针对肌钙蛋白i的抗体及其使用方法

专利名称：针对肌钙蛋白i的抗体及其使用方法
针对肌钙蛋白I的抗体及其使用方法发明背景发明领域本发明涉及针对肌钙蛋白I的抗体及其使用方法。背景信息肌钙蛋白I是可以在例如心肌梗死之后或过程中的心肌损伤测定中使用的肌肉蛋白质。特别地，肌钙蛋白I是肌钙蛋白复合物的3个亚单位之一，其定位于肌肉收缩器的细丝上。这种复合物在控制肌肉收缩的过程中具有主要作用。其他2个亚单位(即，T和 C)在心脏以及骨骼肌组织中也由肌钙蛋白I固定在细肌丝上。测量人血清中的心脏肌钙蛋白I的测定已得到描述。例如，放射性测定已用于这个目的(Cummins 等人，Am Heart Tournal 113:1333-1344(1987)。然而，该测定利用与骨骼形式的肌钙蛋白I具有显著交叉反应性的多克隆抗体。进一步地，已利用了使用2种不同单克隆抗体的夹心测定(Bodar等人，Clinical Chemistry 38:2203-2214(1992)；还参见美国专利号7，观5，418)。不幸的是，此种测定具有非常高的不精确性。因此，当然存在关于对于肌钙蛋白I高度特异性且灵敏的免疫测定的需要。这些免疫测定还必须利用对骨骼组织中发现的肌钙蛋白I不具有交叉反应性的抗体。特别地，需要此种免疫测定，从而使得合适疗法可以由治疗医生利用，从而对受累患者给予最佳的可能预后。本文提及的所有专利和出版物在此整体弓I入作为参考。发明概述本发明涉及能够与心脏肌钙蛋白I结合的结合蛋白，特别是抗体。特别地，这些抗体与肌钙蛋白I的一个或多个表位结合。进一步地，本发明还提供了产生且例如在诊断测定中使用这些结合蛋白或其部分的方法。特别地，本发明包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，称为iTnI 19C7AM1 hGl CHO 204，由美国典型培养物保藏中心(ATCC)指定保藏号 PTA-9816，以及由这种细胞系产生的重组抗体。另外，本发明包括与肌钙蛋白I结合的包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白， 所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个互补性决定区(CDR) GYTFTDYNLH(SEQ ID NO :52)、YIYPYNGITGYNQKFKS(SEQ ID NO 53),DAYDYDLTD(SEQ ID NO: 54)、RTSKNVGTNIH(SEQ ID NO :55)、YASERLP (SEQ ID NO :56)和 QQSNNWPYT (SEQ ID NO :57)。 本发明的结合蛋白可以包括例如这些CDRs中的至少3个。进一步地，这种结合蛋白还可以包括人接纳体构架或支架。这种结合蛋白可以选自例如免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、⑶R嫁接的抗体、人源化抗体、Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体或这些实体中的任何一种的功能上活性的表位结合片段。本发明还包含编码结合蛋白的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白的可变重链的氨基酸序列与SEQ ID NO. :25具有至少70%同一性(参见

图12)。这种分子还可以包括与 SEQ ID N0. 28具有至少70%同一性的可变轻链(参见图12)。
此外，本发明包括编码结合蛋白的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白的可变重链的氨基酸序列是SEQ ID NO. :25ο另外，本发明包括编码结合蛋白的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白的可变轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO. :28。这种分子可以进一步包括编码可变重链的分离的核酸分子，其中所述重链的氨基酸序列是SEQ ID NO. :25。本发明还包括包含与调节元件(例如启动子)附着的上述一种或多种核酸分子的载体，以及包括这种载体的宿主细胞。此外，本发明包括产生能够与肌钙蛋白I结合的上述任何一种结合蛋白的方法， 所述方法包括在足以产生目的结合蛋白的时间和条件下培养上述宿主细胞。本发明还包括通过这种方法产生的结合蛋白。此外，本发明包括包含上述任何一种或多种结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。