专利名称：一种羟基酪醇的提纯方法
技术领域：
本发明涉及一种高含量羟基酪醇的制备方法。
背景技术：
橄榄(olive)在植物学上属木樨科(Oleaceae)，其最著名的要数油橄榄(Olea europaea L.)，后者又称洋橄榄。油橄榄原产小亚细亚，主要分布于地中海沿岸地区，以西 班牙、意大利、葡萄牙以及阿尔巴尼亚为集中产地，现在世界各国都引种栽培，我国也不例 夕卜，20世纪70 80年代甘肃省率先引进国外的油橄榄品种，栽培成功，目前已初具规模。橄榄叶中已知的主要功效成分有三类简单酚类化合物(如羟基酪醇、酪醇)；裂 环烯醚萜(如橄榄苦苷、女贞苷的配基以及它们相应的脱酰二醛衍生物)；木酚素类。此三 类化合物都是很好的抗氧化剂。其中，橄榄苦苷在临床上作为药品，能抑制病毒、细菌、微生 物及其引起的毒素，对低密度脂蛋白(LDL)具有抗氧化作用，改善高血压、高血脂等心血管 疾病，提高T淋巴细胞、NK细胞、吞噬细胞的再生能力，加强细胞对病毒和感染的免疫能力。 而作为橄榄苦苷苷元的羟基酪醇，不仅同样对于低密度脂蛋白(LDL)具有有效的抗氧化保 护作用和抑制血小板凝集，而且近年来的医学研究发现羟基酪醇对亚硝酸盐决定的DNA碱 基修饰和酪氨酸消化反应产生抑制作用，并能在人类细胞系统中接触自由基氧类引起的 细胞毒性(Visioli, F Free Radical-scavenging property of Olive Oil polyphenol. Biochemical and Biophysical Research communications 247 (1) 1998 :60)。此夕卜轻基酪 醇还具有很强的消炎作用、扩张血管和抗菌作用，能够防止动脉粥样硬化，能降低某些癌症 (如乳腺、前列腺、子宫内膜，消化道)的发病率。由于羟基酪醇具有更强的抗氧化活性和降 低癌症发病率的作用，因此，作为苷元的羟基酪醇相对其配糖体橄榄苦苷具有更为巨大的 医疗作用前景。就资源而言，仅我国每年因采收和修剪而废弃的橄榄叶的总量以万吨计，而以西 班牙、意大利、葡萄牙以及阿尔巴尼亚为传统集中产地的地中海沿岸地区，其橄榄叶资源可 谓取之不尽，用之不竭。目前国内对于橄榄苦苷和羟基酪醇的提取和利用缺乏行之有效的 方法，资源利用率十分低下，造成了极大的浪费。国外有专利报道橄榄叶提取物的制备方法，美国专利(US98101563)用80%甲醇 溶剂提取橄榄叶片、真空浓缩、粗提物喷雾干燥，制备橄榄叶片提取物，其中橄榄苦苷含量 约为40%，该方法制备的提取物橄榄苦苷含量低，残留溶剂有毒性，而且并没有涉及羟基酪 醇的制备方法。国内有报道采用橄榄叶片制备橄榄叶提取物的制备方法，颜宜谦利用橄榄叶制备 橄榄多酚，申报了专利(CN1333203A)，其提取工艺是水提醇沉、乙酸乙酯萃取法制备80% 橄榄多酚提取物，但没有明确其单体成分。刘岱琳的专利(CN101298411B)，公开了一种从橄 榄提取液中提取羟基酪醇的方法，该方法采取苯乙烯类树脂柱层析、乙酸乙酯萃取和分子 蒸馏技术可将橄榄叶中的羟基酪醇提纯至70 %，但对其原料中的橄榄苦苷没有得到利用， 造成了资源的利用不完全。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中不足，提供一种高含量羟基酪醇的制备方法。
本发明的技术方案概述如下一种羟基酪醇的提纯方法，包括如下步骤(1)按质量比为1 10 40的比例，将橄榄苦苷粗品在搅拌下用去离子水溶解；(2)过中等极性的吸附型大孔树脂层析柱、活性炭层析柱和中性氧化铝层析柱至 少一种，用2 5倍于保留体积的去离子水冲洗，随后用2 5倍于保留体积的体积分数为 30% 70%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液的洗脱液；(3)真空浓缩所述乙醇水溶液的洗脱液至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；(4)用两种方法之一种进行第一种方法在所述的精制的橄榄苦苷水溶液中，加入无机酸使溶液的pH = 1 3，在65 90°C，反应2 12小时；加入氢氧化钠饱和水溶液使pH = 7，得到含有羟基酪醇 的水溶液；第二种方法在所述的精制的橄榄苦苷水溶液中，加入糖苷酶，糖苷酶的添加量 为所述橄榄苦苷水溶液质量的0. 4% 3. 5%，在37 55°C，反应1 8小时，糖苷酶灭活 处理，得到含有羟基酪醇的水溶液；(5)将所述含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度2 10度，以等量乙酸乙酯萃 取2 5次，酯层合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状即为纯度> 80%的羟基酪醇。