基于志贺毒素2型蛋白的方法和组合物的制作方法

专利名称：基于志贺毒素2型蛋白的方法和组合物的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及治疗和预防志贺毒素(Shiga toxin)相关疾病的领域。
背景技术：
在美国，生成志贺毒素(Mx)的大肠杆菌(STEC)每年造成约110，000例感染。肠出血性大肠杆菌(EHEC)(最显著地是血清型0157:H7)是被发现产生Stx介导的疾病的 STEC的子集(subset)。生成Mx的生物体的感染的一种可能并发症是溶血性尿毒症综合征(HUQ，其特征在于溶血性贫血、栓塞性血小板减少症和肾衰竭。对于具有HUS的那些人而言，存在大约5-10%病死率，且幸存者可能具有持续的肾损伤。目前，没有FDA批准的用于减轻或预防由Mx-介导的疾病引起的疾病的疗法或疫苗，但是几个在将来有前途的选择包括结合和中和的人源化的单克隆抗体，和嵌合的ΜχΑ2/ΜχΒ1类毒素，其引起中和应答并提供对Mxl或或Mxl和Stx2的致死攻击(challenge)的保护。基本上存在Mx的2个主要类型Α χ/Μχ 和Mx2。Mx由痢疾志贺氏菌 (Shigella dysenteriae) 1型生成，而Stxl和Stx2由大肠杆菌生成。Stx和Stxl基本上相同，仅在A亚基中存在1个氨基酸差异。Mxl和的成熟的A和B亚基分别具有68%和 73%相似性。尽管存在氨基酸序列差异，Stx和的晶体结构非常类似(图1)。通过多克隆抗血清可以辨别这些毒素针对Mxl产生的多克隆抗血清不会中和Mx2，反之亦然。 存在 Stxl 和 Stx2 的变体，包括 Stxlc、MxlcUtx2c、Mx2cUtx2d-可活化的(Stx2_act.)、 Stx2e 和 Stx2f0志贺毒素是具有AB5结构的复杂的全毒素。活性结构域(A)含有将60S核糖体亚基的^S rRNA脱嘌呤化的N-糖苷酶，其终止蛋白合成，并最终导致细胞死亡。A亚基是 32kDa，且被胰蛋白酶(trypsin)或弗林蛋白酶(furin)蛋白水解性地切割成 ^kDa A1亚基和 5kDa A2肽，它们通过单个二硫键相连。A1亚基含有活性结构域，且A2肽将该活性结构域非共价地连接到结合(B)结构域上。(B)结构域由5个相同的 7. 7kDa单体组成，所述单体形成五聚体，A2肽的C-端贯穿该五聚体。B亚基单体中的每一个具有2个半胱氨酸残基，它们在每个单体内形成二硫键。B五聚体结合真核受体三聚己糖神经酰胺(三己糖基神经酰胺，globotriaosyl ceramide) (Gb3)(或 Gb4,如对于 Stx2e 的情况)。尽管已知暴露于这些毒素的结果，目前尚不存在对Mx-介导的疾病的已知治疗或疫苗。抗生素的使用可能通过增加细菌的毒素释放而加重该情况。因而，需要预防或治疗由志贺毒素造成的EHEC感染的并发症的化合物。这样的化合物可以用于治疗受感染的受试者，并减少毒素对中枢神经系统(CNS)、血液和肾的系统性作用。另外，如果可以中和毒素，可以安全地给予抗生素，以杀死胃肠(GI)道中的细菌。由于抗生素通过诱导携带毒素基因的噬菌体而增加毒素生成的可能性，STEC感染的抗生素治疗被禁忌。这样的化合物也可以用于预防感染的并发症，其通过在个体获得EHEC感染之前治疗暴露的或高危的个体而进行。这样的个体将包括日间住院医疗的儿童或在医护疗养所中的老年人，该处已经鉴别出EHEC腹泻的病例。这些个体处于发展EHEC感染的高危中，经常具有严重的并发症，且EHEC在这些环境中的传播并不罕见。

发明内容
单克隆抗体11E10会识别的A亚基，并中和它的细胞毒性。尽管MxAl和 MxA2之间存在68%氨基酸(aa)序列相似性，11E10单克隆抗体不会结合MxAl。我们已经发现，11E10表位包括跨MxA2单体上的3个区域的不连续的或构象的表位。发现3个不同性区域在Stx2A亚基的晶体结构上的位置彼此邻近，所述3个不同性区域包括氨基酸 42-49 (SEQ IDNO 1) ,96-100 (SEQ ID NO 2)和 244-259 (SEQ ID NO :3)。因此，我们已经发现，11E10表位包括以SEQ ID NO :1、2和3示出的序列中的至少1个、2个或所有3个。因此，本发明的特征在于一种多肽，其包括在SEQ ID N0:l、2和3中所述的氨基酸序列的至少1个、2个或3个，其中所述多肽不是全长Mx2。所述多肽至少包括在SEQ ID NO 1中所述的氨基酸序列。理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO :1和2中所述的氨基酸序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO :1、2和3中所述的氨基酸序列。在一个实施方式中，在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的一个或多个被插入非-Stx2蛋白支架(protein scaffold)中。在某些实施方式中，所述蛋白支架是与Mxl或其片段基本上相同的蛋白， 例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%相同。在一个实施方式中，所述蛋白支架是^^、Stx或携带一个或多个保守点(位点，point)突变的 Mxl。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括与在SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述多肽可以包括的片段，其包括SEQ ID N0:l、2或3;SEQ ID NO :1和2;或SEQ ID NO :1、2和3，例如，Stx2多肽序列的氨基酸四-297、氨基酸1-158或氨基酸，其中所述片段不是全长Mx2。在有些实施方式中， 所述片段被插入蛋白支架(例如，Stx或Mxl)中。本发明的特征还在于一种多肽，其包括与在SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列的片段基本上相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述片段包括与SEQ ID NO :8的氨基酸 64-122 至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 相同的序列，且另外至少包括在SEQ ID NO :1中所述的氨基酸序列。