同样，本发明包括检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的方法。这种方法包括步骤 在足以形成抗体/抗原复合物的时间和条件下，使测试样品与抗体接触，所述抗体与肌钙蛋白I结合并且包括SEQ ID NO. :25;并且检测复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中肌钙蛋白I抗原的存在。抗体可以进一步包括SEQ ID NO. :28。抗体可以通过具有ATCC保藏指名PTA-9816的中国仓鼠卵巢细胞系产生。本发明还包括检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的方法，其包括步骤在足以形成第一种抗体/抗原复合物的时间和条件下，使测试样品与第一种抗体接触，所述第一种抗体与肌钙蛋白I结合并且包括SEQ ID N0:25 ；在足以形成第一种抗体/抗原/第二种抗体复合物的时间和条件下，将缀合物添加到第一种抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的第二种抗体；和检测通过信号生成化合物生成的信号的存在，所述信号的存在指示所述测试样品中肌钙蛋白I抗原的存在。第一种抗体可以进一步包括SEQ ID N0:28，并且可以通过具有ATCC保藏指名PTA-9816的中国仓鼠卵巢细胞系产生。同样，本发明包括检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的方法，其包括步骤在足以形成肌钙蛋白I抗原/抗体复合物的时间和条件下，使肌钙蛋白I抗原与针对肌钙蛋白I 的抗体接触，其中所述抗体包括SEQ ID NO :25，并且由能够生成可检测信号的信号生成化合物标记；在足以形成肌钙蛋白I抗原/抗体/肌钙蛋白I测试样品抗原复合物的时间和条件下，将测试样品添加到所述肌钙蛋白I抗原/抗体复合物中；并且检测通过信号生成化合物生成的信号的存在，所述信号的存在指示测试样品中肌钙蛋白I抗原的存在。再次，该抗体可以进一步包括SEQ ID NO :28，并且可以通过具有ATCC保藏指名PTA-9816的中国仓鼠卵巢细胞系产生。本发明还包含检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的另一种方法。这种方法包括步骤在足以形成肌钙蛋白I参考抗原/抗体复合物的时间和条件下，使测试样品与1)肌钙蛋白I参考抗原和2、针对肌钙蛋白I抗原的抗体接触，其中所述抗原与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着，且其中所述抗体包括SEQ ID NO :25;并且检测通过信号生成化合物生成的信号，其中测试样品中检测到的肌钙蛋白I抗原的量与结合抗体的肌钙蛋白I 参考抗原的量成反比。再次，该抗体可以进一步包括SEQ ID NO :28，并且可以通过具有ATCC保藏指名PTA-9816的中国仓鼠卵巢细胞系产生。此外，本发明包括包含上述任何一种或多种结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还包含诊断怀疑具有这些状况之一的患者中的急性冠状动脉综合征或心肌梗死的方法。这种方法包括步骤从患者中分离生物学样品；在足以形成肌钙蛋白I抗原 /抗体复合物的时间和条件下，使生物学样品与抗体接触，所述抗体与肌钙蛋白I结合且包括SEQ ID NO 25 ；检测肌钙蛋白I抗原/抗体复合物的存在；使复合物中存在的肌钙蛋白 I抗原与所述复合物中存在的抗体解离；并且测量所解离的肌钙蛋白I抗原的量，其中大于正常群体第99百分位的肌钙蛋白I值约1-5倍的肌钙蛋白I抗原的量指示患者中急性冠状动脉综合征或心肌梗死的诊断。本发明包括诊断怀疑具有这些状况之一的患者中的急性冠状动脉综合征或心肌梗死的另外方法。这种方法包括步骤从患者中分离生物学样品；在足以形成肌钙蛋白I抗原/抗体复合物的时间和条件下，使生物学样品与第一种抗体接触，所述第一种抗体与肌钙蛋白I结合且包括SEQ ID N0:25 ；在足以允许缀合物与结合的肌钙蛋白I抗原结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的肌钙蛋白I抗原/抗体复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的第二种抗体；通过检测通过所述信号生成化合物生成的信号，检测所述生物学样品中可能存在的肌钙蛋白I抗原的存在；并且通过测量信号的强度，测量测试样品中存在的肌钙蛋白I抗原的量，大于正常群体第99百分位值约1-5倍的肌钙蛋白I抗原的量指示患者中急性冠状动脉综合征或心肌梗死的诊断。