所述大孔型树脂优选AB-8型、DlOl型、D71型、HPD-100型或X_5型树脂。所述步骤(2)去离子水的体积优选为3 4倍于保留体积。所述步骤(2)乙醇水溶液的体积分数优选为35% 60%，乙醇水溶液的体积为 3 4倍于保留体积。所述无机酸为盐酸、磷酸或冰乙酸。所述步骤(5)所述糖度为3 5度，所述乙酸乙酯的萃取次数为3 4次。本发明的优点是1、本发明的方法，充分利用了橄榄叶资源中橄榄苦苷和羟基酪醇两大有效成分单 向转化的化学特性，转化率可接近100%，改变了目前羟基酪醇提纯过程中对橄榄苦苷成分 的盲目分离的现状，而是使其转化成为更具经济价值的羟基酪醇，提高了经济效益，同时， 大大降低了制备高含量羟基酪醇的难度。2、本发明采用柱层析技术精制橄榄苦苷粗品，使得橄榄苦苷的含量可以至少提高 到60%以上，减少了后续工艺中乙酸乙酯萃取所需乙酸乙酯的用量和催化反应催化剂的用 量，在节约成本的同时降低了对环境的污染程度。3、依照本发明制备的羟基酪醇含量最高可达90%。4、本发明首次建立了可以同时分析样品中橄榄苦苷和羟基酪醇含量的HPLC方 法，可以准确直观的监控橄榄苦苷和羟基酪醇两种成分的含量和转化程度。
图1为橄榄苦苷标准品的HPLC图谱。图2为橄榄苦苷40%的HPLC图谱。
图3为羟基酪醇标准品的HPLC图谱。图4为橄榄苦苷酶解后得到的含有羟基酪醇的溶液的HPLC图谱。图5为精制得到80%羟基酪醇的HPLC图谱。
具体实施例方式本发明采用的原料橄榄苦苷粗品可以是同时含有橄榄苦苷和羟基酪醇两种成分 的橄榄叶水提浓缩液或粉末，也可以是只含有橄榄苦苷一种成分的橄榄叶水提浓缩液或粉末。橄榄苦苷粗品粉末橄榄苦苷含量不低于10%，羟基酪醇含量不作要求，由橄榄 叶直接以纯水热回流提取、浓缩，喷雾干燥而得。橄榄苦苷水提浓缩液要求液体中橄榄苦苷含量不低于1%，羟基酪醇含量不作 要求，由橄榄叶直接以纯水热回流提取，浓缩而得。本公司研究时采用的是“陕西康盛生物技术有限公司”生产的橄榄苦苷提取物，但 本发明不限定使用该产品，与该企业生产的产品相似的其它来源的橄榄苦苷粗品粉末或橄 榄苦苷水提浓缩液都可以做为本发明的原料。各实施例用HPLC方法同时分析样品中橄榄苦苷和羟基酪醇的含量，步骤为采用 高效液相色谱法，色谱条件为采用十八烷基化学键和固定相为填充剂，即ODS C18柱，规格 为250mmX4. 6mm ；紫外检测波长为280nm，温度为30°C，流动相为乙腈和0. 2%磷酸水溶液 按体积比为1 1 4的混合液，流速为lml/min。实施例11)将橄榄苦苷含量为10%的粗品粉末加入30质量倍去离子水搅拌溶解；2)将橄榄苦苷水溶液过AB-8型大孔树脂柱，用3倍于保留体积的去离子水冲洗， 随后用3倍于保留体积的体积分数为40%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液的洗脱液；3)将收集的洗脱液真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；4)在精制橄榄苦苷水溶液中，加入盐酸使溶液的pH= 2，75°C下搅拌7小时，反映 终止时加入适量氢氧化钠饱和溶液中和至使PH = 7，得到含有羟基酪醇的水溶液；5)将含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯层 合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状物，其羟基酪醇含量为81. 36%。实施例21)将橄榄苦苷含量为1%，羟基酪醇含量为0. 4%的橄榄叶提取浓缩液加入10质 量倍去离子水搅拌溶解；2)将橄榄苦苷水溶液过串联DlOl型大孔树脂柱和中性氧化铝柱，用3倍于保留体 积的去离子水冲洗，随后用3. 5倍于保留体积的35%乙醇水溶液洗脱，收集含乙醇的洗脱 液；3)将收集的洗脱液真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；4)在精制橄榄苦苷水溶液中，加入溶液质量1. 5%的糖苷酶，45°C下搅拌4小时， 反应终止时升温至75°C保温30分钟灭活；得到含有羟基酪醇的水溶液；5)将含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度7度，以等量乙酸乙酯萃取4次，酯层 合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状物，其羟基酪醇含量为81. 5%。