优选地，所述片段另外包含在SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :2和3中所述的(一个或多个)氨基酸序列。所述片段的长度可以是，例如，20、40、59、60、150、200、219、236、250、300或314个氨基酸。在某些实施方式中，所述多肽被类毒素化。所有上述多肽都被包括在术语“本发明的多肽”内。本发明也包括编码任一种本发明的多肽的核酸分子，包括其中所述核酸被连接到载体中的表达构建体上，且其中该载体被插入宿主细胞中。在一个有关的方面，本发明的特征在于一种用于使用任一种本发明的多肽刺激针对的免疫应答的组合物。理想地，所述多肽包括在SEQ IDNO :1和2中所述的序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID N0:l、2和3中所述的序列。在这些实施方式的任一个中，所述组合物可以另外包括佐剂(adjuvant)。在某些实施方式中，所述组合物不会刺激针对Mxl的免疫应答。本发明的特征还在于任一种本发明的多肽(例如，蛋白支架如Stxl，其插入了在 SEQ ID N0:l、2或3中的至少1个、2个或所有3个中所述的氨基酸序列)的应用。这样的肽可以用于针对任意志贺毒素有关的疾病进行免疫或治疗，所述疾病包括溶血性尿毒症综合征和与大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染有关的疾病。在一个实施方式中，所述肽与在SEQ ID NO 8 中所述的氨基酸序列具有至少 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在另一个方面，本发明的特征在于生产特异性地结合乂口的11E10表位的抗-Stx2抗体(例如，单克隆和多克隆抗体)或其片段的方法。这样的抗体或片段特异性地结合Mx2，而不结合乂^。该方法包括，用多肽免疫哺乳动物，所述多肽包括的片段(S卩，非全长Mx2)，所述的片段包括在SEQ IDNO=U 2和3中所述的序列的至少1个、2个或3个，其中该多肽不包括全长Mx2。优选地，所述方法包括，使用这样的多肽，所述多肽至少含有在SEQ ID NO :1中所述的序列，更优选在SEQ ID NO :1和2中所述的序列，甚至更优选在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列。在一个实施方式中，所述肽包括蛋白支架，例如与Mxl基本上相同的蛋白，其插入了在SEQ ID NO 1,2 和3中所述的一个或多个氨基酸序列。所述方法可以包括，用含有11E10表位的多肽(例如，如本文所述的)免疫哺乳动物，其中所述多肽不包括全长Mx2。在一个实施方式中，用含有与在SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽免疫哺乳动物。使用本领域已知的或本文所述的标准方法，可以筛选通过上述方法生产的抗_Stx2抗体，所述方法包括，例如，体外中和试验，以鉴别特异性地结合且不结合Mxl的抗体。 还包括免疫原性多肽和制备该多肽的方法、以及编码该多肽的核酸分子(包括其中该核酸被连接到载体中的表达构建体上，且其中该载体被插入宿主细胞中)，作为本发明的有关方面。本发明的特征还在于特异性地结合的11E10表位的抗-Stx2抗体或其片段， 其中所述抗体或其片段特异性地结合且不结合Mxl。优选的本发明的抗体结合这样的表位，其包括在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的至少1个、2个或所有3个，理想地至少包括SEQ ID NO :1，更理想地至少包括SEQ ID NO 1和2，最理想地含有SEQ ID NO :1、2 和3。所述抗体表位可以是构象表位，其中基于蛋白支架的构象，所述氨基酸序列是邻近的， 例如，如在本文所述的嵌合蛋白中，其中在SEQ ID N0:l、2和3中所述的乂口序列的一个或多个被插入与Mxl基本上相同的蛋白支架中。所述抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgD、IgA、 Fab、Fv、单克隆和多克隆抗体或抗体片段，且可以通过本文所述的方法开发。所述抗体优选地以小于 10011]\1、5011]\1、1011]\1、111]\1、10(^]\1、1(^]\1或让]\1或更小的1((1结合乂12。在一个实施例中，本发明的抗体抑制11E10抗体与的结合或与含有11E10表位的嵌合蛋白的结合， 包括以IOOnM至IpM的Kd值进行抑制。本发明的抗体可以抑制结合真核受体三聚己糖神经酰胺(弥；3)。本发明的抗_Stx2抗体特别地排除下述抗体的任何小鼠、人源化或嵌合形式11E10、TMA-15、VTM1. 1、5C12(包括 5C12 人单克隆抗体和 r5C12)、6G3、5H8、11F11、 11G10、2E1、10E10、IG3、2F10、3E9、4H9、5A4、5F3、5C11、1A4、1A5、BC5BB12、DC1、EH5、EA5BA3、 ED5DF3、GB6、BA4和c α Stx2抗体。本发明另外包括生产任一种本发明的抗体的杂交瘤细胞系。本发明的另一个方面的特征在于使用任一种本发明的抗_Stx2抗体检测生物样品(例如，组织、细胞、细胞提取物、体液和活组织检查样品)中的的方法。本发明的检测方法包括、但不限于，ELISA、RIA、蛋白印迹法、免疫沉淀和流式细胞术。本发明包括，基于样品中的鉴别诊断志贺毒素相关疾病。本发明的特征还在于用于检测志贺毒素相关疾病的免疫检验试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体，和用于检测所述抗体和样品中存在的之间的相互作用的装置(means)。本发明的另一个方面的特征在于使用本文提供的或通过任一种前述方法生产的抗体治疗志贺毒素相关疾病的方法。志贺毒素相关疾病的实例包括溶血性尿毒症综合征 (HUS)和与大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染有关的疾病。这些抗体可以与其它治疗联合给予， 所述其它治疗包括但不限于特异性地结合其它志贺毒素相关蛋白(例如，Stxl)的抗体。“11E10表位”是指这样的氨基酸序列，其作为线性结构或三维构象的结果，形成 11E10抗体的结合位点。该术语可以包括任意的非全长乂口蛋白，所述非全长蛋白包括与在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的1个、2个或3个(例如，SEQ ID NO 1和2， 或SEQ ID N0:l、2和3)相同或基本上相同的序列。