本发明还包括包含上述任何一种或多种单克隆抗体或结合蛋白和若必要的话描述使用这种试剂盒的方式的说明书的试剂盒。另外，本发明包括包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个CDR CDR-VHl。^C1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID N0:63)，其中X1 是 G ；& 是 Y ；& 是 T 或 S ；& 是 F ；X5^T ；& 是 D;X7 是 Y ；& 是 N ；X9 是 I 或 L ；和X10 是 H。CDR-VH2。X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-XI5-XI6-Xit(SEQ ID N0:64)，其中X1 是 Y ；X2 是 I ；& 是 Y ；CDR-VH3。X1-X2-JC3-X4-)C5-X6-X7-X8-)C9-X1()(SEQ ID NO :6 ，其中&是P ；
&是Y ；
&是N;
X7 是 G ；
X8 是 I ；
X9 是 T ；
X10 是 G ；
X11 是 Y ；
)(12 是 N ；
X13 是 Q ；
X14 是 K ；
Xl5 是 F ；
)(16是1^;和
Xl7 是 So
CDR-VH3o X1-X2
&是0 ；
&是A或F ；
X3 是 Y ；
&是D ；
&是Y或S ;
&是D ；
X7 是 W、Y 或 A ；
X8 是 L ；
X9是A或T ；和
)(1(1是￥或D。
CDR-VLl。\「\
X1 是 R ；
&是A或T ；
X3 是 S ；
&是Q或K ；
&是S或N ；
&是I或V ；
X7 是 G ；
X8 是 τ ；
X9 是N;
X10是I ；和
X11是Y或H。
CDR-VL2。^C1-X
&是￥ ；
CDR-VLl0 X1 -X2-X3-X4-X5-X6-X7-Xr-VX1 η(SEQ ID NO :66)，其中
.2 八3八4八5八6八7 ‘
& 是 A 或 G ；)(3是3 或T;& 是 E ；& 是 S 或 R ；X6 是 I、L或 V;和X7 是 S、P 或 F。和CDR-VL3。^C1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID N0:68)，其中X1 是 Q ；& 是 Q ；& 是 S ；X4 是N;& 是 N ；)(6 是 W ；X7 是 P ；)(8是￥;和X9 是 T。附图简述图1是显示用于鉴定且产生对于肌钙蛋白I具有改善的亲和力的抗体的步骤的流程图。图2是野生型TnI 19C7单链可变片段(“scFv”)的核苷酸描述(SEQ ID NO :109 和 SEQ ID NO :110)。图3显示表达全长TnI 19C7单链可变片段(scFv)的酵母与称为 scTnI-C-2 (Spectral Diagnostics, RP-3700)的单链肌钙蛋白 I (沘-llOaa)-接头-肌钙蛋白C结合。更具体而言，该图显示TnI 19C7 scFv表达酵母与scTnI-C-2或抗V5—起温育，随后分别为抗肌钙蛋白mAb和山羊抗小鼠藻红蛋白(GAM:PE)(图3B)或GAM:PE(图 3A)。流式细胞术直方图举例说明如通过抗V5检测的TnI 19C7 scFv的全长表达和TnI 19C7 scFv与scIW-C-〗结合的能力。PE-A单位(横坐标)ΙΟ2、103、IO4和105。计数单位 (纵坐标):102、IO3UO4 和 IO50图4显示TnI 19C7 scFv解离速率(off-rate)测量。更具体而言，表达TnI 19C7 scFv的酵母与饱和浓度的scTnI-C-2 —起温育。细胞洗涤2次，并且在每个时间点，将细胞转移至冰，洗涤且与抗TnI mAb—起温育。在30分钟后，细胞再次洗涤且与山羊抗小鼠藻红蛋白一起温育。再次在30分钟后，细胞洗涤且在流式细胞仪上分析。一阶衰变方程用于拟合个别时间点，其中ml是在时间0时的理论最高限度平均荧光单位(“MFU”)，m2是解离速率(“koff”)，m3是由于自身荧光的本底MFU，并且其为时间x(x是被测量的时间)的 MO是获得测量的时间χ。使用下述计算与TnI-C-2结合的TnI 19C7 scFv的半衰期(t1/2) t1/2 = ln2/k。ff。5乘半衰期是用于分选TnI 19C7 scFv⑶R诱变文库的时间。图5显示 ιΙ 19C7 scFv平衡解离常数(KD)测量。