实施例31)将橄榄苦苷含量为25%的粗品粉末加入20质量倍去离子水搅拌溶解；2)将橄榄苦苷水溶液过中性氧化铝层析柱，用3倍保留体积的去离子水冲洗，随 后用4倍于保留体积的50%乙醇水溶液洗脱，收集含乙醇的洗脱液；3)将收集的含乙醇的洗脱液真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；4)在精制橄榄苦苷水溶液中，加入盐酸使溶液的pH= 1，75°C下搅拌7小时，反应 终止时加入适量氢氧化钠饱和溶液中和至中性；得到含有羟基酪醇的水溶液；5)将含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度10度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯 层合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状物，其羟基酪醇含量为83. 4%。实施例41)将橄榄苦苷含量为0. 2%，羟基酪醇含量为1. 0%的橄榄叶提取浓缩液加入10 质量倍去离子水搅拌溶解；2)将橄榄苦苷水溶液过HPD-100型大孔树脂柱，用2倍保留体积的去离子水冲洗， 随后用2倍于保留体积的35%乙醇水溶液洗脱，收集含乙醇的洗脱液；3)将收集的含乙醇的洗脱液真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；4)在精制橄榄苦苷水溶液中，加入冰乙酸使溶液的pH= 3，90°C下搅拌2小时，反 应终止时加入适量氢氧化钠饱和溶液中和至中性；得到含有羟基酪醇的水溶液；5)将含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取2次，酯层 合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状物，其羟基酪醇含量为80. 6%。实施例51)将橄榄苦苷含量为40%的粗品粉末加入20质量倍去离子水搅拌溶解；2)将橄榄苦苷水溶液过AB-8型大孔树脂柱，用5倍保留体积的去离子水冲洗，随 后用5倍于保留体积的60%乙醇水溶液洗脱，收集含乙醇的洗脱液；3)将收集的含乙醇的洗脱液真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；4)在精制橄榄苦苷水溶液中，加入磷酸，65°C下搅拌12小时，反应终止时加入适 量氢氧化钠饱和溶液中和至中性；5)将含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度3度，以等量乙酸乙酯萃取5次，酯层 合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状物，其羟基酪醇含量为86. 45%。实施例61)将橄榄苦苷含量为40%的粗品粉末加入40质量倍去离子水搅拌溶解；2)将橄榄苦苷水溶液过AB-8型大孔树脂柱，用3倍保留体积的去离子水冲洗，随 后用3倍于保留体积的70%乙醇水溶液洗脱，收集含乙醇的洗脱液；3)将收集的含乙醇的洗脱液真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；4)在精制橄榄苦苷水溶液中，加入溶液质量2%的糖苷酶，50°C下搅拌6小时，反 应终止时升温至75°C保温30分钟灭活；5)将含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度3度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯层 合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状物，其羟基酪醇含量为86. 55%。实施例71)将橄榄苦苷含量为40%的粗品粉末加入40质量倍去离子水搅拌溶解；
2)将橄榄苦苷水溶液过D71型大孔树脂柱，用4倍保留体积的去离子水冲洗，随后 用4倍于保留体积的30%乙醇水溶液洗脱，收集含乙醇的洗脱液；3)将收集的含乙醇的洗脱液真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；4)在精制橄榄苦苷水溶液中，加入溶液质量0.4%的糖苷酶，55°C下搅拌8小时， 反应终止时升温至75°C保温30分钟灭活；5)将含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯层 合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状物，其羟基酪醇含量为80. 3%。