在希望的实施方式中，11E10表位包括 SEQ IDNO :1和2、或1、2和3。包括11E10表位的蛋白的一个实例是包括与在SEQ ID NO: 8中所述的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白。术语“特异性地结合的11E10表位的抗体”或“11E10表位特异性的抗体”是指这样的抗体，其以IOOnM-IpM的Kd值结合包含11E10表位的蛋白。这样的抗体还被表征为，微弱的或没有可检测的与Mxl蛋白的结合(例如，对于Mxl具有大于100nM、200nM、 500nM、1 μ Μ、10 μ Μ、100 μ Μ、ImM或更大的Kd值)。使用本领域已知的任意测定法，包括、但不限于基于表面等离子体共振的测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和竞争测定法(例如RIA’s)，可以测定抗体亲和力。另外，可以对抗体进行本文所述的体外中和测定。使用本文所述的或本领域已知的测定法，特异性地结合11E10表位的抗体可以中和的细胞毒性效应至少10%、20%、30%、40%、50%、75%或更大。该术语特别地排除了下述抗_Stx2 抗体的小鼠、嵌合、人源化或人形式=IlElO, TMA-15、VTM1. 1、5C12 (包括5C12人单克隆抗体和 r5C12(Akiyoshi 和 Tzipori (2005)Infect. Immun. 73 :4054-4061)、6G3、5H8、11F11、 llG10、2El、10E10(Perera 等人(1988)J. Clin. Microbiol. 26 :2127-2131)、IG3、2F10、 3E9、4H9、5A4、5F3、5Cll、lA4、lA5(Ma 等人(2008)Immunol. Lett. 121 :110-115Q008))、 BC5BB12、DC1EH5、EA5BA3、ED5DF3、GB6、BA4(Downes 等人(1988) Infect. Immun. 56 1926-1933), c α 抗体、在 Smith 等人((2006) Vaccine24 :4122-4129)中所述的抗体、 在 Donohue-Rolfe 等人((1999) Infect Immun. 67 :3645-364)中所述的抗体和在 Sheoran 等人((2003) Infect Immun. 71 :3125-3130)中所述的抗体。“抑制结合”是指，使一种蛋白与另一种蛋白的结合减少了至少50%，优选60%、 70 %、80%、90 %或更多，这通过例如本文所述的蛋白印迹法或通过ELISA或本领域已知的 Gb3受体结合测定法来测得。术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体片段，只要这样的分子具有所需的生物活性(例如，中和本文所述的毒素)。本文使用的“纯化的”或“分离的”表示已经从它的天然环境的组分中鉴别出来和分离和/或回收的蛋白。它的天然环境的污染物组分是通常干扰所述蛋白的诊断或治疗用途的物质，且可以包括酶、激素和其它蛋白性的(proteinaceous)或非蛋白性的 (non-proteinaceous)溶质。“类毒素化”是指，例如通过突变、结合(缀合，conjugation)或交联，以减少细胞毒性且维持抗原性的方式改变。的类毒素化形式包括甲醛-和戊二醛-处理过的Stx2和具有Y77S突变的Mx2。类毒素化的Stx蛋白的其它非限制性实例是携带Y77S和 E167Q 突变的 Stx2 (Wen 等人(2006) Vaccine 24 :1142-1148)、携带 E167D 和 6 组氨酸标签的 Stx2 (Robinson 等人(2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103 :9667-9672)、携带 Y77S、 E167Q 和 R170L 突变的 ΜχΑ2/ΜχΒ1 类毒素(Smith 等人，Vaccine 24 :4122-4129 (2006))。 其它实例描述在 Gordon 等人((1992nnfect. Immunol. 60(2) :485-490)中。“非全长Stx2”是指这样的蛋白，其含有全长多肽的小于90^^85^^80%, 75%、70%、65%、60%或更少的氨基酸。非全长 X2的实例包括、但不限于，在SEQ ID N0: 4-8中所述的氨基酸序列。其它实例包括这样的多肽，其包含的氨基酸四-297、1-158 或四-1观或由它们组成，包括，例如在图IA中提供的嵌合多肽。野生型Mxl、Stx2或在本申请内描述的嵌合毒素的A亚基都具有22个氨基酸的前导序列，其被去除，从而产生成熟 A亚基蛋白。为了本说明书的目的，术语“全长Mx2”和片段的氨基酸编号表示全长成熟的MxA2亚基。该成熟A亚基以后被胰蛋白酶或弗林蛋白酶不对称地切割成Al片段 (N-端 248个氨基酸)和A2肽(C-端 50个氨基酸)。A亚基(天然的或嵌合的形式) 通常存在于全毒素的背景下；但是，在单独表达时(例如，没有B亚基)，A亚基或其片段可以引起针对11E10表位的免疫应答。本文使用的术语“蛋白支架”或“支架”表示这样的蛋白结构，其已经插入了异源蛋白的一个或多个氨基酸序列，例如，在SEQ ID N0:l、2或3中所述的乂口氨基酸序列。优选地，蛋白支架的三维结构是已知的，且异源蛋白的片段被插入在关键位置，例如，在表面暴露的环处，或在蛋白支架和异源蛋白之间的结构同源性区域。Stx2的片段的插入，可以伴随着选择性地删除蛋白支架的某些序列，例如，与要被插入的序列具有结构同源性的序列。 在该实例中，蛋白支架的未删除的序列可以用于确定与另一种蛋白(例如，Stxl)的序列同一性百分比。已经用作蛋白支架的示例性的蛋白是Stx或^xl (本文所述)、绿色荧光蛋白 (Abedi等人(1998) Nucleic Acids Res. 26 :623-630)、和细胞毒性T淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA-4) (Hufton等人(2000) FEBS Iett. 475 :225-231)。蛋白支架特别地排除异源蛋白序列与其末端融合的蛋白标签，例如，FLAG表位或谷胱甘肽-S-转移酶。