更具体而言，表达TnI 19C7 scFv的酵母与不同浓度的scTnI-C-2—起温育。细胞用PBS pH6. 8/2 % BSA/0. 02 %Standapol ES-I洗涤2次，并且与抗TnI mAb —起温育30分钟。细胞再次洗涤且与山羊抗小鼠藻红蛋白一起温育30分钟。最后，细胞洗涤且在流式细胞仪上分析。图6是显示简并寡核苷酸为何如此设计的示意描述，从而使得制备此种引物，以便对于每个CDR，70%核苷酸残基保持为野生型残基，并且30%是其他3种残基的混合物。 对于每个文库生成2种PCR产物掺料(sp) PCR产物和非掺料PCR产物。掺料和非掺料PCR 产物组合，以生成完整的⑶R诱变的scFv文库。图7是显示TnI 19C7 scFv文库如何使用酵母同源重组进行构建的示意描述。更具体而言，掺料的CDR PCR产物和切除的酵母展示载体转化到啤酒糖酵母(S. cerevisiae) 菌株EBY100内。在色氨酸缺陷葡萄糖培养基中选择转化的克隆。图8是显示用于生成scFv构建体的PCR弓丨物(tpVHfor直到tpVLrev)，用于生成⑶R掺料的文库的那些(19HlSpfor直到pYD41reW)和用于生成组合文库的那些 (19FRH2for至19FRL3)的概括(参见SEQ ID Nos:l_22)。引物的粗体和扩大区域代表其中在制备引物时掺入“70%野生型、30%其他核苷酸混合物”的那些区域。此种“掺料的”引物生成在文库内的多样性。图9显示如上文图5中所述测定的所选TnI 19C7 scFv的平衡解离常数(KD)测量。图10显示作为抗原50% (Ag50)测量的相对抗体亲和力的结果。通过将可变结构域克隆到免疫球蛋白恒定结构域上，将4个TnI 19C7克隆转变成小鼠IgG2ak抗体。抗体在瞬时HEK 294细胞系统中表达。Ag50是在其下50%最大限度信号的scTnl-C浓度，且代表所选1^11907 AM候选物的相对亲和力分级。TnI 19C7 AMl例示与TnI 19C7野生型抗体相比较的最紧密相关的亲和力。图 11 举例说明在 ARCHITECT 测定形式(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)中TnI 19C7 AMI与scTnl-C结合的能力。TnI 19C7用吖啶锚(acridinium)标记且使用抗TnI捕获珠测定与scTnl-C的结合。(X =用给定校准物浓度的scTnl-C生成的信号； X/A=校准物X信号与校准物A信号的比；RLU=相对光单位)。TnI 19C7 AMl在这个测定形式中显示与野生型TnI 19C7抗体相比较，对于校准物范围更佳的结合。图12举例说明单克隆抗体iTnI 19C7 AMl的重(SEQ ID NO 25)和轻(SEQ ID NO 28)链以及特别地互补决定区(CDRs)的核苷酸(SEQ ID NO 23、SEQ ID NO :24(互补体)、 SEQ ID NO丨6和SEQ ID NO :27(互补体))和编码的氨基酸序列。图13举例说明在TnI 19C7⑶Rs的重和轻链内可以由除图12中所示那些外的氨基酸取代的位置(SEQ ID Nos 29-49)。发明详述除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同样，除非另有具体说明，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分。一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。 除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、以及患者治疗。为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白，，可与术语多肽互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是这样的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含天然结合的组分。如本文使用的，术语“回收”指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。