专利名称：一种从蝇蛆中提取甲壳素和抗菌肽的方法
技术领域：
本发明属于天然产物提取技术领域，涉及一种蝇蛆的综合加工利用技术工艺方法，特别是一种从蝇蛆中提取甲壳素和抗菌肽的方法。
背景技术：
苍蝇的繁殖能力在昆虫世界里位居第一，据文献记载一对苍蝇在4个月内可繁殖蝇蛆沈60亿个，苍蝇养殖条件简单，环境条件要求低，而且原料易得，人畜禽粪、污水处理厂的污泥、屠宰场的废料和废血水均可以作用蝇蛆的营养源，所以在同类原料中，蝇蛆的养殖成本较低，据文献记载可知，干蝇蛆中的粗蛋白占阳-65%，而且必需氨基酸比例超过非必需氨基酸，是优质蛋白质源，干蝇蛆中甲壳素的含量占30%-54.8%，并有大量的抗菌物质。目前，利用蝇蛆为原料采用物理和化学工艺综合加工技术提取天然甲壳素和抗菌肽的成熟工艺方法尚未见有报道，现有的提取工艺，其原理和步骤复杂，工艺条件苛求，提取成本高，环境条件差，产品收率低，经济效益不明显。所以，寻求设计一种利用蝇蛆为原料提取甲壳素、壳聚糖和壳低聚糖以及提取抗菌肽的成熟技术是业界科研人员正在努力的方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种利用蝇蛆为基本原料，经过物理和化学工艺处理提取甲壳素和抗菌肽的技术工艺方法，该方法充分吸取已有技术的优点，经过综合处理后使蝇蛆的经济效益成倍增加。为了实现上述目的，本发明先将鲜蝇蛆经过消毒和漂洗干净后，用压辊挤压，使蝇蛆皮与内脏团浆液分离，蝇蛆皮作为提取甲壳素的原料，内脏团浆液作为提取抗菌肽的原料；其具体工艺包括壳低聚糖纯化、昆虫抗菌肽提取和蛋白粉纯化三个模块；壳低聚糖纯化对收取的蝇蛆进行筛选，除去杂质后，先用重量百分比浓度为的盐酸溶液浸泡蝇蛆皮数小时，洗涤干净后烘干，再用重量百分比浓度为4% NaOH溶液浸泡1-20小时除去蛋白，保留残液，洗涤干净后烘干，经粉碎后加重量百分比浓度为40% NaOH的溶液，水浴98°C加热，保持反应8小时；再重复提纯一次，取少量壳聚糖放入重量百分比浓度为1 %的乙酸溶液中溶解后停止反应，过滤、洗涤，50°C烘干得壳聚糖，取壳聚糖溶于重量百分比浓度为5%的乙酸溶液，调pH值5. 5-6，加甲壳素酶和纤维素酶，50°C酶解反应Mh，变成浑黄色均相非粘性溶液，过滤，使滤液中的壳低聚糖平均聚合度为10，用乙醇沉淀，过滤，干燥得壳低聚糖；昆虫抗菌肽提取在蝇蛆内脏团浆液中加入乙酸至0. 5mol/L的浓度，均浆，4°C过夜，过滤，滤液为抗菌肽酸性提取物，用海藻酸吸附，过滤，再用0. 2mol/L盐酸溶液洗脱吸附在海藻酸上的抗菌肽，将洗脱液用NaOH调PH值为3. 5后，用NaCl沉析，透析，脱盐，干燥得抗菌肽粗制品；粗蛋白粉的纯化把重量百分比浓度为4% NaOH脱蛋白残液与抗菌肽酸性提取物用海藻酸吸附后的残液合并，调节PH值为7，50°C真空浓缩，乙醇沉淀，过滤，干燥，制得粗蛋白粉；将剩余的残酸、碱混合，调PH值为7，排放。本发明用蝇蛆为原料经加工制得最终产品为壳低聚糖、抗菌肽和蛋白粉；其壳低聚糖分离纯化技术是HCl脱钙，4% NaOH去蛋白，45-55% NaOH脱乙酰基，由壳聚糖用复合酶酶解为壳低聚糖；抗菌肽分离纯化技术原理是蝇蛆蛋白浆用乙酸酸化变性，用海藻酸吸附分离，用盐酸洗脱，真空浓缩，NaCl沉析，层析脱盐，干燥后得抗菌肽；4% NaOH残液与蛋白乙酸残液合并，调节PH为7，加热真空浓缩至1/2时，饱和硫酸铵溶液沉析，沉淀物加温干燥得蛋白粉。本发明与现有技术相比，其技术路线合理，提取成本低，产品出率高，经济价值大， 生产环境友好，可以有效利用蝇蛆资源综合加工后制得天然产物品种。