“基本上相同的”是指，当最佳地比对(例如使用下述的方法)时，与第二核酸或氨基酸序列(例如，Stx2、Stxl或嵌合蛋白，诸如在SEQ ID NO 8中所述的序列)具有至少 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 序列同一性的核酸或氨基酸序列。“基本同一性”可以用于表示不同类型和长度的序列， 诸如全长序列、表位或免疫原性肽、功能结构域、编码和/或调节序列、外显子、内含子、 启动子和基因组序列。以不同的方式测定2个多肽或核酸序列之间的同一性百分比，所述方式属于本领域的常识，例如，使用可公开得到的计算机软件，诸如Smith Waterman比对(Smith, Τ. F.和 Μ. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147 :195-7)；“最佳拟合” (Smith 禾口 Waterman (1981) Advances inApplied Mathematics, 482—489),其整合进 GeneMatcher Plus 中(Schwarz禾口Dayhof (1979)Atlas of Protein Sequence and Structure,Dayhoff, M. 0.编，第；353-358页)；BLAST程序(基础的局部比对搜索工具(Altschul，S. F. ,W. Gish, 等人(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST_2、 ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign (DNASTAR)软件。另外，本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在要对比的序列长度上实现最大比对所需的任意算法。一般而言，对于蛋白，对比序列的长度可以是至少5个氨基酸，优选10、25、50、100、150、200、300 或315个氨基酸或更多达到蛋白的整个长度。对于核酸，对比序列的长度通常可以是至少 15、75、150、300、450、600、900或945个核苷酸或更多达到核酸分子的整个长度。应当理解， 对于测定序列同一性的目的，当对比DNA序列和RNA序列时，胸腺嘧啶核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。在一个实施方式中，可以在SEQ ID NO :8的片段(例如，SEQ ID NO :8的氨基酸 64-122或64-282)长度上，测量蛋白(例如，志贺毒素蛋白的成熟A亚基)的序列同一性。 对于氨基酸序列，保守替换(替代、置换，substitutions)通常包括在下述组内的替换甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、 苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。“片段”是指多肽或核酸分子的一部分，其含有参照核酸分子或多肽的整个长度的小于 100%，优选至少 2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%。 片段可以含有，例如，10、15、75、150、300、450、600、900或945或更多个核苷酸，或4、5、10、 25、50、100、150、200、300、315个氨基酸或更多。志贺毒素1型或志贺毒素2型蛋白的片段可以包括小于全长蛋白的任意部分，例如，长度为4、5、8、10、25、50、100、150、200、300、315、或更多个氨基酸的片段。在一个实施例中，片段包括SEQ ID NO :8的氨基酸64-122或64-282。“志贺毒素相关疾病”是指由表达志贺毒素的病原体导致的任意疾病。术语“志贺毒素相关疾病”意在包括溶血性尿毒症综合征、志贺细菌性痢疾(shigellosis)、和由生成志贺毒素的大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染导致的疾病。


图IA示出了最初的杂种(杂交，hybrid) Mxl/Stx2A亚基。Stxl以黑色显示，Stx2 以白色描绘。在各个嵌合蛋白的左侧显示了嵌合毒素的名称，在嵌合的A亚基的下面列出了 的区域。图IB显示了用兔抗-Stxl和抗-Stx2多克隆(上图)或单克隆11E10 (下图)探测(作为探针检测，probe)的Stxl、Mx2和最初的嵌合毒素的蛋白印迹分析。泳道1和2 分别含有25ng纯化的Stxl或Stx2。泳道3-8含有下述嵌合毒素泳道3，Stxl (2A29_297)； 泳道 4，Stxl (2Ah58)；泳道 5，Stxl(2A29_128)；泳道 6，Mxl QA29_76)；泳道 7，Stxl (2A42_76)；泳道 8，Stx 1(2A42_49)。图IC显示了 11E10单克隆抗体对最初的嵌合毒素的中和百分比。将中和数据标准化，使得全的％中和设定为100% (实际的％中和=65% )，并以标准化的全长 Stx2中和的百分比，给出其它毒素的中和水平。误差棒代表标准化的值的标准误差。图2A显示了 MxAl和MxA2在包含1 IElO单克隆抗体表位的3个区域中的氨基酸比对。黑色和灰色氨基酸分别描绘了保守的和非保守的氨基酸；点代表相同的残基。11E10 单克隆抗体表位的3个区域如下区域A (MxA2残基42-49)、区域B (StxA2残基96-100)、区域C (StxA2残基M4-259)。在比对中显示的氨基酸的编号是相对于MxAl成熟蛋白。StxAl 具有在位置185处的额外氨基酸；该添加造成区域C(在MxA2中的表位)成为与Mxl的对应区域不同的一个编号。图2B显示了晶体结构的条带图，它用浅灰色显示了 Μχ2Α1和B亚基，11E10单克隆抗体表位的3个区域除外。区域A(绿色)、B (蓝色)和C(青色)分别用黑色、灰色和白色的箭头标记。用黑色描绘A2肽，且用星号标记活性部位(红色)。图2C显示了晶体结构的填空表示(spacefill representation)。用箭头指示区域A、B和C。图3A示出了含有嵌合的A亚基的第二代嵌合毒素。Mxl以黑色显示，而以白色描绘。在各个嵌合蛋白的左侧显示了嵌合毒素的名称，在嵌合的A亚基的下面列出了 Stx2 的区域。区域 A、B 和 C 分别表的氨基酸 42-49 (SEQ ID NO 1) ,96-100 (SEQ ID NO 2)、244-259(SEQ IDNO 3)。图:3B描述了用兔抗-Stxl (上图)或11E10单克隆抗体(下图)探测的Mxl、Stx2 和5个第二代嵌合毒素的蛋白印迹分析。