本发明还包括编码本文所述抗体的可变轻和重链的分离的核苷酸序列(或其片段)以及具有这样的序列的那些核苷酸序列(或其片段)，所述序列包括、对应于、等同于、 可杂交至或互补于与这些编码核苷酸序列至少约70% (例如70% 71%,72%,73%,74%, 75%、76%、77%、78% 或 79% )、优选至少约 80% (例如 80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、 85%、86%、87%、88%或89%)、且更优选至少约90% (例如 91 %、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100% )的同一性。(关于百分比同一性，在70%和100%之间且包括70%和100%的所有整数(及其部分)被视为在本发明的范围内。)此种序列可以衍生自任何来源(例如从天然来源中分离的，经由半合成途径产生的，或从头合成的)。特别地，此种序列可以从除实施例中所述外的来源中分离或获得(例如细菌、真菌、藻类、小鼠或人)。除上述核苷酸序列外，本发明还包括本文所述抗体的可变轻和重链的氨基酸序列 (或这些氨基酸序列的片段)。进一步地，本发明还包括这样的氨基酸序列(或其片段)， 其包括、对应于、等同于或互补于与本发明的蛋白质的氨基酸序列至少约70% (例如70%、 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78% 或 79% )、优选至少约 80% (例如 80%、 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或 89% )、且更优选至少约 90% 同一性(例 ta 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% )。(再次，关于百分比同一性，在70%和100%之间且包括70%和100%的所有整数(及其部分)(如与上述核苷酸序列同一性结合叙述的)被视为在本发明的范围内。)为了本发明的目的，核苷酸序列的“片段”定义为对应于指定的核苷酸序列区域的大约至少6、优选至少约8、更优选至少约10个核苷酸、且甚至更加优选至少约15个核苷酸的邻接序列。术语“同一性”指在特定比较窗或区段上在逐核苷酸基础上的2个序列的相关性。因此，同一性定义为2个DNA区段(或2个氨基酸序列)的相同链(有义或反义)之间的相同、对应或等价程度。“序列同一性百分比”通过下述进行计算在特定区域上比较2个最佳比对的序列，测定在其上等同碱基或氨基酸在2个序列中出现的位置数目，以获得匹配的位置数目，将此种位置数目除以待比较的区段中的位置总数目，并且将结果乘以100。序列的最佳比对可以通过下述进行Smith&Waterman，Appl. Math. 2 :482(1981) 的算法，Needleman&Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的算法，Pearson&Lipman， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85 :2444 (1988)的方法和实现相关算法的计算机程序(例如 Clustal Macaw Pileup(http//cmRm. Stanford. edu/biochem218/ll Multiple, pdf ； Higgins 等人，CABI0S. 5L151-153 (1989))、FASTDB(Intelligenetics)、BLAST (National Center for Biomedical Information ；Altschul 等人’ Nucleic Acids Research 25 3389-3402(1997))、PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI)或 GAP、BESTFIT、 FASTA 禾口 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package Release 7. O, Genetics Computer Group，Madison，WI)。(参见美国专利号 5，912，120。)为了本发明的目的，“互补性”定义为2个DNA区段之间的相关性程度。它通过测量在合适条件下一个DNA区段的有义链与另一个DNA区段的反义链杂交以形成双螺旋的能力进行测定。“互补体”定义为基于规范碱基配对规则与给定序列配对的序列。例如，在一条核苷酸链中的序列A-G-T与另一条链中的T-C-A “互补”。在双螺旋中，腺嘌呤在一条链中出现，胸腺嘧啶在另一条链中出现。类似地，无论哪里在一条链中发现鸟嘌呤，在另一条中就发现胞嘧啶。2个DNA区段的核苷酸序列之间的相关性越大，2个DNA区段的链之间形成杂交双链体的能力越大。2个氨基酸序列之间的“相似性”定义为在2个序列中一系列等同以及保守氨基酸残基的存在。2个氨基酸序列之间的相似性程度越高，2个序列的对应、相同或等价越高。 (2个氨基酸序列之间的“同一性”定义为在2个序列中一系列确切相同或不变的氨基酸残基的存在。)“互补性”、“同一性”和“相似性”的定义是本领域普通技术人员众所周知的。“由......编码”指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分包含来