实施例81)将橄榄苦苷含量为40%的粗品粉末加入40倍去离子水搅拌溶解；2)将橄榄苦苷水溶液过X-5型大孔树脂柱，用5倍保留体积的去离子水冲洗，随后 用5倍于保留体积的55%乙醇水溶液洗脱，收集含乙醇的洗脱液；3)将收集的含乙醇的洗脱液真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；4)在精制橄榄苦苷水溶液中，加入溶液质量3. 5%的糖苷酶，45°C下搅拌1小时， 反应终止时升温至75°C保温30分钟灭活；5)将含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯层 合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状物，其羟基酪醇含量为81. 23%。实施例91)将橄榄苦苷含量为40%的粗品粉末加入40倍去离子水搅拌溶解；2)将橄榄苦苷水溶液过活性炭层析柱，用2倍保留体积的去离子水冲洗，随后用2 倍于保留体积的55%乙醇水溶液洗脱，收集含乙醇的洗脱液；3)将收集的含乙醇的洗脱液真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；4)在精制橄榄苦苷水溶液中，加入溶液质量2%的糖苷酶，37°C下搅拌6小时，反 应终止时升温至75°C保温30分钟灭活；5)将含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度5度，以等量乙酸乙酯萃取3次，酯层 合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状物，其羟基酪醇含量为83. 2%。
权利要求
1.一种羟基酪醇的提纯方法，其特征是包括如下步骤(1)按质量比为1 10 40的比例，将橄榄苦苷粗品在搅拌下用去离子水溶解；(2)过中等极性的吸附型大孔树脂层析柱、活性炭层析柱和中性氧化铝层析柱至少 一种，用2 5倍于保留体积的去离子水冲洗，随后用2 5倍于保留体积的体积分数为 30% 70%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液的洗脱液；(3)真空浓缩所述乙醇水溶液的洗脱液至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；(4)用两种方法之一种进行第一种方法在所述的精制的橄榄苦苷水溶液中，加入无机酸使溶液的pH = 1 3，在 40 90°C，反应2 12小时；加入氢氧化钠饱和水溶液使pH = 7，得到含有羟基酪醇的水 溶液；第二种方法在所述的精制的橄榄苦苷水溶液中，加入糖苷酶，糖苷酶的添加量为所述 橄榄苦苷水溶液质量的0. 4% 3. 5%，在37 55°C，反应1 8小时，糖苷酶灭活处理，得 到含有羟基酪醇的水溶液；(5)将所述含有羟基酪醇的水溶液真空浓缩至糖度2 10度，以等量乙酸乙酯萃取 2 5次，酯层合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状即为纯度> 80%的羟基酪醇。
2.根据权利要求1所述的一种羟基酪醇的提纯方法，其特征是所述大孔型树脂为AB-8 型、DlOl型、D71型、HPD-100型或X-5型树脂。
3.根据权利要求1所述的一种羟基酪醇的提纯方法，其特征是所述步骤( 去离子水 的体积为3 4倍于保留体积。
4.根据权利要求1所述的一种羟基酪醇的提纯方法，其特征是所述步骤O)乙醇水溶 液的体积分数为35% 60%，乙醇水溶液的体积为3 4倍于保留体积。
5.根据权利要求1所述的一种羟基酪醇的提纯方法，其特征是所述无机酸为盐酸、磷 酸或冰乙酸。
6.根据权利要求1所述的一种羟基酪醇的提纯方法，其特征是所述步骤( 所述糖度 为3 5度，所述乙酸乙酯的萃取次数为3 4次。
全文摘要
本发明公开了一种羟基酪醇的提纯方法，步骤为将橄榄苦苷粗品在搅拌下用去离子水溶解；过吸附型大孔树脂层析柱，用去离子水冲洗，用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；真空浓缩至无醇，得到精制的橄榄苦苷水溶液；加入无机酸反应；加入氢氧化钠使pH＝7，得到含有羟基酪醇的水溶液；真空浓缩，以等量乙酸乙酯萃取，酯层合并浓缩除去乙酸乙酯，得到淡黄色膏状即为纯度≥80％的羟基酪醇。本发明的方法，充分利用了橄榄叶资源中橄榄苦苷和羟基酪醇单向转化的特性，转化率高，改变了目前羟基酪醇提纯过程中对橄榄苦苷成分的盲目分离的现状，而是使其转化成为更具经济价值的羟基酪醇，提高了经济效益，同时，大大降低了制备高含量羟基酪醇的难度。
文档编号C07C39/11GK102093170SQ20101057377
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者孙华庚, 於洪建 申请人:天津市尖峰天然产物研究开发有限公司