泳道1含有25ng纯化的Mx2。泳道2_6含有下述嵌合毒素泳道2，Stxl+A ；泳道3，Stxl+AB ；泳道4，Stxl+AC ；泳道5，Stxl+BC ；泳道6， Stxl+ABCο图3C显示了 11E10单克隆抗体对第二代杂种毒素的中和。将中和的水平标准化为100%，如在图IC中所示。误差棒代表标准化的值的标准误差。图4A显示了使用11E10单克隆抗体对和变体的蛋白印迹分析。泳道 1含有25ng纯化的Mx2。泳道2-5含有下述毒素泳道2，Stx2c ；泳道3，Stx2d ；泳道4， Stx2dact ；泳道5，Mx2e。用兔抗_Stx2多克隆抗体(上图)或单克隆抗体11E10 (下图)探测蛋白印迹。图4B描述了 11E10对变体的中和百分比。将中和的水平标准化为 100%，如在图IC中所示。误差棒代表标准化的值的标准误差。图5描述了通过兔网织红细胞裂解物中萤光素酶mRNA的翻译测得的蛋白合成抑制。将纯化的的0. 2ng等分试样与0、0. 2或2ng 11E10相混合，并加入网织红细胞裂解物中。通过萤光素酶mRNA的翻译的减少，指示蛋白合成抑制，并在向萤光素底物加入毒素-处理过的裂解物以后，通过生物发光测量。将2ng同种型-匹配的(isotype-matched) 无关的抗体13C4样品与2ng 相混合，作为阴性对照。误差棒代表从平均比标准误差计算出的95%置信区间。从双尾Mudent氏t_检验衍生出的概率值指示含有和没有抗体的样品之间的生物发光信号的显著差异(P < 0. 005)。图6A-6J证实，单克隆抗体11E10会改变Vero细胞中的总细胞分布。将 Stx2与PBS (A、H-J)或11E10 (B、C和E-G)相混合，然后加给Vero细胞他。作为对照，在没有
存在下，将11E10加给Vero细胞(D)。用针对的多克隆抗体、然后用AlexaFluor 488结合的第二抗体检测毒素(A和B)，而用AlexaFluor 488结合的抗-小鼠IgG检测 11E10(C和D)。通过中毒的细胞的双重标记，评估与初级内体(内涵体，endosome)标志物EEAl的共区域化。用抗_Stx2单克隆IlFll和绿色荧光第二抗体，使在有(图E)和没有(图H)抗体11E10存在下的乂口分布显现出来(可视化，visualize)。用山羊抗-EEAl 和红色荧光第二抗体，使内体标志物EEAl的分布显现出来(图F和I)。使这些染色图案重叠(图G和J)，并用黄-橙染色(用箭头指示)，指示毒素与内体的共区域化。图7A-7D显示了 x2区域A(SEQ ID NO 1)(图 7A)、Stx2 区域 B (SEQ ID NO 2) (图 7B)、Stx2 区域 C (SEQ ID NO :3)(图 7C)和 Stx2e 区域 B (SEQ ID NO :19)(图 7D)的氨基酸序列。
图8A显示了 Mxl+A嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2A区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸；成熟蛋白的长度是293个氨基酸。图8B显示了 Mxl+AB嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO :5)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2A和B区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸； 成熟蛋白的长度是293个氨基酸。图8C显示了 Mxl+AC嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO :6)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2A和C区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸； 成熟蛋白的长度是293个氨基酸。图8D显示了 Mxl+BC嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO 7)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2B和C区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸； 成熟蛋白的长度是293个氨基酸。图8E显示了 Mxl+ABC嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO 8)。加工过的前导序列标有下划线，Stx2A, B和C区域是粗体且标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸；成熟蛋白的长度是293个氨基酸。图9A显示了 Mxl操纵子的DNA序列(SEQ ID NO 9)，其从MxAl起始密码子处开始，并在MxBl终止密码子处结束。图9B显示了 MxAl的DNA序列(SEQ ID NO :10)，其从MxAl起始密码子处开始， 并在MxAl终止密码子处结束。图9C显示了 StxBl的DNA序列(SEQ ID NO :11)，其从MxBl起始密码子处开始， 并在MxBl终止密码子处结束。图IOA显示了 MxAl的氨基酸序列(SEQ ID N0:12)。加工过的前导序列标有下划线。未加工的蛋白的长度是315个氨基酸；成熟蛋白的长度是293个氨基酸。图IOB显示了 StxBl的氨基酸序列(SEQ ID N0:13)。加工过的前导序列标有下划线。未加工的蛋白的长度是89个氨基酸；成熟蛋白的长度是69个氨基酸。图IlA显示了操纵子的DNA序列(SEQ ID NO 14)，其从MxA2起始密码子处开始，并在MxB2终止密码子处结束。图IlB显示了 MxA2的DNA序列(SEQ ID NO 15)，其从MxA2起始密码子处开始， 并在MxA2终止密码子处结束。图IlC显示了 MxB2的DNA序列(SEQ ID NO 16)，其从MxB2起始密码子处开始， 并在MxB2终止密码子处结束。图12A显示了 MxA2的氨基酸序列(SEQ ID NO 17)。加工过的前导序列标有下划线。未加工的蛋白的长度是319个氨基酸；成熟蛋白的长度是297个氨基酸。图12B显示了 StxB2的氨基酸序列(SEQ ID NO 18)。加工过的前导序列标有下划线。未加工的蛋白的长度是89个氨基酸；成熟蛋白的长度是70个氨基酸。