自由核酸序列编码的多肽的至少3个氨基酸、更优选至少8个氨基酸、和甚至更加优选至少 15个氨基酸的氨基酸序列。如本文使用的，“生物学活性”指针对肌钙蛋白I的抗体或肌钙蛋白I的所有固有生物学特性。此种特性包括例如抗体与肌钙蛋白I结合的能力和本文描述的功能上相关的抗体。如本文使用的，关于抗体、蛋白、或肽与第二种化学种类相互作用的术语“特异性结合”或“特异地结合”，意指相互作用取决于化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别且与特定蛋白结构结合而不是一般地与蛋白结合。如果抗体对表位“A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。如本文使用的，术语“抗体”广泛地指包含4条多肽链-2条重(H)链和2条轻(L) 链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生。此种突变体、变体或衍生抗体实体是本领域已知的，其非限制性实施方案在下文讨论。在全长抗体中，每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，用称为构架区(FR)的较保守区域点缀。每个 VH和VL由3个⑶Rs和4个FRs组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和IgY)、种类(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类，并且可以来自任何物种(例如小鼠、人、鸡、大鼠、兔、羊、鲨鱼和骆驼科动物(camelid))。本发明的抗体的⑶Rs显示于下表1和2中表1 关于 TnI 19C7 AMl 的重链的 CDRs
权利要求
1.一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，称为TnI 19C7 AMI hGl CHO 204，由美国典型培养物保藏中心(ATCC)指定保藏号PTA-9816。
2.一种通过权利要求1的所述CHO细胞系产生的重组抗体。
3.一种包括与肌钙蛋白I结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个互补性决定区(OtR) =GYTFTDYNLH(SEQ ID NO :52)、YIYPYNGITGYNQKFKS(SEQ ID NO 53)、DAYDYDYLTD (SEQ ID NO :54)、 RTSKNVGTNIH(SEQ ID NO :55)、YASERLP(SEQ ID NO :56)和 QQSNNWPYT(SEQ ID NO :57)。
4.权利要求3的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括至少3个CDRs。
5.根据权利要求4的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括至少6个CDRs。
6.根据权利要求3的结合蛋白，其进一步包括人接纳体构架。
7.一种编码结合蛋白的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白的可变重链的氨基酸序列与SEQ ID NO. :25具有至少70%同一性。
8.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白的可变轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO. J8具有至少70%同一性。
9.一种编码结合蛋白的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白的可变重链的氨基酸序列是 SEQ ID NO. :25。
10.一种编码结合蛋白的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白的可变轻链的氨基酸序列是 SEQ ID N0. :28ο
