCTCTGGTGAACCTGGCAA ACAAGGTCCCTCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT·2221 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT·2281 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT·2341 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT·2401 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGGTGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT·2461 GTCGGCCCTGTTGGCGCCCGTGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT·2521 GAGACAGGCG AACAGGGCGA CTAAGAATTC(4)制备基因重组人胶原蛋白融合肽段①发酵以步骤(3)构建的基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌 SMD1168-COL3al-COLlal为原始菌种，涂布YPD平板获得单菌落，扩繁单菌落分装为 甘油菌种保存；每次取甘油菌种，接种于5mL种子YPD培养基中，30°C振荡培养20 24小时，转接于400ml BMGY培养基中，30°C振荡培养至OD600达10 12，作为一级种 子；将一级种子接入装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，30°C、pH值为5.0、DO 20% 30%,培养16-20小时，作为二级种子；将二级种子转接入装有30L FBS培养基的50L发酵罐中；生长培养18 20小时，30°C、pH值为5.0、DO 20% 30%，补加甘油至发 酵液内的菌体湿重达到150mg，饥饿1-2小时；驯化培养9小时，每三小时为一个驯化时 间段，30°C、pH值为5.0、DO 20% 30%，第一段每5分钟补加甲醇lmL，第二段每5 分钟补加甲醇2mL，第三段每5分钟补加甲醇3mL;诱导培养72小时，30°C、pH值为 5.0、DO 20% 30%，视DO值提高甲醇流加速率并维持补料速度在5-10.9ml/L/h进行 发酵，至DO值浮动缩小至5% 8%，发酵结束；②纯化取发酵液离心除去酵母细胞，得发酵上清液；用截留量为20000的聚砜中空纤维超 滤浓缩发酵上清液至原发酵上清液体积的20%，得超滤浓缩液；用凝胶过滤法脱除超滤 浓缩液中的无机盐，得脱盐液；用DAEA阴离子交换柱处理脱盐液，以0.02M()LNaCI水 溶液为平衡液，样品溶液PH为8-9，洗脱液PH5-6，NaCIO.5MOL ；分段收集洗脱液， 电泳，色谱法检测纯度，得纯度为85%以上的溶液；用截留量为20000的聚砜中空纤维 超滤浓缩至质量浓度为 5% ；③制备基因重组人胶原蛋白融合肽段冷冻干燥，得基因重组人胶原蛋白融合肽段。
3.权利要求1基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途。
4.按照权利要求3所述的基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途，其特 征在于所制备的化妆品由下述质量配比的原料制成基因重组人胶原蛋白融合肽段8 12g透明质酸0.3 0.6g甘油20 30g去离子水1000g。
5.按照权利要求4所述的基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途，其特 征在于所制备的化妆品由下述质量配比的原料制成基因重组人胶原蛋白融合肽段IOg透明质酸0.5g甘油25g去离子水1000g。
全文摘要
一种基因重组人胶原蛋白融合肽段，它的全长为839个氨基酸，其氮端为III型人胶原蛋白908-1137位肽段共229个氨基酸，碳端为I型人胶原蛋白497-1104位肽段共608个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接。其制备方法由克隆I型即COL1和III型即COL3人胶原蛋白基因的cDNA、毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-COL3a1-COL1a1的构建、基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1的构建、制备基因重组人胶原蛋白融合肽段步骤组成。采用本发明方法制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段，经试验，可作为制备化妆品的材料。
文档编号C07K1/36GK102020716SQ20101052776
公开日2011年4月20日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者侯曾淼, 张凤龙, 赵金礼 申请人:西安华澳丽康生物工程有限公司