具体实施例方式一般而言，本发明的特征在于与蛋白的11E10表位的发现有关的组合物和方法。我们已经发现，11E10表位包括在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的至少1个、2个或3个。本发明的组合物和方法可以用于检测、治疗或预防志贺毒素相关疾病。例如，用含有11E10表位的肽或用特异性地结合蛋白的11E10表位的抗体，可以治疗具有志贺毒素相关疾病(例如，溶血性尿毒症综合征和与大肠杆菌和痢疾志贺氏菌感染有关的疾病) 或处于发展所述疾病的风险中的受试者(主体、对象，subject)。I.适应症志贺毒素相关疾病包括由生成志贺毒素的痢疾志贺氏菌或肠出血性 (enterohemorrhagic)大肠杆菌(EHEC)(最特别地，血清型0157:H7)的感染导致的那些疾病。这些感染经常导致溶血性尿毒症综合征(HUQ，其特征在于溶血性贫血、栓塞性血小板减少症和肾衰竭。本发明的化合物和方法可以用于治疗具有志贺毒素相关疾病或处于发展所述疾病的风险中的受试者。这样的受试者包括日间住院医疗的(in day care)儿童或在医护疗养所中的老年人。在一个实施例中，所述受试者是在日间住院医疗中或在医护疗养所中，该处已经检测出EHEC腹泻的病例。在该实施例中，所述受试者可能已经或没有发展所述疾病。本发明的方法和组合物可以用于治疗受EHEC感染的个体中的感染、检测其它受感染的个体、和预防EHEC在日间住院医疗或医护疗养所中的传播。II.抗体本发明包括特异性地结合志贺毒素2型(Stx2)蛋白的11E10表位的抗体的生产和抗体本身。理想地，这样的抗体不会可检测地结合Mxl。抗体的识别和特异性地结合靶蛋白的独特能力，提供了用于诊断和治疗与生成志贺毒素的大肠杆菌(STEC)有关的疾病的方案。本发明提供了抗体的生产，所述抗体包括、但不限于，多克隆和单克隆抗体、抗-独特型(anti-idiotypic)抗体、鼠和其它哺乳动物抗体、抗体片段、双特异性抗体、抗体二聚体或四聚体、单链抗体(例如，scFv' s和结合抗原的抗体片段诸如Fab、双抗体和Fab'片段)、基于抗体结合区的重组结合区、嵌合抗体、灵长类动物化的抗体、人源化抗体和全人抗体、结构域删除(缺失，deleted)的抗体、和用可检测的标志物标记或用毒素或放射性核素偶联的抗体。这样的抗体通过本领域已知的常规方法生产。在一个方面，本发明包括特异性地结合的11E10表位的单克隆抗体或抗体片段的制备，其中所述制备包括，使用多肽，所述多肽含有选自在SEQ ID NO :1、2或3中所述的序列的至少1个、2个或3个序列。 一个实例是在SEQ ID NO 8中所述的蛋白。多克隆抗体通过如下免疫兔或其它动物，可以制备多克隆抗体注射抗原，随后以适当的间隔进行强化。给动物抽血，并通常通过ELISA，针对纯化的蛋白测定血清。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射抗原和佐剂，可以在动物体内产生特异性地结合11E10表位的多克隆抗体。使用双功能试剂或衍生剂(例如，马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基结合)、 戊二醛或琥珀酸酐)，将含有11E10表位的肽结合到在被免疫的物种中呈免疫原性的蛋白上(例如，钥孔嘁血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂)，这是有用的。例如，可以针对11E10表位，用免疫原性结合物或衍生物免疫动物，其通过下述进行将Iyg至Img所述肽或结合物(分别对于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂(Freund' s complete adjuvant)混合，并将此溶液在多个位点皮内注射。一个月后，通过在多个位点皮下注射，用占原始量1/5至1/10的在弗氏完全佐剂中的肽或结合物强化 (boost)动物。7-14天后，抽取动物血样，并测定血清的针对抗原或其片段的抗体效价。强化动物，直至效价平稳。优选地，用相同多肽的结合物强化动物，但是所述结合物结合不同的蛋白和/或通过不同交联剂结合。还可在重组细胞培养物中制备结合物，作为蛋白融合物。还适当地使用明矾等凝聚剂来增强免疫应答。可以在人免疫球蛋白基因的转基因动物中，或通过从原料(起始材料，starting material)受试者分离2种或更多种反应性的B-淋巴细胞，生产嵌合的、人源化的或全人多克隆抗体。也可以纯化和选择多克隆抗体(例如，对于构象限制的抗原肽，通过亲和力)，在必要时重复，以提供单克隆抗体。可替换地或附加地，可以采用从淋巴细胞克隆出编码单个抗体的核酸。单克隆抗体在本发明的另一个实施方式中，从基本上同源的抗体的群体(即除了可能存在少量天然产生的突变以外，构成(including)群体的单独抗体是相同的)，得到单克隆抗体。 因此，术语“单克隆”指示抗体的特征不是离散抗体(discrete antibodies)的混合物。通过本领域已知的方法可以制备单克隆抗体，所述方法例如Kohler和Milstein 的杂交瘤方法，其通过使来自免疫的小鼠的脾细胞与连续复制的肿瘤细胞(诸如骨髓瘤或淋巴瘤细胞)融合而进行(Kohler 和 Milstein(1975)Nature 256 :495-497 ;Gulfre 和 Milstein(1981)Methods in Enzymology Jmmunochemical Techniques 73 :1-46,Langone 和Banatis编，Academic Press)。然后通过有限稀释方法，克隆杂交瘤细胞，并通过ELISA、 RIA或生物测定，测定上清液的抗体生产。在另一个实施方式中，可以通过重组DNA方法制备单克隆抗体。为了制备特异性地结合IlElO表位的单克隆抗体(Mab)，可以使用由培养的连续细胞系生产抗体分子的任意技术。例如，由上面的Kohler和Milstein((1975)最初开发的、以及在 Kohler 和 Milstein(1976)Eur J Immunol. 6 :511-519 ;Kohler 等人(1976)Eur J Immunol. 6 :292-295 ；Hammerling ^A (1981) B =Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y.