11.权利要求10的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白进一步包括包含SEQID Ν0. 25的氨基酸序列的可变重链。
12.一种包括SEQ ID NO. :25的氨基酸序列的分离的结合蛋白。
13.—种包括SEQ ID NO. 的氨基酸序列的分离的结合蛋白。
14.一种包括权利要求9或权利要求10的所述分离的核酸分子的载体。
15.一种包括权利要求14的所述载体的分离的宿主细胞。
16.一种产生能够与肌钙蛋白I结合的结合蛋白的方法，其包括在足以产生所述结合蛋白的时间和条件下培养权利要求15的所述宿主细胞。
17.一种根据权利要求16的方法产生的分离的蛋白质。
18.—种药物组合物，包括权利要求3的结合蛋白和药学上可接受的载体。
19.一种检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的方法，其包括步骤a)在足以形成抗体/抗原复合物的时间和条件下，使所述测试样品与抗体接触，所述抗体与肌钙蛋白I结合并且包括SEQ ID N0. 25的氨基酸序列；和b)检测所述复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中肌钙蛋白I抗原的存在。
20.权利要求19的方法，其中所述抗体进一步包括SEQID NO. 的氨基酸序列。
21.权利要求20的方法，其中所述抗体通过具有ATCC保藏指名PTA-9816的CHO细胞系 TnI 19C7 AMI hGl CHO 204 产生。
22.—种检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的方法，其包括步骤a)在足以形成第一种抗体/抗原复合物的时间和条件下，使所述测试样品与第一种抗体接触，所述第一种抗体与肌钙蛋白I结合并且包括SEQ ID NO 25 ；b)在足以形成第一种抗体/抗原/第二种抗体复合物的时间和条件下，将缀合物添加到所述第一种抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的第二种抗体；和c)检测通过所述信号生成化合物生成的信号的存在，所述信号的存在指示所述测试样品中肌钙蛋白I抗原的存在。
23.权利要求22的方法，其中所述第一种抗体进一步包括SEQID NO :28。
24.权利要求23的方法，其中所述第一种抗体通过具有ATCC保藏指名PTA-9816的CHO 细胞系 TnI 19C7 AMI hGl CHO 204 产生。
25.一种检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的方法，其包括步骤a)在足以形成肌钙蛋白I抗原/抗体复合物的时间和条件下，使肌钙蛋白I抗原与针对肌钙蛋白I的抗体接触，其中所述抗体包括SEQ ID NO :25的氨基酸序列，并且由能够生成可检测信号的信号生成化合物标记；b)在足以形成肌钙蛋白I抗原/抗体/肌钙蛋白I测试样品抗原复合物的时间和条件下，将所述测试样品添加到所述肌钙蛋白I抗原/抗体复合物中；和c)检测通过所述信号生成化合物生成的信号的存在，所述信号的存在指示所述测试样品中肌钙蛋白I抗原的存在。
26.权利要求25的方法，其中所述抗体进一步包括SEQID NO :28的氨基酸序列。
27.权利要求M的方法，其中所述抗体通过具有ATCC保藏指名PTA-9816的CHO细胞系 TnI 19C7 AMI hGl CHO 204 细胞系产生。
28.一种检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的方法，其包括步骤a)在足以形成肌钙蛋白I参考抗原/抗体复合物的时间和条件下，使所述测试样品与 1)肌钙蛋白I参考抗原和2、针对肌钙蛋白I抗原的抗体接触，其中所述抗原与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着，且其中所述抗体包括SEQ ID N0:25的氨基酸序列；和b)检测通过所述信号生成化合物生成的信号，其中所述测试样品中检测到的肌钙蛋白 I抗原的量与结合所述抗体的肌钙蛋白I参考抗原的量成反比。
29.权利要求观的方法，其中所述抗体进一步包括SEQID NO :28的氨基酸序列。
30.权利要求四的方法，其中所述抗体通过具有ATCC保藏指名PTA-9816的CHO细胞系 TnI 19C7 AMI hGl CHO 204 产生。