图1为本发明的工艺步骤流程原理示意框图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步描述。本实施例先将鲜蝇蛆经过消毒和漂洗干净后，用压辊挤压，使蝇蛆皮与内脏团浆分离，蝇蛆皮作为提取甲壳素的原料，内脏团浆液作为提取抗菌肽的原料；(一)低壳聚糖的纯化蝇蛆皮含有大量的甲壳素、蛋白质、脂肪、矿物质等，为了达到预期效果，首先用重量百分比浓度为的盐酸溶液浸泡蝇蛆皮数小时，洗涤干净后， 烘干后用重量百分比浓度为4% NaOH溶液浸泡1-20小时除去蛋白，洗涤干净后，烘干，经粉碎后加重量百分比浓度为40% NaOH的溶液，水浴98°C加热，保持反应8小时；再重复提纯一次，取少量壳聚糖放入重量百分比浓度为1 %的乙酸溶液中溶解后停止反应，过滤、洗涤， 50°C烘干得壳聚糖，取壳聚糖溶于重量百分比浓度为5%的乙酸溶液调pH值5. 5-6，加甲壳素酶和纤维素酶，50°C酶解反应Mh，变成浑黄色均相非粘性溶液，过滤，使滤液中的低聚壳聚糖平均聚合度为10，用乙醇沉淀，过滤，干燥得低聚壳聚糖；( 二)昆虫抗菌肽提取在蝇蛆内脏团浆液中加入乙酸至0. 5mol/L的浓度，均浆， 4°C过夜，过滤，滤液为抗菌肽酸性提取物，用海藻酸吸附，过滤，用0. 2mol/L盐酸溶液洗脱，将洗脱液用NaOH调PH值为3. 5后，用NaCl沉析，透析，脱盐，干燥得抗菌肽粗制品；(三)粗蛋白粉的纯化把重量百分比浓度为4%NaOH脱蛋白的残液与抗菌肽酸性提取物用海藻酸吸附后的残液合并，调节PH值为7，50°C真空浓缩，乙醇沉淀，过滤，干燥，制得粗蛋白粉；将剩余的残酸、碱混合，调PH值为7，排放。本实施例用蝇蛆为原料经加工制得最终产品为壳低聚糖、抗菌肽和蛋白粉；其壳低聚糖分离纯化技术原理是1% HCl脱钙，4% NaOH去蛋白，45-55% NaOH脱乙酰基，由壳聚糖用复合酶酶解为壳低聚糖；抗菌肽分离纯化技术原理是蝇蛆蛋白浆用乙酸酸化变性，用海藻酸吸附分离，用盐酸洗脱，真空浓缩，NaCl沉析，层析脱盐，干燥后得抗菌肽；4% NaOH残液与蛋白乙酸残液合并，调节PH为7，加热真空浓缩至时，饱和硫酸铵溶液沉析，沉淀物加温干燥得蛋白粉。实施例1 取粪便培养蝇蛆100g，用1/5000ΚΜη04溶液漂洗10分钟后，投入1/100 的豆粕浆培养1天，使蝇蛆排净粪液，再用清水洗涤一次，得鲜蝇蛆91g，压辊挤压，得蝇蛆皮35g和蝇蛆内脏团浆56g，蝇蛆皮可提取甲壳素及壳聚糖，蝇蛆内脏团浆可提取抗菌肽。实施例2:(1)甲壳素制备35g蝇蛆皮加入250ml三颈烧瓶，加入50ml 盐酸溶液， 于38-40 V水浴中加热4小时，过滤，洗涤数次至中性，50 °C干燥，干燥的蝇蛆皮加4 % Na0H50ml，于96-98水浴锅中加热5小时，过滤，洗涤数次至中性，50°C以下干燥，得甲壳素 4. 9g，收率 14%。(2)壳聚糖制备将甲壳素4.9g浸泡于100ml45%-55%的NaOH中，在水浴锅 98-99°C中持续反应8小时后，再新配制100ml45% -55%的NaOH，在水浴锅98_99°C中继续加温8-16小时，待产物在-2%乙酸中完全溶解时，反应结束，水洗至中性得3. 4g壳聚糖，收率为甲壳素的70%。(3)壳低聚糖的制备取蝇蛆壳聚糖3. 4g溶于IOOml乙酸中，调节PH值至5. 