，第563-681页)中的杂交瘤技术，和三源杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人(198 Immunol Today 4 :72-79)，和用于生产人单克隆抗体的 EBV-^^^^^ (Cole^A (1985) B =Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R. Liss, Inc.，第77-96页)。这样的抗体可以属于任意的免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、 IgE、IgA、IgD和它们的任意子类。可以在体外或在体内培养在本发明中生产Mab的杂交瘤。在本发明的另一个实施方式中，使用本领域已知的技术，可以在无菌动物中生产单克隆抗体。—般而言，用包括IlElO表位的多肽免疫小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠)， 以诱导淋巴细胞，该淋巴细胞生产或能生产可特异性地结合用于免疫的抗原或其片段的抗体。可替换地，在体外免疫淋巴细胞。取出免疫的宿主动物(例如，小鼠)的脾细胞，并使用合适的融合剂(如聚乙二醇)，使所述脾细胞与合适的细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，以形成杂交瘤细胞(Goding(1986)Monoclonal Antibodies Principles andPractice,第59-103页，Academic I^ress)。根据本发明，可以使用任意合适的骨髓瘤细胞系；但是，优选的骨髓瘤细胞是有效地融合、支持选择的抗体生产细胞的稳定的高水平抗体生产、且对培养基(诸如HAT培养基)敏感的那些。在它们中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如来源于可从Mlk Institute Cell Distribution Center, San Diego，Calif. USA 得到的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠肿瘤的那些，和可从美国典型培养物保藏中心，Rockville, Md. USA得到的SP-2细胞。可以在合适的培养基中，接种和培养如此制备的杂交瘤细胞，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。然后可以测定通过这样的选择和/或培养基(在其中维持杂交瘤细胞)得到的杂交瘤细胞，以鉴别特异性地结合IlElO表位的单克隆抗体的生产。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合试验诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)或使用Biacore仪器，测定由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性。通过例如Munson和Rodbard ((1980) Anal Biochem. 107 220-239)的katchard分析，可以测定单克隆抗体的结合亲和力。鉴别出生产具有所需的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，通过有限稀释过程，可以亚克隆所述克隆，并通过标准方法培养(Goding，同上)。此外，所述杂交瘤细胞可作为动物的腹水瘤(ascites tumors)在体内生长。通过常规的免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法，可以使由亚克隆分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水液或血清中分离出来。使用常规方法(例如，使用能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以容易地分离并测序编码本发明的单克隆抗体的DNA。本发明的杂交瘤细胞用作这类DNA的优选来源。分离后，可以将所述DNA置于表达载体中，然后转染进宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体(参见例如，Skerra等人(199;3)Curr Opin Immunol. 5 :256-262 和 Pluckthun(1992)Immunol Rev. 130 151—188)。还可以修饰DNA，例如通过使人重链和轻链恒定结构域的编码序列的全部或一部分代替同源的鼠序列(Morrison 等人(1984) Proc Natl AcadSci. U. S. A. 81 :6851-6855), 或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价地连接到免疫球蛋白编码序列上。以此方式，制备嵌合或杂种抗体，它们具有抗-IlElO表位单克隆抗体的结合特异性。 通常，这种非免疫球蛋白多肽代替本发明抗体的恒定结构域，或者它们代替本发明抗体的抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合的二价抗体，所述嵌合的二价抗体包括一个具有对根据本发明的IlElO表位的特异性的抗原结合位点和另一个具有对不同抗原的特异性的抗原结合位点。修饰的抗体本发明的修饰的抗体包括、但不限于嵌合的单克隆抗体(例如，人-小鼠嵌合体)、人单克隆抗体和人源化的单克隆抗体。嵌合抗体是这样的分子，其中不同的部分源自不同的动物物种，诸如具有人免疫球蛋白恒定区和源自鼠mAb的可变区的那些(参见，例如，美国专利号4，816，567和4，816，397)。非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗体的其它抗原结合子序列)，所述免疫球蛋白链或其片段含有源自非人免疫球蛋白的最小序列，诸如一个或多个来自非人物种的互补性决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(参见，例如，美国专利号5，585,089)。人源化的抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体(recipient)的互补性决定区(CDR)的残基被具有所需的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体) (诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基替代。