31.一种诊断怀疑具有这些状况之一的患者中的急性冠状动脉综合征或心肌梗死的方法，其包括步骤a)从所述患者中分离生物学样品；b)在足以形成肌钙蛋白I抗原/抗体复合物的时间和条件下，使所述生物学样品与抗体接触，所述抗体与肌钙蛋白I结合且包括SEQ ID NO 25的氨基酸序列；c)检测所述肌钙蛋白I抗原/抗体复合物的存在；d)使所述复合物中存在的所述肌钙蛋白I抗原与所述复合物中存在的所述抗体解离；和e)测量所解离的肌钙蛋白I抗原的量，其中大于正常群体第99百分位的肌钙蛋白I值约1-5倍的肌钙蛋白I抗原的量指示所述患者中急性冠状动脉综合征或心肌梗死的诊断。
32.—种诊断怀疑具有这些状况之一的患者中的急性冠状动脉综合征或心肌梗死的方法，其包括步骤a)从所述患者中分离生物学样品；b)在足以形成肌钙蛋白I抗原/抗体复合物的时间和条件下，使所述生物学样品与第一种抗体接触，所述第一种抗体与肌钙蛋白I结合且包括SEQ ID NO 25的氨基酸序列；c)在足以允许缀合物与结合的肌钙蛋白I抗原结合的时间和条件下，将所述缀合物添加到所得到的肌钙蛋白I抗原/抗体复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的第二种抗体；d)通过检测通过所述信号生成化合物生成的信号，检测所述生物学样品中可能存在的肌钙蛋白I抗原的存在；和e)通过测量所述信号的强度，测量所述测试样品中存在的肌钙蛋白I抗原的量，大于正常群体第99百分位值约1-5倍的肌钙蛋白I抗原的量指示所述患者中急性冠状动脉综合征或心肌梗死的诊断。
33. 一种试剂盒，其包括包含权利要求2的所述重组抗体或权利要求3的所述结合蛋白的容器。
34.
35. 一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个⑶R CDR-VHl· A-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID N0:63)，其中X1 是 G ；X2 是 Y ；X3是T或S ；X4是？；&是丁 ；&是0 ；X7是 Y;&是1X9是I或L ；和Xio 是 H.CDR-VH2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-VX8-X9-XIO-Xii-XI2-XI3-XI4-XI5-XI6-XI7(SEQ ID N0:64)，其中 &是I ； )(4是？；X7 是 G; &是I ； X9 是 T ； X10 是 G ；A1是Y X12 是 N )(13是0 )(14是1( X15 是 F X16^K Xl7 是 S.CDR-VH3. ^C1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11 (SEQ ID NO :66)，其中X2是A或F ；)(4是0 ；X5是Y或S ；&是0 ；X7 是 W、Y 或 A ；X8 是 L ；X9是A或T ；和Xltl 是 Y 或 D.CDR-VL1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID N0:66)，其中 X1 是 R ； X2是A或T ； X3 是 S ； X4是Q或K X5是S或N X6是I或V X7 是 G ； Xs 是 T ； X9 是N; X10是I ；和 X11是Y或H.CDR-VL2. A-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID N0:67)，其中X2是A或G ； X3是S或T ； X4 是 E ； X5是S或R ； 父6是I、L或V ；和 X7 是 S、P 或 F. 禾口CDR-VL3. A-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID N0:68)，其中&是Q; ；&是1 )(6是1; X7 是 P ； X8是Y ；和 Xg 是 T。
36.权利要求3的结合蛋白，其中所述结合蛋白选自免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、人源化抗体、Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体及其功能上活性的表位结合片段。
全文摘要
本发明涉及针对肌钙蛋白I的抗体及其使用方法。特别地，此种抗体可以用于检测患者中的肌钙蛋白I，并且还可以用于例如心肌梗死或急性冠状动脉综合征的诊断中。
文档编号C07K16/18GK102421795SQ201080017906
公开日2012年4月18日 申请日期2010年2月23日 优先权日2009年2月24日
发明者D·黄, J·D·泰纳, R·N·齐曼, S·E·布罗菲, 涂伯林 申请人:雅培制药有限公司