5_6， 加入甲壳素酶和纤维素酶4g，在50-55°C酶解反应10小时，再在100°C煮沸10分钟，然后用乙醇沉淀，离心取沉淀物，再用丙酮脱水，脱酯，得沉淀物，干燥得壳低聚糖白色粉末2. 04， 收率为60%。实施例3 取56g蝇蛆内脏团浆加入乙酸至0. 5mol/L的浓度，均浆，4°C过夜，离心，过滤，得200ml蝇蛆抗菌肽酸提取液，加入海藻酸后，搅拌1小时，使抗菌肽被海藻酸充分吸附，4°C静置，过夜，用布氏漏斗抽滤，收集已吸附抗菌肽的海藻酸，用0. 2mol/L盐酸洗脱，收洗脱液，用固体醋酸钠调节PH值为3. 5后，用320g/L的NaCl盐析，过夜后，经透析袋透析、脱盐、干燥得0. 6g抗菌肽粗品。实施例4 4% NaOH提取甲壳素残液与抗菌肽醋酸提取液残液二者合并，调节PH 值为7，加热真空浓缩至1/2，用饱和硫酸铵沉析，沉淀烘干，为粗蛋白粉干粉13g。本实施例所涉及的溶液除注明外，均为重量百分比浓度。
权利要求
1. 一种从蝇蛆中提取甲壳素和抗菌肽的方法，其特征在于先将鲜蝇蛆经过消毒和漂洗干净后，用压辊挤压，使蝇蛆皮与内脏团浆液分离，蝇蛆皮作为提取甲壳素的原料，内脏团浆液作为提取抗菌肽的原料；具体工艺包括壳低聚糖纯化、昆虫抗菌肽提取和蛋白粉纯化三个模块；壳低聚糖纯化对收取的蝇蛆进行筛选，除去杂质后，先用重量百分比浓度为的盐酸溶液浸泡蝇蛆皮数小时，洗涤干净后烘干，再用重量百分比浓度为4% NaOH溶液浸泡 1-20小时除去蛋白，保留残液，洗涤干净后烘干，经粉碎后加重量百分比浓度为40% NaOH 的溶液，水浴98°C加热，保持反应8小时；再重复提纯一次，取少量壳聚糖放入重量百分比浓度为1 %的乙酸溶液中溶解后停止反应，过滤、洗涤，50°C烘干得壳聚糖，取壳聚糖溶于重量百分比浓度为5%的乙酸溶液，调pH值5. 5-6，加入甲壳素酶和纤维素酶，50°C酶解反应 24h,变成浑黄色均相非粘性溶液，过滤，使滤液中的壳低聚糖平均聚合度为10，用乙醇沉淀，过滤，干燥得壳低聚糖；昆虫抗菌肽提取在蝇蛆内脏团浆液中加入乙酸至0. 5mol/L的浓度，均浆，4°C过夜， 过滤，滤液为抗菌肽酸性提取物，用海藻酸吸附，过滤，再用0. 2mol/L盐酸溶液洗脱吸附在海藻酸上的抗菌肽，将洗脱液用NaOH调PH值为3. 5后，用NaCl沉析，透析，脱盐，干燥得抗菌肽粗制品；粗蛋白粉纯化把重量百分比浓度为4% NaOH脱蛋白残液与抗菌肽酸性提取物用海藻酸吸附后的残液合并，调节PH值为7，50°C真空浓缩，乙醇沉淀，过滤，干燥，制得粗蛋白粉； 将剩余的残酸、碱混合，调PH值为7，排放。
全文摘要
本发明属于产物提取技术领域，涉及一种从蝇蛆中提取甲壳素和抗菌肽的方法，先将鲜蝇蛆经过消毒和漂洗干净后挤压使蝇蛆皮与内脏团浆液分离；先用盐酸溶液浸泡，洗涤后烘干，再用NaOH溶液浸泡除去蛋白；保留残液，洗涤后烘干，经粉碎后加NaOH的溶液，水浴98℃加热反应；壳聚糖放入乙酸溶液中溶解后停止反应，过滤、洗涤，50℃烘干得壳聚糖，再在蝇蛆内脏团浆液中加入乙酸，均浆，4℃过夜，过滤，滤液用海藻酸吸附，过滤，再用盐酸溶液洗脱吸附在海藻酸上的抗菌肽，将洗脱液调pH值为3.5后，用NaCl沉析，透析，脱盐，干燥得抗菌肽粗制品；其技术路线合理，成本低，产率高，经济价值大，环境友好，可有效利用蝇蛆资源制得天然产物品种。
文档编号C07K1/34GK102558387SQ201010602929
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者夏伟, 张 浩, 徐权汉, 郑德志 申请人:青岛中仁药业有限公司