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基替代。人源化的抗体还可以包括在受体抗体中和在输入的CDR或框架序列中都不存在的残基。一般而言，人源化的抗体包括基本上所有的至少一个、通常2个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区域与非人免疫球蛋白的CDR区域相对应，且所有或基本上所有的FR区域是人免疫球蛋白共有序列的FR区域。人源化的抗体还最适宜地至少包括免疫球蛋白恒定区(Fe)的一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。通过本领域已知的重组DNA技术，例如使用在下述文献中所述的方法，可以生产嵌合的和人源化的单克隆抗体:WO 87/02671 ；EP 184,187 ；EP171,496 ；EP 173,494 ； WO 86/01533 ；US 4, 816, 567 ；EP 125，023 ;Better 等人(1988) kience 240:1041-1043; Liu 等人((1987) Proc Natl Acad Sci. U. S. A. 84:3439-3443) ；Liu 等人((1987) J Immunol. 139 :3521-3526) ；Sun 等人((1987) Proc Natl Acad Sci. U. S. A. 84 :214-218)； Nishimura 等人((1987)Cancer Res. 47 :999-1005) ；Wood 等人((1985)Nature 314 446-449) ；Shaw 等人((1988)J Natl Cancer Inst. 80 :1553-1559) ；Morrison ((1985) Science 229 :1202-1207) ；Oi 等人((1986)Biotechniques. 4 :214) ；US5, 225，539 Jones 等人((1986)Nature 321 :552-525) ；Verhoeyan 等人((1988)Science 239 :1534)；和 Beidler等人((1988) J Immunol. 141 :4053-4060)。关于人源化的抗体和与其有关的方法的进一步讨论，参见下面。Newman ((1992)Biotechnology. 10 :1455-1460)公开了另一种生产重组抗体的非常有效的方法。也参见美国专利号5，756，096 ；5, 750, 105 ；5，693，780 ；5, 681, 722 ；和 5，658，570。将非人抗体人源化的方法是本领域众所周知的。人源化可以基本上按照如上所述的 Winter 和同事的方法(包括 Jones 等人 0 ((1986) Nature 321 :522-525) ；Riechmann 等人((1988) Nature 332 :323-327) ；Verhoeyen 等人((1988) Science 239 :1534-1536)来完成，其通过用啮齿动物CDR或CDR序列代替人抗体的相应序列进行。因此，这种人源化的抗体是嵌合抗体(参见美国专利号4，816，567和6，331，415)。在实践中，人源化的抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和一些可能的FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基替代。要用于制备人源化的抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择，对于减少抗原性而言是非常重要的。根据所谓的最佳拟合方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库，筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后接受与啮齿动物的序列最接近的人序列， 作为人源化的抗体的人框架(FR) (Sims 等人(1993) J Immunol. 151 =2296-2308 ；Chothia 和Lesk (1987) JMolBiol. 196 :901-917)。另一种方法使用源自轻链或重链的特定子集 (subgroup)的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化的抗体(Carter 等人(1992)Proc Natl Acad Sci. U. S. A. 89 :4285-4289 ；Presta 等人 (1993)J Immunol. 151 :2623-2632)。
还希望，被人源化的抗体保留对抗原(即，Stx2的11E10表位)的高亲和力和其它有利的生物特性。为实现这一目的，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和不同概念的人源化产物，来制备人源化的抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且是本领域技术人员熟知的。可获得例证并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些展示(显示，displays)，可以分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析这些残基影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力。以此方式，可以选择FR残基，并与共有和输入(import)序列结合，从而得到所需的抗体特征， 诸如增加的对(一种或多种)靶抗原的亲和力。一般而言，⑶R残基直接地并最显著地参与影响抗原的结合。全人抗体可用于人受试者的治疗性处理。例如，使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因、但是可以表达人重链和轻链基因的转基因小鼠，可以生产这样的抗体。可以以常见方式，用选择的抗原(例如，包括11E10表位的多肽)免疫转基因小鼠。例如，参见 PCT
发明者安杰拉·迈尔顿-塞尔桑, 艾利森·奥博莱, 詹姆斯·辛克莱尔, 迈克尔·史密斯 申请人:杰克孙 M. 亨利基金会先进军事医学有限公司